一種β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用，尤其是酶法轉(zhuǎn)化多組分人參皂苷Rbl和Rb2制備人參皂苷Rd的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人參(Panax ginseng C.A.Meyer)是一種多年生五前科人參屬藥用植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，其顯著的抗腫瘤、抗炎、抗衰老活性一直以來都是研宄的熱點(diǎn)。隨著現(xiàn)代分離和分析技術(shù)的進(jìn)步，人參皂苷中的活性成分也得到了深入的解析，已分離鑒定的人參皂苷單體有50余種。
[0003]近年來，人參皂苷Rd因其獨(dú)特的藥理活性受到廣泛的關(guān)注，其獨(dú)特的腎臟保護(hù)功能和特異性阻斷受體依賴性鈣離子通道功能是其它單體所沒有的，同時(shí)人參皂苷Rd還具有較強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能，除此之外，還具有治療心血管疾病、炎癥等功能。因此，開發(fā)一種高效專一、低成本且綠色的人參皂苷Rd生產(chǎn)工藝具有迫切的現(xiàn)實(shí)需要同時(shí)也具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0004]人參皂苷Rd相對(duì)于多組分人參皂苷(Rbl、Rb2、Rc、Re和Rgl)在人參中含量顯著偏低，從人參中直接提取回收率低，無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)；因其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使得化學(xué)合成人參皂苷Rd更為困難，然而根據(jù)人參皂苷Rd在結(jié)構(gòu)方面與多組分人參皂苷Rbl、Rb2的相比發(fā)現(xiàn)(圖1)，它們都具有相同的達(dá)瑪烷骨架，僅在碳20位相差一個(gè)糖基(吡喃葡萄糖基和阿拉伯吡喃糖基)。因此去除該20位的相應(yīng)糖基即可得到所需產(chǎn)物人參皂苷Rd，而相比反應(yīng)條件劇烈的物理及化學(xué)方法，生物酶法所適用的反應(yīng)條件相對(duì)溫和且高效專一，幾乎不產(chǎn)生廢棄物因此無污染，綠色環(huán)保。
[0005]針對(duì)目前已有的對(duì)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd方面的研宄及相關(guān)專利，發(fā)現(xiàn)其中存在的局限有:(1)大部分生物轉(zhuǎn)化人參皂苷所用方式是微生物轉(zhuǎn)化，但微生物轉(zhuǎn)化所得產(chǎn)物品質(zhì)難以控制，對(duì)產(chǎn)品的純度及得率有較大影響，而酶處理專一性強(qiáng)，副產(chǎn)物少，因此發(fā)掘單一高效的糖苷水解酶能達(dá)到提高產(chǎn)物得率及純度的目的；(2)在利用生物酶轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd研宄中，可以通過β -葡萄糖苷酶催化人參皂苷Rbl來獲得，但還沒有通過微生物酶催化人參皂苷Rb2來獲得，也沒有發(fā)現(xiàn)能催化人參皂苷Rb2的β-葡萄糖苷酶。因此發(fā)掘高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2的水解酶，特別是既能轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl又能轉(zhuǎn)化人參Rb2水解酶，對(duì)于制備人參皂苷Rd具有重大意義和應(yīng)用前景。此外，提高制備Rd產(chǎn)量，對(duì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化Rd制備獲得人參皂苷Rg3，Rh2和CK等更多活性物質(zhì)也具有重要意義；(3)酶水解人參皂苷過程中的產(chǎn)物之一的葡萄糖對(duì)葡萄糖苷酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)酶活力有極大的影響，發(fā)掘耐糖能力優(yōu)異的β -葡萄糖苷酶有利于提高酶催化的效率，該種性質(zhì)對(duì)降低生產(chǎn)成本及能耗具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明針對(duì)上述局限性，本申請(qǐng)人提供一種具有較高阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶及其制備方法與應(yīng)用，并通過基因工程技術(shù)獲得催化效率高，熱穩(wěn)定性優(yōu)異，能耐受高溫的重組β -葡萄糖苷酶TPEBGL1，該重組酶TPEBGL1對(duì)人參皂苷Rbl和Rb2都具有較強(qiáng)的催化能力。同時(shí)，能耐受較高濃度的葡萄糖。因而可降低產(chǎn)物反饋抑制對(duì)酶活力的影響，此外，還創(chuàng)立了一種不需IPTG誘導(dǎo)即可高效表達(dá)該重組酶TPEBGLI的酶制備方法，因此通過TPEBGL1轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rd的方法是一種高效、便捷的方法。
[0007]技術(shù)方案:一種β -葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]編碼所述β -葡萄糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述β -葡萄糖苷酶的制備方法，將SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，以及其誘導(dǎo)表達(dá)條件和后續(xù)目的蛋白的純化。
[0010]所述制備方法步驟如下:
[0011]I)、以提取的 Thermotoga petrophila DSM 13995 基因組 DNA 為模板，用具有 SEQID N0:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到SEQ ID N0.2所示的DNA分子；
[0012]2)、將得到的DNA分子和pET_20b分別用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，連接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重組質(zhì)粒；
