專利名稱：一種新型親和載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以瓊脂粉為基質(zhì)制備親和載體的方法，以及工業(yè)用酶的制備方法。
背景技術(shù)：
固定化金屬離子親和層析，又稱為金屬螯合親和層析(ImmobilizedMetal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)是近年來被普遍應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化的常用方法，其原理是利用Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等過渡金屬離子與蛋白質(zhì)表面的組氨酸、色氨酸或半胱氨酸配位結(jié)合。由于蛋白質(zhì)表面這些氨基酸的種類、位置和空間構(gòu)象不同，因而與金屬螯合物的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化。
基因工程的發(fā)展極大地促進(jìn)了IMAC技術(shù)的應(yīng)用。通常，利用基因工程技術(shù)在目標(biāo)重組蛋白質(zhì)的N端或C端接上一段多肽段，大多為多聚組氨酸，這樣幾乎不會改變酶活力與穩(wěn)定性，而且可以提高目的蛋白質(zhì)與載體的結(jié)合力。IMAC技術(shù)使純化蛋白質(zhì)更加方便，由于其簡便、快速、專一和高效等特點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，尤其是當(dāng)前生物技術(shù)下游加工過程。而且，可以實(shí)現(xiàn)單步純化固定化各種蛋白質(zhì)及工業(yè)用酶。
隨著人們對環(huán)境保護(hù)的日益重視，以及為了滿足減少成本的要求，化學(xué)合成法逐漸被酶法合成所代替。針對酶的純化，目前許多公司已經(jīng)推出許多固定化金屬螯合親和層析載體，如Clontech、GE healthcare、Qiagen等公司，這些載體對用組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)合量見表1。
表1各個(gè)公司推向市場的載體


這些載體均以瓊脂糖為基質(zhì)制備而成，載體機(jī)械強(qiáng)度高，能夠快速、簡單地純化目的蛋白質(zhì)，不僅可以用于實(shí)驗(yàn)室研究，也可用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。但是這些載體價(jià)格昂貴，大批量應(yīng)用時(shí)成本很高，很難在成本敏感的工業(yè)生產(chǎn)過程(比如工業(yè)用酶純化和固定化)中推廣。
因此，價(jià)格便宜且仍保留甚至具有性能更好的載體對于本領(lǐng)域來說仍然是非常有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面涉及一種親和載體，它以瓊脂粉為基質(zhì)，所述瓊脂粉交聯(lián)有螯合劑，其中，所述瓊脂粉基質(zhì)和螯合劑的質(zhì)量比為800-1200∶10-45。
本發(fā)明另一方面涉及一種金屬螯合親和載體，它以瓊脂粉為基質(zhì)，所述瓊脂粉交聯(lián)有螯合劑，所述螯合劑螯合有金屬離子，其中，所述瓊脂粉基質(zhì)、螯合劑和金屬離子的質(zhì)量比為800-1200∶10-45∶1-15。
本發(fā)明另一方面涉及以瓊脂粉為基質(zhì)的金屬螯合親和載體的制備方法，該方法包括(1)用pH3.0-6.8的酸性緩沖液抽提瓊脂粉，然后用pH8.0-10.0的堿性緩沖液抽提瓊脂粉，瀝干，得到濕瓊脂粉；(2)用能使帶有OH基的固體載體帶有反應(yīng)性官能團(tuán)的活化劑處理步驟(1)得到的濕瓊脂粉；(3)使步驟(2)得到的瓊脂粉與螯合劑交聯(lián)，得到交聯(lián)了螯合劑的瓊脂粉；和(4)使步驟(3)得到的瓊脂粉與金屬離子螯合，得到所述金屬螯合親和載體。
本發(fā)明還涉及瓊脂粉在制備金屬螯合親和載體中的用途。
具體實(shí)施例方式
