專利名稱：獐牙菜苦苷單體的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及川東獐牙菜(Swertia davida Franch)中的有效成分獐牙菜苦苷(Swertiamarin)單體的分離純化方法。
背景技術(shù)：
龍膽科獐牙菜屬植物在全世界約有100多種，中國(guó)大約有70余種，川東獐牙菜為土家族民間常用的一種民族藥。民間稱水黃連，青魚膽，來(lái)源于龍膽科獐牙菜屬植物川東獐牙菜(Swertia davida Franch)的全草，具有清熱解毒、清肝利膽的作用，用于治療痢疾、腸炎、肝炎、膽囊炎、婦科炎癥等疾病，其中以治療黃膽肝炎和病毒性肝炎療效尤為顯著。由于本屬植物藥理作用顯著，對(duì)其研究與開發(fā)也越來(lái)越受重視。目前，國(guó)內(nèi)外已研究過30多種獐牙菜屬植物的化學(xué)成分，做了大量的分離、鑒定、藥理和臨床研究工作，其主要化學(xué)成分有口山酮化合物，環(huán)烯醚萜化合物，三萜類化合物和黃酮類化合物等。
環(huán)烯醚萜類化合物是龍膽科植物的主要藥用成分之一，也是本科植物的特征性成分，在化學(xué)分類學(xué)上具有重大意義。川東獐牙菜中環(huán)烯醚萜類化合物主要有獐牙菜苦苷(Swertiamarin)、龍膽苦苷(gentiopicroside)、當(dāng)藥苷(sweroside)等，此類化合物大多單獨(dú)以葡糖苷的形式存在如，或進(jìn)一步酸化為酸化的裂環(huán)烯醚萜類化合物，具有保肝、利膽、抗炎及解痙止痛等作用，近年來(lái)，世界各國(guó)積極推進(jìn)該類化合物的開發(fā)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、日用化工和食品加工等領(lǐng)域，研究獐牙菜苦苷的提取分離純化方法和生產(chǎn)工藝具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
獐牙菜苦苷為中等極性物質(zhì)，易溶于水飽和的正丁醇及甲醇，目前對(duì)生藥材的提取分離一般用MeOH先粗提，回收溶劑后用石油醚(bp30-60℃)和CHCl3脫酯，再用n-BuOH或EtoAc萃取。再減壓回收溶劑后得粗提物，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析分離及TLC檢測(cè)，洗脫劑一般為CHCl3-CH3OH或CHCl3-CH3OH-H2O以適當(dāng)比例混合的溶液；顯色劑一般為20％H2SO4水溶液，或?qū)Χ装被郊兹?。環(huán)烯醚萜及裂環(huán)烯醚萜類化合物在龍膽科植物中基本上以糖苷形式存在，其以苷元形式的存在幾乎沒有。
獐牙菜苦苷的精制純化方法主要有硅膠柱色譜法，凝膠柱色譜分離法，半制備高效液相色譜法和高速逆流色譜法等，近年來(lái)，納濾膜分離在該類植物成分的分離純化研究上也有應(yīng)用。與粗品的提取分離工藝相比較，上述精制方法分離速度快捷，產(chǎn)品純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粗品。同時(shí)能保持產(chǎn)品的天然活性，有機(jī)溶劑殘留少，品質(zhì)穩(wěn)定，是制備高純獐牙菜苦苷單體的發(fā)展方向。然而，目前來(lái)說，上述精制方法距工業(yè)化應(yīng)用均存在一定差距。其中硅膠柱色譜法展開的有機(jī)溶劑通常采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲酸中的一種或多種配比體系，工藝復(fù)雜，有機(jī)溶劑價(jià)格高且毒性較強(qiáng)，操作安全性低。