專利名稱：膠原肽,二肽及疾病抑制劑的制作方法
膠原肽，二肽及疾病抑制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膠原肽，二肽及疾病抑制劑。詳細(xì)是涉及含有有特定的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的二肽的膠原肽，有新穎的結(jié)構(gòu)的二肽，以上述二肽作為必須的有效成分的，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)炎，褥瘡等的抑制(在本發(fā)明，而所說(shuō)的用語(yǔ)“抑制”含作為抑制癥狀的發(fā)癥的”預(yù)防”的意味，抑制發(fā)癥的癥狀的“治療”作為的意味的雙方。)有效的疾病抑制劑。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是指雖然發(fā)生骨的絕對(duì)量的減少，但不伴隨骨的質(zhì)的變化的狀態(tài)。骨不斷被吸收，形成，且吸收率與形成率產(chǎn)生差，且骨形成成為負(fù)的平衡，則發(fā)生骨質(zhì)疏松。骨的吸收由破骨細(xì)胞進(jìn)行，且破骨細(xì)胞的分化及活化越是顯著，骨的吸收率越變高。另一方面，骨的形成由成骨細(xì)胞進(jìn)行，且成骨細(xì)胞的分化及活化越是顯著，骨的形成率越變高。變形性關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)同時(shí)發(fā)生慢性的退行性變化及增殖性變化，且關(guān)節(jié)的形態(tài)變化的疾病。關(guān)節(jié)軟骨漸漸磨耗或缺損，且骨露出。關(guān)節(jié)軟骨不存在血管系統(tǒng)，且特別是，關(guān)節(jié)摺動(dòng)部軟骨細(xì)胞及肋軟骨組織的修復(fù)·再生與存在血管的骨組織相比困難。特別是，支持關(guān)節(jié)軟骨的骨組織變疏(骨質(zhì)疏松癥)，則導(dǎo)致關(guān)節(jié)部的功能障礙，且作為結(jié)果，而變形性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)發(fā)癥。褥瘡是指，長(zhǎng)時(shí)間臥床時(shí)，骨的突出的部位的皮膚及軟部組織，由于骨與病床之間長(zhǎng)時(shí)間的壓迫，引起循環(huán)障礙，且成壞死的狀態(tài)。作為對(duì)于如上所述的癥狀的肽的效能而言，對(duì)于變形性關(guān)節(jié)炎的效能被報(bào)告，且例如，已知作為有效成分含膠原肽，葡萄糖胺鹽，且pH2 5的關(guān)節(jié)強(qiáng)化飲料(專利文獻(xiàn)1 參照)，由用膠原酶分解膠原成分或明膠成分被得到，以氨基酸序列Gly-X-Y的三肽作為有效成分的慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變形關(guān)節(jié)癥的改善劑(專利文獻(xiàn)2參照)，以含有從膠原及膠原肽可選的至少1種，從氨基糖，粘多糖類及糖醛酸可選的至少1種作為特征的經(jīng)口關(guān)節(jié)障礙治療劑或功能性食品(專利文獻(xiàn)3參照)等。專利文獻(xiàn)1特開2002-125638號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開2002-255847號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3特開2003-48850號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題但是，上述以往的技術(shù)僅示對(duì)于變形性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防至治療，膠原或，是各種各樣的肽分子的混合物的膠原肽，或特定的三肽有效，且對(duì)于預(yù)防至治療不僅是變形性關(guān)節(jié)炎， 且也含骨質(zhì)疏松癥，褥瘡等的廣的意味的疾病有效的肽結(jié)構(gòu)至今未知。從而，作為本發(fā)明要解決的課題在于，變以往的著眼點(diǎn)，找出對(duì)于骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)癥，褥瘡等的各種疾病的抑制有效的肽分子的本體，尤其是，向腸管的體內(nèi)的吸收容易而新穎的二肽，且提供含有上述二肽作為必須的有效成分的疾病抑制劑及含有上述二肽作為必須的二肽的膠原肽。解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行銳意研究。其結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)新穎發(fā)現(xiàn)的有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽，在腸管的體內(nèi)吸收容易，并且，作為疾病抑制劑的有效成分起作用，具體而言，例如，抑制破骨細(xì)胞的分化與活化，且亢進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與活化，且抑制軟骨細(xì)胞的變性而調(diào)節(jié)其分化，且發(fā)現(xiàn)對(duì)于骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)癥的抑制有效的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)此二肽使皮膚真皮中的原膠原量恢復(fù)，也抑制褥瘡，且確認(rèn)這些事實(shí)，而完成本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及的膠原肽以包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的二肽作為特征。本發(fā)明涉及的二肽以有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)作為特征。本發(fā)明涉及的疾病抑制劑以包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的有效成分作為特征。發(fā)明效果由本發(fā)明可有效抑制骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)癥，褥瘡等的癥狀。實(shí)施方式以下，雖然對(duì)于本發(fā)明涉及的膠原肽，二肽及疾病抑制劑詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍不被這些說(shuō)明約束，而對(duì)于以下的例示以外，在不損害本發(fā)明的趣旨的范圍內(nèi)可適宜實(shí)
