一種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因 子CgTNF8787及其構(gòu)建和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞因子（cytokine)由免疫活性細(xì)胞和其它細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子 蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，是參與固有免疫應(yīng)答功能最多樣且最重要的一類(lèi)免疫效應(yīng)分子。目前已發(fā) 現(xiàn)上百種細(xì)胞因子，并對(duì)其來(lái)源、分子結(jié)構(gòu)、相應(yīng)的受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物學(xué)功能以及與臨床 關(guān)系進(jìn)行了大量研究，特別是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組細(xì)胞因子已成功應(yīng)用于腫瘤、 炎癥、造血功能障礙等疾病治療，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 鑒于細(xì)胞因子廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用、在病害防治方面潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值及其在 揭示免疫系統(tǒng)演化等方面的重要意義，在更低等的生物中尋找細(xì)胞因子，一直是免疫學(xué)的 熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，通過(guò)基因組學(xué)的研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)果蠅、海膽、海鞘中存在一種重要細(xì)胞因 子類(lèi)型一腫瘤壞死因子（TNF)JNF是機(jī)體免疫調(diào)控的關(guān)鍵組分，其功能活性包括誘發(fā)細(xì)胞 凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)、提高吞噬細(xì)胞吞噬活性、誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子和免疫效應(yīng)物質(zhì)的表達(dá) 等多種功能，在機(jī)體的正?；虿±?xiàng)l件下均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，與高等動(dòng)物廣泛 深入的研究狀態(tài)相比，無(wú)脊椎動(dòng)物TNF的研究剛剛起步，目前除了個(gè)別物種中的基因序列， TNF相關(guān)信息嚴(yán)重匱乏，尤其缺乏對(duì)其功能的明確認(rèn)識(shí)。
[0004] 以太平洋長(zhǎng)牡蠣為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物信息學(xué)的相 關(guān)手段，從長(zhǎng)牡蠣基因組中鑒定了 19個(gè)TNF基因拷貝，基因序列在關(guān)鍵位點(diǎn)保守，但整體同 源性較低，其中11個(gè)已完成基因克隆和體外蛋白重組，初步的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)表明對(duì)應(yīng)的 重組蛋白均具有一定的腫瘤殺抑活性，具有較好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787及其構(gòu) 建和應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787,重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞 死因子CgTNF8787的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 1中所示。
[0008] 所述重組蛋白CgTNF8787的構(gòu)建：
[0009] 1)以牡蠣cDNA為模板，采用P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；
[0010] 2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體通過(guò)T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物與 pET30a(+)載體經(jīng)EcoRI，Xhol雙酶切后連接；
[0011] 3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化、復(fù)性，即得到 具有序列表SEQIDNO. 1中氨基酸序列的重組蛋白CgTNF8787 ;
[0012] 所述引物P1和P2分別為：
[0013] P1 :5' -GGAATTCCATATGTTGAGCAAAGTGGACTCCAGTG-3' ；
[0014] P2 :5 ' -CCGCTCGAGCAATTTGAACATTCCAAAATAATTCC-3 '。
[0015] 所述步驟3)經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后采用鎳柱純化獲得變性重組蛋白，而后透析復(fù)性。
[0016] -種CgTNF8787重組蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQIDNO. 1中氨基酸序列的重組 蛋白CgTNF8787可用于制備抑制腫瘤的藥物。
[0017] -種CgTNF8787基因重組蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQIDNO. 1中氨基酸序列的 重組蛋白CgTNF8787可用于制備飼料添加劑。
[0018] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 本發(fā)明采用通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增太平洋牡蠣CgTNF8787分子基因的CDNA全長(zhǎng)，并對(duì) 其編碼區(qū)進(jìn)行原核重組表達(dá)。獲得的重組蛋白是在太平洋牡蠣中一個(gè)含有腫瘤壞死因子 TNF結(jié)構(gòu)域的CgTNF活性分子，該蛋白對(duì)HEK293和HCT116等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用， 其可作為一個(gè)抗腫瘤制劑候選分子。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例采用MTT法檢測(cè)不同濃度CgTNF8787重組蛋白對(duì)HEK293細(xì) 胞生長(zhǎng)的抑制率圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例采用MTT法檢測(cè)不同濃度CgTNF8787重組蛋白對(duì)HCT116細(xì) 胞生長(zhǎng)的抑制率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0023] 太平洋長(zhǎng)牡蠣CgTNF8787基因重組蛋白，序列表SEQIDNO. 1中氨基酸序列所示。
[0024] SEQIDNO. 1 (CGI_10018787)
[0026] (a)序列特征：
[0027] ?長(zhǎng)度：318個(gè)氨基酸
[0028] ?類(lèi)型：蛋白
[0029] 魯鏈型：?jiǎn)捂?br>[0030] (b)分子類(lèi)型：雙鏈DNA
[0031] (c)假設(shè)：否
[0032] (d)反義：否
[0033] (e)最初來(lái)源：太平洋長(zhǎng)牡蠣
[0034] (f)特異性名稱(chēng)：無(wú)
[0035] 太平洋長(zhǎng)牡蠣CgTNF8787重組蛋白的構(gòu)建：
