專(zhuān)利名稱(chēng)：：親和層析基質(zhì)及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及層析領(lǐng)域。在一些特定實(shí)施方式中本發(fā)明提供了涉及親和層析的基質(zhì)及方法。
背景技術(shù)：
：層析方法一般用于從混合物中分離和/或純化目標(biāo)分子如蛋白質(zhì)、核酸和多糖。親和層析具體包括使混合物通過(guò)連有特異性配體(即特異性結(jié)合配偶體)的基質(zhì)，以使目標(biāo)分子結(jié)合于其上。通過(guò)接觸配體，目標(biāo)分子結(jié)合到基質(zhì)上并因此從混合物中保留下來(lái)。相比于其他類(lèi)型的層析，親和層析提供了一些優(yōu)點(diǎn)。它提供了一種高特異性、快速、經(jīng)濟(jì)和高產(chǎn)率的純化方法。在一個(gè)應(yīng)用中親和層析可被用于純化如單克隆抗體的蛋白質(zhì)。比如IgG亞型抗體可通過(guò)結(jié)合有A蛋白或G蛋白的基質(zhì)而得到親和純化(BoyleandReis，1987，5fofec/zwo/ogy5:697;Herm肌sonetal.,1992,/附7wo6i',/ze^4^"zXvrec/jm々wes，AcademicPress;美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2006/0134805號(hào))。連接蛋白質(zhì)配體的方法過(guò)去已被描述，如將A蛋白和G蛋白連接到固體支持物例如層析介質(zhì)上，參見(jiàn)，例如Hermansonetal.1992,/附mo6z'fe^丄/gam/rec/wz々M",AcademicPress;美國(guó)專(zhuān)禾'J5,874,165號(hào)；3,932,557號(hào)；4，772，635號(hào)；4,210,723號(hào)；5,250,6123號(hào)；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP1352957Al:WO2004/074471。典型地，這種介質(zhì)是用反應(yīng)官能團(tuán)("活化基團(tuán)")如環(huán)氧化物(表氯醇)、氰(溴化氰CNBr)，N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)、醛或活化的羧酸(如N-羥基丁二酰亞胺(NHS)酯、羰基二咪唑(CDI)活化酯)來(lái)活化的。這些活化基團(tuán)能直接連接到基礎(chǔ)基質(zhì)，如CNBr，或者它們也可以是"接頭"或間隔分子的一部分，典型地是碳、氧和氮原子的直鏈，如在接頭丁二醇二縮水甘油醚(一種常用的環(huán)氧化物偶聯(lián)劑)中發(fā)現(xiàn)的碳和氧的十元鏈。在偶聯(lián)條件下再將活化介質(zhì)與蛋白質(zhì)配體相平衡。一旦偶聯(lián)反應(yīng)完成，徹底洗滌介質(zhì)。對(duì)于A蛋白，通常每毫升介質(zhì)可負(fù)載4-6毫克蛋白質(zhì)(配體密度)，形成IgG的最大靜態(tài)容量(Qs)為40g/L。蛋白質(zhì)配體密度決定了靜態(tài)容量。靜態(tài)容量給出了能在層析分離中應(yīng)用的蛋白質(zhì)容量的上限。一般動(dòng)態(tài)容量或者說(shuō)負(fù)載容量(Qd)在一定的介質(zhì)中與靜態(tài)容量相關(guān)。一種適合于連接到瓊脂糖支持物上的重組形式的A蛋白也已被描述。重組形式的蛋白質(zhì)被工程化以具有半胱氨酸末端，參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利6,399,750號(hào)；<7￡HeaMcare尸racfwcfZiferafwre々rSep/wmse尸a^F/ow,M^w/ec/fl/sAfaZ^/ec/%/m。運(yùn)用該種重組A蛋白，IgG的靜態(tài)容量己能達(dá)到55-70g/L。然而，應(yīng)用該種重組A蛋白的一個(gè)局限是其必須經(jīng)基因工程化以包含選擇性偶聯(lián)官能團(tuán)，由此導(dǎo)致的耗時(shí)和昂貴。另一種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的策略是"接頭輔助偶聯(lián)"。接頭輔助偶聯(lián)與以下要詳述的配體輔助偶聯(lián)相反，它的特點(diǎn)是依賴(lài)于一個(gè)包含了配體(即待純化耙分子的特異結(jié)合配偶體)和有助于將配體偶聯(lián)到固體支持物上的適當(dāng)連接官能團(tuán)的單分子。這種技術(shù)包括將官能團(tuán)(如帶電的胺)工程化設(shè)計(jì)為能偶聯(lián)目標(biāo)蛋白質(zhì)配體的接頭或間隔區(qū)。這些體系中的接頭也含有將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到接頭上的活化基團(tuán)。接頭首先連接到固體支持物，再與蛋白質(zhì)接觸。因此單分子接頭同時(shí)起著將蛋白質(zhì)共價(jià)連接到基質(zhì)和非共價(jià)地與蛋白質(zhì)相互作用的功能。這提供了在偶聯(lián)反應(yīng)前/中實(shí)體的預(yù)先連接。這一技術(shù)己用于將聚糖偶聯(lián)到膜表面以進(jìn)行膜印跡凝膠電泳(美國(guó)專(zhuān)禾'J5,543,054號(hào)；Charkoudianetal.，1995，爿""/少//<^/28:1055)。另一個(gè)接頭輔助偶聯(lián)的實(shí)例是市售產(chǎn)品Affi-Gel15(BioRad,Hercules:CA)。Affi-Gel15是一種瓊脂糖支持物，經(jīng)NHS活化的羧酸作為其接頭臂的一部分含有帶正電的官能團(tuán)。此帶正電的官能團(tuán)是一個(gè)仲胺。該胺在pH7.4時(shí)被質(zhì)子化并允許偶聯(lián)等電點(diǎn)(pi)小于6的蛋白質(zhì)。Affigel基質(zhì)和其他由接頭輔助偶聯(lián)產(chǎn)生的此類(lèi)配體有局限性，由于連接基團(tuán)(帶正電)是蛋白質(zhì)偶聯(lián)接頭的一部分，使得兩種官能團(tuán)的比率固定在l:l。另一個(gè)在美國(guó)專(zhuān)利5,260,373號(hào)中描述的帶電接頭臂是將A蛋白偶聯(lián)到瓊脂糖上:包含了精氨酸的短接頭臂用于輔助蛋白質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖支持物上。精氨酸接頭用NHS活化并攜帶有正電荷。然而結(jié)果顯示，相比于無(wú)接頭輔助的偶聯(lián)，IgG結(jié)合容量?jī)H有少量改進(jìn)。另外上面所述的1:1比率問(wèn)題仍然存在。最近的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/928，731號(hào)描述了A蛋白通過(guò)接頭結(jié)合到固體支持物上。在發(fā)酵和組織培養(yǎng)上，應(yīng)用同比放大的方法已能同時(shí)提高體積和靶分子濃度，如單克隆抗體的生產(chǎn)。產(chǎn)品濃度超過(guò)lg/L也不足為奇。這些產(chǎn)品在投入市場(chǎng)前需要經(jīng)過(guò)純化。因此，需要一種具有提高的結(jié)合容量以提供良好的產(chǎn)品產(chǎn)率，并且經(jīng)濟(jì)而易于制造的層析基質(zhì)。本發(fā)明以下描述的多種實(shí)施方式滿足了這些以及其他需求。
發(fā)明內(nèi)容在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制造親和層析基質(zhì)的方法，其中所述基質(zhì)包含固體支持物和至少一種蛋白質(zhì)配體，并且其中所述方法包括a)使締合基團(tuán)接觸所述固體支持物以使締合基團(tuán)與固體支持物反應(yīng)；b)活化所述固體支持物(如添加活化基團(tuán))；c)使所述蛋白質(zhì)配體接觸所述固體支持物以使該蛋白質(zhì)配體結(jié)合到固體支持物上并與a)中的締合基團(tuán)相互作用。在一些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種親和層析基質(zhì)，其包含a)固體支持物；b)結(jié)合到所述固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，在固體支持物上所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體相互作用。在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明給出了一種從混合物中純化靶分子的方法，其包括1)在第一組條件下使所述混合物與親和層析基質(zhì)接觸，以使靶分子結(jié)合到基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，其中親和層析基質(zhì)包含a)固體支持物;b)結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和C)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，在固體支持物上所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體相互作用；2)改變l)所述的條件以使靶分子不再結(jié)合在基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，以純化目標(biāo)物質(zhì)。任選地，可在步驟1和2之間使用諸如磷酸鹽緩沖液、水、以及下文提及的補(bǔ)充緩沖液等恰當(dāng)?shù)南礈煸噭┻M(jìn)行一個(gè)或數(shù)個(gè)洗滌步驟。在步驟1之前基質(zhì)也可先用合適的緩沖液進(jìn)行平衡。