施變更?！捕?，膠原肽〕本發(fā)明涉及的二肽有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及的膠原肽含有上述二肽作為必須的二肽。例如，可如后述由酶處理膠原或明膠得到。有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽，羥基脯氨酸單位及/或甘氨酸單位被化學(xué)修飾也可，而對(duì)于羥基脯氨酸單位而言，羥基被化學(xué)修飾也可。以上，在本發(fā)明而言，“有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽”是指含化學(xué)修飾的，也含未化學(xué)修飾的。另外，以下中，有將“有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽”單表示為“Hyp-Gly”時(shí)(對(duì)于其他肽也同樣)。Hyp-Gly被化學(xué)修飾時(shí)，可在從弱酸性到中性溶解，且也可期待與后述的其他有效成分的相溶性升高等。具體而言，對(duì)于羥基脯氨酸殘基的羥基而言，可舉0-乙?；鹊幕瘜W(xué)修飾，對(duì)于甘氨酸殘基的α-羧基而言，可舉酯化，酰胺化等的化學(xué)修飾。對(duì)應(yīng)于后述的其他有效成分的種類等，而選擇適宜的化學(xué)修飾即可。上述Hyp-Gly，例如，如后述，可由將膠原或明膠分成2階段酶處理，或從氨基酸合成得到，且對(duì)于化學(xué)修飾而言，可舉如后述的公知的手段。但是，本發(fā)明涉及的二肽也可通過(guò)這些方法以外的方法得到，而例如，代替下述2階段酶處理法，而省略1次酶處理的方法或，同時(shí)進(jìn)行1次酶處理及2次酶處理的方法也可。<膠原或明膠的2階段酶處理>將膠原或明膠通過(guò)一般的方法1次酶處理之后，作為2次酶處理，由使用有羥基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶反應(yīng)的2階段酶處理，而可得含Hyp-Gly的膠原肽。
由此2階段酶處理，則由1次酶處理，而有用于介經(jīng)口免疫寬容機(jī)制的骨 軟骨組織的炎癥緩和的分子量比較大的肽生成，且由2次酶處理，而例如，是有x-Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的肽(χ表示脯氨酸以外的氨基酸殘基。)，則Hyp-Gly殘基與χ殘基間的肽結(jié)合(Hyp的氨基與χ的羧基源于的肽結(jié)合)被切斷而Hyp-Gly生成。作為上述膠原而言，雖然當(dāng)然不是特別限定，但可舉例如，?；蜇i等的哺乳動(dòng)物來(lái)源的膠原或鯊或鯛等的魚類來(lái)源的膠原，且這些從上述哺乳動(dòng)物的骨，皮部分或上述魚類的骨，皮，鱗部分等可得。具體而言，對(duì)上述骨，皮，鱗等實(shí)施脫脂 脫灰處理，提取處理等的以往公知的處理即可。上述明膠由將上述膠原通過(guò)熱水提取等的以往公知的方法處理可得。作為上述膠原或明膠的2階段酶處理中用的酶而言，雖然不特別限定，但考慮將得到的二肽在特定保健用食品中利用的情況等，則優(yōu)選用病原性微生物來(lái)源的酶以外的酶。作為1次酶處理的處理?xiàng)l件而言，例如，可對(duì)于膠原或明膠100重量份用酶0. 1 5重量份，且于30 65°C處理1 72小時(shí)。由上述膠原或明膠的1次酶處理得到的膠原肽的平均分子量?jī)?yōu)選為200 2000， 更優(yōu)選為200 1800。平均分子量在上述范圍，則可認(rèn)為充分生成分子量比較大的肽。1次酶處理后，應(yīng)必要使酶失活也好，作為這時(shí)的失活溫度而言，例如，是70 100°C。作為用于上述1次酶處理的酶而言，是可切斷膠原或明膠的肽結(jié)合的酶，則不特別限定，而通常，可用被稱為蛋白分解酶或蛋白酶的酶。具體而言，可舉例如，膠原酶，巰基蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，酸性蛋白酶，堿性蛋白酶，金屬蛋白酶等，且可將這些單獨(dú)地，或多個(gè)組合使用。作為上述巰基蛋白酶而言，已知植物來(lái)源的木瓜凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶，動(dòng)物來(lái)源的組織蛋白酶，鈣依賴性蛋白酶等。另外，作為上述絲氨酸蛋白酶而言，已知胰蛋白酶，組織蛋白酶D等，作為上述酸性蛋白酶而言，已知胃蛋白酶， 胰凝乳蛋白酶等。而且，2次酶處理中，例如，作為酶，而用曲霉屬來(lái)源的有羥基氨?；彼岫拿富钚约鞍滨；彼岫拿富钚缘拿傅拿阜磻?yīng)進(jìn)行。由此反應(yīng)，1次酶處理物中未被含的 Hyp-Gly 生成。作為2次酶處理的處理?xiàng)l件而言，例如，可對(duì)于1次酶處理物100重量份用酶 0. 01 5重量份，且于30 65°C處理1 72小時(shí)。由上述2次酶處理得到的膠原肽的平均分子量?jī)?yōu)選為200 1500，更優(yōu)選為 200 900。此2次酶處理以Hyp-Gly的生成作為主要目的，且優(yōu)選由1次酶處理得到的膠原肽中，比較大的肽不被過(guò)量水解完地，成上述平均分子量的范圍地進(jìn)行2次酶處理。2次酶處理后有必要使酶失活，而作為失活溫度而言，是例如，70 100°C。由于由上述2階段酶處理得到的水解物，或由上述2階段酶處理及發(fā)酵得到的發(fā)酵生成物是也含Hyp-Gly以外的氨基酸或肽成分的混合物，所以得Hyp-Gly或者其鹽時(shí)，則應(yīng)必要，也可使如進(jìn)行分級(jí)分離、純化。作為分級(jí)分離 純化的方法而言，不特別限制，而使例如，超濾或，凝膠過(guò)濾層析，離子交換層析，逆相層析，親和層析等的各種液相層析或，使這些組合的方法等的以往公知的方法即可。具體而言，例如，可如以下分級(jí)分離 純化。艮口，首先，將上述水解物或發(fā)酵生產(chǎn)物的約2g/10mL分成2次負(fù)荷到離子交換柱(例如，DEAE T0Y0PEARL 650M柱(東^ 一社制)或SP T0Y0PEARL 650M柱(東^ 一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脫的空體積級(jí)分。