專利名稱：基于示蹤分子的蛋白質(zhì)-微球化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)-固體支持介質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)的檢測(cè)辦法，具體涉及一種蛋白質(zhì)-羧基化聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)辦法，尤其適用于變應(yīng)原提取物與羧基化聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)與評(píng)估。
背景技術(shù)：
在免疫化學(xué)產(chǎn)品的開發(fā)過程中，經(jīng)常需要將抗體等蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵的方式同固相支持介質(zhì)偶聯(lián)。在偶聯(lián)反應(yīng)中，通常使用高純度的蛋白質(zhì)溶液作為偶聯(lián)底物。但是在一些情況下，高純度的蛋白質(zhì)難以獲得，蛋白質(zhì)溶液中混有大量雜質(zhì)。以血清變應(yīng)原特異性IgE或IgG4檢測(cè)產(chǎn)品開發(fā)為例，需要將變應(yīng)原提取物同固相支持介質(zhì)(如羧基化聚苯乙烯微球)之間進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)。變應(yīng)原提取物是動(dòng)物、植物、微生物的蛋白質(zhì)粗提物，其有效成分是可以引發(fā)過敏的蛋白質(zhì)或多肽。許多變應(yīng)原提取物成分復(fù)雜、雜質(zhì)較多。以屋塵螨提取物為例，其中蛋白質(zhì)總含量較低，通常只占總重量的1/8到1/5，有效成分的含量更低，其余為雜 質(zhì)，并且其中已知的引發(fā)過敏的蛋白質(zhì)就有19種。由于目前還沒有一個(gè)完善的變應(yīng)原提取物標(biāo)準(zhǔn)，以及蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、容易降解，造成不同供應(yīng)商、不同批次的變應(yīng)原提取物之間有很大差異。此外，變應(yīng)原種類繁多，僅常見的變應(yīng)原就有六十余種。合理、精確、有效地監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)是產(chǎn)品開發(fā)、原材料質(zhì)量評(píng)估和產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵。通常而言，對(duì)于蛋白質(zhì)與固相支持介質(zhì)之間偶聯(lián)反應(yīng)的效率有兩個(gè)檢測(cè)方案。第一個(gè)技術(shù)方案是直接測(cè)定偶聯(lián)后固相支持介質(zhì)表面上的目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度。這一技術(shù)方案的實(shí)施需要使用針對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性抗體。例如，在屋塵螨血清變應(yīng)原特異性IgE檢測(cè)產(chǎn)品開發(fā)過程中，需要測(cè)定偶聯(lián)后的固相支持介質(zhì)表面變應(yīng)原的種類與數(shù)量，但是已知的引發(fā)過敏的蛋白質(zhì)就有19種。此外，由于常見的變應(yīng)原就有六十余種，每一個(gè)變應(yīng)原-固相支持介質(zhì)之間偶聯(lián)反應(yīng)的檢測(cè)就需要使用多個(gè)抗體，這一技術(shù)方案的工作量大，成本高。第二個(gè)方案是測(cè)定固體介質(zhì)表面上的目標(biāo)蛋白質(zhì)與其對(duì)應(yīng)檢測(cè)對(duì)象的結(jié)合。以屋塵螨血清變應(yīng)原特異性IgE檢測(cè)產(chǎn)品為例，需要測(cè)定固相支持介質(zhì)表面的變應(yīng)原可以特異性地結(jié)合多少IgE。這一技術(shù)方案的實(shí)施的難點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)步驟多，并且需要大量來源于不同過敏患者的血清。此外，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，由于在反應(yīng)中缺乏內(nèi)參，上面兩個(gè)技術(shù)方案均無法對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行直接分析。例如，當(dāng)上述兩個(gè)方案均測(cè)定出偶聯(lián)反應(yīng)的效率低于預(yù)期值時(shí)，兩個(gè)方案均無法確定失誤的具體原因是由于化學(xué)試劑或反應(yīng)條件的問題，還是變應(yīng)原提取物的質(zhì)量問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種基于外源性示蹤分子的蛋白質(zhì)-羧基化聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)方法，其通過向氨基-羧基的偶聯(lián)反應(yīng)中加入少量的外源性示蹤分子，并對(duì)其進(jìn)行跟蹤，可以有效地監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)的效率。此外，通過外源性示蹤分子上的氨基與反應(yīng)中其它蛋白質(zhì)的氨基競(jìng)爭(zhēng)，可以計(jì)算出其它蛋白質(zhì)的氨基濃度，其可以作為蛋白質(zhì)提取物質(zhì)量好壞的評(píng)估指標(biāo)之一。由于外源性示蹤分子不干擾下游的免疫化學(xué)反應(yīng)，不會(huì)對(duì)偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球的正常使用造成不良影響。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案—種基于外源性示蹤分子的蛋白質(zhì)-羧基化聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)方法，包括如下步驟(I)將蛋白質(zhì)與外源性示蹤分子按照一定質(zhì)量比或者摩爾比混合；(2)在特定偶聯(lián)反應(yīng)條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)；并通過改變偶聯(lián)反應(yīng)條件以及使用不同濃度的蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液，對(duì)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化；