其他實(shí)施方式中，本發(fā)明給出了一種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法，其包括a)使締合基團(tuán)接觸固體支持物以使締合基團(tuán)與固體支持物進(jìn)行反應(yīng)；b)活化固體支持物；C)使蛋白質(zhì)配體接觸固體支持物，以使蛋白質(zhì)配體結(jié)合到固體支持物上并與a)中的締合基團(tuán)相作用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種將A蛋白偶聯(lián)到瓊脂糖支持物上的方法，其包括a)使帶電物質(zhì)接觸瓊脂糖支持物以使帶電物質(zhì)與瓊脂糖支持物共價(jià)反應(yīng)；b)用活化基團(tuán)活化瓊脂糖支持物；c)使A蛋白接觸瓊脂糖支持物，以使A蛋白共價(jià)結(jié)合到固體支持物上，并非共價(jià)地與a)中的帶電物質(zhì)相互作用。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種親和層析基質(zhì)，其包含a)瓊脂糖支持物；b)共價(jià)結(jié)合到瓊脂糖支持物上的A蛋白；c)共價(jià)地結(jié)合到固體支持物上并非共價(jià)地與A蛋白相互作用的帶電物質(zhì)。在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種瓊脂糖珠，其包含至少10g/L蛋白質(zhì)配體，這些配體結(jié)合在瓊脂糖珠表面上。蛋白質(zhì)配體可作為親和配體如A蛋白、G蛋白，也可作為靶分子如目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)配體可不通過(guò)任何居于其間的接頭分子，而是通過(guò)活化的官能團(tuán)以如共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合到固體支持物上。蛋白質(zhì)配體也可非共價(jià)地同一個(gè)或數(shù)個(gè)締合基團(tuán)相互作用，這些締合基團(tuán)通過(guò)不同的共價(jià)鍵共價(jià)結(jié)合到固體支持物上，其間或有或無(wú)接頭分子的作用。因此在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了非接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種非接頭輔助的，能偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體。在一些實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體單獨(dú)地通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到固體支持物上。在其它實(shí)施方式中蛋白質(zhì)配體通過(guò)被活化的官能團(tuán)，在居于其間的接頭分子作用下，以如共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合到固體支持物上。蛋白質(zhì)配體也可非共價(jià)地與一個(gè)或數(shù)個(gè)締合基團(tuán)相互作用，所述締合基團(tuán)不通過(guò)接頭分子便共價(jià)結(jié)合到固體支持物上。因此在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了非接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)，以及有接頭輔助的偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)，以及偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體，其中締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體的某部分群體是通過(guò)接頭偶聯(lián)到固體支持物上的。蛋白質(zhì)配體的某群體可通過(guò)接頭偶聯(lián)到固體支持物上，或者締合基團(tuán)的某群體可通過(guò)接頭偶聯(lián)到固體支持物上。在一些實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體均具有通過(guò)不同的接頭偶聯(lián)到固體支持物上的群體。在其他一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種接頭輔助的締合基團(tuán)，通過(guò)例如共價(jià)鍵的方式偶聯(lián)到固體支持物上。這種締合基團(tuán)也可在無(wú)接頭分子的情況下，與共價(jià)偶聯(lián)到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體以例如非共價(jià)的形式相互作用。本發(fā)明的其余目的和優(yōu)點(diǎn)一部分將通過(guò)之后的描述闡明，有些通過(guò)描述就能明確地獲知，或者可通過(guò)實(shí)踐本發(fā)明而認(rèn)識(shí)到。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)尤其將通過(guò)之后的權(quán)利要求書(shū)所指出的要素和結(jié)合而被認(rèn)識(shí)和達(dá)到。應(yīng)當(dāng)理解，之前的一般性介紹和接下來(lái)詳細(xì)的描述僅是示例性的和解釋性的，并不是對(duì)請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明的限制。圖1示出含A蛋白的不同親和層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)及靜態(tài)容量。圖2比較了使用本發(fā)明的方法，當(dāng)用和不用締合基團(tuán)和配體輔助A蛋白進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，不同親和層析介質(zhì)的結(jié)合容量。圖3示出使用和未使用中間鹽緩沖液洗漆時(shí)，測(cè)定的洗脫池中CHO細(xì)胞蛋白(CHOP)的水平，以及結(jié)合到介質(zhì)上的宿主細(xì)胞蛋白的水平，所述介質(zhì)上含有不同量的締合基團(tuán)。IgG的回收率都類(lèi)似，~90%-95%。圖4a示出通過(guò)進(jìn)行中間鹽洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了A蛋白的介質(zhì)時(shí)，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖4b示出通過(guò)進(jìn)行中間鹽洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了A蛋白的介質(zhì)時(shí)，洗脫池中DNA的水平的降低。圖5示出用不同pH和鹽濃度的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了A蛋白的介質(zhì)時(shí)，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖6a示出用含有丙氨酸或甜菜堿的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了A蛋白的介質(zhì)時(shí)，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低。圖6b示出用含有不同氨基酸的緩沖液進(jìn)行中間洗滌以配體輔助偶聯(lián)化學(xué)方法偶聯(lián)了A蛋白的介質(zhì)時(shí)，洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白水平的降低具體實(shí)施例方式將配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)(如配體輔助偶聯(lián))到諸如層析介質(zhì)的預(yù)成型的固體支持物上的方法，其中所述活化劑和締合基團(tuán)通過(guò)單獨(dú)的和不同的反應(yīng)連接到固體支持物上，并且其中所述活化劑和締合基團(tuán)在共價(jià)連接到固體支持物上的反應(yīng)之前并未連接，所述活化劑共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)配體，而所述締合基團(tuán)非共價(jià)地與蛋白質(zhì)配體的作用加速了蛋白質(zhì)配體和活化劑間共價(jià)鍵的形成。所述的方法可包括a)使締合基團(tuán)與固體支持物反應(yīng)；b)活化固體支持物；c)將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。一些實(shí)施方式中締合基團(tuán)與蛋白質(zhì)配體均可共價(jià)連接到固體支持物上，但不能互相共價(jià)結(jié)合，除非通過(guò)固體支持物。締合基團(tuán)和活化劑都可共價(jià)結(jié)合到固體支持物的外表面。蛋白質(zhì)配體可共價(jià)連接到已結(jié)合在固體支持物上的活化劑。締合基團(tuán)可通過(guò)與蛋白質(zhì)配體間比如非共價(jià)作用來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)配體與活化劑之間共價(jià)鍵的形成，活化劑是共價(jià)結(jié)合在固體支持物的外表面的。也考慮蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)都可結(jié)合到固體支持物上可及的內(nèi)表面和孔。應(yīng)當(dāng)理解步驟a)和b)可按任何順序進(jìn)行。因此在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了可用于將締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的兩步反應(yīng)。獨(dú)立進(jìn)行步驟a)-c)有一些優(yōu)點(diǎn)，包括選擇締合基團(tuán)、蛋白質(zhì)配體和固體支持物的靈活性，并可通過(guò)控制締合基團(tuán)相對(duì)于蛋白質(zhì)配體的比例來(lái)優(yōu)化所需親和層析反應(yīng)的條件。