接下來(lái)，將回收的級(jí)分負(fù)荷于有與上述離子交換柱相反的離子交換基的柱(例如，SP T0Y0PEARL 650M柱(東乂一社制)或DEAE T0Y0PEARL 650M 柱(東〃一社制)等)，而回收被用蒸留水洗脫的空體積級(jí)分。接下來(lái)，將此級(jí)分負(fù)荷于凝膠過(guò)濾柱(例如，SEPHADEX LH-20柱(Pharmacia社制)等)，且用30%甲醇水溶液洗脫與是化學(xué)合成品的Hyp-Gly洗脫的位置相當(dāng)?shù)募?jí)分回收。對(duì)于本級(jí)分而言，供于裝填逆相柱 (例如，μ Bondasphere 5 μ C18 300Α柱(Waters社制)等)的高效液相色譜(HPLC)，且由含0. 三氟醋酸的32%以下的乙腈水溶液的直線濃度梯度分級(jí)分離。然后，將回收的 Hyp-Gly級(jí)分由減壓干燥，而可得高純度的Hyp-Gly。<從氨基酸的合成>可從氨基酸合成Hyp-Gly。作為Hyp-Gly的合成法而言，一般有(1)固相合成法與(2)液相合成法(例如，特開2003-183^8號(hào)公報(bào)參照)，且前者的情況中，再已知(A)Fmoc法與(B)Boc法的方法，而 Hyp-Gly通過(guò)任何方法合成也可。以下以固相法作為一例詳細(xì)說(shuō)明。可將羥基脯氨酸固定于載質(zhì)聚苯乙烯，且由作為氨基的保護(hù)使用Fmoc基或Boc 基的公知的固相合成法合成。即，將表面用氨基修飾的直徑0. Imm左右的聚苯乙烯高分子凝膠的珠作為固相使用，且由作為縮合劑用二異丙基碳二亞胺(DIC)的脫水反應(yīng)，向 Fmoc(fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保護(hù)氨基的羥基脯氨酸結(jié)合甘氨酸(肽結(jié)合)之后，將固相用溶劑洗好，且除去殘留的甘氨酸等。此后，由除去與固相結(jié)合的羥基脯氨酸殘基的保護(hù)基(脫保護(hù))，可合成Hyp-Gly。<化學(xué)修飾>Hyp-Gly可被施化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾的具體的手段或處理?xiàng)l件可適用通常的肽的化學(xué)修飾技術(shù)。對(duì)于羥基脯氨酸殘基的羥基的化學(xué)修飾而言，可例如，0-乙?；怯稍谒軇┲谢蚍撬軇┲惺篃o(wú)水醋酸作用等進(jìn)行。甘氨酸殘基的α -羧基的化學(xué)修飾對(duì)于，例如，酯化可由向甲醇的在懸濁后通氣干燥氯化氫氣體等進(jìn)行，且酰胺化可由使碳二亞胺等作用來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)修飾的其他具體例，可適用特公昭62-44522號(hào)公報(bào)或特公平5-79046號(hào)公報(bào)等中記載的化學(xué)修飾技術(shù)?！布膊∫种苿潮景l(fā)明涉及的疾病抑制劑作為必須的有效成分包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽。 作為疾病抑制劑而言，可適宜舉骨質(zhì)疏松癥抑制劑，變形性關(guān)節(jié)炎抑制劑，褥瘡抑制劑等。本發(fā)明涉及的疾病抑制劑除了含本發(fā)明涉及的二肽作為有效成分之外，以本發(fā)明涉及的膠原肽含的本發(fā)明涉及的二肽作為有效成分也可。然后，在這時(shí)，上述疾病抑制劑不僅是，含有從氨基酸化學(xué)合成的Hyp-Gly或，從是膠原或明膠的水解物的膠原肽單離的 Hyp-Gly的實(shí)施方式，而也可是不從上述膠原肽單離Hyp-Gly地直接以膠原肽的形含有的實(shí)施方式。本發(fā)明涉及的疾病抑制劑，如此，也含使直接以膠原肽含有的形態(tài)，而是以本發(fā)明涉及的二肽作為有效成分，且也可包括將這些二肽在膠原肽的形中用的情況而聯(lián)用。對(duì)于上述本發(fā)明涉及的疾病抑制劑全量，優(yōu)選將上述Hyp-Gly以0. 001重量份以上的比例配合。更優(yōu)選以0.01重量份以上的比例配合。不足0.001重量份，則有本發(fā)明的效果不被充分表達(dá)的擔(dān)憂。而且，將本發(fā)明涉及的疾病抑制劑直接注入患部而用時(shí)，上述Hyp-Gly的含量?jī)?yōu)選是lmmol/L以上。本發(fā)明涉及的疾病抑制劑也可將Hyp-Gly在生理鹽水等中稀釋，而可充分得本發(fā)明的效果，而上述Hyp-Gly以外，在不損害本發(fā)明的效果的范圍，也可使含有適宜其他有效成分或制劑用的成分。作為上述其他有效成分而言，葡萄糖胺及/或其鹽，可舉軟骨素硫酸等，且可將這些以1種或2種以上組合使用。其中也是，葡萄糖胺及/或其鹽由于有使由Hyp-Gly的疾病抑制效果升高的作用而優(yōu)選。另外，作為上述其他有效成分，而也可含Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，而例如，分子量比較大的肽，對(duì)于慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，由于奏被稱緩和由經(jīng)口免疫寬容機(jī)制的骨 軟骨組織的炎癥的效果，所以有用。為了使含有Hyp-Gly以外的肽或氨基酸，則水解膠原或明膠而得到含有Hyp-Gly的膠原肽之后，將此膠原肽不單離Hyp-Gly地直接使用即可。而且，作為上述其他有效成分，以促進(jìn)骨鹽沉著的目的，可用鈣或糖轉(zhuǎn)移橙皮苷等，且以膠原的合成、沉著促進(jìn)等的目的，也可用維生素C等。作為上述其他有效成分的配合量而言，對(duì)于疾病抑制劑全量，優(yōu)選以0. 001 20 重量份用，而更優(yōu)選以0. 01 20重量份的比例用。特別是，將葡萄糖胺及/或其鹽的配合量，對(duì)于疾病抑制劑全量，優(yōu)選作為5 15重量份。不足5重量份，則有使Hyp-Gly的效果升高的效果不被充分發(fā)揮的擔(dān)憂，且超15重量份，則被排出到尿或糞中，且有成過(guò)量攝取的擔(dān)憂。作為用于制劑化的成分而言，例如，可用結(jié)晶性纖維素等的賦形劑等，且對(duì)應(yīng)于其形態(tài)等設(shè)定適宜的量即可。作為本發(fā)明涉及的疾病抑制劑的使用形態(tài)而言，可舉例如，由經(jīng)口施用攝取，或者向患部直接注入，或者所說(shuō)的形態(tài)。