兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備及其應(yīng)用。熊果酸通過化學(xué)改造將C3位的羧基取代為氨基，所生成的氨基化的熊果酸化學(xué)偶聯(lián)到多糖骨架上，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，在水中可以自組裝成納米膠束，其特征包括：1)通過化學(xué)改造的熊果酸的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)；2)疏水基團(tuán)所形成的疏水內(nèi)核可以物理包裹抗腫瘤藥物，明顯改善抗腫瘤藥物的溶解性；3)通過化學(xué)偶聯(lián)熊果酸及物理包裹其他抗腫瘤藥物，可實(shí)現(xiàn)聯(lián)合化療，增強(qiáng)抗腫瘤活性，達(dá)到聯(lián)合增效的作用，降低毒性。本發(fā)明制備方法簡單，容易操作，產(chǎn)率較高，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
【專利說明】兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備及其在腫瘤治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在當(dāng)今全球范圍內(nèi)，癌癥已經(jīng)成為人類死亡的主要原因。世界衛(wèi)生組織指出，目前癌癥每年在全球奪取700多萬人的生命，而且這一數(shù)字還會繼續(xù)上升。因此，對于癌癥的治療和研究刻不容緩，是新世紀(jì)人類急需解決的難題。目前，癌癥的治療手段主要是手術(shù)治療和化學(xué)藥物治療，但是手術(shù)治療只能切除肉眼可見的腫瘤，化療藥物的水溶性較差，口服生物利用度低，體內(nèi)代謝較快，對癌細(xì)胞缺乏靶向性，具有較大的毒副作用。
[0003]熊果酸是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎、保肝、降血脂等作用。近年來發(fā)現(xiàn)，熊果酸能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長。體外研究表明，熊果酸可抑制血管生成，是很強(qiáng)的血管生成抑制劑。用20%胎牛血清的培養(yǎng)液使血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)呈指數(shù)生長狀態(tài)，137.06~1096.5 μ mol.L—1的熊果酸對VEC增殖具有抑制作用，并有劑量依賴性。李希波等人研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對裸鼠肺腺癌移植瘤生長有抑制作用，其機(jī)制可能與降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表達(dá)、抑制新生血管的形成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，熊果酸對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用而被人們重視，研究增多。例如，熊果酸通過Caspase-3，8，9誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡，通過p53通路誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌A459凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸C3位羥基和C17位羧基是熊果酸維持抗腫瘤活性的關(guān)鍵基團(tuán)。將熊果酸C3位羥基取代為剛2后，其對人原髓白血病HL-60細(xì)胞、人胃癌BGC細(xì)胞、人肝癌Bel-7402細(xì)胞及Hela細(xì)胞的ED5tl分別為2.0,2.5,1.7、和2.4mg / L，熊果酸則為72.0、53.7,45.0和49.4mg/L。因此，分析其構(gòu)效關(guān)系可知，將熊果酸C3位的羥基取代為NH2后，熊果酸的抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。此外，熊果酸資源廣，毒性反應(yīng)少，越來越受到大家的關(guān)注。但是，熊果酸難溶于水，導(dǎo)致其制劑制備困難`和生物利用低等問題，因此提高難溶性熊果酸的溶解度，進(jìn)而提高其生物利用度成為一個熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0004]多糖是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，在控制細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞分化以及維持生命體正常代謝方面有著重要的意義。此外，由于多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，主鏈結(jié)構(gòu)由于存在大量的活性基團(tuán)(如羧基和氨基等)易于化學(xué)修飾而改善其理化性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的修飾成兩親性偶聯(lián)物。例如，透明質(zhì)酸是一種由葡萄醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接構(gòu)成的線性大分子粘多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、高粘彈性，并且能與細(xì)胞表面某些特異性受體專一性結(jié)合，因此，經(jīng)透明質(zhì)酸改造的藥物載體具有良好的生物相容性、靶向性、緩釋性以及高載藥量等優(yōu)勢。肝素及其衍生物是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成酸性粘多糖硫酸酯，具有良好的水溶性，因其結(jié)構(gòu)上含有大量的羥基和羧基，易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。[0005]藥物-多糖偶聯(lián)物是將疏水性的化療藥物和水溶性多糖通過化學(xué)共價鍵偶聯(lián)形成高分子藥物，其主要優(yōu)勢在于:對實(shí)體瘤具有傾向性沉積作用，即EPR效應(yīng)；延長藥物在血液的循環(huán)時間，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬；改善疏水性藥物可溶性等。例如，將熊果酸與透明質(zhì)酸偶聯(lián)，所形成的兩親性熊果酸-透明質(zhì)酸偶聯(lián)物，其不僅可以在水中發(fā)生自組裝，形成內(nèi)部疏水外部親水的膠束結(jié)構(gòu)，增加熊果酸的水溶性，還可以通過與細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體特異性結(jié)合的能力以及透明質(zhì)酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，實(shí)現(xiàn)藥物的主動靶向傳遞。肝素及其衍生物具有抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等作用，因此，熊果酸-肝素偶聯(lián)物不僅可解決熊果酸的溶解性問題，亦可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，增強(qiáng)其抑制腫瘤生長的活性。