[0013]3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109 (DE3)，不加IPTG于37°C下誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni2+親和層析柱純化即得。
[0014]包含所述β -葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重組質(zhì)粒。
[0015]所述β -葡萄糖苷酶在制備人參皂苷Rd中的應(yīng)用。
[0016]—種通過所述β -葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl和Rb2制備人參皂苷Rd的方法，所述β -葡萄糖苷酶在pH 4-8，溫度30°C -95°C，酶解人參皂苷Rbl和Rb2制備得到人參皂苷Rd。pH優(yōu)選為6.0，溫度優(yōu)選為90°C。
[0017]有益效果:
[0018](I)本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性優(yōu)異，能耐受高溫；
[0019](2)本發(fā)明所述葡萄糖苷酶具有較高β_1，6-糖苷鍵水解能力同時(shí)具有較強(qiáng)的α -1，6-阿拉伯吡喃糖苷鍵水解能力，對(duì)人參皂苷Rbl和Rb2的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶與人參皂苷Rbl和Rb2孵育一定時(shí)間后，檢測(cè)到人參皂苷Rbl或Rb2幾乎完全轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd ;
[0020](3)本發(fā)明所述TPEBGL1的制備方法不需要誘導(dǎo)劑IPTG即可高效表達(dá)。
【附圖說明】
[0021]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0022]圖1為本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl和Rb2生成人參皂苷Rd的水解線路圖。
[0023]圖2為實(shí)施例2純化的葡萄糖苷酶的純度鑒定結(jié)果圖；其中泳道M為蛋白Marker (購(gòu)自Thermo scientific公司，貨號(hào)2661)，泳道I為純酶蛋白；泳道2為誘導(dǎo)表達(dá)后全細(xì)胞裂解液；泳道3為PET-20b轉(zhuǎn)化宿主菌空白對(duì)照的全細(xì)胞裂解液。
[0024]圖3為實(shí)施例3本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖，其中縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位為％;橫坐標(biāo)為誘導(dǎo)條件的編號(hào)，其中1-6分別表示:1，37°C不加IPTG ;2，30°C不加 IPTG ;3，30°C 加 IPTG 至終濃度 0.0lmM ;4，30°C 加 IPTG 至終濃度 0.05mM ;5，30°C 加IPTG至終濃度0.1mM ;6，30°C加IPTG至終濃度0.5mM。
[0025]圖4為實(shí)施例4本發(fā)明所述述β -葡萄糖苷酶的定性測(cè)定結(jié)果圖，其中a為最適反應(yīng)pH的測(cè)定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位％ ;b為最適反應(yīng)溫度的測(cè)定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為溫度，單位攝氏度(°C)，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位％ ;cSpH穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位％ ;(1為溫度穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為保溫時(shí)間，單位小時(shí)(min)，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位％。
[0026]圖5所示為實(shí)施例5本發(fā)明所述葡萄糖苷酶的耐糖系數(shù)Ki測(cè)定結(jié)果圖。橫坐標(biāo)為反應(yīng)體系中葡萄糖添加量，單位mM，縱坐標(biāo)為相對(duì)酶活力，單位％。
[0027]圖6系列所示實(shí)施例6不同反應(yīng)時(shí)間下利用HPLC對(duì)人參皂苷Rbl和Rb2分別水解制備人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果圖，其中:
[0028]圖6A為人參皂苷Rbl經(jīng)TPEBGL1制備生成人參皂苷Rd的結(jié)果圖；
[0029]圖6B為不同反應(yīng)時(shí)間下(0，10，20，30，40，50，60min)對(duì)人參皂苷Rbl酶水解生成人參皂苷Rd的組分變化情況進(jìn)行HPLC分析結(jié)果圖；
[0030]圖6C為人參皂苷Rb2經(jīng)TPEBGL1制備生成人參皂苷Rd的結(jié)果圖；
[0031]圖6D為不同反應(yīng)時(shí)間下(0，5，10，30，50，70，80，90min)對(duì)人參皂苷Rb2酶水解生成人參皂苷Rd的組分變化情況進(jìn)行HPLC分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅為本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0033]本發(fā)明提供了一種具有a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力的葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，命名為TPEBGLI ο
[0034]本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述β -葡萄糖苷酶的DNA分子片段。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
[0035]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼所述的β -葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
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