(3)對(duì)羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進(jìn)行定量。優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)粗提取物(例如變應(yīng)原提取物)或者純化的蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經(jīng)水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. 0，含O. 05M O. 2M的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質(zhì)/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進(jìn)一步封閉微球的活性基團(tuán)，偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述超聲處理的時(shí)間為20秒 5分鐘，超聲頻率為20KHz。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球是被懸浮于貯存液中保藏的，所述貯存液為PH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt%牛血清白蛋白、O. 01 O. 05wt%吐溫-20和O. I O. 5wt%疊氮鈉。更優(yōu)選地,所述磷酸緩沖鹽溶液采用含O. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述步驟(3)為，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，數(shù)分鐘后，加入2N的硫酸終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在450nM波長處讀取吸光度。更優(yōu)選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt %牛血清白蛋白和O. 01 O. 05wt%吐溫-20 ；或者是，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有熒光基團(tuán)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 Ih,其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細(xì)胞儀(如FACS Calibur等)進(jìn)行定量。更優(yōu)選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. O,濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt %牛血清白蛋白和0.01 O. 05wt% 吐溫-20。本發(fā)明還提供了一種采用外源性示蹤分子測(cè)定待測(cè)蛋白溶液中有效成分濃度的方法，包括如下步驟(I)按照質(zhì)量比或摩爾比，將固定量的外源性示蹤分子與不同量的待測(cè)蛋白質(zhì)分子混合；(2)將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)；(3)對(duì)偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進(jìn)行定量；(4)通過數(shù)學(xué)計(jì)算，測(cè)量蛋白質(zhì)溶液中有效成分的含量。
優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)粗提取物(例如變應(yīng)原提取物)或者純化的蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質(zhì)。偶聯(lián)反應(yīng)中，將固定量的外源性示蹤分子(如5ug兔IgG)與不同量的蛋白質(zhì)溶液(如5、10、20ug不知純度的蛋白質(zhì))混合。優(yōu)選地，所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經(jīng)水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. 0，含O. 05M O. 2M的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質(zhì)/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進(jìn)一步封閉微球的活性基團(tuán)，偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。優(yōu)選地，所述步驟⑵中，所述超聲處理的時(shí)間為20秒 5分鐘，超聲頻率為20KHz。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球微球是被懸浮于貯存液中保藏的，所述貯存液為PH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I L Owt%牛血清白蛋白、O. 01 O. 05wt%吐溫-20和O. I O. 5界七％疊氮鈉。更優(yōu)選地,所述磷酸緩沖鹽溶液采用含O. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述步驟(3)為，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，數(shù)分鐘后，加入2N的硫酸終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在450nM波長處讀取吸光度。更優(yōu)選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. 0wt%牛血清白蛋白和O. 01 O. 05wt%吐溫-20。或者是，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有熒光基團(tuán)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 Ih,其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細(xì)胞儀(如FACS Calibur等)進(jìn)行定量。更優(yōu)選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. O,濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含0. I I. Owt %牛血清白蛋白和0.01 0. 05wt% 吐溫-20。步驟(4)中，在偶聯(lián)反應(yīng)中，羧基化聚苯乙烯微球同蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合，形成共價(jià)鍵。
權(quán)利要求
