專利名稱：構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白定位組裝及圖案化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)微乳液制備蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單而又快速的方法。此蛋白圖案化結(jié)構(gòu)能夠作為篩分不同蛋白的媒介，在細(xì)胞的可控生長(zhǎng)、生物傳感器制備和組織工程材料等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
有序圖案化的蛋白，由于可以作為一種在特定微區(qū)域內(nèi)研究蛋白與抗體以及其他生物分子相互作用的有效途徑(BLAWAS A S, REI CHERT W M. Protein patterning, Biomaterials 1998，19 :595-609)，近年來(lái)在生物傳感器、醫(yī)藥器械、細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)和組織工程等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注(MIN E, WONG K H, STENZEL M H. Microwells with patterned proteins by a self-assembly process using honeycomb—structured porous films, Adv. Mater. 2008，20 :3550-3556)。目前被廣泛應(yīng)用的蛋白圖案化制備技術(shù)主要包括光刻(S0RRIBAS H, PADESTEC, TIEFENAVER L. Photolithographic generation of protein micropatterns for neuron culture applications, Biomaterials 2002, 23:893-900)、軟刻蝕(WHITESIDES G Μ, XIA Y N. Soft lithography, Angew. Chem. ht. Ed. 1998,37 :550-575)、化學(xué)選擇性吸附或沉積(VEISEH Μ, ZAREIE M H, ZHANG M Q. Highly selective protein patterning on gold-silicon substrates for biosensor applications,Langmuir 2002,18 :6671-6678)以及等離子體刻蝕(MU⑶RUMA H,TAKAHASHI H. Protein patterning on functionalized surface prepared by selective plasma polymerization, Surf. Coat. Technol. 2010,205 :2490-2494)等方法。利用這些方法可以制備出規(guī)整有序的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)，但是這些方法大多要求較為嚴(yán)刻的實(shí)驗(yàn)條件和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，在一定程度上限制了其應(yīng)用。因此需要發(fā)展新的制備有序蛋白圖案化的簡(jiǎn)便方法。自Francois等首次以星形聚苯乙烯為膜材質(zhì)，在高濕度環(huán)境中獲得峰窩狀圖案化結(jié)構(gòu)以來(lái)，以水滴為模板的呼吸圖案化(Breath Figure)方法因其操作步驟簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件溫和快速等優(yōu)點(diǎn)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注(WIDAWSKI G，RAffISO M，F(xiàn)RANCOIS B. Self-organized honeycomb morphology of star-polymer polystyrene films,Nature 1994,369 :387-389),并發(fā)展出各種各樣的成膜材料。此方法是在潮濕的環(huán)境中，利用水蒸汽在鋪展在固體或者水表面的聚合物溶液的表面冷凝形成水珠并在表面張力作用下產(chǎn)生規(guī)則排列。當(dāng)水珠和溶劑完全揮發(fā)后，在固化的聚合物膜上就形成了有序蜂窩狀微孔結(jié)構(gòu)。 改變實(shí)驗(yàn)條件可以調(diào)節(jié)孔洞的尺寸以及有序性。采用不同的成膜材料、摻雜材料以及實(shí)驗(yàn)參數(shù)實(shí)現(xiàn)了多孔結(jié)構(gòu)的各種應(yīng)用(孫航，吳立新.水滴模板法構(gòu)筑蜂窩狀有序多孔膜，化學(xué)進(jìn)展2010,22 :1784-1798)。金屬納米粒子、二氧化硅和聚合物小球以及多金屬氧簇等也通過(guò)這種方法被引入到多孔結(jié)構(gòu)中。最近這種方法經(jīng)過(guò)改進(jìn)也可以應(yīng)用到蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的制備中來(lái)。但是在此過(guò)程中，蛋白的引入需要在制得有序多孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)多步化學(xué)反應(yīng)修飾的手段實(shí)現(xiàn)(ZHANG Y, WANG C. Micropatterning of proteins on 3D porouspolymer fIms fabricated by using the breath-figure method, Adv. Mater. 