Hyp-Gly,由于在腸管迅速被吸收，且向氨基酸的分解也幾乎不發(fā)生，適宜由經(jīng)口施用的攝取。經(jīng)口施用的情況中，則將Hyp-Gly與上述其他有效成分或制劑用的成分混合而通過(guò)以往公知的方法，由打錠成型作為錠劑，或者也可以其他，顆粒劑，散劑，膠囊劑等的固態(tài)劑，溶液劑，懸濁劑，乳劑等的液劑，冷凍干燥制劑等的任意的形態(tài)制備。向患部直接注入時(shí)，則將Hyp-Gly用生理鹽水等稀釋而使用，而應(yīng)必要，而且，也可用上述其他有效成分，而作為其濃度而言，如上述，優(yōu)選將Hyp-Gly的含量作為lmmol/L 以上。在本發(fā)明涉及的疾病抑制劑中作為必須的有效成分含有的二肽有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)，與有氨基酸，Hyp-Gly以外的結(jié)構(gòu)的二肽，向Hyp-Gly結(jié)合其他氨基酸的三肽以上的肽等則相異。通過(guò)使包含上述具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽，表達(dá)出優(yōu)良的疾病抑制效果(骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)炎，褥瘡等的癥狀的抑制效果)。以上者將在后述的實(shí)施例中的性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)中被具體立證。
〔與其他二肽的聯(lián)用〕Hyp-Gly的疾病抑制效果有可通過(guò)與其他二肽聯(lián)用協(xié)同提高的情況。例如，通過(guò)將Hyp-Gly與ftx)-Hyp聯(lián)用，可協(xié)同提高Hyp-Gly的疾病抑制效果。而且，例如，對(duì)于變形性關(guān)節(jié)炎等的疾病而言，通過(guò)聯(lián)用Ala-Hyp，可協(xié)同提高其效能。作為本發(fā)明涉及的膠原肽，例如，為了得共同含Hyp-Gly與ftx)-Hyp的膠原肽，基本上，通過(guò)與對(duì)于Hyp-Gly說(shuō)明的2階段酶處理法同樣的方法，僅變更2次酶處理中用的酶的種類即可。作為這樣的酶而言，可舉例如，有曲霉屬等來(lái)源的氨?；彼岫拿富钚约傲u基氨?；彼岫拿富钚缘拿?。在本發(fā)明涉及的疾病抑制劑中，而將Hyp-Gly與ftO-Hyp聯(lián)用時(shí)，兩者的含有比率的優(yōu)選的范圍是，兩者的合計(jì)作為100重量％時(shí)，Hyp-Gly 50 90重量％，Pro-Hyp 10
50重量％。另外，將Hyp-Gly與其他二肽聯(lián)用時(shí)，對(duì)于上述本發(fā)明涉及的疾病抑制劑全量的二肽的配合比例優(yōu)選例如，二肽的合計(jì)量，0. 001重量份以上的比例。更優(yōu)選以0.01重量份以上的比例配合。而且，將本發(fā)明涉及的疾病抑制劑直接注入患部使用時(shí)，二肽的合計(jì)含量?jī)?yōu)選是ΙΟμπιοΙ/L以上。對(duì)于由聯(lián)用其他二肽的協(xié)同效果，以本發(fā)明的疾病抑制劑可抑制的代表的上述癥狀，即，骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)炎，褥瘡作為例而具體說(shuō)明。骨質(zhì)疏松癥是，如前述，骨的吸收由破骨細(xì)胞進(jìn)行，且破骨細(xì)胞的分化及活化越是顯著，骨的吸收率越變高的同時(shí)，另一方面，骨的形成由成骨細(xì)胞進(jìn)行，且成骨細(xì)胞的分化及活化越是顯著，骨的形成率越變高。因此，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的分化及活化，且亢進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及活化，可抑制骨質(zhì)疏松癥。然后，根據(jù)本發(fā)明人的了解，則Hyp-Gly，Pro-Hyp 在破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的分化及活化中示如下的作用。S卩，首先，對(duì)于破骨細(xì)胞的分化及活化的機(jī)制說(shuō)明，則首先，(i)多個(gè)前體破骨細(xì)胞融合而分化成多核巨細(xì)胞。催化此分化的酶是TRAP(Tertaric Acid Resistant Acid !Phosphatase :酒石酸抗性酸性磷酸酯分解酶)。接下來(lái)，(ii)將上述多核巨細(xì)胞(破骨細(xì)胞)骨組織溶解、分解。在上述機(jī)制，Hyp-Gly作為主要而抑制(i)，且Pro-Hyp抑制⑴， ( )的兩方。因此提示，由聯(lián)用Hyp-Gly，Pro-Hyp，這些協(xié)同作用，而發(fā)揮更優(yōu)良的效果。另外，成骨細(xì)胞合成、分泌骨基質(zhì)(I型膠原)，且由ALP (Alkaline Phosphatase 堿性磷酸酯分解酶)石灰化(Caltl(PO4)6(OH)2 氫氧化磷灰石)此骨基質(zhì)，亢進(jìn)骨化。此時(shí)， Hyp-Gly,亢進(jìn)上述ALP活性，且通過(guò)再聯(lián)用ftx)-Hyp，由協(xié)同效果促進(jìn)Hyp-Gly的亢進(jìn)效果， 且可使表達(dá)相比單獨(dú)地用分別的二肽都優(yōu)良的亢進(jìn)效果。變形性關(guān)節(jié)炎依次分成，⑴細(xì)胞增殖期，(ii)軟骨細(xì)胞分化/成熟期，(iii)向肥大化軟骨細(xì)胞的分化(變性)期，(iv)石灰化及經(jīng)此之后的凋亡(程序化的細(xì)胞死亡) 的4期，而在(i)，(ii)而言，主要ftx)-Hyp亢進(jìn)向軟骨細(xì)胞的分化及貢獻(xiàn)于其維持，且再 (ii)，調(diào)節(jié)Hyp-Gly前體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分化，且催化向肥大化軟骨細(xì)胞的分化(變性)，并且，由抑制也是特異標(biāo)記物的ALP (Alkaline Phosphatase 堿性磷酸酯分解酶)的活性，抑制向(iii)的移行。其中，根據(jù)本發(fā)明人的見解，則通過(guò)再聯(lián)用Ala-Hyp，在(ii)的Hyp-Gly 的作用，即，前體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分化的調(diào)節(jié)，和ALP活性的抑制協(xié)同升高。如此提示，通過(guò)CN 102177173 A