從原理上來說，只要有自由羥基的聚合物，如瓊脂糖、瓊脂粉、殼聚糖、纖維素等，都可以作為IMAC制備的基質(zhì)。纖維素雖然廉價(jià)、易得，但是非特異性吸附嚴(yán)重，影響蛋白質(zhì)純化效果。瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖相間結(jié)合的中性鏈狀多糖組成，表面不帶電荷，非特異性吸附低，而且具有大量的豐富的化學(xué)基團(tuán)(如OH官能基)，易于改質(zhì)，因此現(xiàn)有技術(shù)中常用其來制備IMAC載體，但是價(jià)格較貴，限制了它的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用。
瓊脂粉價(jià)格低廉，由瓊脂糖和果膠組成。其中的果膠據(jù)報(bào)道非特異性吸附蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)，若用于親和層析，將影響分離效果。到目前為止，還沒有以瓊脂粉為基質(zhì)制備載體的報(bào)道。我們以瓊脂粉為基質(zhì)制備了金屬鰲合親和載體，用多種工業(yè)用酶進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)純化和固定化結(jié)果較好，并沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性吸附現(xiàn)象。
因此，本發(fā)明涉及一種金屬螯合親和載體，它以瓊脂粉為基質(zhì)制得。瓊脂粉先經(jīng)緩沖液抽提，然后用活化劑活化，然后先后與螯合劑、金屬離子的鹽溶液相互作用，從而制得用于本發(fā)明金屬螯合親和載體。本發(fā)明金屬螯合親和載體中，瓊脂粉、螯合劑和金屬離子的質(zhì)量比通常為800-1200∶10-45∶1-15，更通常為900-1000∶15-35∶3-10，更通常為1000∶18-33∶5-9。在一優(yōu)選實(shí)施例中，交聯(lián)了螯合劑后的瓊脂粉基質(zhì)可先不螯合金屬離子，待到使用時(shí)再與所需的金屬離子螯合。
本發(fā)明對用于抽提瓊脂粉的緩沖液并無特殊限制。通常先使用pH為3.0-6.8、優(yōu)選為4.0-6.0的酸性緩沖液抽提，然后使用pH7.5-11.0、優(yōu)選為pH8.0-10.0的堿性緩沖液抽提。本發(fā)明對緩沖液的濃度也無特殊限制，通常為0.02-0.08mol/L，優(yōu)選為0.03-0.06mol/L，更優(yōu)選為0.04-0.05mol/L。通常使用的酸性緩沖液有醋酸緩沖液、磷酸緩沖液，堿性緩沖液有碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
在一優(yōu)選的實(shí)施例中，按1克瓊脂粉30-70毫升緩沖液的比例加入醋酸緩沖液，該醋酸緩沖液的pH范圍為3.0-6.0，優(yōu)選為4.0-5.0，更優(yōu)選為4.0，其濃度為0.03-0.06mol/L，優(yōu)選為0.04mol/L。通常用醋酸緩沖液進(jìn)行兩次抽提，當(dāng)然，抽提的次數(shù)依實(shí)際情況而定，例如可以是3或4次，也可以是1次。當(dāng)抽提多次時(shí)，更換緩沖液的間隔時(shí)間一般為2-5小時(shí)，較佳為2-3小時(shí)。除醋酸緩沖液外，還可以使用其它緩沖液，如磷酸緩沖液，其pH通常為6.8、濃度通常為0.03mol/L。
用醋酸緩沖液抽提結(jié)束后，通常用水洗多次，如2-3次，然后放置過夜。之后使用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液抽提。用于本發(fā)明的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的pH通常為8.0-10.0，較佳為9.0，其濃度通常為0.03-0.07mol/L，通常為0.05mol/L。通常，加入緩沖液后攪拌5-6小時(shí)，并放置過夜。之后可過濾沉淀物并水洗瀝干?？稍俅斡锰妓徕c-碳酸氫鈉緩沖液抽提，即重復(fù)一次碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液抽提過程。在一優(yōu)選實(shí)施例中，在40℃用pH9.0、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液進(jìn)行抽提。