2007,19 913-916)。這種孔洞內(nèi)定位修飾涉及到較為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，而且蛋白在孔洞外的分布也不可避免。因此，發(fā)展更為簡(jiǎn)便的蛋白圖案化方法，使其能夠在保持水滴模板制備有序多孔結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單方便特性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)蛋白的圖案化。這對(duì)于實(shí)現(xiàn)圖案化蛋白的應(yīng)用是非常重要的。人們?cè)?jīng)試圖改進(jìn)呼吸圖案化方法，即通過(guò)將水引入到有機(jī)溶液中(或者相反的過(guò)程)形成乳狀液，然后澆鑄成膜(NISHIKAWA T，NISHIDA J，OOKURA R，NISHIMURA S I，SCHEUMANN V, ZIZLSPERGER M, LAffALL R, KNOLL, W, SHIMOMURA Μ. Web-structured films of an amphiphilic polymer from water in oil emulsion !fabrication and characterization, Langmuir 2000,16 :1337-1342)。也有報(bào)道通過(guò)乳液的方法將蛋白定位到孔結(jié)構(gòu)內(nèi)(ZHANG WXjMENG X L，LI JW,KE B BjCHEN P C,XU Z KjWAN L S. Macroporous, protein-containing films casting from water—in—oil emulsions featuring a block-copolymer, Soft Matter 2011,7:4221-4227)。但是到目前為止，得到的多孔膜一方面有序性較差，孔結(jié)構(gòu)分布不均勻，另一方面蛋白的分布不理想，不能很好的將蛋白定位在孔結(jié)構(gòu)內(nèi)。盡管改變不同的實(shí)驗(yàn)條件如溶劑、濕度、含水量等，多孔結(jié)構(gòu)的有序性依然不好(WANG M Τ,LEI Y,ZHANG L D,WANG S X. Mesoscopic self-assembling morphology of polymer based on emulsification，Mater. Res. Bull. 2000，35 :1625-1630)，使得這些改進(jìn)難以實(shí)用化。其中的原因主要是聚合物兩親性、水滴穩(wěn)定劑、溶劑等成膜條件的優(yōu)化等沒(méi)有達(dá)到合適的控制條件。考慮到表面孔結(jié)構(gòu)的尺度范圍、應(yīng)用條件和水滴模板的生長(zhǎng)平衡，如果能夠選擇更常用的聚合物溶液體系，將預(yù)先結(jié)合了蛋白的乳液滴保持在更小的尺度上，然后將得到的乳液澆鑄成膜，那么表面結(jié)構(gòu)會(huì)由于水滴的生長(zhǎng)平衡而更有序，而且水滴中的蛋白會(huì)隨著水滴的揮發(fā)保留在形成的多孔結(jié)構(gòu)底部。這樣就既可以避免水滴的擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)捷而又快速的表面蛋白圖案化結(jié)構(gòu)聚合物膜的制備，又能獲得尺度均一的有序結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便易行的制備尺度均一和有序的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法及其在識(shí)別不同蛋白方面的應(yīng)用。作為一種制備多孔結(jié)構(gòu)的方法，乳液法由于其制得的多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的規(guī)則度和有序性不好，所以以其為基礎(chǔ)制備多孔結(jié)構(gòu)的報(bào)道并不多見(jiàn)。本發(fā)明通過(guò)選擇合適的聚合物和水溶液體系，應(yīng)用微乳液法制備出有序的多孔結(jié)構(gòu)聚合物膜以及在此聚合物膜基礎(chǔ)上得到蛋白圖案化結(jié)構(gòu)，并且應(yīng)用所得蛋白圖案化結(jié)構(gòu)對(duì)不同的蛋白進(jìn)行識(shí)別。本發(fā)明點(diǎn)在于蛋白被預(yù)先溶解在水中，然后與聚合物的有機(jī)溶液混合，混合溶液經(jīng)微乳化后滴在干凈的固體基底上，隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)，溶液表面的溫度下降，所以在溶液內(nèi)部與表面形成溫度梯度，進(jìn)而導(dǎo)致溶液內(nèi)部對(duì)流作用的形成，相鄰的水滴間會(huì)在這種對(duì)流的作用下碰撞、融合并長(zhǎng)大，長(zhǎng)大后的水滴在對(duì)流以及熱毛細(xì)的作用下以能量最低的原理形成六方密堆積排列，待有機(jī)溶劑和水全部揮發(fā)后，蛋白留在水滴形成的模板位置，也就是孔洞底部。這樣，有序的多孔結(jié)構(gòu)膜和蛋白圖案化結(jié)構(gòu)同時(shí)形成，從而實(shí)現(xiàn)了一步直接制備蛋白圖案化結(jié)構(gòu)。