這不同于前面所述將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法，例如接頭輔助偶聯(lián)，后者必將導(dǎo)致蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)的比例達(dá)到l:l。在過(guò)去描述的方法中，活化劑與締合基團(tuán)在被結(jié)合到固體支持物前會(huì)互相共價(jià)連接，或者直接摻入固體支持物中作為形成所述固體支持物的聚合反應(yīng)的一部分。這些方法缺乏靈活性，也不能對(duì)配體密度進(jìn)行優(yōu)化。其他一些方法如隨機(jī)偶聯(lián)或多點(diǎn)連接取決于蛋白質(zhì)配體中的任何胺基。多點(diǎn)連接缺乏靈活性，不能控制蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)包括應(yīng)用兩種或多種不同的締合基團(tuán)和/或兩種或多種不同的蛋白質(zhì)配體。而另一些優(yōu)點(diǎn)包括嚴(yán)密控制配體密度以?xún)?yōu)化動(dòng)態(tài)容量、靜態(tài)容量或其二者。其它優(yōu)點(diǎn)還在于限制了基質(zhì)上非特異性結(jié)合的不需要的雜質(zhì)的量。非特異性結(jié)合是過(guò)去已有的方法的特殊問(wèn)題，它依賴(lài)于用結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)配體的物質(zhì)如包含胺基的物質(zhì)涂敷固體支持物。本發(fā)明提供的配體濃度控制避免了這些以前描述的方法中所發(fā)現(xiàn)的高非特異性結(jié)合水平。因此通過(guò)不聯(lián)合締合基團(tuán)和活化劑結(jié)合到固體支持物上的反應(yīng)，本發(fā)明能更好地控制活化劑和締合基團(tuán)的濃度比例，進(jìn)而更好地控制和修正用于分離靶蛋白質(zhì)的層析條件，如pH、緩沖液鹽濃度。因此本發(fā)明的一些實(shí)施方式預(yù)期了各種蛋白質(zhì)配體和締合基團(tuán)的比例，包括蛋白質(zhì)配體濃度超過(guò)締合基團(tuán)時(shí)的比例，以及締合基團(tuán)濃度超過(guò)蛋白質(zhì)配體濃度時(shí)的比例。本發(fā)明的不同實(shí)施方式還預(yù)期使用了多種不同的締合基團(tuán)。本發(fā)明的不同實(shí)施方式預(yù)期了多種不同的能用于活化固體支持物的活化劑。同樣，預(yù)期多種不同的蛋白質(zhì)配體也可用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式中。在本文中，蛋白質(zhì)配體是指結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)，它適合于特異性地結(jié)合目標(biāo)靶分子。蛋白質(zhì)可以包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的片斷或亞基、多肽、或蛋白質(zhì)的肽段。在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了將高濃度蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法。相比于以前描述的一些方法，這轉(zhuǎn)而可提高靶分子的結(jié)合容量，如靜態(tài)容量(Qs)和動(dòng)態(tài)容量(Qd)。例如使用以前的方法，典型地每ml固體支持物僅能負(fù)載4-6mg的n-A蛋白(即來(lái)源于葡萄球菌A的A蛋白)。而采用本發(fā)明的方法，每ml固體支持物能負(fù)載7-100mg的A蛋白。在一些實(shí)施方式中固體支持物上能負(fù)載超過(guò)10mg/ml的A蛋白。在其它實(shí)施方式中固體支持物上至少能裝載8mg/ml。本發(fā)明的一些實(shí)施方式雖未重組改變A蛋白，如添加一半胱氨酸殘基，也未依賴(lài)于接頭輔助偶聯(lián)，但也都提高了靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括使至少一種能與固體支持物反應(yīng)的締合基團(tuán)與固體支持物接觸。固體支持物可以是己經(jīng)形成的，如聚合支持物，它可與至少一種締合基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。另一些實(shí)施方式中，固體支持物沒(méi)有預(yù)形成，如非聚合的，從而將締合基團(tuán)添加到化學(xué)組分中，所述化學(xué)組分隨后與摻入的締合基團(tuán)反應(yīng)形成固體支持物。固體支持物和締合基團(tuán)間的反應(yīng)可導(dǎo)致其間共價(jià)鍵的形成。于是締合基團(tuán)可共價(jià)結(jié)合到固體支持物的外表面，也可結(jié)合到可及的內(nèi)表面，如孔。也考慮了涉及締合基團(tuán)的非共價(jià)相互作用，如離子相互作用、疏水相互作用、范德華力和氫鍵。例如締合基團(tuán)可非共價(jià)地與帶電分子(如共價(jià)連接于固體支持物的聚合物)相互作用。締合基團(tuán)也可與蛋白質(zhì)配體相作用。因此固體支持物被活化后，蛋白質(zhì)配體能共價(jià)地結(jié)合到固體支持物上，并且非共價(jià)地與締合基團(tuán)相互作用。這樣非共價(jià)相互作用促進(jìn)蛋白質(zhì)配體共價(jià)結(jié)合到固體支持物上。在一些實(shí)施方式中締合基團(tuán)可直接與固體支持物反應(yīng)而不需要任何居間的或連接的分子。另一些實(shí)施方式中締合基團(tuán)可作為一種混合物提供，第一群締合基團(tuán)與固體支持物直接反應(yīng)，第二群締合基團(tuán)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)接頭分子間接地與固體支持物反應(yīng)。另外接頭分子的活化作用可引起締合基團(tuán)的改變，至少將一些締合基團(tuán)摻入接頭分子中，也允許一些締合基團(tuán)直接與固體支持物反應(yīng)，比如通過(guò)共價(jià)結(jié)合。由于某些化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)，設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)配體非共價(jià)相互作用的締合基團(tuán)可能會(huì)與活化基團(tuán)反應(yīng)，因此最終是通過(guò)包含締合基團(tuán)和活化基團(tuán)的接頭臂，而將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上。然而這些活化反應(yīng)改變了固體支持物和締合基團(tuán)，造成蛋白質(zhì)偶聯(lián)位點(diǎn)的分散。這些位點(diǎn)中的一群包含了通過(guò)締合基團(tuán)而連接到固體支持物上的活化基團(tuán)(比如經(jīng)CNBr活化的腫胺)。第二群締合基團(tuán)可能存在于包含了直接連接到底部基質(zhì)的活化基團(tuán)和未改性的締合基團(tuán)的偶聯(lián)位點(diǎn)上(比如具有未改性的仲胺的經(jīng)CNBr活化的底部基質(zhì))。這是"接頭輔助偶聯(lián)"(僅可能存在一群偶聯(lián)位點(diǎn))和"配體輔助偶聯(lián)"(存在至少兩個(gè)可變的群的偶聯(lián)位點(diǎn))差異的一個(gè)例子。由于締合基團(tuán)與活化基團(tuán)在類(lèi)型、量和反應(yīng)性上可獨(dú)立地變化，可應(yīng)用更寬范圍的偶聯(lián)條件和結(jié)構(gòu)?？紤]了所有締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體間的非共價(jià)相互作用。與蛋白質(zhì)配體的非共價(jià)相互作用可包括例如離子相互作用、疏水相互作用、范德華力或氫鍵介導(dǎo)的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，締合基團(tuán)和蛋白質(zhì)配體之間的相互作用是離子相互作用。比如帶正電的締合基團(tuán)可結(jié)合到固體支持物上。然后，固體支持物即以化學(xué)官能性活化，這將促進(jìn)蛋白質(zhì)配體化學(xué)結(jié)合到固體支持物上，如通過(guò)共價(jià)結(jié)合。包含蛋白質(zhì)配體溶液的pH值可被調(diào)節(jié)，以使蛋白質(zhì)攜帶同固體支持物相連接的締合基團(tuán)的電荷所互補(bǔ)的電荷，比如至少一個(gè)負(fù)電荷或一個(gè)凈負(fù)電荷。與固體支持物結(jié)合的帶正電締合基團(tuán)與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)之間的相互作用將促進(jìn)蛋白質(zhì)配體鍵合到已被活化的固體支持物上，同以前的方法相比還將提高結(jié)合容量。這些帶電物質(zhì)可以是離子，或帶凈電荷的分子。選擇合適的緩沖條件以將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是完全在能力范圍內(nèi)的。適合的緩沖液包括任何不含胺的緩沖液，如碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液。緩沖液的鹽濃度取決于所用的締合基團(tuán)。例如鹽濃度可在5nM-100mM之間。當(dāng)利用帶電物質(zhì)時(shí)，鹽濃度至少為5nM但低于0.1M，至少為5nM但低于0.01M，至少為5nM但低于0.001M。在一些實(shí)施方式中鹽濃度可為O.OIM。當(dāng)利用疏水性種類(lèi)時(shí)需要較高的鹽濃度。此時(shí)鹽濃度可大于O.OOIM，大于0.01M，大于0.1M。實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為O'C到99-C的范圍。在一些實(shí)施方式中實(shí)施本方法的溫度低于6(TC，低于40。C，低于20'C，低于l(TC。在一些實(shí)施方式中實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為4'C。在其他一些實(shí)施方式中實(shí)施本發(fā)明方法的溫度為20'C。