凝膠柱色譜分離法所采用填充料主要有Toyopear HW-40、Sephadex LH-20、XAD-8和Duolite S587等凝膠及吸附樹脂，存在著柱材料昂貴、獐牙菜處理量低等問題而無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)；半制備型高效液相色譜對(duì)儀器依賴性強(qiáng)，制備型色譜柱價(jià)格高昂，設(shè)備精細(xì)，操作復(fù)雜，且制備量少；高速逆流色譜法是一種不用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，采用GS1OAZ高速逆流色譜儀，可以獲得較高純度及收率的獐牙菜苦苷產(chǎn)品，分離效果好且不存在污染，具有一定的發(fā)展前景。但目前而言，高速逆流色譜技術(shù)在分離多組分混合物時(shí)如何確定洗脫溶劑種類與配比，保持柱效率長(zhǎng)期穩(wěn)定及擴(kuò)大生產(chǎn)能力等方面在理論與實(shí)踐上均有待完善，研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室少量標(biāo)準(zhǔn)樣品的試制，離工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)還有相當(dāng)大的距離。納濾膜分離法是近年來(lái)從食品飲料行業(yè)衍生到中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究領(lǐng)域，發(fā)展迅速的一項(xiàng)新型純化技術(shù)，在植物化學(xué)成分制備方面應(yīng)用尚不廣泛，是一種正處于工業(yè)開發(fā)階段的化學(xué)分離工程技術(shù)，目前的報(bào)道還多見于實(shí)驗(yàn)室研究。
獐牙菜苦苷的提取分離純化以溶劑法為主，存在很多弊端。其一，產(chǎn)品質(zhì)量低，由于獐牙菜植物化學(xué)成分復(fù)雜，溶劑的選擇性差，所得產(chǎn)品純度差且色澤深黃，必須經(jīng)脫色、結(jié)晶精制，方可應(yīng)用于醫(yī)藥與保健品領(lǐng)域；其二、產(chǎn)品的溶劑殘留量難以達(dá)到FAO/WHO規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，極大地影響了其使用。其三，產(chǎn)品穩(wěn)定性差，易氧化分解轉(zhuǎn)變成為其他化學(xué)成分。其四，色譜柱分離溶劑體系復(fù)雜，溶劑消耗大，效率差，成本高。其五、環(huán)境污染嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)一種分離純化操作步驟簡(jiǎn)單、分離效率高、制備量大的獐牙菜苦苷單體工業(yè)化生產(chǎn)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下獐牙菜苦苷單體的分離純化方法，包括從獐牙菜原料中提取含獐牙菜苦苷的粗品，其次從粗提物中純化得到獐牙菜苦苷單體；具體的工藝方法包括大孔吸附樹脂預(yù)分離、有機(jī)溶媒復(fù)提、硅膠柱色譜純化及脫色、冷凍干燥；本發(fā)明提供了一種獐牙菜苦苷單體的分離純化方法，該方法包括下列步驟(1)大孔吸附樹脂預(yù)分離工序?yàn)橐源罂孜綐渲琒-8為柱填料，柱高700mm，取獐牙菜粗提物20g，50％乙醇為解析溶劑，解析流速10ml/min，洗脫劑用量1500ml，收集液經(jīng)檢測(cè)后合并含獐牙菜苦苷的餾分，濃縮回收溶劑后真空干燥；該步獐牙菜苦苷可分離純化到50％以上，從原料計(jì)回收率可達(dá)70％；(2)溶媒復(fù)提將樹脂預(yù)分離產(chǎn)品用20倍量水飽和的乙酸乙酯70℃回流提取1小時(shí)，可將粗制品中的主要環(huán)烯醚萜類物質(zhì)(獐牙菜苦苷、龍膽苦苷等)與其他成分有效分離，該方法操作簡(jiǎn)便，溶劑回收利用次數(shù)高，成本低廉，產(chǎn)品提取制率達(dá)50％，獐牙菜苦苷純度超過75％；(3)硅膠柱色譜純化硅膠G為柱填料，以乙酸乙酯∶甲醇(7∶3，V/V)為洗脫劑工藝條件為柱高500mm，