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本發(fā)明包括以下步驟1)將蛋白溶于二次水中，得到濃度為5mg/mL的蛋白水溶液；幻將聚合物和表面活性劑以20 1 120 1的質(zhì)量比混合后溶于有機(jī)溶劑中， 制備濃度為6mg/mL的聚合物溶液；3)將蛋白水溶液與聚合物溶液以1 20的體積比混合，震蕩至溶液呈微乳白色， 得到微乳液；4)將步驟3)得到的微乳液在濕度為30% 40%、溫度為25 30°C的環(huán)境中澆鑄在清洗過(guò)的平滑基底(包括玻璃、石英或硅等)上成膜，得到孔徑為3 10 μ m的有序多孔膜，與此同時(shí)，蛋白富集在有序多孔膜中孔的底部，從而得到有序的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)。所述蛋白為牛血清白蛋白(簡(jiǎn)稱為BSA)，聚合物為聚苯乙烯(簡(jiǎn)稱為PS)或聚甲基丙烯酸甲酯(簡(jiǎn)稱為PMMA)，分子量為32 36萬(wàn)；有機(jī)溶劑為二氯甲烷；表面活性劑為雙十二烷基二甲基溴化銨(簡(jiǎn)稱為DDAB)。有序的蛋白圖案化可用于不同蛋白的識(shí)別。本發(fā)明采用的設(shè)備簡(jiǎn)單，方法操作便利，制備條件溫和，快捷，得到的多孔結(jié)構(gòu)以及蛋白圖案規(guī)整有序。將蛋白預(yù)先溶解在水中的方法省去了通常引入蛋白所涉及的復(fù)雜步驟，同時(shí)，所引入的蛋白的活性依然保持，可對(duì)特定的抗體進(jìn)行識(shí)別。得到的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)也可用來(lái)識(shí)別不同的蛋白質(zhì)。Bernard等通過(guò)蛋白與抗體間的識(shí)別作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定蛋白的分離(BERNARD A, FITZLI D, SONDEREGER P, DELAMARCHE Ε, MICHEL B, BOSSHARD H R, BIEBUYCKH. Affinity capture of proteins from solution and their dissociation by contact printing,Nat. Biotechnol. 2001，19 ；866-869)。通過(guò)利用本發(fā)明所制得的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)，可以用極少量的抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的分離或檢測(cè)。此外，本發(fā)明也可應(yīng)用于其他水溶性的生物分子如其他蛋白(血紅蛋白、溶菌酶等)或者其抗體、組成DNA序列中的某一段寡核苷酸等的圖案化及其所識(shí)別的特定物質(zhì)的檢測(cè)與分離，而且制得的寡核苷酸有序排列還可通過(guò)與互補(bǔ)序列進(jìn)行識(shí)別實(shí)現(xiàn)有序孔洞中DNA的合成與檢測(cè)。


圖1 實(shí)施例1制備得到的多孔結(jié)構(gòu)的掃描電鏡照片；圖2 用熒光基團(tuán)標(biāo)記的蛋白得到的圖案化結(jié)構(gòu)的激光共聚焦顯微鏡照片；圖3 用普通蛋白制得的蛋白的圖案化結(jié)構(gòu)浸入不同蛋白的混合溶液后的激光共聚焦顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述聚合物為PS和PMMA。有序的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)用于識(shí)別不同蛋白的過(guò)程將制得的有序多孔結(jié)構(gòu)膜浸入不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的兩種蛋白的混合溶液中，4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖溶液(簡(jiǎn)稱為PBQ清洗數(shù)次，用激光共聚焦顯微鏡觀察。以下實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述，但所述實(shí)例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL聚合物溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色， 得到微乳液，在濕度為35%，溫度為25°C條件下將20 μ L得到的微乳液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑約為5μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。附圖1是得到的多孔結(jié)構(gòu)的掃描電鏡照片。圖Ia是大面積的掃描電鏡照片，說(shuō)明得到的多孔結(jié)構(gòu)大面積有序，插圖表明所得到的膜可以從基底上揭掉。圖Ib是選定區(qū)域放大后的掃描電鏡照片，說(shuō)明得到的多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞呈六方密堆積排列，大小均一，排列有序。圖Ic是得到的多孔結(jié)構(gòu)截面的掃描電鏡照片，說(shuō)明得到的多孔結(jié)構(gòu)中孔洞是呈單層排布的。將上述BSA替換為熒光基團(tuán)異硫氰酸熒光素(簡(jiǎn)稱為FITC)共軛的BSA(購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，附圖2是用該熒光蛋白得到的多孔結(jié)構(gòu)在不同切面的激光共聚焦顯微鏡照片，圖加是標(biāo)記出不同切面的單個(gè)孔洞示意圖。Sl S5對(duì)應(yīng)于圖加中不同切面的激光共聚焦顯微鏡照片。此圖表明熒光蛋白強(qiáng)度從孔頂?shù)娇椎撞恳来卧黾?，即熒光蛋白主要分布在孔洞底部。