[0006]兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物可以在水溶液中自組裝，形成內(nèi)部疏水、外部親水的膠束結(jié)構(gòu)，其疏水性的內(nèi)核可以裝載疏水性的藥物，達(dá)到增溶的目的。多糖通過化學(xué)偶聯(lián)氨基化的熊果酸，以及物理包裹其他抗腫瘤藥物，可以達(dá)到協(xié)同治療的效果，從而提高療效。因此，兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物不僅可以單獨(dú)用作制備高分子藥物，還可以作為藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種熊果酸-多糖類兩親性偶聯(lián)物，通過化學(xué)改造將熊果酸結(jié)構(gòu)上的羥基取代為氨基并且通過化學(xué)偶聯(lián)的方法，將疏水性的氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物。同時，該偶聯(lián)物是是安全性好、載藥量高、生物活性好的抗腫瘤藥物載體。該體系顯著增強(qiáng)了熊果酸的抗腫瘤活性，而且大大提高了熊果酸的水溶性，避免了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高了熊果酸的生物利用度。本發(fā)明使熊果酸和多糖的應(yīng)用具有更廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是提供上述兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備方法。
[0009]本發(fā)明的還有一個目的是提供上述兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物在抗腫瘤中的應(yīng)用。
[0010]為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，該體系將熊果酸C3位上的羥基取代成氨基，形成氨基化的熊果酸。在多糖的羧基上，通過化學(xué)偶聯(lián)的方法，引入氨基化的熊果酸，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物。由于對熊果酸進(jìn)行了化學(xué)改造，所形成的氨基化的熊果酸的抗腫瘤活性顯著增加，并且由于在親水性的多糖骨架上引入了疏水基團(tuán)，增加了其兩親性，故兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物能在水中自組裝形成納米膠束，提高了熊果酸的水溶性和穩(wěn)定性，延長其在血液中的循環(huán)時間，增加熊果酸的抗腫瘤作用。
[0011]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，其中多糖選自低分子量肝素、脫硫酸化肝素、未分級肝素、透明質(zhì)酸、海藻酸、軟骨素、多硫酸化軟骨素、羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-0，N-羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
[0012]所述的兩親性熊果酸-多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0013]熊果酸通過氧化反應(yīng)，將羥基氧化成羰基，所形成的3-羰基的熊果酸與鹽酸羥胺溶解于吡啶中，反應(yīng)生成白色固體，該白色固體與氰基硼氫化鈉(NaBH3CN),乙酸鈉(CH3COONa)和三氯化鈦(TiCl3)溶解于甲醇中，反應(yīng)生成氨基化的熊果酸。將多糖溶于反應(yīng)溶劑中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)為活化劑，進(jìn)行縮合反應(yīng)將氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上。
[0014]所述的制備方法中，氧化反應(yīng)的氧化劑為氯鉻酸吡啶(PCC)，溶劑為二氯甲烷，或者氧化反應(yīng)的氧化劑為瓊斯(Jones)試劑，溶劑為二氯甲烷-丙酮。
[0015]所述的制備方法，其中反應(yīng)溶劑選自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水或甲酰胺與水、或N，N- 二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑。
[0016]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，可單獨(dú)用作高分子藥物，也可用作藥學(xué)活性或者藥理活性分子的藥物載體。
[0017]所述的藥學(xué)活性或者藥理活性分子選自紫杉烷類、喜樹堿類、長春新堿類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類或維A酸類抗腫瘤藥物。
[0018]所制備的高分子藥物或包載疏水性藥學(xué)活性或藥理活性分子的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物為注射劑、片劑、膠囊劑、口服溶液劑、貼劑、搽劑、洗劑、凝膠劑、涂劑、軟膏劑、噴霧劑、氣霧劑或鼻用制劑。
[0019]該兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物制成載藥納米膠束的方法操作步驟如下:兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物與水按重量比為3~50: 1000的比例溶解，得到兩親性多糖偶聯(lián)物納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的抗腫瘤藥物用藥學(xué)上可接受的溶劑溶解，與所述的熊果酸-多糖納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機(jī)溶劑小分子得到粒徑為10~1000nm的納米膠束，得到的納米膠束可直接應(yīng)用，也可通過冷凍干燥或噴霧干燥制成固體制劑。
[0020]具體方案如下:
[0021]在多糖分子的骨架上引入氨基化的熊果酸，使其具有兩親性，在水性介質(zhì)中可自組裝成納米膠束，其中疏水的氨基化熊果酸聚集成內(nèi)核，而多糖分子形成親水性外殼，故得到的納米膠束具有性質(zhì)穩(wěn)定、有效地逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、高抗腫瘤活性等特征。同時，該兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物還是一種優(yōu)良的藥物載體，可物理包裹難溶性抗腫瘤藥物。該偶聯(lián)物作為藥物載體，粒徑在10~1000nm可控，均勻度好，再分散性好，載藥量高。該偶聯(lián)物可用于注射、口服、外用或粘膜給藥。
