專利名稱：兩種基于pBV220載體的新型載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組通用性的新型原核高效pBV220載體的組建，及其本系列載體的實際用途。
純化標簽的運用是近年來發(fā)展起來的新的基因表達策略，它的運用極大地方便了對目的蛋白的純化。目前常用的純化標簽有金葡菌A蛋白(SPA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、多聚組氨酸序列(poly His)及β-半乳糖苷酶等。目前已有多種與純化標簽融合表達的商品化載體出售，如pEZZ18、pGEX等，其中以后者的系列化載體應(yīng)用最為廣泛，有多種不同酶切位點的載體可供選擇，且表達的融合蛋白以可溶性形式存在，有利于親和層析的純化，并且融合的GST可選用因子Xa或凝血酶切割去除。另一種純化標簽基于組氨酸與金屬離子特異結(jié)合性的金屬螯合層析，1975年即發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的組氨酸殘基具有與金屬離子結(jié)合的能力，利用這種原理的層析稱為固定化金屬親和層析。多聚組氨酸與SPA等分子量大的蛋白質(zhì)純化標簽相比更具優(yōu)點，如分子量小，對目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能影響小，配體價廉易得等。近年來隨著基因工程技術(shù)的飛速進展重新引起人們的興趣，并將之應(yīng)用于親和層析。但是，目前的表達攜帶多聚組氨酸的載體不多，并且存在著一些不僅人意的缺點，如需要IPTG誘導(dǎo)，導(dǎo)致大批量生產(chǎn)目的蛋白時代價昂貴。
采用現(xiàn)有的原核高效表達載體已成功地表達了難以數(shù)計的外源基因。實現(xiàn)在大腸桿菌中的高效表達必須滿足一定的條件，如強的可誘導(dǎo)啟動子，合適的SD序列，強的轉(zhuǎn)錄終止子等。盡管目前的大多數(shù)原核高效表達載體基本上能夠滿足這些要求，但仍有不少的外源基因難于在大腸桿菌中獲得高效表達。多種原因與基因的低表達有關(guān)，如細菌內(nèi)蛋白酶對目的蛋白的降解、mRNA不穩(wěn)定等，但最主要的原因在于外源基因5′端序列易于形成較強的二級結(jié)構(gòu)，SD序列及起始密碼子無法與核糖體30S亞基結(jié)合，導(dǎo)致翻譯效率大為降低。據(jù)認為幾種細胞因子的低表達與此有關(guān)。
本發(fā)明的目的是組建一種能夠用金屬螯合層析快速純化目的產(chǎn)物的載體和一種能夠用于篩選高表達克隆的載體，并且這兩種載體都是基于pBV220載體的。pBV220載體是由我們實驗室自行研制的一個原核高效表達載體，近年來在國內(nèi)獲得了廣泛的應(yīng)用(張智清等病毒學(xué)報1988，4(2)97)。
本發(fā)明的實施方案如下第一種載體設(shè)計的基本策略是將人工合成的一對互補寡核苷酸插入到pBV220的EcoRI與BamHI之間，封閉原有的EcoRI酶切位點，加入起始密碼子ATG及6組氨酸編碼序列，后移EcoRI位點，并增加XhoI酶切位點以利于新質(zhì)粒的鑒定。兩段人工合成的寡核苷酸序列分別為(1)5′AAT TAA ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC GAA TTCTCG AG 3′(2)5′GAT CCT CGA GAA TTC GTG ATG ATG GTG ATG ATGCAT TT 3′在密碼子和堿基的選擇上考慮到以下的因素優(yōu)化SD序列周圍序列，選擇適當?shù)拿艽a子以減少mRNA 5′端二級結(jié)構(gòu)形成的可能性，有可能增加目的蛋白的表達量。質(zhì)粒組建過程見附

圖1。
酶切鑒定證實引入了新的XhoI酶切位點，并且重新恢復(fù)了EcoRI和BamHI位點，多克隆位點位于His6編碼區(qū)的后面，大多數(shù)基因可按正確的讀碼框架粘端插入表達融合蛋白，此外，EcoRI、XhoI及BamHI補平后可產(chǎn)生三種不同的讀碼框架，便于不同讀碼框架基因的融合表達。核苷酸序列測定也證實了我們的設(shè)計。我們將這種載體命名為pBV222載體(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，DH5α/pBV222，編號CGMCC NO0253)。