[0036] 1.重組載體的構(gòu)建：本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的pET30a(+)原核 表達(dá)載體。通過(guò)PCR技術(shù)，使用5'末端分別添加了EcoRI，Xhol特定酶切位點(diǎn)的基因特異 性引物P1 (5, -GGAATTCCATATGITGAGCAAAGTGGACTCCAGTG-3'）和P2 (5,-CCGCTCGAGCAAITTG AACATTCCAAAATAATTCC-3'）擴(kuò)增太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF基因全長(zhǎng)編碼區(qū)。反應(yīng) 條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與pMD18-T載 體連接。轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆利用載體引物進(jìn)行菌落PCR篩選并測(cè)序，驗(yàn)證測(cè)序正確后用質(zhì) 粒提取試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒（大連寶生物工程有限公司），待用；使用EcoRI，Xhol雙 酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）對(duì)酶切產(chǎn)物純化回收； 純化片段與經(jīng)EcoRI，Xhol雙酶切的表達(dá)載體pET-30a(+)連接，完成載體的構(gòu)建。
[0037] 2.重組蛋白的表達(dá)：以BL21(DE3)為重組表達(dá)菌株，將上述構(gòu)建的重組載體和 pET-30a(+)空載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。挑取 單克隆，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C在搖床中劇烈震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后以1: 100的比例接種于250mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D6QQ= 0. 4-0. 8。加入IPTG，使終 濃度達(dá)到lmm〇l/mL，16°C160rpm繼續(xù)過(guò)夜培養(yǎng)20h。4°C，5000rgm，離心10min，收集菌體， 于-80°C凍存?zhèn)溆谩Ｈml菌液離心，棄去上清后，加入80yLPBS緩沖液和20yL5X蛋 白上樣緩沖液（常規(guī)通用試劑），l〇〇°C沸水煮沸10分鐘，離心，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。
[0038] 3.重組蛋白的純化與濃縮：將上述所得蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了可 溶重組蛋白，用超濾管濃縮除鹽，即獲得SEQIDNO. 1所示的重組蛋白。
[0039] 用具體操作步驟如下：
[0040] 鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白：
[0041] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1. 6X20cm，柱床體積為10ml;
[0042] (2)用緩沖液 1 (1. 14gLiNa^PCM，14. 5gLiNa^PCM，29. 3gLWaCl);平衡 2-5 個(gè) 床體積，流速為2mLminS
[0043] (3)將 20ml細(xì)胞破碎液（50mMPBS，pH7. 4,0?5MNaCl)0?45ym濾膜過(guò)濾，上樣， 流速為lmLminS
[0044] (4)用緩沖液1再洗2-5個(gè)床體積，流速為2mLmin1;
[0045] (5)用分別含50、100、400mM的咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2mLmin\ 收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)；
[0046] (6)用30 %異丙醇流洗5個(gè)柱床體積，再用20 %的乙醇保存柱子。
[0047] 實(shí)例 2
[0048] 重組蛋白CgTNF8787抗腫瘤生長(zhǎng)活性分析
[0049] 檢測(cè)實(shí)施例1所得CgTNF8787蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為 1-5X105cellmL\取96孔板每孔加入100yL細(xì)胞懸液，置37°C，5%C02及飽和濕度條件 的培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜；第2天預(yù)先將不同濃度的重組蛋白為加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù) 孔，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（無(wú)任何添加）和空白孔（只加培養(yǎng)基）；將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱， 在37°C，5%C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24h;每孔加入MTT溶液（5mgmLiUOyLJTr 繼續(xù)培養(yǎng)l_4h，避光；終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150yLDMS0,輕微振 蕩10min;在酶標(biāo)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光值（A值）。結(jié)果顯示 CgTNF8787對(duì)HEK293(圖1)和HCT116(圖2)等多種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787,其特征在于：重組的太平洋長(zhǎng) 牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 1中所示。2. 按權(quán)利要求1所述的重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787的構(gòu)建方法，其 特征在于： 1) 以牡蠣cDNA為模板，采用Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用； 2. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體通過(guò)T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物與pET30a (+)載 體經(jīng)EcoRI，XhoI雙酶切后連接； 3) 將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化、復(fù)性，即得到具有 序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白CgTNF8787 ; 所述引物Pl和P2分別為： Pl :5' -GGAATTCCATATGTTGAGCAAAGTGGACTCCAGTG-3'； P2 :5' -CCGCTCGAGCAATTTGAACATTCCAAAATAATTCC-3'。3. 按權(quán)利要求1所述的CgTNF8787基因重組蛋白的制備，其特征在于：所述步驟3)經(jīng) 誘導(dǎo)培養(yǎng)后采用鎳柱純化獲得變性重組蛋白，而后透析復(fù)性。4. 一種按權(quán)利要求1所述CgTNF8787重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白CgTNF8787可用于制備抑制腫瘤的藥物。5. -種按權(quán)利要求1所述CgTNF8787基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白CgTNF8787可用于制備飼料添加劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787及其構(gòu)建和應(yīng)用。重組的太平洋長(zhǎng)牡蠣腫瘤壞死因子CgTNF8787的氨基酸序列如序列表SEQ？ID？NO.1中所示。制備為通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增CgTNF8787基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其TNF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了原核重組表達(dá)。該蛋白對(duì)HEK293和HCT116等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其可作為一個(gè)抗腫瘤制劑候選分子。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, A61K38/19, C07K14/525, A23K1/165
【公開(kāi)號(hào)】CN105131102
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510452360
【發(fā)明人】王玲玲, 邱麗梅, 杜昕宇, 王秀丹, 劉瑞, 張峘
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日