1.一種基于示蹤分子的蛋白質(zhì)-微球化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將蛋白質(zhì)與外源性示蹤分子按照一定質(zhì)量比或者摩爾比混合； (2)在特定偶聯(lián)反應(yīng)條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)；并通過改變偶聯(lián)反應(yīng)條件以及使用不同濃度的蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液，對(duì)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化； (3)對(duì)羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進(jìn)行定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)粗提取物或者純化的蛋白質(zhì)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G或者其它純化的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經(jīng)水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. O，含O. 05M O. 2M的2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. O，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質(zhì)/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. O，含O. 05M O.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進(jìn)一步封閉微球的活性基團(tuán)，偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，數(shù)分鐘后，加入2N的硫酸終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在450nM波長處讀取吸光度； 或者是，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有熒光基團(tuán)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量。
5.一種采用外源性示蹤分子測(cè)定待測(cè)蛋白溶液中有效成分濃度的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)按照質(zhì)量比或摩爾比，將固定量的外源性示蹤分子與不同量的待測(cè)蛋白質(zhì)分子混合； (2)將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)； (3)對(duì)偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進(jìn)行定量； (4)通過數(shù)學(xué)計(jì)算，測(cè)量蛋白質(zhì)溶液中有效成分的含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)粗提取物或者純化的蛋白質(zhì)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經(jīng)水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. O，含O. 05M O. 2M的2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. O，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質(zhì)/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. O，含O. 05M O.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進(jìn)一步封閉微球的活性基團(tuán)，偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色，數(shù)分鐘后，加入2N的硫酸終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在450nM波長處讀取吸光度； 或者是，取偶聯(lián)后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數(shù)次，將微球懸浮于含有熒光基團(tuán)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟(4)中，在偶聯(lián)反應(yīng)中，羧基化聚苯乙烯微球同蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合，形成共價(jià)鍵，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)中，蛋白質(zhì)的濃度>>羧基化聚苯乙烯微球的可結(jié)合蛋白質(zhì)的最大值時(shí)， Y值為微球表面結(jié)合的兔IgG的量；Ymax =微球表面結(jié)合兔IgG的最大值，(也近似于微球表面可結(jié)合蛋白質(zhì)的最大值) [IgG]為偶聯(lián)反應(yīng)中兔IgG的濃度，[X]為偶聯(lián)反應(yīng)中待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度； 微球表面上兔IgG的比例與反應(yīng)中的比例一致，即
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于示蹤分子的蛋白質(zhì)-微球化學(xué)偶聯(lián)效率的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)將蛋白質(zhì)與外源性示蹤分子按照一定質(zhì)量比或者摩爾比混合；(2)在特定偶聯(lián)反應(yīng)條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)；并通過改變偶聯(lián)反應(yīng)條件以及使用不同濃度的蛋白質(zhì)-外源性示蹤分子溶液，對(duì)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化；(3)對(duì)羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進(jìn)行定量。本發(fā)明通過向氨基-羧基的偶聯(lián)反應(yīng)中加入少量的外源性示蹤分子，并對(duì)其進(jìn)行跟蹤，可以有效地監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯微球之間化學(xué)偶聯(lián)的效率。該方法可以迅速、合理、有效地監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102818901SQ20121029297
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者程愛陽 申請(qǐng)人:天津博敏達(dá)生物科技有限公司