洗脫流速1.5ml/min，以200ml為一個(gè)餾分收集解析料液，將No.8～No.15餾分合并后濃縮干燥，可實(shí)現(xiàn)獐牙菜苦苷的有效純化，獐牙菜苦苷單體洗脫率為82.67％，純度可達(dá)到96.22％，一次性上樣量可達(dá)6g，洗脫劑用量3600ml；(4)脫色、干燥取5g獐牙菜苦苷加入20倍量無(wú)水乙醇超聲溶解，緩慢加入8ml石油醚并不停攪拌，有白色結(jié)晶析出時(shí)停止攪拌放置到冰箱中(4℃)冷置過夜，過濾，少量無(wú)水乙醇洗滌，晶體在30℃下冷凍干燥后純度可以達(dá)到98.52％，回收率72.80％，色澤淺白，無(wú)色素殘留。
本發(fā)明方法有下列特點(diǎn)(1)本項(xiàng)目采用低溫自動(dòng)柱色譜分離、析晶脫色及冷凍升華干燥等現(xiàn)代技術(shù)手段，依據(jù)川東獐牙菜化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能有效實(shí)現(xiàn)獐牙菜苦苷有效成分的提取、分離、純化與干燥，并且分離純化過程在特定的、自動(dòng)控制的低溫條件下完成，含量與活性水平得以充分保證。
(2)獐牙菜苦苷在樹脂預(yù)分離、溶媒復(fù)提、硅膠柱色譜與析晶脫色各步分離效果及分離效率均較高，純度增長(zhǎng)幅度大，以原料計(jì)獐牙菜苦苷回收率可達(dá)到41.50％，含量＞98％，特別解決了色素殘留問題，提高了產(chǎn)品的外觀與化學(xué)品質(zhì)；(3)所用樹脂填料、有機(jī)溶劑均廉價(jià)易得，洗脫時(shí)間短，溶劑回收方便。與報(bào)道的Sephadex LH-20分離或半制備HPLC純化工藝相比較，分離介質(zhì)與設(shè)備價(jià)格便宜，只需經(jīng)過常規(guī)的柱層析系統(tǒng)即可完成單體獐牙菜苦苷的分離制備，且實(shí)驗(yàn)室一次純化制備量可以達(dá)到克級(jí)水平，生產(chǎn)線上一次加工量在1Kg以上，在很大程度上提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。


圖198％獐牙菜苦苷發(fā)明工藝路線圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)首先用75％含水乙醇分別以川東獐牙菜重量的8倍量、7倍量和5倍量分三次從川東獐牙菜切碎原料中提取獐牙菜苦苷，提取液完全回收至無(wú)乙醇?xì)埩簦瑵饪s到含固量約5％料液待上柱。
(2)獐牙菜苦苷等環(huán)烯醚萜類組分的大孔吸附樹脂預(yù)分離a、大孔吸附樹脂預(yù)處理取650克S-8吸附樹脂用95％乙醇3000ml浸泡過夜充分溶脹；b、裝柱將溶脹好的樹脂緩慢倒入層析柱，使其均勻沉降，繼續(xù)用5～10倍柱床體積的95％乙醇淋洗樹脂雜質(zhì)，最后以10倍柱床體積純水洗滌至流出液無(wú)乙醇?xì)埩?，平衡備用；c、上樣取獐牙菜提取濃縮液800g常溫下以8ml/min的流速緩慢滲入S-8樹脂吸附，用6倍量柱床體積純水同流速洗滌雜質(zhì)后，50％乙醇為解析溶劑，解析流速10ml/min，洗脫劑用量1500ml，收集液經(jīng)檢測(cè)后合并含獐牙菜苦苷的餾分，得到獐牙菜苦苷分離物4.55g，含量為54.68％，料液濃縮回收溶劑后60℃真空干燥。
(3)精確稱取上述樣品4g，用40ml水飽和的乙酸乙酯70℃回流提取1小時(shí)，濃縮回收有機(jī)溶劑后低溫真空干燥得到含量為75.02％獐牙菜苦苷產(chǎn)品2.4g。
(4)獐牙菜苦苷硅膠柱色譜純化a、硅膠柱的預(yù)處理稱取300g硅膠G，105℃烘干備用；b、裝柱以乙酸乙酯為溶劑緩慢裝入硅膠，使其均勻沉降，繼續(xù)用3倍量柱床體積的乙酸乙酯淋洗以平衡柱子；c、上樣少量甲醇溶解2g待純化樣品，用20g硅膠拌勻后濕法裝柱，常溫下(25℃)用滴管緩慢將洗脫劑乙酸乙酯∶甲醇(7∶3，V/V)加入柱內(nèi)，待樣品完全滲入硅膠后接上自動(dòng)部分收集器開始收集，洗脫流速1.5ml/min，以200ml為一個(gè)餾分收集解析料液，No.8～No.15餾分合并后(1600ml)濃縮冷凍干燥，得96.85％獐牙菜苦苷產(chǎn)品1.28g。