締合基團(tuán)本發(fā)明中所用適合的締合基團(tuán)包括如離子性物質(zhì)的帶電物質(zhì)，以及如疏水性物質(zhì)的不帶電物質(zhì)。所述締合基團(tuán)可改性固體支持物，如直接共價(jià)結(jié)合固體支持物。離子性物質(zhì)的恰當(dāng)實(shí)例可包括季胺、叔胺、仲胺、伯胺、磺酸、碳酸、或其任意組合。疏水性物質(zhì)的恰當(dāng)實(shí)例可包括苯基、丁基、丙基、或其任意組合。同樣考慮可使用混合模式的物質(zhì)，如帶電物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的混合物。締合基團(tuán)也可與蛋白質(zhì)配體相互作用。因此締合基團(tuán)與蛋白質(zhì)配體的相互作用可以包括混合物的相互作用，例如離子性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)。締合基團(tuán)可通過(guò)使固體支持物上的官能團(tuán)和締合基團(tuán)上的官能團(tuán)的反應(yīng)而被共價(jià)偶聯(lián)到固體支持物。合適的官能團(tuán)包括，但不僅限于胺、羥基、巰基、羧基、亞胺、醛、酮、烯、炔、偶氮、腈、環(huán)氧化物、氰和被活化的羧酸基團(tuán)。例如瓊脂糖珠包含的羥基可與如縮水甘油三甲基氯化銨這樣的帶正電締合基團(tuán)的環(huán)氧化物官能團(tuán)反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到只要使用至少一種雙功能締合基團(tuán)，多種締合基團(tuán)就可偶聯(lián)到固體支持物。因此締合基團(tuán)可先后被偶聯(lián)到固體支持物上，或者可單獨(dú)地直接偶聯(lián)到固體支持物上。蛋白質(zhì)配體和耙分子任何蛋白質(zhì)配體可應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)踐中，只要它是目標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的配偶體。蛋白質(zhì)配體的實(shí)例可包括A蛋白、G蛋白、抗體的Fc受體、激素或生長(zhǎng)因子的受體。蛋白質(zhì)配體可以是免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或它們的片段。片段可包括保留了結(jié)合靶抗原表位、和/或結(jié)合Fc受體、和域A蛋白和/或G蛋白的能力的免疫球蛋白片段。蛋白質(zhì)配體可以是Fc分子或其片段，F(xiàn)ab或其類(lèi)似物，一種酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，酪氨酸激酶如MAP、Src、Lck，一種底物如谷胱甘肽。蛋白質(zhì)配體可以是一個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)簽，如帶有一個(gè)或多個(gè)組氨酸的多肽。蛋白質(zhì)配體可以是融合蛋白如Embrel。蛋白質(zhì)配體可以是結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸，如轉(zhuǎn)錄因子、逆轉(zhuǎn)錄酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、螺旋酶。在本發(fā)明的方法中假如靶分子是一個(gè)受體，其配體如生長(zhǎng)因子可作為蛋白質(zhì)配體。當(dāng)靶分子為一免疫球蛋白如IgG或包含至少一個(gè)Fc區(qū)段部分的IgG片段，蛋白質(zhì)配體就可為A蛋白、G蛋白或其功能性片段。其功能性片段包括保留了結(jié)合Fc區(qū)域、或IgG的Fc片段的能力的A蛋白片段或G蛋白片段。蛋白質(zhì)配體可以是一個(gè)天然存在的分子或工程化的分子。在一些實(shí)施方式中需要基因改造天然存在的蛋白質(zhì)配體以促進(jìn)其結(jié)合到固體支持物上或?qū)⑵涠ㄏ虻焦腆w支持物上或兼具這二者功能。因此，依賴(lài)所用的締合基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將帶電基團(tuán)、或疏水性基團(tuán)、或此二者工程化到蛋白質(zhì)配體中。這些改變可在蛋白質(zhì)配體的任何位置進(jìn)行力當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)配體是A蛋白時(shí)，如果使用n-A蛋白(天然存在)，本發(fā)明提供了大于50mg/ml的靜態(tài)結(jié)合容量Qs，如果使用r-A蛋白(重組A蛋白)則提供了大于65mg/ml的靜態(tài)結(jié)合容量Qs。重組A蛋白可包括除末端半胱氨酸外的修飾。當(dāng)固體支持物在溶液中提供時(shí)，如珠，合適的蛋白質(zhì)配體濃度是0.05-700拜ol/ml固體支持物、0.1-100拜ol/ml固體支持物。靶分子可包括特異地結(jié)合到所選蛋白質(zhì)配體上的任何分子。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)配體是A蛋白或G蛋白時(shí)，靶分子可包括IgG亞類(lèi)的免疫球蛋白。靶分子的具體實(shí)例包括單克隆抗體。同樣考慮保留了結(jié)合所選蛋白質(zhì)配體的能力的免疫球蛋白片段。靶分子也可以是融合蛋白，包括Fc融合蛋白，如Embrel。固體支持物和活化劑任何多孔材料均可用作固體支持物。作為實(shí)例而非限制，多孔材料可釆用膜、珠、凝膠、盒、柱、芯片、滑片板或單塊。多孔材料可包括有機(jī)或無(wú)機(jī)分子或其組合，也可包括一種或數(shù)種適合于反應(yīng)(如與締合基團(tuán)、活化劑或兩者形成共價(jià)鍵)進(jìn)行的官能團(tuán)(如羥基)。多孔材料可包括親水性化合物、疏水性化合物、疏油性化合物、親油性化合物或其任意組合。多孔材料可包括聚合物或共聚物。合適的多孔材料的實(shí)例包括但不僅限于聚醚砜、聚酰胺如瓊脂糖、纖維素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚)、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(噁唑酮)、聚苯乙烯、陶瓷、尼龍和金屬。固體支持物可用恰當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團(tuán)來(lái)活化。合適的化學(xué)官能團(tuán)包括氰如溴化氰，醛，環(huán)氧化物，經(jīng)活化的羧酸如N-羥基琥珀酰亞胺酯，或其任意組合物。或者，當(dāng)締合基團(tuán)是伯胺、仲胺或叔胺時(shí)，締合基團(tuán)能被表氯醇或雙功能環(huán)氧化物活化。接頭在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了可通過(guò)居間接頭偶聯(lián)到固體支持物上的締合基團(tuán)和域蛋白質(zhì)配體。此接頭包含至少一個(gè)偶聯(lián)到連接部分的官能團(tuán)。連接部分可包括任何能被偶聯(lián)到官能團(tuán)的分子。因此連接部分可以包括任何烷基、鏈烯基或炔基。連接部分可包含有l(wèi)-30個(gè)碳原子的碳鏈。在一些實(shí)施方式中接頭可包含超過(guò)30個(gè)碳原子。連接部分可包含至少一個(gè)雜原子如氮、氧和硫。連接部分可包含支鏈、直鏈或環(huán)狀鏈。連接部分可被兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)所取代。一個(gè)特定實(shí)施方式中接頭可包含下列通過(guò)羥基連接到瓊脂糖的基團(tuán)-CH2CH2N(CH2CH3)2CH2CH(0H)CH2O(CH2)40CH2CH(O)CH2o純化靶分子的方法在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了從混合物中純化靶分子的方法。靶分子可以是任何分子，其帶有特異性結(jié)合配偶體，該特異性結(jié)合配偶體可偶聯(lián)到固體支持物上。靶分子的實(shí)例包括蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白)。免疫球蛋白可以是多克隆抗體或單克隆抗體或其功能片段。功能片段可包括任何包含可變區(qū)的免疫球蛋白的片段，其仍然特異性結(jié)合其抗原，同時(shí)保持了特異性結(jié)合偶聯(lián)于固體支持物的蛋白質(zhì)配體的能力。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括a)在第一組條件下使包含靶分子的混合物接觸本發(fā)明(本文所描述)的固體支持物，以使靶分子特異性結(jié)合蛋白質(zhì)配體，偶聯(lián)于固體支持物；b)改變條件以使靶分子不再結(jié)合在親和配體上。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括改變步驟a)和b)之間的pH值。在一些實(shí)施方式中進(jìn)行步驟b)的pH比步驟a)的pH更呈酸性。因此步驟a)可在中性pH(例如pH6-8)進(jìn)行，而步驟b)可在酸性pH(如pH1-6)進(jìn)行。另一些實(shí)施方式中本方法包括改變緩沖液的鹽濃度。因此在一個(gè)實(shí)施方式中步驟a)可使用高鹽濃度，如大于0.1M，和/或步驟b)可使用低鹽濃度，如小于O.IM。另一些實(shí)施方式中步驟a)可使用低鹽濃度，如小于0.1M，和/或步驟b)可使用高鹽濃度。在其它實(shí)施方式中步驟a)和步驟b)之間的緩沖液pH值和/或鹽濃度均可改變。1.層析基質(zhì)的中伺洗漆在一些實(shí)施方式中本發(fā)明也提供了洗滌層析基質(zhì)以除去非特異結(jié)合的雜質(zhì)，由此得到更純凈的終產(chǎn)物的方法。基質(zhì)可包括本領(lǐng)域任何公知的層析基質(zhì)。例如層析基質(zhì)可以是一種親和基質(zhì)。親和基質(zhì)可以是本文所描述的任何親和基質(zhì)，包括通過(guò)配體輔助偶聯(lián)制作的親和基質(zhì)。該方法可包括在靶分子結(jié)合到層析基質(zhì)上以后進(jìn)行一次中間洗滌。一般地，非特異性吸附的雜質(zhì)可包括除靶分子或產(chǎn)物之外的任何組分。