另一種篩選高表達克隆載體如(圖2)，載體骨架仍然采用自行組建的原核高效表達載體pBV220，首先設(shè)計兩對引物，從pSELECT-1載體上擴增四環(huán)素抗性基因，插入pBV220載體的BamHI與PstI酶切位點間，構(gòu)建成可用于篩選高表達克隆的載體，并將之命名為pBV223(1) 5′端Primer序列5′TA GGA TCC ATG AAA TCT AAC AAT GCG C 3′(2) 3′端Primer序列5′TA CTG CAG TCA GGT CGA GGT GGC CCG C 3′擴增的TetR基因大約1.2kb左右，低融點瓊脂糖回收片段，酶切插入載體組建成pBV223載體(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，大腸桿菌DH5α/pBV223，編號CGMCC NO.0253)，圖3為pBV223載體的質(zhì)粒圖譜。pBV223插入簡并基因庫后，在GM-CSF基因的終止密碼子與四環(huán)素抗性基因間只有BamHI的酶切識別序列6核苷酸。
下面的優(yōu)選例對本發(fā)明作詳細敘述，但不意味著限制本發(fā)明的范圍。實施例1互補寡核苷酸的插入將濃度0.5ug/ul的互補Oligo以等摩爾濃度混合后，100℃加熱3分鐘，室溫放置10分鐘以上復(fù)性，適當稀釋后再用T4 DNA多聚核苷酸激酶對Oligo磷酸化，反應(yīng)條件50mMTris.HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，37℃，30分鐘，載體酶切后低融點瓊脂糖法純化，將復(fù)性的互補Oligo與載體以3∶1的比例混合，連接轉(zhuǎn)化，篩選正確的克隆。實施例2表達蛋白的純化30℃過夜搖菌，次日150轉(zhuǎn)入LB中搖菌至OD≈0.5-0.7，升溫至42℃表達4-6小時，收集細菌，加入5-10倍體積的裂解緩沖液中(6M鹽酸胍，20mM PBS，pH8.0)，4℃過夜，17000rpm離心15分鐘，上清直接IMAC層析純化?；蚴占w后超聲破碎，以裂解緩沖液裂解包涵體。實施例3金屬螯合層析IMAC層析柱的準備10ml Chalating Sepharose 4B FF預(yù)處理后裝柱，分別用5倍體積的0.2N NaOH、超純水洗柱，5倍體積的0.2M NiSO4緩慢通過柱子，以5倍以上體積的裂解細菌緩沖液平衡。層析方法1細菌裂解上清液直接上柱，6M鹽酸胍，20mM PBS，pH5.7緩沖液洗脫雜蛋白，6M鹽酸胍，20mMPBS，pH4.8緩沖液洗脫目的蛋白，洗脫的蛋白過夜透析后SDS-PAGE分析方法II包涵體裂解上清液上柱，繼以6M鹽酸胍，20mM PBS，pH8.0-4.0的線性梯度洗脫蛋白。實施例4簡并序列基因庫的建立以pCD/GM-CSF為模板，5′簡并序列Primer加3′端Primer PCR擴增簡并序列GM-CSF基因，因引物內(nèi)含較多的不配對序列，采用較低退火溫度及不易出現(xiàn)錯配的PCR擴增條件10×Buffer 10ul，2.5mM dNTP 8ul；上、下游引物各100 pmol，Taq酶2u。PCR循環(huán)條件為50℃，45sec；72℃，1min；94℃，45sec；共28個循環(huán)。1μg載體與3-5倍量的PCR片段酶切后連接、轉(zhuǎn)化。實施例5四環(huán)素抗性的篩選方法選擇GM-CSF作報告基因，是由于GM-CSF5′端C＋G含量很高，可能導(dǎo)致mRNA形成較強的二級結(jié)構(gòu)，未經(jīng)修飾的GM-CSF基因直接在大腸桿菌表達的表達量很低。采用GM-CSF 5′端簡并序列引物，與3′端引物PCR擴增GM-CSF基因，由此擴增的PCR基因片段5′端的特定位置上密碼子是簡并的，在5′端及3′端Primer內(nèi)分別設(shè)計不同的酶切位點，酶切后克隆入四環(huán)素選擇載體pBV223中。