(5)脫色精確稱量1g樣品加入20ml無(wú)水乙醇超聲溶解，緩慢加入8ml石油醚并不停攪拌，有白色結(jié)晶析出時(shí)停止攪拌放置到冰箱中(4℃)冷置過夜，過濾，少量無(wú)水乙醇洗滌晶體。
(6)冷凍干燥晶體在30℃下冷凍干燥后，得到含量98.76％的獐牙菜苦苷純品0.72g，色澤淺白泛亮。
權(quán)利要求
1.一種獐牙菜苦苷單體的分離純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)大孔吸附樹脂預(yù)分離a.用75％含水乙醇以川東獐牙菜重量的8倍量、7倍量和5倍量分三次從川東獐牙菜提取獐牙菜苦苷，合并提取液除去乙醇后濃縮到含固量為5％的料液待上柱；b.取大孔吸附樹脂，用95％乙醇浸泡過夜充分溶脹后，裝入層析柱，用95％乙醇淋洗樹脂雜質(zhì)，以純水洗滌樹脂至無(wú)乙醇?xì)埩?，平衡備用；c.取步驟a的料液，常溫下以8ml/min流速進(jìn)入層析柱吸附，以6倍量柱床體積純水同流速洗滌雜質(zhì)，50％乙醇為解析溶劑，流速10ml/min，吸集洗脫液，濃縮回吸溶劑后60℃真空干燥得到獐牙菜苦苷分離物；d.步驟c獐牙菜苦苷分離物用以水飽和的乙酸乙酯70℃回流提取1小時(shí)，濃縮提取液，回收溶劑后低溫(40℃)真空干燥得到獐牙菜苦苷高純品；(2)硅膠柱色譜純化a.烘干后的硅膠以乙酸乙酯為溶劑裝柱，用乙酸乙酯淋洗平衡；b.取上述獐牙菜苦苷高純品；以甲醇溶解，用硅膠拌勻后濕法裝柱；c.常溫下將洗脫劑乙酸乙酯∶甲醇7∶3V/V加入柱內(nèi)，待獐牙菜苷高純品完全滲入硅膠后，用收集器收集洗脫液，洗脫流速1.5ml/min，以200ml為一個(gè)收集部份的餾分，合并第8-15餾分，濃縮除去溶劑后，冷凍干燥得獐牙菜苷單體純化粗品；(3)脫色干燥取步驟(2)純化的單體粗品，以無(wú)水乙醇超聲溶解，緩慢加入石油醚，攪拌結(jié)晶，冷卻4℃放置過夜，過濾除去濾液，晶體在30℃下冷凍干燥得到獐牙菜苦苷純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種獐牙菜苦苷單體的分離純化方法，其特征在于其中步驟(1)所述的大孔樹脂為S-8吸附樹脂、XAD-2樹脂、NKA-9樹脂、D101樹脂、HP20或聚酰胺吸附劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種獐牙菜苦苷單體的分離純化方法，其特征在于其中步驟(2)所述的從硅膠上解吸獐牙菜苦苷的溶劑為乙酸乙酯∶甲醇7∶3V/V、氯仿或正丁醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了川東獐牙菜(Swertia davida Franch)中有效成分獐牙菜苦苷(Swertiamarin)單體的分離純化方法。本發(fā)明方法以大孔吸附樹脂S－8為預(yù)分離填料，含水乙醇為洗脫劑；再以硅膠G柱色譜純化，乙酸乙酯－甲醇為洗脫劑解析，層析產(chǎn)品經(jīng)析晶脫色處理，最終冷凍干燥得到98％獐牙菜苦苷純品。本發(fā)明方法與原有傳統(tǒng)工藝相比，采用常規(guī)廉價(jià)填料為分離介質(zhì)，優(yōu)化了產(chǎn)品分離純化、脫色與干燥技術(shù)，方法簡(jiǎn)便，制備周期短，成本低，單體提取率及產(chǎn)品純度高，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H17/00GK1966511SQ20051011039
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者范小兵, 張盛, 殷夢(mèng)龍, 李紅 申請(qǐng)人:上海諾德生物實(shí)業(yè)有限公司