而且這些蛋白的小圓點(diǎn)呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體(購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)后，重復(fù)以上步驟，制得該蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和熒光染料 CY3 標(biāo)記的血紅蛋白(^ MUJUMDAR R B, ERNST L A, MUJUMDAR S R, LEWIS C J, WAGGONER A S.Cyanine dye labeling reagents :sulfoindocyanine succinimidyl esters, Bioconjugate Chem. 1993，4 :105 111中所述方法合成)混合溶液中，4°C冰箱中放置12 小時(shí)后，用PBS緩沖溶液(購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，F(xiàn)ITC共軛的BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。附圖3是將由BSA抗體制得的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)浸入FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白的混合溶液后的共聚焦顯微鏡照片。圖3a是只顯示FITC的熒光時(shí)的顯微鏡照片，綠色的FITC主要分布在孔洞內(nèi)；圖北是只顯示CY3時(shí)的顯微鏡照片，紅色的CY3的分布幾乎沒(méi)有選擇性；圖3c是同時(shí)顯示兩種熒光時(shí)的顯微鏡照片，同樣，綠色分布于孔洞內(nèi)， 紅色無(wú)選擇性分布。這就表明圖案化的蛋白的活性依然保持，還可與特定的識(shí)別它的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，此蛋白的圖案化結(jié)構(gòu)可用來(lái)識(shí)別不同的蛋白。實(shí)施例2將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PMMA (分子量為35萬(wàn))和0. 33mg DDAB 溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL聚合物溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑約為5μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。此多孔結(jié)構(gòu)中孔洞也呈有序的六方密堆積排列。而且孔洞的排列是單層的。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例3將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為35萬(wàn))和1. OmgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL聚合物溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色， 得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、 乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約4μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低， 但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例4將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為；35萬(wàn))和1. 5mgDDAB溶解在 5mL 二氯甲烷中，取50yL蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、 二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約3μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例5將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，20mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約7μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例6將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，25mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約6μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例7將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，35mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將20 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約4μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱
8中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例8將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將10 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約4μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例9將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將30 μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約6μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。實(shí)施例10將5mg BSA溶解在ImL 二次水中，30mg PS (分子量為35萬(wàn))和0. 33mgDDAB溶解在5mL 二氯甲烷中，取50 μ L蛋白水溶液與ImL PS溶液混合，振蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳狀液，在濕度為35%，溫度為30°C條件下將40μ L得到的微乳狀液滴在用二次水、乙醇、二次水依次清洗過(guò)的平滑玻璃基底上。待溶劑揮發(fā)后，在留下的聚合物膜表面得到孔徑為約7μπι的有序多孔結(jié)構(gòu)。在此多孔結(jié)構(gòu)中，孔洞的有序性與實(shí)施例1相比略有降低，但是孔洞還是呈單層的六方密堆積排列。將上述BSA換為熒光基團(tuán)FITC共軛的BSA后，重復(fù)以上步驟，制備得到有序的多孔結(jié)構(gòu)薄膜；用激光共聚焦顯微鏡觀察，蛋白分布在多孔結(jié)構(gòu)中孔洞的底部，因而也呈有序的六方密堆積排列。將上述BSA換為BSA的一級(jí)抗體后，重復(fù)以上步驟，制得具有此蛋白抗體的圖案化結(jié)構(gòu)膜，將此膜浸入IOmL FITC共軛的BSA和CY3標(biāo)記的血紅蛋白混合溶液中，于4°C冰箱中放置12小時(shí)后，用PBS緩沖溶液清洗數(shù)次。用激光共聚焦顯微鏡觀察，由于特異性抗體識(shí)別作用，BSA選擇性的分布在孔洞內(nèi)，而沒(méi)有特異性識(shí)別作用的血紅蛋白的分布則沒(méi)有選擇性。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法，其步驟如下1)將蛋白溶于二次水中，得到濃度為5mg/mL的蛋白水溶液；2)將聚合物和表面活性劑以20 1 120 1的質(zhì)量比混合后溶于有機(jī)溶劑中，制備濃度為6mg/mL的聚合物溶液；3)將蛋白水溶液與聚合物溶液以1 20的體積比混合，震蕩至溶液呈微乳白色，得到微乳液；4)將步驟3)得到的微乳液在濕度為30% 40%、溫度為25 30°C的環(huán)境中澆鑄在清洗過(guò)的平滑基底上成膜，得到孔徑為3 10 μ m的有序多孔膜，蛋白富集在有序多孔膜中孔的底部，從而得到有序的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于蛋白為牛血清白蛋白、牛血清白蛋白的一級(jí)抗體或熒光基團(tuán)異硫氰酸熒光素共軛的牛血清白蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于聚合物為聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯，其分子量為32 36萬(wàn)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于有機(jī)溶劑為二氯甲烷。
5.如權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)筑基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于表面活性劑為雙十二烷基二甲基溴化銨。
6.權(quán)利要求1 5所述方法構(gòu)筑的基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求6所述的基于聚合物薄膜的蛋白圖案化結(jié)構(gòu)在蛋白篩分中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白定位組裝及圖案化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)微乳液制備蛋白圖案化結(jié)構(gòu)的方法。包括蛋白水溶液和聚合物有機(jī)溶液的制備、蛋白水溶液和聚合物有機(jī)溶液混合、微乳化后澆鑄成膜等步驟。本發(fā)明所述方法采用的設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、周期短，有序的多孔薄膜和蛋白圖案化結(jié)構(gòu)同時(shí)形成，從而不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白的引入；被圖案化的蛋白的活性依然存在，可以與特定的抗體進(jìn)行反應(yīng)，因此可以應(yīng)用于不同蛋白間的識(shí)別；此外這種方法還可應(yīng)用于水溶性的無(wú)機(jī)簇、納米粒子等其他體系，該蛋白圖案化結(jié)構(gòu)能夠作為篩分不同蛋白的媒介，在細(xì)胞的可控生長(zhǎng)、生物傳感器制備和組織工程材料等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102352053SQ20111031016
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者吳立新, 孫航, 梁靜, 馬英一 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)