說(shuō)明書
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聯(lián)用Hyp-Gly、ftx)-Hyp，且再優(yōu)選也聯(lián)用Ala-Hyp，抑制協(xié)同軟骨細(xì)胞的變性，且由使維持關(guān)節(jié)細(xì)胞的表現(xiàn)型，貢獻(xiàn)于變形性關(guān)節(jié)癥的抑制。褥瘡的發(fā)癥與治愈過(guò)程依次分成⑴炎癥反應(yīng)期，(ii)增殖期(肉芽形成期)， (iii)穩(wěn)定期的3期。S卩，接受皮膚損傷，則在(i)的炎癥反應(yīng)期發(fā)生組織的斷裂與血管的斷裂，且局部出血，而由血液中的凝固因子等的作用與血管的收縮止血。接下來(lái)，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞等作為浸出液從血管滲出，且向傷口移動(dòng)(細(xì)胞遷移)。其中，Pro-Hyp發(fā)揮促進(jìn)淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞的細(xì)胞遷移的功能。單核細(xì)胞成為巨噬細(xì)胞，且這再放出各種各樣的化學(xué)物質(zhì)，而成以下信號(hào)的發(fā)生源。另外，由內(nèi)因性膠原酶(例如，MMP-13)而皮膚真皮中的膠原線維被分解。接下來(lái)，在(ii)的增殖期，由巨噬細(xì)胞的作用被釋放的化學(xué)物質(zhì)或由前述的內(nèi)緣性膠原酶發(fā)生的膠原分解片段肽(例如，Pro-Hyp與Hyp-Gly)被刺激，且成纖維細(xì)胞被募集，且膠原線維(膠原原膠原主成分)生成。成纖維細(xì)胞，毛細(xì)血管，膠原進(jìn)行共同作業(yè)， 且向傷口進(jìn)出，且封缺損面，且愈合創(chuàng)面(肉芽組織形成)。其中，Pro-Hyp與Hyp-Gly的兩者協(xié)同亢進(jìn)膠原合成，而促進(jìn)肉芽組織形成，而特別是，( )的增殖期的初期過(guò)程中主要 Pro-Hyp發(fā)揮生理功能，且在后期過(guò)程，主要Hyp-Gly發(fā)揮生理功能。肉芽組織被形成，則基底層以外的非增殖細(xì)胞移動(dòng)而形成一層的上皮細(xì)胞層。然后，在此層下，從創(chuàng)緣基底層的細(xì)胞移動(dòng)、增殖，且形成多層的上皮的結(jié)果，完成上皮化。最后，(iii)的過(guò)程中，成纖維細(xì)胞的活性回到平常，且膠原的生成變少，且保持生成量與分解量平衡的同時(shí)，以定常狀態(tài)移行，而完成治愈。含于本發(fā)明涉及的膠原肽的二肽的上述的作用從在后述的實(shí)施例中的性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)的各種效果的證實(shí)也被提示。(Pro-Hyp)上述的ftx)-Hyp不僅在與Hyp-Gly聯(lián)用時(shí)，而在單獨(dú)地用時(shí)，也有抑制骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)炎，褥瘡等的癥狀的作用。以下中，對(duì)于此ftx)-Hyp詳細(xì)說(shuō)明，而由于與關(guān)于Hyp-Gly的上述的說(shuō)明重復(fù)的內(nèi)容多，對(duì)于主要差異點(diǎn)說(shuō)明。Pro-Hyp也可脯氨酸單位及/或羥基脯氨酸單位被化學(xué)修飾，而特別是，對(duì)于羥基脯氨酸單位而言，羧基與羥基的任何，或，兩方被化學(xué)修飾也可。以上，在本說(shuō)明書，“有ftx)-Hyp的結(jié)構(gòu)的二肽”，或，將其略記而稱為“ftx)-Hyp” 時(shí)，此包括化學(xué)修飾的，也包括未化學(xué)修飾的。Pro-Hyp被化學(xué)修飾時(shí)，可在從弱酸性到中性溶解，且也可期待與其他有效成分的相溶性升高等。具體而言，對(duì)于脯氨酸殘基的α-氨基而言，可舉聚肽基化，琥珀酰化，馬來(lái)?；?，乙?；?，脫氨基化，苯甲?；?，烷基磺?；┍酋；?，二硝基苯基化，三硝基苯基化，氨甲?；交奔柞；?，巰基化等的化學(xué)修飾；對(duì)于羥基脯氨酸殘基的α-羧基而言，可舉酯化，酰胺化等的化學(xué)修飾；對(duì)于羥基脯氨酸殘基的羥基而言，可舉0-乙?；鹊幕瘜W(xué)修飾。對(duì)應(yīng)于其他有效成分的種類等，而選擇適宜的化學(xué)修飾即可。將上述ftx)-Hyp配合到疾病抑制劑的比例或，而且，對(duì)于在將此疾病抑制劑作為向關(guān)節(jié)局部的注入用而使用時(shí)的ftx)-Hyp的含量而言，與Hyp-Gly中述的比例或含量同樣即可。上述ftx)-Hyp與Hyp-Gly同樣，由例如，將膠原，明膠分成2階段酶處理，或從氨基酸合成可得，且對(duì)于化學(xué)修飾而言，可舉如后述的公知的手段。作為用于得到ftx)-Hyp的酶處理法而言，基本上，通過(guò)與對(duì)于Hyp-Gly說(shuō)明的2階段酶處理法同樣的方法即可，而2次酶處理中，使如使用例如，有曲霉屬等來(lái)源的氨基肽酶 P及氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。Pro-Hyp，與Hyp-Gly同樣，可從氨基酸合成，而這時(shí)，在以上說(shuō)明的Hyp-Gly的合成法中，單，代替羥基脯氨酸用脯氨酸，且代替甘氨酸用羥基脯氨酸即可。如前述，Pro-Hyp也可被施化學(xué)修飾。化學(xué)修飾的具體的手段或處理?xiàng)l件可適用通常的肽的化學(xué)修飾技術(shù)。對(duì)于脯氨酸殘基的α -氨基的化學(xué)修飾，例如，聚肽基化由與N-碳酸酐等的反應(yīng)， 琥珀酰化或馬來(lái)?；墒乖讦宝?附近與琥珀酸酐或馬來(lái)酸酐等反應(yīng)，乙?；墒乖谥行愿浇cN-羥基琥珀酰亞胺乙酸酯等反應(yīng)，脫氨基化由使亞硝酸等作用，苯甲酰化由使苯甲酰氯或安息香酸酐等作用，烷基磺?；蛳┍酋；墒古c苯磺酰基氯，P"甲苯磺?；?，甲磺?；鹊确磻?yīng)，二硝基苯基化或三硝基苯基化由使2，4_ 二硝基氟苯，2，4，6_三硝基苯磺酸等作用，氨甲?；虮交奔柞；墒骨杷岬茸饔?，巰基化由使N-乙酰高胱氨酸硫代內(nèi)酯，S-乙酰巰基琥珀酸酐，硫代仲康酸，S-乙酰硫代衣蘋酸酐等作用來(lái)進(jìn)行即可。