一種制備hEGF粗制品的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備hEGF制品的方法。該方法為收集吸附尿蛋白后的吸附劑，將洗脫下來的尿蛋白溶液上已經(jīng)平衡好的金屬螯合層析柱，hEGF結(jié)合到該金屬螯合層析柱上，收集hEGF組分洗脫峰，經(jīng)過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。該方法是一種從男性尿液中制備hEGF粗制品的方法，該粗制品可用于hEGF的后續(xù)純化，純化出的hEGF不含使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的異源蛋白，該方法操作簡便,便于工業(yè)化生產(chǎn)，為規(guī)?；苽淙藖碓吹膆EGF提供了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種制備hEGF粗制品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種尿蛋白的提取方法，尤其涉及一種hEGF粗制品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人尿中含有三百多種蛋白質(zhì)，尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶等都已經(jīng)從人尿中分離出來，并在疾病治療等領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。
[0003]人表皮生長因子(HumanEpidernal Growth Factor,又叫 Urogastrone,尿抑胃素，以下簡稱為hEGF)，于70年代首次從人尿中分離。hEGF是人生長因子中的一種，是由53個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為604?a，等電點(diǎn)為4.6左右的小分子多肽。hEGF含有三對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，因此對(duì)酸、堿、熱等理化因素均較穩(wěn)定。目前，hEGF已被開發(fā)成治療抑制胃酸分泌的注射劑和燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷以及角膜損傷的外用藥物和美容護(hù)膚品。
[0004]中國人尿資源非常豐富，依賴于這一有利條件，尿蛋白產(chǎn)業(yè)從上世紀(jì)七十年代末就已經(jīng)開始發(fā)展起來，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規(guī)?；a(chǎn)方式主要有兩種，方法一:收集尿液，運(yùn)輸?shù)郊庸c(diǎn)，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來源分散，收集成本高，加上城市衛(wèi)生改造，收集已經(jīng)越來越困難；方法二:直接將吸附尿蛋白的樹脂放置在廁所進(jìn)行連續(xù)在線吸附，然后收集吸附后的樹脂運(yùn)回加工點(diǎn)進(jìn)行分離純化。這種方法對(duì)環(huán)境無污染，可以在大中城市進(jìn)行收集，尿源集中，運(yùn)輸成本較低，極大地?cái)U(kuò)大了尿蛋白的收集區(qū)域。
[0005]尿蛋白產(chǎn)品目前主要的生產(chǎn)過程是:首先，在各地經(jīng)過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經(jīng)過下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。
[0006]目前，hEGF來源有兩種。第一，hEGF主要通過基因工程制備，名稱為重組hEGF(Recombind Human Epiderma`l Growth Factor,以下簡稱 rhEGF)。主要的制備途徑有原核表達(dá)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)、酵母表達(dá)等，通過收集發(fā)酵液，進(jìn)行分離純化得到rhEGF。第二，從人尿中分離提取hEGF。目前，主要是從孕婦尿液中經(jīng)過復(fù)雜的純化過程得到hEGF。
[0007]通過基因工程制備的rhEGF雖然易純化、產(chǎn)量高，但由于其中存在微量的異源蛋白，rhEGF容易引起過敏反應(yīng)，因此，目前只作為外用藥物使用。從尿液中制備的hEGF，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)和人體完全相同，不存在異源蛋白，可作為注射劑進(jìn)入臨床。目前國外已經(jīng)有進(jìn)行臨床研究的案例。但是hEGF目前多數(shù)從孕婦尿中分離得到，孕婦尿難于收集且產(chǎn)量低，限制了 hEGF的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種從男性尿液中制備hEGF粗制品的方法，該粗制品可用于hEGF的后續(xù)純化，純化出的hEGF不含使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的異源蛋白，該方法操作簡便便于工業(yè)化生產(chǎn)出hEGF粗制品，為從自然來源中提取hEGF提供基礎(chǔ)。[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明制備hEGF粗制品的方法的技術(shù)方案是:
一種制備hEGF粗制品的方法，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經(jīng)過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。
[0010]所述的制備hEGF粗制品的方法，包括如下步驟:
1)將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；
2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進(jìn)行清洗、解吸處理；
3)超濾濃縮；
4)超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)，上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗；
5)用洗脫溶液洗脫，收集含有hEGF組分的洗脫峰；
6)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2— 10小時(shí)后，收集沉淀，得到hEGF粗制品。
[0011]所述的金屬螯合層析柱螯合的金屬離子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。優(yōu)選 Cu2+。
[0012]金屬螯合層析柱平衡液為0.01 - 0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2 — 2.0M,ρΗ6.0-8.0。優(yōu)選0.02Μ磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5Μ。
[0013]所述的金屬螯合層析柱洗脫溶液為0.05-0.2Μ磷酸鹽緩沖液，NH4Cl濃度為
.0.5-1.0Μ, ρΗ6.0-8.0。優(yōu)選 0.1M 磷酸鹽緩沖液，0.8Μ 的 NH4Cl, ρΗ7.5。