非特異性結(jié)合的雜質(zhì)的例子可包括蛋白質(zhì)、DNA、脂類(lèi)、內(nèi)毒素、病毒顆粒，及其他小分子包括酚紅、蛋白胨、泊洛沙姆、氨基酸。中間洗滌試劑可包括平衡緩沖液，或與進(jìn)料液(即含有未純化樣品的溶液)有相似pH和鹽濃度的緩沖液，進(jìn)一步包含a)提高濃度的鹽(如氯化鈉、氯化銨、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸銨等)，或b)不同的pH值(更低或更高)，或c)a)和b)的組合，或d)添加劑，如表面活性劑(如吐溫)、氨基酸及其衍生物、或有機(jī)溶質(zhì)(如乙二醇)。與PBS這樣的洗滌溶液相比，該中間洗滌可降低某些種類(lèi)的非特異性結(jié)合2-5倍。在一些實(shí)施方式中，與眾所周知的PBS之類(lèi)的洗滌溶液相比，可降低某些種類(lèi)的非特異性結(jié)合超過(guò)5倍。在一些實(shí)施方式中本發(fā)明提供了洗滌親和基質(zhì)以除去非特異性結(jié)合種類(lèi)的方法，包括使具有弱堿性pH(如7.3-7.5)以及添加鹽濃度為0-1M的緩沖液接觸親和基質(zhì)。因此，緩沖液可以是PBS或任何其他合適的緩沖液，并進(jìn)一步添加額外的鹽。在一些實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是0.15M到1M。在其它實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是0.25M到1M。在另一些實(shí)施方式中鹽濃度的范圍是0.25M到0.5M。在一些實(shí)施方式中鹽濃度大于0.0001M但低于0駕。其他實(shí)施方式中的緩沖液，如PBS或任何其他合適的緩沖液，具有酸性pH(如6.5)且添加鹽濃度小于1M、大于0.0001M(如0.4M)。在其它實(shí)施方式的緩沖液具有弱堿性pH值(如7.3-7.5)。一些實(shí)施方式中洗滌緩沖液可包含一種或多種帶電氨基酸。洗滌緩沖液可包含氨基酸或垸基化氨基酸，包括甜菜堿、L-丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、和賴(lài)氨酸。氨基酸或烷基化氨基酸的濃度可為0.25M到0.5M。一些實(shí)施方式中氨基酸或烷基化氨基酸濃度小于0.5M但大于O.OO(HM。其它實(shí)施方式中氨基酸或烷基化氨基酸濃度的范圍是從0.0001M到1M。中間洗滌緩沖液所用的合適的氨基酸包括但不僅限于甘氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及氨基酸衍生物如n-甲基甘氨酸和三甲基p-丙氨酸。在一些實(shí)施方式中，中間沖滌緩沖液包括添加氨基酸或氨基酸衍生物的緩沖液，所述緩沖液具有弱酸性pH值，如pH范圍在6.0-6.99。實(shí)施例實(shí)施例1:使用季銨類(lèi)配體、溴化氰和n-A蛋白(14/mg/ml)進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去已被描述的方法(PorathandFornstedt,1970，/.C7zra附afogra//^，51:479)將瓊脂糖珠(Sepharose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。根據(jù)下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)如陽(yáng)離子反應(yīng)在lOOmL的75%重量的縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC)和3.3g的50。/。重量的氫氧化鈉中加入100mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(>100rpm)進(jìn)行過(guò)夜。再將這些珠過(guò)濾并用三個(gè)200mL體積的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。珠(10mL)經(jīng)過(guò)濾后置于20mLlM的Na2CO3中平衡。再將樣品與第二個(gè)每毫升乙腈含0.5gCNBr的罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。一旦溶液冷卻，將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振蕩儀上OlOOrpm)。2分鐘后再將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并再次放置在置于冰上的振蕩儀上(>100rpm)。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3進(jìn)行洗滌并過(guò)濾。再將過(guò)濾的珠餅(10mL)加入到含有140mgn-A蛋白(14mg/mL)的10mL的0.012MNaHC03。珠在室溫振蕩過(guò)夜。接著用0.2MNaHC03洗滌并過(guò)濾。將珠餅加入20mL0.2MNaHC03中的0.5M氨基乙醇中。30分鐘后用0.2MNaHC03，含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉(pH4.5)，最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量的測(cè)定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例2:使用季銨類(lèi)配體、溴化氰和n-A蛋白U7.8mg/ml)進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去已被描述的方法(PorathandFomstedt,1970,/C/zra附atogra//7乂51:479)將瓊脂糖珠(Sepharose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。依下述方法使瓊脂糖顆粒與帶正電的締合基團(tuán)如陽(yáng)離子反應(yīng)在L00mL的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨)(GTMAC)和3.3g的50。/。重量氫氧化鈉中加入100mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩OlOOrpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后過(guò)濾珠，并用三個(gè)200mL體積的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica,MA)進(jìn)行洗滌。珠(10mL)經(jīng)過(guò)濾后置于20rnL1M的Na2C03中平衡。再將樣品與每毫升乙腈含0.5gCNBr的第二個(gè)罐一起在冰上進(jìn)行^^卻。溶液冷卻后，將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀Ol00rpm)上。2分鐘后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(M00rpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHCO3進(jìn)行洗滌并過(guò)濾。再將過(guò)濾的珠餅(10mL)加入到含有285mgn-A蛋白(17.8mg/mL)的16mL0.012MNaHC03中。珠在室溫振蕩過(guò)夜。接著用0.2MNaHCO3洗漆并過(guò)濾。將珠餅加入20mL0.2MNaHC03中的0.5M氨基乙醇中。30分鐘后用0.2MNaHCO3、含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉(pH4.5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量的測(cè)定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例3:使用季銨類(lèi)配體、溴化氰和r-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去已被描述的方法(PorathandFomstedt,1970，J.C/zramatogra;/^，51:479)將瓊脂糖珠(Sepharose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。依下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)如陽(yáng)離子反應(yīng)在100mL的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC)和3.3g的50%重量氫氧化鈉中加入lOOmL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩OlOOrpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)200mL體積的Milli-Q水進(jìn)行洗滌。珠(10mL)經(jīng)過(guò)濾后置于20mLlM的Na2CO3中平衡。再將樣品與每毫升乙腈含t).5gCNBr的第二個(gè)罐一起在冰上進(jìn)行冷卻々一且溶液冷卻，立即將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀OlOOrpm)上。2分鐘后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(>100rpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHC(V冼滌并過(guò)濾。再將過(guò)濾的珠餅(10mL)加入到含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的10mL0.012MNaHC03溶液中。珠在室溫振蕩過(guò)夜。接著用0.2MNaHC03洗滌珠并過(guò)濾。將珠餅加入20mL0.2MNaHCO3中的0.5M氨基乙醇中。