然后可使用抽提得到的瓊脂粉制備本發(fā)明的親和載體。首先可用活化劑處理上述抽提瀝干得到的濕瓊脂粉。通常，使瓊脂粉與活化劑反應(yīng)，使其帶有高反應(yīng)性的官能基，例如環(huán)氧基或氯甲?；?，以使其能與延伸臂或是螯合劑進(jìn)行合成反應(yīng)。常見的活化方法有溴化氰法、環(huán)氧化法、二乙烯法等。最常用的是環(huán)氧化法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明使用環(huán)氧氯丙烷作為活化劑用于處理瓊脂粉。通常，每克抽提瀝干的濕瓊脂粉使用約0.45-0.85ml、較佳0.55-0.75ml的活化劑處理。在一優(yōu)選實(shí)施例中，每克抽提瀝干的濕瓊脂粉用約0.65ml的活化劑處理?；罨沫傊壑校傊叟c活化劑的質(zhì)量比通常為800-1000∶5-35，更通常為800-1000∶10-30，更通常為1000∶13-25。
之后，可使用螯合劑處理經(jīng)活化劑處理的瓊脂粉。螯合劑的使用主要是協(xié)助金屬離子以配位鍵的方式固定于固體載體上，而螯合劑主要以亞基與金屬離子形成配位鍵，因此稱為多亞基螯合劑，其亞基數(shù)分別為三、四及五個(gè)。一般過渡金屬均有六個(gè)配位數(shù)，因此與螯合劑的亞基結(jié)合后，剩余的配位數(shù)可以與蛋白質(zhì)上的特定氨基酸結(jié)合，而與沒有特定氨基酸的蛋白質(zhì)分離，常見的螯合劑有IDA(亞氨基二乙酸)、NTA(氨三乙酸)、TED〔N，N，N-三(羧甲基)乙二胺〕及CM-Asp(羧甲基化天冬氨酸)。其中最常用的螯合劑為IDA，其上的一個(gè)氮原子、兩個(gè)氧原子與金屬離子螯合后，金屬離子還剩余三個(gè)空軌道與蛋白質(zhì)結(jié)合。IDA體積小，與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)立體阻礙較小，并且IDA具有親水性，帶有二個(gè)負(fù)電荷，與金屬離子螯合后呈電中性，這使固體載體蛋白質(zhì)間的非特定性吸附減少到最小程度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用IDA為螯合劑制備本發(fā)明的金屬螯合親和載體。通常，每克已活化的瓊脂粉用0.15-0.25克、較佳0.18-0.22克的螯合劑。在一優(yōu)選實(shí)施例中，螯合劑為IDA，每克活化的瓊脂粉用0.18克的IDA。
然后，可使用金屬離子的鹽溶液處理所獲得瓊脂粉。通常使用最多的金屬離子為第一列的過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+，因其具有較多的空軌道，所形成之配位化合物的穩(wěn)定度較佳。金屬離子與螯合劑間的穩(wěn)定度一般為Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Ca2+或Mg2+。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，金屬離子為Co2+。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，金屬離子為Ni2+。本發(fā)明對所使用的金屬離子的鹽也無特殊限制，例如可使用這些金屬離子的鹽酸鹽、硫酸鹽等等。
本發(fā)明另一方面涉及所述金屬螯合親和載體的制備，包括先后用醋酸緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液抽提瓊脂粉，用活化劑活化抽提的瓊脂粉，用螯合劑交聯(lián)，然后將所得產(chǎn)物與金屬離子螯合。本發(fā)明金屬螯合親和載體中，干瓊脂粉、螯合劑和金屬離子的鹽在載體制備過程中投入物料的質(zhì)量比為0.8-1.2∶0.45-1.62∶0.2-0.36；對于自身呈液態(tài)的活化劑而言，每0.8-1.2克干瓊脂粉活化劑的用量約為1-10毫升，較佳地約2-5毫升。當(dāng)活化劑自身為非液態(tài)時(shí)，可將其溶解在合適的溶劑中，相對于每0.8-1.2克干瓊脂粉的用量約為0.5-10g，較佳地約1-5克。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在1g瓊脂粉加40-60ml緩沖液的比例加入pH4.0、0.04mol/L醋酸緩沖液(醋酸鈉-醋酸緩沖液)攪拌抽提，隔2-5小時(shí)更換一次緩沖液，二次抽提后過濾沉淀物，水洗幾次(較佳2-3次)后放置過夜。第二天，再以同樣比例加入pH 9.0、0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液攪拌4-8小時(shí)并放置過夜。第三天，過濾沉淀物水洗瀝干，再重復(fù)前一天的方法，水洗至中性，瀝干。