[0022]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的具體制備方法如下:
[0023]一、氨基取代的熊果酸衍生物的合成
[0024]1.熊果酸用二氯甲烷溶解，一定溫度下逐步滴入溶解有氧化劑的溶液中，室溫攪拌一定時間。反應(yīng)液經(jīng)過濾，洗滌，水洗，干燥，過濾，濃縮后，硅膠柱層析洗脫、濃縮，得白色固體；
[0025]2. 將反應(yīng)I得到的白色固體和鹽酸羥胺溶解于吡啶中，一定溫度下回流一定時間。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，蒸餾水洗滌，過濾，水洗，干燥，得白色固體；
[0026]3.將反應(yīng)2得到的白色固體、氰基硼氫化鈉和乙酸鈉，溶解于甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)。冰浴條件下，緩慢滴加三氯化鈦溶液，室溫攪拌一定時間。將所得的白色渾濁液，加入適量的蒸餾水，旋去甲醇，調(diào)節(jié)溶液PH至中性，用二氯甲烷萃取，有機(jī)層水洗，干燥，過濾，濾液濃縮。用甲醇、二氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結(jié)晶，得白色固體，即氨基化的熊果酸。
[0027]合成路線如下:
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物是通過以下方法制備得到的:熊果酸通過化學(xué)改造得到氨基化的熊果酸，其抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)；在多糖上的羧基引入氨基化的熊果酸，使其具有兩親性，在水性介質(zhì)中可自組裝形成納米膠束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物中所述的多糖包括低分子量肝素、脫硫酸化肝素、未分級肝素、透明質(zhì)酸、海藻酸、軟骨素、多硫酸化軟骨素、羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟: ①熊果酸用二氯甲烷溶解，一定溫度下逐步滴入溶解有氧化劑的溶液中，室溫攪拌一定時間。反應(yīng)液經(jīng)過濾，洗滌，水洗，干燥，過濾，濃縮后，硅膠柱層析洗脫、濃縮，得白色固體； ②將反應(yīng)①得到的白色固體和鹽酸羥胺溶解于吡啶中，一定溫度下回流一定時間。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，蒸餾水洗滌，過濾，水洗，干燥，得白色固體； ③將反應(yīng)②得到的白色固體、氰基硼氫化鈉和乙酸鈉，溶解于甲醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)。冰浴條件下，緩慢滴加三氯化鈦溶液，室溫攪拌一定時間。將所得的白色渾濁液，加入適量的蒸餾水，旋去甲醇，調(diào)節(jié)溶液PH至中性，用二氯甲烷萃取，有機(jī)層水洗，干燥，過濾，濾液濃縮。用甲醇、二 氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結(jié)晶，得白色固體，即氨基化的熊果酸； ④將多糖溶于反應(yīng)溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺為催化劑，加入氨基化的熊果酸，控制反應(yīng)至反應(yīng)完全，反應(yīng)結(jié)束后，用沉淀劑沉淀，過濾得到沉淀物，復(fù)溶，超聲，透析，冷凍干燥，即得熊果酸-多糖類兩親性偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于: 步驟①中，所述的氧化反應(yīng)的氧化劑為氯鉻酸吡啶，溶劑為二氯甲烷，或者氧化反應(yīng)的氧化劑為瓊斯試劑，溶劑為二氯甲烷-丙酮；所述的溫度控制為-10~30°C，所述的室溫攪拌時間為0.5~IOh ； 步驟②中，所述的溫度控制為80~150°C ;所述的回流時間為2~24h ; 步驟③中，所述的室溫攪拌時間為2~36h ; 步驟④中，所述的反應(yīng)溶劑選自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水或甲酰胺與水、或N，N-二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑，所述的控制反應(yīng)為先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺活化劑反應(yīng)0.2~2h后，再加入氨基化的熊果酸，室溫反應(yīng)6~72h ;所述的沉淀劑選自冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇。
5.權(quán)利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物，其特征在于其可以單獨(dú)用作制備高分子藥物，或者用作制備疏水性藥學(xué)活性或藥理活性分子的載體中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所制備的高分子藥物或包載疏水性藥學(xué)活性或藥理活性分子的兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物為注射劑、片劑、膠囊劑、口服溶液劑、貼劑、搽劑、洗劑、凝膠劑、涂劑、軟膏劑、噴霧劑、氣霧劑或鼻用制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥學(xué)活性或藥理活性分子選自:紫杉烷類、喜樹堿類、長春新堿類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類或維A酸類抗腫瘤藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物制備載藥納米膠束的方法包括如下步驟:兩親性熊果酸-多糖偶聯(lián)物與水按重量比為3~50: 1000的比例溶解，得到熊果酸-多糖納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的抗腫瘤藥物用藥學(xué)上可接受的溶劑溶解，與所述的熊果酸-多糖納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機(jī)溶劑小分子得到粒徑為10~1000nm的納米膠束；得到的納米膠束可直接應(yīng)用，也可通過冷凍干燥或噴霧干燥制成固體制劑復(fù)溶后再利用。`
【文檔編號】A61K31/56GK103705939SQ201310742882
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】姚靜, 李園珂, 周建平 申請人:中國藥科大學(xué)