構(gòu)建了兩種不同的隨機序列基因庫，一種是僅隨機A＋T，據(jù)認為增加外源基因5′端的A＋T含量往往能夠降低mRNA二級結(jié)構(gòu)形成的趨勢，起到提高表達量的作用；第二種隨機序列庫四種堿基全部簡并，這種隨機庫的容量將會更大，從中篩選出高表達克隆的機會更多一些。
(1)AT簡并庫5′端Primer5′ATACT GAATTC TTC ATG GCW CCW GCW CGWTCW CCW AGT CCW AGT ACW CAG CCC 3′W代表A或T，在8個部位簡并A或T，可以看出僅需要256個克隆即可代表所有的隨機序列庫。
(2)四種堿基簡并庫5′端Primer5′TAT GAA TTC ATG GCN CCN GCN CGN TCN CCNAGY CCN AGY ACN CAG CCC 3′N代表四種堿基，Y代表C或T兩種堿基。需要2.6×105個克隆才能代表所有的隨機序列。上述兩引物與GM-CSF 3′端Primer擴增，擴增的PCR片段在5′端是異質(zhì)的，插入pBV223選擇載體中，連接產(chǎn)物SmaI酶切，目的是去除未插入基因的空白載體。首先將AT簡并GM-CSF cDNA插入pBV220載體直接篩選高表達克隆，未發(fā)現(xiàn)高水平的表達克隆，說明簡并程度不夠大。實施例6四環(huán)素抗性生長選擇結(jié)果pBV223與與簡并序列基因庫連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移DH5α菌，首先氨芐青選擇培養(yǎng)，將生長的全部重組細菌收集后，分別在不同濃度的四環(huán)素培養(yǎng)基上二次選擇，42℃培養(yǎng)過夜。隨四環(huán)素濃度的升高，細菌克隆數(shù)逐漸減少。
表1.四環(huán)素抗性生長選擇結(jié)果四環(huán)素濃度(ug/ml)克隆數(shù)5＞100015 20030 7060 111000從60ug/ml四環(huán)素濃度的培養(yǎng)基上挑選部分克隆，誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE分析，各克隆均有表達，表達量大致相同。實施例7質(zhì)粒的提取單菌落接種與含氨芐青的LB中搖菌過夜，離心收集菌體，將細菌沉淀重懸于150ul溶液I中，5分鐘后加溶液II，置于冰上10分鐘；加200ul溶液III，置于冰上10分鐘；10000rpm離心10分鐘，去除沉淀，等體積酚/氯仿抽提。上清加2.5倍體積的乙醇，置于液氮中15分鐘，15000rpm離心15分鐘，抽干沉淀，用20ul TE緩沖液溶解。
本發(fā)明的優(yōu)點如下(1)對采用本載體表達的目的產(chǎn)物容易快速純化，表達產(chǎn)物量大；(2)采用本載體的方法簡便可靠。
權(quán)利要求
1.一種基于原核高效pBV220載體的能夠快速純化產(chǎn)物的載體，其特征在于兩段人工合成的寡核苷酸序列分別為(1) 5′AAT TAA ATG CAT CAT CAC CAT CAT CAC GAATTC TCG AG 3′(2) 5′GAT CCT CGA GAA TTC GTG ATG ATG GTG ATGATG CAT TT 3′(3)密碼子和堿基選擇、質(zhì)粒組建過程見附圖1。
2.一種基于原核高效pBV220載體的篩選高表達克隆的載體，其特征在于(1)在pBV220載體克隆入四環(huán)素抗性基因；(2)建立簡并序列基因庫的方法；(3)目的基因與四環(huán)素基因之間的序列特征。
全文摘要
本發(fā)明包括兩種基于pBV220的原核高效表達載體，采用PRPL啟動子，一個是在表達產(chǎn)物的氨基端攜帶有6組氨酸，便于對表達產(chǎn)物的快速純化；另一個是在pBV220載體上克隆入四環(huán)素抗性基因，通過建立外源基因的5′端隨機序列庫，依靠四環(huán)素抗性篩選出高表達菌株。本發(fā)明對目的產(chǎn)物的快速純化和解決表達產(chǎn)物低的問題有重要的意義。
文檔編號C12N15/63GK1142538SQ9610140
公開日1997年2月12日 申請日期1996年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者李福勝, 張智清, 侯云德, 貢惠宇 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所