對(duì)于羥基脯氨酸殘基的α -羧基的化學(xué)修飾，例如，酯化由向甲醇通氣懸濁后干燥氯化氫氣體等，酰胺化由使碳二亞胺等作用來(lái)進(jìn)行即可。對(duì)于羥基脯氨酸殘基的羥基的化學(xué)修飾而言，例如，0-乙?；稍谒軇┲谢蚍撬軇┲惺勾姿狒饔玫葋?lái)進(jìn)行即可。作為化學(xué)修飾的其他具體例，而可適用特公昭62-44522號(hào)公報(bào)或特公平5-79046 號(hào)公報(bào)等中記載的化學(xué)修飾技術(shù)。對(duì)于作為有效成分含ftx)-Hyp的疾病抑制劑的詳細(xì)而言，由于與關(guān)于作為有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制劑的敘述相同，所以省略說(shuō)明。(Ala-Hyp)上述的Ala-Hyp，不僅在與Hyp-Gly聯(lián)用時(shí)，而在單獨(dú)使用時(shí)，也有抑制變形性關(guān)節(jié)炎等的癥狀的作用。以下中，對(duì)于此Ala-Hyp詳細(xì)說(shuō)明，而由于與關(guān)于Hyp-Gly或ftx)-Hyp的上述的說(shuō)明重復(fù)的內(nèi)容多，對(duì)于主要差異點(diǎn)說(shuō)明。Ala-Hyp也可丙氨酸單位及/或羥基脯氨酸單位被化學(xué)修飾，而特別是，對(duì)于羥基脯氨酸單位而言，羧基與羥基的任何，或，兩方被化學(xué)修飾也可。以上，在本說(shuō)明書中，“有Ala-Hyp的結(jié)構(gòu)的二肽”，或，將其略記為“Ala-Hyp”時(shí)， 此包括化學(xué)修飾的，也包括未化學(xué)修飾的。Ala-Hyp被化學(xué)修飾時(shí)，可在從弱酸性到中性溶解，且也可期待與其他有效成分的相溶性升高等，基本上，與上述的ftx)-Hyp同樣的化學(xué)修飾即可。即，對(duì)于丙氨酸殘基的 α -氨基而言，與在上述的ftx)-Hyp的脯氨酸殘基的α -氨基同樣的化學(xué)修飾，對(duì)于羥基脯氨酸殘基的α -氨基及羥基而言，與在上述的ftx)-Hyp的羥基脯氨酸殘基的α -氨基及羥基同樣的化學(xué)修飾即可。對(duì)應(yīng)于其他有效成分的種類等，而選擇適宜的化學(xué)修飾即可。
對(duì)于將上述Ala-Hyp配合到疾病抑制劑的比例或，而且，在將此疾病抑制劑作為向關(guān)節(jié)局部的注入用而使用時(shí)的Ala-Hyp的含量而言，與Hyp-Gly中述的比例或含量同樣即可。上述Ala-Hyp，與Hyp-Gly同樣，由例如，將膠原，明膠分成2階段酶處理，或從氨基酸合成可得，且對(duì)于化學(xué)修飾而言，可舉如后述的公知的手段。作為用于得到Ala-Hyp的酶處理法而言，基本上，通過(guò)與對(duì)于Hyp-Gly說(shuō)明的2階段酶處理法同樣的方法即可，而2次酶處理中，使用例如，有曲霉屬等來(lái)源的蛋白酶活性及羥基氨酰基脯氨酸二肽酶活性的酶。Ala-Hyp，與Hyp-Gly同樣，可從氨基酸合成，而這時(shí)，在以上說(shuō)明的Hyp-Gly的合成法中，單，代替羥基脯氨酸用丙氨酸，且代替甘氨酸用羥基脯氨酸即可。如前述，且Ala-Hyp也可被施化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾的具體的手段或處理?xiàng)l件可適用通常的肽的化學(xué)修飾技術(shù)。對(duì)于丙氨酸殘基的α -氨基而言，與在上述的ftx)-Hyp的脯氨酸殘基的α-氨基同樣，對(duì)于羥基脯氨酸殘基的α-氨基及羥基而言，與在上述的ftx)-Hyp 的羥基脯氨酸殘基的α-氨基及羥基同樣化學(xué)修飾即可。對(duì)于作為有效成分含Ala-Hyp的疾病抑制劑的詳細(xì)而言，由于與關(guān)于作為有效成分含Hyp-Gly的疾病抑制劑的敘述相同，所以省略說(shuō)明。
實(shí)施例以下，由本發(fā)明涉及的二肽或?qū)⑵浜哪z原肽的性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)，以上述二肽作為有效成分的疾病抑制劑的配合例，而更具體說(shuō)明本發(fā)明，而本發(fā)明不限定于這些。以下中， 為方便，將“重量份”簡(jiǎn)稱為“份”，將“重量％ ”簡(jiǎn)稱為“ ％ ”?！捕摹场磳?shí)施例1>由前述的固相法合成Hyp-Gly。BP,由將表面用氨基修飾的直徑0. Imm左右的聚苯乙烯高分子凝膠的珠作為固相用，且作為縮合劑用二異丙基碳二亞胺(DIC)IO份的脫水反應(yīng)，使向用 Fmoc (fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保護(hù)氨基的羥基脯氨酸45份結(jié)合甘氨酸45份(肽結(jié)合)之后，將固相用溶劑(乙醇)洗好，且除去殘留的甘氨酸等。此后，通過(guò)將與固相結(jié)合的羥基脯氨酸殘基的保護(hù)基由三氟醋酸的溫育除去(脫保護(hù))合成Hyp-Gly。此二肽合成中，使用Liberty肽合成系統(tǒng)(CEM社制)。〈實(shí)施例2>實(shí)施例1的Hyp-Gly，及后述的參考例1_1的ftx)-Hyp的1 1混合物(重量基準(zhǔn))作為實(shí)施例2?！磳?shí)施例3>實(shí)施例1的Hyp-Gly，后述的參考例1_1的ftx)-Hyp，及后述的參考例1_2的 Ala-Hyp的1 1 1混合物(重量基準(zhǔn))作為實(shí)施例3。〈參考例1-1 >在上述Hyp-Gly的合成法，將羥基脯氨酸變更為脯氨酸，甘氨酸變更為羥基脯氨酸的以外，同樣地合成ftO-Hyp，且將其作為參考例1-1。