30分鐘后用0.2MNaHC03、含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉溶液(pH4.5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量的測(cè)定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例4:不使用季胺類(lèi)配體，用溴化氰和n-A蛋白(17.8mg/ml)進(jìn)行無(wú)配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去已被描述的方、法(PorathandFornstedt，1970，C/zrawatogra/;^,51:479)將瓊脂糖珠(Sepharose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)200mL體積的Milli-Q水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。珠(10mL)經(jīng)過(guò)濾后置于20mLlM的Na2CO3中平衡。將樣品與每毫升乙腈含0.5gCNBr的第二個(gè)罐一起在冰上進(jìn)行冷卻。溶液冷卻后，將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀Ol00rpm)上。2分鐘后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(〉100rpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHC03洗滌并過(guò)濾。將過(guò)濾的珠餅(10mL)加入到含有285mgn-A蛋白(17.8mg/mL)的16mL0.012MNaHC03溶液中。珠在室溫振蕩過(guò)夜。接著用0.2MNaHC03洗滌并過(guò)濾。將珠餅加入20mL0.2MNaHC03中的0.5M氨基乙醇。30分鐘后用0.2MNaHC03、含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉溶液(pH4.5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其動(dòng)態(tài)和靜態(tài)容量的測(cè)定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例5:不使用季胺類(lèi)配體，用溴化氰和1-A蛋白進(jìn)行無(wú)配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去己被描述的方法(PorathandFornstedt，1970，丄Cferw必ogn;/^，51:479)將瓊脂糖珠(S印harose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)200mL體積的Milli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。珠(10mL)經(jīng)過(guò)濾后置于20rnL1M的Na2C03中平衡。再將樣品與每毫升乙腈含0.5gCNBr的第二個(gè)罐一起置于冰上進(jìn)行冷卻。溶液冷卻后，將1.5mL的CNBr乙腈溶液加入珠并將珠放置在置于冰上的振蕩儀OlOOipm)上。2分鐘后再向珠加入1.5mL的CNBr乙腈溶液并將珠放置在置于冰上的振蕩儀(>100rpm)上。允許珠反應(yīng)4分鐘，然后用200mL冰冷水及200mL冰冷的0.012M的NaHC03進(jìn)行洗滌并過(guò)濾。再將過(guò)濾的珠餅(10mL)加入到lOmL含有250mg市售r-A蛋白(25mg/mL)的0.012MNaHC03。珠在室溫振蕩過(guò)夜。接著用0.2MNaHCO3洗滌珠并過(guò)濾。將珠餅加入20mL0.2MNaHC03中的0.5M氨基乙醇。30分鐘后用0.2MNaHC03、含0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉溶液(pH4.5)、最后是磷酸鹽緩沖液洗滌珠。其動(dòng)態(tài)和靜態(tài)容量的測(cè)定依實(shí)施例12的描述進(jìn)行。實(shí)施例6:使用季銨類(lèi)配體、丁二醇二縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)按過(guò)去已被描述的方法(PorathandFomstedt,1970,/C72國(guó)"togr—y,51:479)將瓊脂糖珠(Sepharose4B)(GEHealthcare,PiscatawayNJ)用表氯醇進(jìn)行交聯(lián)。按照下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽(yáng)離子)反應(yīng)在40g的75%重量縮水甘油基三甲基氯化銨)(GTMAC)、10mLMilli-Q水和1.67g的50。/。重量氫氧化鈉中加入50mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩OlOOrpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)lOOmL體積的Milli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)進(jìn)行洗滌。珠樣品用下述方法進(jìn)行滴定以測(cè)定季銨配體密度。將珠(50mL，濾餅)添加到含有15mL4.6MNaOH的罐中。漿化混合物，然后加入19.5mL的丁二醇二縮水甘油醚(BUDGE)。該混合物在35。C振蕩2小時(shí)。再將顆粒用750mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗滌，用250mL的10mMNaHCO3平衡。BUDGE活化歩驟后立即將10mL珠濾餅加入lOmL含30g/L濃度n-A蛋白的10mMNaHC03的溶液中。使珠在雜交儀中37'C旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。2小時(shí)后用30mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗滌珠。再將珠濾餅(10mL)加入一盛有由lmL巰基乙醇、9mL具有0.2MNaHC03和0.5MNaCl的緩沖液組成的lOmL溶液的罐中。漿化混合物并在室溫旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。再將珠用30mL的下列緩沖液洗滌0.1MTris緩沖液(pH8)，添加了0.15MNaCl的0.1MTris緩沖液(pH8)，50mM醋酸(pH4.5)，含0.002%疊氮化鈉的PBS(pH7.4)。用前述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測(cè)定(Pierce,Rockford,IL)以n-A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的A蛋白配體密度見(jiàn)下表1。實(shí)施例7:使用季銨類(lèi)配體、丁二醇二縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)實(shí)施例7中的珠與實(shí)施例6中的一樣，差別在于加入締合基團(tuán)。根據(jù)下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽(yáng)離子)反應(yīng)在25g的75%重量GTMAC，25rnLMilli-Q⑧水，和1.67g的50%重量氫氧化鈉中加入50mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩OlOOrpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)lOOmL體積的Milli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)進(jìn)行洗滌。之后所有的步驟(BUDGE活化和A蛋白偶聯(lián))都與實(shí)施例6一樣。然后，用前述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測(cè)定(Pierce，Rockford，IL)以n-A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的A蛋白配體密度見(jiàn)下表1。實(shí)施例8:使用季銨類(lèi)配體、丁二醇二縮水甘油醚和n-A蛋白進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)實(shí)施例8中的珠與實(shí)施例6中的一樣，差別在于加入締合基團(tuán)。按照下述方法使瓊脂糖珠與帶正電的締合基團(tuán)(如陽(yáng)離子)反應(yīng)在10g的75%重量GTMAC，40mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)，和1.67g的50%重量氫氧化鈉中加入50mL珠。在室溫，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上劇烈振蕩(>100rpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后過(guò)濾珠并用三個(gè)100mL體積的Mim-Q⑧水(Millipore公司，Billerica，MA)進(jìn)行洗滌。之后所有的步驟(BUDGE活化和A蛋白偶聯(lián))都與實(shí)施例6—樣。甩前述方法表征珠的靜態(tài)容量，并用標(biāo)準(zhǔn)BCA測(cè)定(Pierce,Rockford,IL)以n-A蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的A蛋白配體密度見(jiàn)下表l。表l.實(shí)施例6-8中的介質(zhì)特性總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例9:使用季銨類(lèi)配體、表氯醇和ii-A蛋白在CPG上進(jìn)行配體輔助偶聯(lián)可控孔度玻璃(CPG)(Millipore公司，Billerica，MA)LCA-CPG1000A用于使用締合基團(tuán)輔助將A蛋白偶聯(lián)到CPG上。