親和載體的制備方法也是周知的。通常，取醋酸緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液抽提瀝干的濕瓊脂粉，以約1g濕瓊脂粉約0.5-2毫升氫氧化鈉溶液的比例加入1.2-1.8mol/L氫氧化鈉溶液(含硼氫化鈉)，23-28℃邊攪拌邊加入丙酮和環(huán)氧氯丙烷，繼續(xù)攪拌。以1g濕瓊脂粉計(jì)，每克濕瓊脂粉加入的丙酮約為0.1-0.5毫升，加入的環(huán)氧氯丙烷約為0.1-0.3毫升。反應(yīng)至約2小時(shí)、4小時(shí)和8小時(shí)時(shí)再次分別按上述比例加入環(huán)氧氯丙烷，總共反應(yīng)12小時(shí)后，用去離子水洗凈至中性，瀝干得到EPI-ARG。每100g EPI-ARG中加入190-220ml、0.05-0.2mol/L碳酸鈉溶液(含7-10％亞氨基二乙酸)，用氫氧化鈉調(diào)pH至10.5-11.5，25-28℃攪拌反應(yīng)12-14小時(shí)，用去離子水充分洗凈，瀝干得EPI-ARG-IDA。每20g EPI-ARG-IDA加入60-100ml、30-70mmol/L、pH6.0磷酸鈉緩沖液(含3-8mg/ml氯化鈷、0.5-2mol/L氯化鈉)，25-28℃攪拌反應(yīng)12-14小時(shí)，用去離子水充分洗凈，即得到載體。
在本發(fā)明的制備方法中，對環(huán)境溫度、壓力并無特殊要求，通常在大氣壓、室溫下進(jìn)行。
用于制備本發(fā)明金屬螯合親和載體的瓊脂粉可從市場上購得，如上海雙向西巴斯科技發(fā)展有限公司、中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司等等。
作為瓊脂糖原料的瓊脂粉，具備瓊脂糖的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)構(gòu)均勻，理化性質(zhì)穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)親和力較弱，具有大量的OH官能基，易于改質(zhì)，而且來源豐富，價(jià)格便宜。市場上瓊脂粉的價(jià)格要比瓊脂糖低4倍以上。因此，使用瓊脂粉作為基質(zhì)的本發(fā)明金屬螯合親和載體具有成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)。而且，本發(fā)明所制備的載體不僅可作為純化載體，還可以用作固定化載體，而且其作為親和載體的性能與商品化的載體相比相當(dāng)甚至要優(yōu)異得多。此外，與螯合劑交聯(lián)但未螯合金屬離子的本發(fā)明瓊脂粉基親和載體在長時(shí)間放置后再螯合上金屬離子，其性能與未放置的、直接螯合上金屬離子的本發(fā)明金屬螯合親和載體基本相同。因此，該親和載體可視為所述金屬螯合親和載體的中間體。
以下將以具體實(shí)施例的方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。應(yīng)理解，本發(fā)明的范圍并不限于這些優(yōu)選的具體實(shí)施例，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下可對本發(fā)明作出各種修改和變動(dòng)。
實(shí)施例1載體制備方法稱取30克瓊脂粉，按1g瓊脂粉加50ml緩沖液的比例加入pH4.0、0.04mol/L醋酸緩沖液(醋酸鈉-醋酸緩沖液)攪拌抽提，隔3小時(shí)更換一次緩沖液，二次抽提后過濾沉淀物，水洗3次后放置過夜。第二天，再按照上述比例用pH9.0、0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液抽提，攪拌6小時(shí)并放置過夜。第三天，過濾沉淀物水洗瀝干，再重復(fù)前一天的方法，水洗至中性，瀝干，得到175g濕瓊脂粉，再在其中加入175ml、1.6mol/L氫氧化鈉溶液(含4g硼氫化鈉)，于25℃邊攪拌邊加入57ml丙酮和28.5ml環(huán)氧氯丙烷，繼續(xù)攪拌反應(yīng)至2小時(shí)、4小時(shí)和8小時(shí)再分別加入28.5ml環(huán)氧氯丙烷?？