〈參考例1-2>在上述Hyp-Gly的合成法，將羥基脯氨酸變更為丙氨酸，甘氨酸變更為羥基脯氨酸變更為的以外，同樣地合成Ala-Hyp，且將其作為參考例1_2。<比較例1>在上述Hyp-Gly的合成法中，將羥基脯氨酸變更為亮氨酸，甘氨酸變更為羥基脯氨酸以外，同樣地合成Leu-Hyp，且將其作為比較例1。〈比較例2>在上述Hyp-Gly的合成法中，將羥基脯氨酸變更為苯丙氨酸，甘氨酸變更為羥基脯氨酸以外，同樣地合成Wie-Hyp，且將其比較例2作為?！幢容^例3>在上述Hyp-Gly的合成法中，將羥基脯氨酸變更為絲氨酸，甘氨酸變更為羥基脯氨酸以外，同樣地合成kr-Hyp，且將其作為比較例3?！踩摹场幢容^仿Ij4>在上述Hyp-Gly的合成法中，將羥基脯氨酸變更為脯氨酸，甘氨酸變更為實(shí)施例1 中合成的Hyp-Gly以外，同樣地合成Pro-Hyp-Gly，且將其作為比較例4?！舶被帷场幢容^例5，6>是氨基酸的脯氨酸作為比較例5，羥基脯氨酸作為比較例6?！材z原肽〕〈實(shí)施例4>根據(jù)示于以下的方法，而得到含有Hyp-Gly的豬皮來(lái)源的膠原肽(PC)，且將其作為實(shí)施例4。使是豬皮來(lái)源膠原的熱變性物的明膠(I型膠原)Ikg溶解于75V的溫水4L，且溫度調(diào)節(jié)到60°C之后，作為1次反應(yīng)，而添加黃色曲霉來(lái)源蛋白酶10g，且由pH5. 0 6. 0， 于溫度45 55°C保持120分鐘酶來(lái)進(jìn)行水解處理。接下來(lái)，作為2次酶反應(yīng)，向其中添加有羥基氨?；彼岫拿富钚缘拿浊固崛∶钢两K濃度1. 5%，且將其可溶化之后，使于 50°C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后，此反應(yīng)液在100°C加熱處理10分鐘，且之后，冷卻至60°C，且用活性炭與過(guò)濾助劑(硅藻土)過(guò)濾，且對(duì)得到的母液于120°C高溫殺菌處理3秒鐘。然后， 將殺菌后的母液噴霧干燥，且得到豬皮來(lái)源的膠原肽(PC)。將此PC供于薄層層析(TLC)。即，向TLC板(商品名"Cellulose F”，Merck社制)滴下10 μ g可溶化于水的PC(斑原點(diǎn))，使干燥之后，用溶劑(η-丁醇醋酸水= 4:1:幻展開。將此板風(fēng)干之后，由將靛紅-醋酸鋅發(fā)色液(將靛紅lg，醋酸鋅1.5g加溫溶解于異丙醇IOOmL,且冷卻后加醋酸ImL調(diào)節(jié))噴霧到同板，確認(rèn)上述中得到的PC的藍(lán)色的斑的Rf值([從斑原點(diǎn)至發(fā)色斑的距離]+ [從斑原點(diǎn)至溶劑展開前沿的距離])，與是點(diǎn)斑到相同板的內(nèi)部標(biāo)記物的Hyp-Gly與ftx)-Hyp中Hyp-Gly的藍(lán)色斑的Rf值一致，即， 此 PC 含 Hyp-Gly。再有，計(jì)數(shù)氨基酸序列已知的豬皮來(lái)源的I型膠原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出該I型膠原全體中的理論含有量時(shí)，是20. 0重量％。
((Hyp-Gly的數(shù)(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))從以上來(lái)看，上述PC理論上含Hyp-Gly最大20. 0重量％?！磳?shí)施例5>用魚鱗來(lái)源明膠以外，由與上述PC的制備同樣的操作，得到含有Hyp-Gly的魚鱗來(lái)源的膠原肽(FC)，且將其作為實(shí)施例5。將此FC與上述PC的情況中同樣由TLC分析時(shí)，確認(rèn)出Hyp-Gly的存在。再有，計(jì)數(shù)氨基酸序列已知的魚鱗來(lái)源的I型膠原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出該I型膠原全體中的理論含有量時(shí)，是23. 5重量％。((Hyp-Gly的數(shù)(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))從以上來(lái)看，上述FC理論上含Hyp-Gly最大23. 5重量％?！磳?shí)施例6>根據(jù)示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly的豬皮來(lái)源的膠原肽(PC-CP)，且將其作為實(shí)施例6。使豬皮來(lái)源膠原的熱變性物是的明膠(I型膠原)Ikg向20mM Tris-HCl緩沖液 (pH7. 5) 4L在加溫的同時(shí)溶解之后，冷卻至40°C，且作為1次酶反應(yīng)，而添加Ig的膠原酶 (新田明膠社制，Collagenase N2)后，由pH7. 0 7. 8，于40°C保持M小時(shí)進(jìn)行酶分解處理。接下來(lái)作為2次酶反應(yīng)，而向此反應(yīng)液添加有羥基氨?；彼岫拿富钚缘暮谇固崛∶钢两K濃度1. 0%，且將其可溶化之后，使于pH4. 0，50°C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后，將此反應(yīng)液在100°C加熱處理10分鐘，且之后，冷卻至60°C，且用活性炭與過(guò)濾助劑(硅藻土)過(guò)濾，且對(duì)得到的母液于120°C高溫殺菌處理3秒鐘。然后，將殺菌后的母液噴霧干燥，得到 PC-CP。另外，將此PC-CP與上述PC的情況中同樣由TLC分析時(shí)，確認(rèn)出Hyp-Gly的存在。再有，計(jì)數(shù)氨基酸序列已知的豬皮來(lái)源的I型膠原(重量(X) g)中含的Hyp-Gly 的序列的和(Y)，且由下述式求出該I型膠原全體中的理論含有量時(shí)，是20. 0重量％。((Hyp-Gly的數(shù)(Y)) X (Hyp-Gly的重量(分子量)))/(全序列的重量(X))從以上來(lái)看，上述PC-CP理論上含Hyp-Gly最大20. 0重量％?！磳?shí)施例7>根據(jù)示于以下的方法，得到含有Hyp-Gly及ftO-Hyp的豬皮來(lái)源的膠原肽 (PC-PH)，且將其作為實(shí)施例7。使是豬皮來(lái)源膠原的熱變性物的明膠(I型膠原)Ikg溶解于75V的溫水4L，且將溫度調(diào)節(jié)到60°C之后，作為1次酶反應(yīng)，而添加黃色曲霉來(lái)源蛋白酶10g，且由pH5. 0 6. 0，于溫度45 55°C保持120分鐘酶進(jìn)行水解處理。接下來(lái)，作為2次酶反應(yīng)，而向其中添加有氨酰基脯氨酸二肽酶活性及羥基氨?；彼岫拿富钚缘暮谇固崛∶钢两K濃度1. 5 %，且將其可溶化之后，使于pH4. 5 5. 5，溫度45 50 V反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后，此反應(yīng)液在100°C加熱處理10分鐘，且之后，冷卻至60°C，且用活性炭與過(guò)濾助劑(硅藻土) 過(guò)濾，且將得到的母液于120°C高溫殺菌處理3秒鐘。然后，將殺菌后的母液噴霧干燥，得到 PC-PH。另外，將此PC-PH與上述PC的情況中同樣由TLC分析時(shí)，確認(rèn)出PC-PH的藍(lán)色斑的Rf值與Hyp-Gly及ftO-Hyp的各藍(lán)色斑的Rf值一致，且共含PC-PHHyp-Gly及ftO-Hyp。