將LCA-CPG(10mL)加入到10mL含50%重量的縮水甘油基三甲基氯化銨。反應(yīng)在3(TC輕微振蕩(<100rpm)進(jìn)行過(guò)夜。然后用50mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗漆CPG并過(guò)濾形成一干餅。再將CPG加入到35mL含表氯醇(6%重量)的水溶液中，在30。C輕微振蕩2分鐘。然后用lOOmLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗滌珠，然后過(guò)濾形成一干餅。將珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL濃度的n-A蛋白的0.01MNaHC03中。偶聯(lián)反應(yīng)在35'C輕微振蕩進(jìn)行過(guò)夜。再用lOOmLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗滌珠并過(guò)濾形成一干餅。然后將珠加入到lOmLO.lMTris緩沖液中的1M氨基乙醇，pH8。反應(yīng)l小時(shí)后用各50mL的0.2MNaHCO3，添加了0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉(pH4.5)洗滌珠，最后用磷酸鹽緩沖液洗滌珠。按前述方法測(cè)定靜態(tài)容量，結(jié)果示于表2。締合基團(tuán)濃度用元素分析法測(cè)定。實(shí)施例10:不使用季銨類(lèi)配體和表氯醇，在CPG上進(jìn)行n-A蛋白的配體偶聯(lián)可控孔度玻璃(CPG)(Millipore公司，Billerica，MA)ProSep5-CHO1000A用于不使用締合基團(tuán)輔助將A蛋白偶聯(lián)到CPG上。將5-CHO珠(5mL)加入到5mL含15mg/mL濃度n-A蛋白的0.01MNaHC03中。偶聯(lián)反應(yīng)在35'C輕微振蕩進(jìn)行過(guò)夜。然后用100mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica，MA)洗滌珠并過(guò)濾形成一干餅。然后將珠加入到lOmL0.1MTris緩沖液中的1M氨基乙醇，pH8。反應(yīng)1小時(shí)后用各50mL的0.2MNaHC03，添加了0.5MNaCl的0.1M醋酸鈉(pH4.5)洗滌珠，最后用磷酸鹽緩沖液洗滌珠。按前述方法測(cè)定靜態(tài)容量，結(jié)果示于表2。締合基團(tuán)濃度用元素分析法測(cè)定。表2.實(shí)施例9和10的介質(zhì)特性的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例ll:締合基團(tuán)濃度的測(cè)定季銨類(lèi)配體的滴定季銨類(lèi)配體密度用酸堿滴定法測(cè)定。將lmL珠的樣品置于一次性塑料柱中，然后用Milli-Q⑧水(lOmLXMillipore公司，Billerica,MA)和1MNaOH(10mL)平衡。再用4mLMilli-Q⑧水(Millipore公司，Billerica,MA)洗滌珠并過(guò)濾形成一濕珠餅。將珠加入到盛有80rnL的1MNaCl溶液的帶有攪拌棒的小玻璃燒杯中。將pH計(jì)放在燒杯中。樣品用0.01MHC1滴定。用強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂珠(Q-SepharoseFF)作為對(duì)照。實(shí)施例6-8的數(shù)值示于下表1。結(jié)果驚人地顯示相比于市售產(chǎn)品和各種試驗(yàn)條件，較低密度的締合基團(tuán)和相應(yīng)較低密度的配體提供了更優(yōu)的靜態(tài)容量。實(shí)施例12:IgG靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量的測(cè)定前述實(shí)施例和市售基準(zhǔn)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量依據(jù)下述方法測(cè)定1.在PBS緩沖液中制取每個(gè)樣品的珠懸浮液(20%珠)。2.攪拌珠懸浮液，將500mL樣品移入3支15mL塑料錐形管中。3.向每支管加入PBS中的蛋白質(zhì)溶液(IgG)(lmg/ml)(14mL)。4.蓋上管并置于定軌振蕩儀中緩慢振蕩(<100rpm)。5.24小時(shí)后使珠沉淀，結(jié)合后從溶液中讀出UV值。6.將UV吸光度轉(zhuǎn)換成IgG濃度(￡~1.38)，而質(zhì)量衡算用于測(cè)定飽和將A蛋白介質(zhì)填充入Omnifit柱(直徑0.66cm，床高7cm)，測(cè)定多克隆人免疫球蛋白(IgG)的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。柱用PBS緩沖液(pH7.4)平衡，使用同樣的緩沖液將蛋白質(zhì)(lg/L)上柱。以10%穿透時(shí)的容量來(lái)比較不同介質(zhì)。圖1示出兩個(gè)市售基準(zhǔn)Mabselect⑧和MabselectXtra(GEHealthcare,Piscataway，NJ)及實(shí)施例1-3的產(chǎn)品中IgG的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)容量的比較。實(shí)施例2-5的結(jié)果示于圖2。表示出實(shí)施例6-8的靜態(tài)容量。表2示出實(shí)施例9-10的靜態(tài)含量。實(shí)施例13:經(jīng)過(guò)或未經(jīng)中間洗滌時(shí)，不同締合配體密度下宿主細(xì)胞蛋白(HCP)在IgG洗脫池中的水平澄清單克隆抗體(mAb)、無(wú)血清CHO培養(yǎng)基(AngelBiotechnology,Northumberland,UK)用作模式HCP原料。經(jīng)過(guò)10個(gè)柱體積(CV)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4-7.5，電導(dǎo)率15-17mS/cm)平衡后，將20CV的原料負(fù)載于填充了實(shí)施例6-8所述A蛋白介質(zhì)的柱(內(nèi)徑0.66cm，x長(zhǎng)7cm)上。然后用10CV的PBS洗滌珠，或者用8CV的添加了1MNaCl的PBS(pH7.4-7.5)、再用2CV未添加的PBS(pH7.4-7.5)洗滌。接著用10CV的0.1M檸檬酸鈉(pH3)緩沖液洗脫。從0.5至5.5CV收集峰部分。再將柱用5CV的6M鹽酸胍清洗，用PBS緩沖液平衡。這個(gè)結(jié)合一洗脫試驗(yàn)是在BioCad⑧預(yù)備液相色譜系統(tǒng)(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,CA)上進(jìn)行的。洗脫池在280nm紫外吸收處測(cè)定IgG濃度及產(chǎn)率。CHOP濃度用市售酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(CygnusTechnologiesInc.,Southport,NC)分析。圖3示出的結(jié)果顯示用合適的中間洗滌緩沖液易于將伴有較高蛋白質(zhì)配體濃度的非特異性結(jié)合進(jìn)行抵消。與表1示出的結(jié)果相結(jié)合，數(shù)據(jù)顯示出本方法的靈活性以及本文所描述的基質(zhì)能使本領(lǐng)域技術(shù)人員在減小不良副效應(yīng)(例如非特異性結(jié)合)的同時(shí)最大化所需容量，這就提供了一種適合于特定性應(yīng)用的親和基質(zhì)。實(shí)施例14:使用鹽緩沖液中間洗滌降低了IgG洗脫池中宿主細(xì)胞蛋白(HCP)和DNA水平澄清非IgG表達(dá)、無(wú)血清CHO培養(yǎng)基(LampireBiologicalLaboratories,Piperville,PA)用作模式HCP原料，其摻入(spike)lmg/ml多克隆人丙種球蛋白(WgG)(SeraCareLifeSciences,Inc.,Oceanside，CA)。經(jīng)過(guò)10個(gè)柱體積(CV)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4-7.5，電導(dǎo)率15-17mS/cm)平衡后，將20CV原料負(fù)載于填充了實(shí)施例2所述A蛋白介質(zhì)的柱(內(nèi)徑0.66cm，x長(zhǎng)7cm)上。然后用8CV的添加了0-lMNaCl的PBS(pH7.4-7.5)洗滌，再用2CV的未添加的PBS(pH7.4-7.5)洗滌。接著用10CV的0.1M檸檬酸鈉(pH3)緩沖液洗脫。從0.5至5.5CV收集峰部分。再將柱用5CV的6M鹽酸胍清洗，用PBS緩沖液再平衡。結(jié)合一洗脫試驗(yàn)是在BioCad⑧預(yù)備液相色譜系統(tǒng)(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,CA)上進(jìn)行的。洗脫池在280nm紫外吸收處測(cè)定IgG濃度及產(chǎn)率。CHOP濃度用市售酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(CygnusTechnologiesInc.,Southport,NC)分析。圖4a示出用不同的鹽洗滌緩沖液測(cè)定的洗脫池中CHOP的水平。自O(shè)隱IM逐漸增加的NaCl濃度使CHOP濃度從450ng/ml到80ng/ml下降超過(guò)5倍。IgG的回收率全部類(lèi)似，~90-95%。圖4b示出使用添加了1MNaCl的PBS緩沖液測(cè)定的洗脫池中DNA的水平。相比于用普通PBS洗滌溶液配體輔助偶聯(lián)的A蛋白樣品，鹽洗降低了非特異性吸附的DNA水平達(dá)20-60%。實(shí)施例15:使用較低pH和較高鹽濃度的中間洗滌降低了IgG洗脫池中HCP水平試驗(yàn)在與實(shí)施例14所述相似條件下進(jìn)行，不同之處在于使用了包含8CV的PBS(pH6.5，添加了0.4MNaCl)的中間洗滌緩沖液。圖5示出用不同pH和鹽濃度的中間洗滌緩沖液測(cè)定的洗脫池中CHOP的水平。相比于用未添加的PBS(pH7.4-7.5)緩沖液洗滌步驟所得到的結(jié)果，含0.4MNaCl的pH6.5PBS緩沖液將CHOP水平降低到約1/8。