偣卜磻?yīng)12小時(shí)后，用去離子水洗凈至中性，瀝干得到260g EPI-ARG。260g EPI-ARG中加入520ml、0.1mol/L碳酸鈉溶液(含9％亞氨基二乙酸)，用6mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至11，25℃攪拌反應(yīng)12小時(shí)，用去離子水充分洗凈，瀝得EPI-ARG-IDA。取20g EPI-ARG-IDA，加入80ml、50mmol/L、pH6.0磷酸鈉緩沖液(含5mg/ml氯化鈷、1mol/L氯化鈉)，25℃攪拌反應(yīng)12小時(shí)，用去離子水充分洗凈瀝干，即得到載體EPI-30-ARG-IDA-Co2+。
采用與以上方法相同的步驟，但用氯化鎳替換上述氯化鈷，可制得本發(fā)明的另一種載體，即EPI-30-ARG-IDA-Ni2+。
實(shí)施例2具有不同金屬離子密度的親和載體固定化效率比較高金屬密度的親和載體制備方法同實(shí)例1。
低金屬密度的親和載體EPI-5-ARG-IDA的制備方法如下瓊脂粉用緩沖液溶漲，清洗，瀝干得到濕瓊脂粉。量取100ml濕瓊脂粉，加入100ml 0.4N NaOH(含2g NaBH4)，加32ml乙二醇二甲醚，混勻，攪拌中加入16ml環(huán)氧氯丙烷(全需預(yù)冷)，25℃攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，用去離子水洗凈至中性即得EPI-5-ARG100ml，EPI-5-ARG中加入100ml 0.1M Na2CO3(其中含亞胺基二乙酸9％)，用6N NaOH調(diào)至pH11，25℃攪拌反應(yīng)16小時(shí)，用去離子水充分洗凈，瀝得EPI-5-ARG-IDA。取20g EPI-5-ARG-IDA，加入80ml、50mmol/L、pH6.0磷酸鈉緩沖液(含5mg/ml氯化鈷、1mol/L氯化鈉)，25℃攪拌反應(yīng)12小時(shí)，用去離子水充分洗凈瀝干，即得到載體EPI-5-ARG-IDA。

注該實(shí)例中檢測制備親和載體吸附能力所用的酶是氨甲酰水解酶，跟其他實(shí)例中所用的酶不同，只能作為檢測載體吸附能力的參考。
實(shí)施例3GL-7-ACA酰化酶一步純化固定化過程28ml(酶活力單位21.5U/ml)GL-7-ACA?；笩o細(xì)胞抽提液中加入1.0g實(shí)施例1制得的載體，充氮?dú)饷芊猓?8℃，170轉(zhuǎn)每分鐘，振蕩保溫24后，用20mmol/L磷酸鈉緩沖液pH8.0(含0.2mol/L氯化鈉，10％甘油)沖洗，用Bradford比色法檢測流出液，至OD595小于0.06時(shí)，用0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)清洗，真空抽棄水分，測定固定化酶酶活。
本實(shí)施例中GL-7-ACA?；笩o細(xì)胞抽提液參照文獻(xiàn)制備Armise′n P、Mateo C、Corte′s E、Barredo JL、Salto F、Di′ez B、Rode′s L、Garci′a JL、Ferna′ndez-Lafuente R、Guisa′n JM，1999，“多-His標(biāo)記的戊二酰基?；D(zhuǎn)移酶在特制的金屬螯合載體上的選擇性吸附”，J Chromatogr A，84861-70。
GL-7-ACA?；腹潭ɑ该富顪y定按K.Balasingham、D.Warburton、P.Dunnil、D.Lilly〔Boichim.Biophys.Acta，(1972)250-256〕所述的方法進(jìn)行。
按照上述方法，測得GL-7-ACA酰化酶固定化酶酶活為100U/g，固定化收率16.7％。
實(shí)施例4本發(fā)明實(shí)施例1制得的載體的固定化酰化酶酶活與商品化載體的固定化?；该富畋容^將3ml(酶活力單位17.5U/ml)GL-7-ACA酰化酶無細(xì)胞抽提液中分別加入三種不同載體(即EPI-30-ARG-IDA-Co2+、EPI-30-ARG-IDA-Ni2+和TALON金屬親和樹脂)中，載體的量均為0.1g，酶與載體結(jié)合條件相同，具體如下。載體與酶的混合液充氮?dú)饷芊猓?8℃、150轉(zhuǎn)/每分鐘保溫24后，用20mmol/L、pH8.0磷酸鈉緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，10％甘油)沖洗，用Bradford比色法檢測流出液，至OD595小于0.06時(shí)，用0.1mol/L、pH7.0磷酸鈉緩沖液清洗，真空抽棄水分，按實(shí)施例2中所述方法測定固定化酶酶活。