〈比較例7>僅進(jìn)行在上述的PC-CP的制備的1次酶反應(yīng)，而得到均不含有Hyp-Gly，Pro-Hyp 的膠原肽(PC-CP-Cont)，且將其作為比較例7。S卩，使豬皮來(lái)源膠原的熱變性物是的明膠(I型膠原)lkg加溫的同時(shí)溶解在20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)4L中之后，冷卻至40°C，且作為1次酶反應(yīng)，而添加Ig的膠原酶 (新田明膠社制，Collagenase N2)后，由pH7. O 7. 8，于40°C保持M小時(shí)進(jìn)行酶分解處理。接下來(lái)，將酶水解處理中得到的溶液在100°C加熱處理10分鐘，且之后，冷卻至60°C， 且用活性炭與過(guò)濾助劑(硅藻土)過(guò)濾，且對(duì)得到的母液于120°C高溫殺菌處理3秒鐘。然后，將殺菌后的母液噴霧干燥，且PC-CP-Cont得到。另外，將此PC-CP-Cont與上述PC的情況中同樣由TLC分析時(shí)，無(wú)法確認(rèn)Hyp-Gly， Pro-Hyp的任何存在?！残阅茉u(píng)價(jià)試驗(yàn)〕用上述實(shí)施例1 7，參考例1-1、1-2、比較例1 7涉及的各二肽，三肽，氨基酸， 膠原肽進(jìn)行的各性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)的詳細(xì)示于以下。<評(píng)價(jià)試驗(yàn)1-1 破骨細(xì)胞的分化及活化的抑制>基于Kobayashi Y.等的破骨細(xì)胞分化培養(yǎng)法[J. Bone Miner. Metab. (2004)22 p. 318-328]評(píng)價(jià)。即，用Hyp-Gly, Hyp-Gly及Pro-Hyp的1 1混合物，且將各自添加到小鼠初代骨髓細(xì)胞培養(yǎng)液至終濃度625 μ Μ,且從培養(yǎng)6天后研究是標(biāo)記物酶的酒石酸抗性酸性磷酸酯水解酶(TRAP)的各抑制活性。同樣地，研究用其他二肽(Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、 Phe-Hyp、kr-Hyp)，三肽(Pro-Hyp-Gly)，氨基酸(ftx^Hyp)時(shí)的 TRAP 抑制活性。而且，也研究作為對(duì)照，而未添加肽(空白)之時(shí)的TRAP抑制活性。另外，而且，各種肽，由氨基酸的破骨細(xì)胞的分化及活化的抑制度，以下由Pit測(cè)定評(píng)價(jià)。即，將破骨細(xì)胞在象牙片上培養(yǎng)的Pit測(cè)定基于Kakudo S，et al(1996). J. Bone Miner. Metab. 14 :129-136實(shí)施。具體而言如下。若令含有小鼠腸管骨來(lái)源的破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞與骨髓間質(zhì)細(xì)胞的懸浮液在 10% DMSO存在下，于_80°C冷凍保存，而使成熟破骨細(xì)胞死亡。將此細(xì)胞2. OX IO5接種于設(shè)置象牙片的96孔板的各孔，且將各被驗(yàn)肽添加到培養(yǎng)液，于37°C，5% CO2培養(yǎng)約1周。之后，用硅制橡膠POLICEMAN從象牙片除去細(xì)胞之后， 用酸蘇木精溶液染色象牙片數(shù)分鐘。此時(shí)，由TRAP染色測(cè)量TRAP染色陽(yáng)性多核巨細(xì)胞(破骨細(xì)胞)數(shù)，且算出對(duì)照(空白)的對(duì)于其細(xì)胞數(shù)的相對(duì)數(shù)。之后，在顯微鏡下測(cè)量由破骨細(xì)胞的Pit數(shù)(吸收窩的數(shù))，且由對(duì)于空白(對(duì)照)的相對(duì)比表示各被驗(yàn)肽的破骨細(xì)胞的活性抑制度。結(jié)果示于表1。[表1]
權(quán)利要求
1.膠原肽，其包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的二肽。
2.二肽，其具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)。
3.疾病抑制劑，其包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的有效成分。
4.權(quán)利要求3中所述的疾病抑制劑，其中成為上述有效成分的二肽作為膠原肽被含
5.權(quán)利要求3或4中所述的疾病抑制劑，其中作為有效成分也含葡萄糖胺及/或其鹽。
6.權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的疾病抑制劑，其是骨質(zhì)疏松癥抑制劑。
7.權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的疾病抑制劑，其是變形性關(guān)節(jié)炎抑制劑。
8.權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的疾病抑制劑，其是褥瘡抑制劑。
9.權(quán)利要求3 8中任一項(xiàng)所述的疾病抑制劑，其是經(jīng)口用抑制劑。
10.權(quán)利要求3 8中任一項(xiàng)所述的疾病抑制劑，其是向關(guān)節(jié)局部的注入用抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明以提供對(duì)于骨質(zhì)疏松癥，變形性關(guān)節(jié)癥，褥瘡等的各種疾病的抑制有效的肽分子的本體，尤其是向腸管的體內(nèi)的吸收容易的二肽，含有上述二肽作為必須的二肽的膠原肽及含有上述二肽作為必須的有效成分的疾病抑制劑作為課題，且作為解決涉及的課題的手段，而本發(fā)明涉及的膠原肽以包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的二肽作為特征。本發(fā)明涉及的二肽以有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)作為特征。本發(fā)明涉及的疾病抑制劑以包含具有Hyp-Gly的結(jié)構(gòu)的二肽作為必須的有效成分作為特征。
文檔編號(hào)C07K5/06GK102177173SQ20088013093
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者中谷祥惠, 井上直樹, 劉錦芳, 和田政裕, 小林永運(yùn), 小泉圣子, 杉原富人, 真野博, 高崎一 申請(qǐng)人:新田明膠株式會(huì)社