實(shí)施例16:使用含氨基酸或垸基化氨基酸的緩沖液的中間洗滌降低了IgG洗脫池中HCP水平試驗(yàn)在與實(shí)施例14所述相似條件下進(jìn)行，不同之處在于使用了中間洗滌緩沖液，其包含8CV的PBS(pH7.4-7.5，電導(dǎo)率15-17mS/cm)和0.25-0.5M甜菜堿，L-丙氨酸，甘氨酸，或賴(lài)氨酸，或0.125-0.25M纈氨酸，或0.15M谷氨酸。圖6a示出用含甜菜堿和L-丙氨酸的中間洗滌緩沖液測(cè)定的洗脫池中CHOP的水平。0.25M甜菜堿降低了CHOP的濃度。比較而言，丙氨酸比甜菜堿更有效。兩個(gè)濃度的丙氨酸都使結(jié)合的CHOP減少了超過(guò)2倍。圖6b示出用含不同濃度纈氨酸、甘氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸的中間洗滌測(cè)定的洗脫池中CHOP的水平。相比于PBS洗滌，使用氨基酸洗滌使得洗脫池內(nèi)CHOP的水平減少了約3-10倍，其中賴(lài)氨酸和谷氨酸看起來(lái)是最有效的。本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的表示組分?jǐn)?shù)量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字在所有情況下應(yīng)當(dāng)理解為由術(shù)語(yǔ)"大約"所修飾。因此，除非作了相反的表示，說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的數(shù)值參數(shù)是近似值，可依據(jù)本發(fā)明希望得到的目的性質(zhì)進(jìn)行變化。至少為了不將與本發(fā)明教導(dǎo)等價(jià)的應(yīng)用限定在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)，每個(gè)數(shù)值參數(shù)應(yīng)依據(jù)有效數(shù)字的數(shù)值和普通四舍五入法進(jìn)行解釋。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的，任何不違背本發(fā)明精神和范圍的修改和改變都可以被做出。本文中所述的具體實(shí)施方式僅通過(guò)舉例的方式而提供，并不意味做出了任何限制。說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅被作為示例，本發(fā)明的真正范圍和精神實(shí)質(zhì)體現(xiàn)在以下權(quán)利要求書(shū)中。權(quán)利要求1.一種將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法，該方法包括a)使締合基團(tuán)接觸所述固體支持物，以使所述締合基團(tuán)與所述固體支持物相互作用；b)活化所述固體支持物；c)單獨(dú)地使所述蛋白質(zhì)配體接觸固體支持物，以使所述蛋白質(zhì)配體結(jié)合到固體支持物上，并與a)所述的締合基團(tuán)非共價(jià)地相互作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的固體支持物是珠。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的珠是瓊脂糖珠。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的締合基團(tuán)是帶電物質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的帶電物質(zhì)帶有正電荷。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的帶電物質(zhì)帶有負(fù)電荷。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的締合基團(tuán)是疏水性的。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的固體支持物通過(guò)接觸至少一種下列物質(zhì)而被活化a)溴化氰；b)醛；c)環(huán)氧化物；d)被活化的羧酸。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)配體也能夠結(jié)合免疫球蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)配體選自A蛋白和G蛋白。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)配體共價(jià)地結(jié)合到所述的固體支持物上。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的締合基團(tuán)與固體支持物間的相互作用是共價(jià)鍵。13.—種親和層析基質(zhì)，其包含a)固體支持物；b)結(jié)合到固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，其中所述的締合基團(tuán)非共價(jià)地與所述的蛋白質(zhì)配體相互作用。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的固體支持物是珠。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的珠是瓊脂糖珠。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的締合基團(tuán)是帶電物質(zhì)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的帶電物質(zhì)帶有正電荷。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的帶電物質(zhì)帶有負(fù)電荷。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的締合基團(tuán)是疏水性的。20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的親和層析基質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)配體選自A蛋白和G蛋白。21.—種從混合物中純化靶分子的方法，該方法包括-1)使混合物在第一組條件下與親和層析基質(zhì)接觸，以使所述靶分子結(jié)合到所述基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，其中所述的親和層析基質(zhì)包含a)固體支持物；b)結(jié)合到所述固體支持物上的蛋白質(zhì)配體；和c)單獨(dú)地結(jié)合到固體支持物上的締合基團(tuán)，其中所述締合基團(tuán)與所述蛋白質(zhì)配體相互作用；以及2)改變l)的條件，使所述靶分子不再結(jié)合到所述基質(zhì)的蛋白質(zhì)配體上，以純化目標(biāo)物質(zhì)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的靶分子是免疫球蛋白。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的靶分子是融合蛋白。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的融合蛋白是Fc融合蛋白。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其進(jìn)一步包括中間洗滌步驟以除去雜質(zhì)，該步驟包括在步驟l)之后、步驟2)之前，使洗滌緩沖液接觸瓊脂糖支持物。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的雜質(zhì)包括小分子、蛋白質(zhì)、核酸或其任意組合。28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液包含酸性pH值、鹽或兩者。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的pH值范圍為5-6.99。30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液的pH值范圍為5.0-8.0。31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液具有堿性pH值，并包含大于0.0001M但小于0.8M的NaCl。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的pH為7.4。33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的洗滌緩沖液包含氨基酸或烷基化氨基酸。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的氨基酸或垸基化氨基酸選自L-丙氨酸、甜菜堿、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸和賴(lài)氨酸。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的氨基酸是帶電氨基酸。36.—種親和層析基質(zhì)，其包含a)瓊脂糖支持物；b)共價(jià)結(jié)合到所述瓊脂糖支持物上的A蛋白；和c)帶電物質(zhì)，其單獨(dú)地共價(jià)結(jié)合固體支持物并非共價(jià)地與A蛋白相互作用。37.—種瓊脂糖珠，其包含至少10g/L結(jié)合在所述瓊脂糖珠表面上的A蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了將蛋白質(zhì)配體偶聯(lián)到固體支持物上的方法。本發(fā)明還提供了親和層析基質(zhì)，和用親和層析基質(zhì)純化靶分子的方法。文檔編號(hào)C12N11/08GK101365948SQ200780001886公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2007年1月5日優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日發(fā)明者J·烏瑪納,J·查庫(kù)迪恩,N·索伊斯,卞南英,陳王申請(qǐng)人:米利波爾公司