結(jié)果EPI-30-ARG-IDA-Co2+的固定化酶酶活95U/g；EPI-30-ARG-IDA-Ni2+的固定化酶酶活32U/g；Clontech TALON金屬親和樹脂的固定化酶酶活30U/g；結(jié)果顯示，本發(fā)明制備EPI-30-ARG-IDA-Co2+的固定化?；该富畋菴lontech TALON金屬親和樹脂的固定化酶酶活高2-3倍，EPI-30-ARG-IDA-Ni2+的固定化酶酶活與該Clontech TALON金屬親和樹脂的固定化酶酶活相當(dāng)。
實(shí)施例5固定化GL-7-ACA?；傅倪B續(xù)轉(zhuǎn)化將3克GL-7-ACA溶解于50mmol/L、pH7.0磷酸鈉緩沖液中，定容至100ml，用6mol/L的氨水調(diào)pH值為8.0，取5ml該溶液投入0.3g實(shí)施例2制得的GL-7-ACA酰化酶固定化酶，20℃水浴震蕩反應(yīng)，期間調(diào)節(jié)pH至8.0，第1、6、13、21、29、35、41、47和50次反應(yīng)的30分鐘、60分鐘分別取樣，HPLC測定。連續(xù)轉(zhuǎn)化50次，轉(zhuǎn)化效率如下

實(shí)施例6載體制備方法同實(shí)施例1。
青霉素G?；敢徊郊兓潭ɑ^程40ml青霉素G?；复置敢?20U/ml)加入0.4g載體，18℃、160轉(zhuǎn)/每分鐘保溫24后，用20mmol/L磷酸緩沖液pH8.0(含0.2mol/L氯化鈉，10％甘油)沖洗，用Bradford比色法檢測流出液，至OD595小于0.06，用0.1mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)清洗，真空抽棄水分。采用對二甲胺苯甲醛(PDAB)法測定此載體固定化青霉素G?；该富睢?br> 本實(shí)施例中青霉素G?；复置赴匆韵挛墨I(xiàn)所公開的方法制備YongWen、Xunlong Shi、Zhongyi Yuan和Pei Zhou，“從嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌得到的His標(biāo)記的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和表征”，第24-28頁，Protein Expression and Purification，38(2004)24-28。
固定化青霉素G酰化酶酶活參照文(Biochim.Biophys.Acta.，1972，276250-256)所公開的對二甲胺苯甲醛(PDAB)法測定此載體固定化青霉素?；笇η嗝顾谿鹽水解制備6-APA的表觀酶活。
按上述方法測得青霉素G?；腹潭ɑ富顬?00U/g，固定化收率20％。
實(shí)施例7載體制備方法同實(shí)施例1。
D-氨基酸氧化酶純化過程30ml D-氨基酸氧化酶粗酶液加入1g載體，15℃、140轉(zhuǎn)/每分鐘保溫18小時(shí)后裝柱。用50倍柱床體積的漂洗緩沖液(含0.1mol/L Tris-HCl、0.25mol/L氯化鈉、5％甘油、5mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫，用Bradford比色法檢測流出液，至OD595小于0.06，用洗脫緩沖液(含0.1mol/LTris-HCl、0.25mol/L氯化鈉、5％甘油、250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫，收集純酶。
本實(shí)施例中所用的D-氨基酸氧化酶粗酶液制備按文獻(xiàn)Jorge Alonso、Estrella Cortes等，“對從Trigonopsis variabilis得到的D氨基酸氧化酶進(jìn)行遺傳加工，以促進(jìn)其在大腸桿菌中的超表達(dá)以及使用特制金屬螯合載體進(jìn)行的下游加工”，Enzyme and Microbial Technology 25(1999)88-95。