[0014]步驟4中超濾濃縮液調(diào)節(jié)ρΗ6 - 8，電導(dǎo)0.5 — 10mS/cm。優(yōu)選pH8.0,電導(dǎo)2.2mS/cm。
[0015]在步驟4和步驟5之間，增加一個(gè)沖洗步驟，使用pH3 - 6，NaCl濃度≤0.2M來沖洗金屬螯合層析柱，所述的沖洗液緩沖介質(zhì)為0.01 — 0.2M磷酸鹽或醋酸鹽。優(yōu)選PH5.0的0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為0.1M。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):首次實(shí)現(xiàn)了從男性尿液中富集及分離hEGF，并使得從人來源中提取hEGF的方法可以工業(yè)化實(shí)施；首次引入了金屬螯合層析工藝，有效分離hEGF，大大降低了 hEGF后續(xù)純化的難度，純化出的hEGF不含使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的異源蛋白；采用高效離子交換吸附劑，放置尿斗或尿池中，進(jìn)行尿蛋白的在線富集，避免了尿液的大規(guī)模運(yùn)輸，降低了成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為制備hEGF粗制品的方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0019]一種制備hEGF粗制品的方法，包括如下步驟:
1)將離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；
2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進(jìn)行清洗、解吸處理；
3)超濾濃縮；
4)超濾濃縮液調(diào)節(jié)pH6— 8,電導(dǎo)0.5 — 10mS/cm,優(yōu)選ρΗ8.0,電導(dǎo)2.2mS/cm,上已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗，平衡液為0.01 - 0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2 — 2.0M, pH6.0-8.0，優(yōu)選0.02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5M，螯合金屬離子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+ 中的任意一種，優(yōu)選 Cu2+ ；
5)用洗脫液洗脫，收集洗脫峰。所述的洗脫溶液為0.05-0.2M磷酸鹽緩沖液，NH4Cl濃度為 0.5-1.0M, ρΗ6.0-8.0，優(yōu)選 0.1M 磷酸鹽緩沖液，pH7.5,0.8MNH4C1 ；
6)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2- 10小時(shí)后，收集沉淀，得到hEGF粗制品。
[0020]在步驟4和步驟5之間，增加一個(gè)沖洗步驟，使用pH3 - 6，NaCl濃度≤0.2M來沖洗金屬螯合層析柱，所述的沖洗液緩沖介質(zhì)為0.01 - 0.2M磷酸鹽或醋酸鹽，優(yōu)選PH5.0的0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為0.1M。
[0021]實(shí)例一
1.大孔型離子交換樹脂100公斤作為吸附劑，經(jīng)過再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過樹脂，24小時(shí)后，收集吸附尿蛋白的樹脂，將吸附后樹脂用飲用水沖洗干凈、裝柱；用IM的NaCl進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。
[0022]2.用截留分子量IOK的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH7.0,電導(dǎo)0.5mS/cm，上已平衡好的金屬離子為Cu2+的金屬螯合層析柱(Chelating sepharose FF);再用平衡液(0.2M磷酸鹽緩沖，0.2MNaCl, pH7.0)沖洗金屬螯合層析柱；用0.1M的醋酸鹽緩沖液(pH5.0)沖洗金屬螯合層析柱；用0.05M磷酸鹽緩沖液，1.0M的NH4Cl，pH8.0，洗脫層析柱，收集洗脫峰(E 液)。
[0023]3.將收集的E液，加入硫酸銨粉末至飽和，邊加邊攪拌，靜置10小時(shí)，E液加入硅藻土 20g離心收集和吹干沉淀，得到hEGF粗制品32g。
[0024]通過檢測hEGF的收率約93%，活性集中在hEGF粗制品中。hEGF含量如表1所示: 表 I ___
【權(quán)利要求】
1.一種制備hEGF粗制品的方法，其特征在于:收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經(jīng)過硫Ife按沉淀，制備hEGF粗制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經(jīng)尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； 收集已吸附尿蛋白的樹脂，進(jìn)行清洗、解吸處理； 超濾濃縮； 超濾濃縮液調(diào)節(jié)PH和電導(dǎo)，上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗； 用洗脫溶液洗脫，收集含有hEGF組分的洗脫峰； 在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 - 10小時(shí)后，收集沉淀，得 到hEGF粗制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于:所述的金屬螯合層析柱螯合的金屬離子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于，金屬螯合層析柱平衡液為0.01 — 0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2 — 2.0M, ρΗ6.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于:所述的金屬螯合層析柱洗脫溶液為0.05-0.2M磷酸鹽緩沖液，NH4C1濃度為0.5-1.0M, pH6.0-8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于，步驟4中超濾濃縮液調(diào)節(jié) pH6 — 8，電導(dǎo) 0.5 — 10mS/cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于，在步驟4和步驟5之間，增加一個(gè)沖洗步驟，使用PH3 - 6，NaCl濃度< 0.2M來沖洗金屬螯合層析柱，所述的沖洗液緩沖介質(zhì)為0.01 — 0.2M磷酸鹽或醋酸鹽。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103694334SQ201310715778
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】苗丕渠, 蘇古方, 吳蓉蓉, 侯曉彥 申請(qǐng)人:揚(yáng)州艾迪生物科技有限公司