D-氨基酸氧化酶酶活測定方法參考文獻(xiàn)Tzann-Shun Hwang、Hui-Mei Fu、Long-Liu Lin和Wen-Hwei Hsu，“以乳糖為誘導(dǎo)子的Trigonopsis variabilis D氨基酸氧化酶在大腸桿菌中的高水平表達(dá)”，Biotechnology Letters，22；655-658，2000。
根據(jù)上述方法測得載體對于D-氨基酸氧化酶的吸附量100U/g。
純化倍數(shù)約6.4；純化收率31.6％。具體數(shù)據(jù)見下表。
組氨酸標(biāo)記的D-氨基酸氧化酶用本發(fā)明中制備的金屬螯合親和載體的純化

實(shí)施例8按實(shí)施例1所述的步驟，用以下量的物質(zhì)制備下述金屬螯合親和載體。

按實(shí)施例3所述的步驟測試這些載體的固定化收率約為15-25％。
權(quán)利要求
1.一種金屬螯合親和載體，其特征在于，它以瓊脂粉為基質(zhì)，所述瓊脂粉交聯(lián)有螯合劑，所述螯合劑螯合有金屬離子，其中，所述瓊脂粉基質(zhì)、螯合劑和金屬離子的質(zhì)量比為800-1200∶10-45∶1-15。
2.如權(quán)利要求1所述的金屬螯合親和載體，其特征在于，所述螯合劑選自亞氨基二乙酸、氨三乙酸、N，N，N-三(羧甲基)乙二胺或羧甲基化天冬氨酸。
3.如權(quán)利要求2所述的金屬螯合親和載體，其特征在于，所述螯合劑為亞氨基二乙酸。
4.如權(quán)利要求1所述的金屬螯合親和載體，其特征在于，所述金屬離子選自Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Ca2+或Mg2+。
5.一種親和載體，其特征在于，它以瓊脂粉為基質(zhì)，所述瓊脂粉交聯(lián)有螯合劑，其中，所述瓊脂粉基質(zhì)和螯合劑的質(zhì)量比為800-1200∶10-45。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的金屬螯合親和載體的方法，其特征在于，所述方法包括(1)用pH3.0-6.8的酸性緩沖液抽提瓊脂粉，然后用pH8.0-10.0的堿性緩沖液抽提瓊脂粉，瀝干，得到濕瓊脂粉；(2)用能使帶有OH基的固體載體帶有反應(yīng)性官能團(tuán)的活化劑處理步驟(1)得到的濕瓊脂粉；(3)使步驟(2)得到的瓊脂粉與螯合劑交聯(lián)，得到交聯(lián)有螯合劑的瓊脂粉；和(4)使步驟(3)得到的瓊脂粉中的螯合劑與金屬離子螯合，得到所述金屬螯合親和載體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述活化劑是環(huán)氧氯丙烷。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述螯合劑選自亞氨基二乙酸、氨三乙酸、N，N，N-三(羧甲基)乙二胺或羧甲基化天冬氨酸；所述金屬離子選自Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Ca2+或Mg2+。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在載體制備過程中干瓊脂粉、螯合劑和金屬離子的鹽投入物料的質(zhì)量比為0.8-1.2∶0.45-1.62∶0.2-0.36，每克濕瓊脂粉使用0.45-0.85ml的活化劑處理。
10.瓊脂粉在制備金屬螯合親和載體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種金屬螯合親和載體及其制備方法。該金屬螯合親和載體以瓊脂粉為基質(zhì)，交聯(lián)了螯合劑，并螯合有金屬離子。其制備包括分別用酸性緩沖液和堿性緩沖液抽提瓊脂粉、用活化劑活化抽提的瓊脂粉、與螯合劑交聯(lián)、與金屬離子螯合。本發(fā)明的金屬螯合親和載體成本低、制作簡便，而且不僅可作為純化載體，還可以用作固定化載體，其作為親和載體的性能與商品化的載體相比相當(dāng)甚至要優(yōu)異得多。
文檔編號C07K1/00GK1796551SQ20041009930
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者楊晟, 陳軍, 蘇流利, 王筱蘭, 鄭華寶, 林欣, 程天凡, 楊俊杰, 王金剛, 姜衛(wèi)紅, 楊蘊(yùn)劉 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院