一種β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突變體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖苷酶，和通過基因定點(diǎn)突變 的方法獲得0-葡萄糖苷酶的突變體和一些耐熱性提高的0-葡萄糖苷酶的突變體，以及 0-葡萄糖苷酶和0-葡萄糖苷酶突變體的在纖維素降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于能源危機(jī)日益嚴(yán)重，可再生且環(huán)保效果顯著的木質(zhì)纖維素糖化工藝越來越受 到人們的關(guān)注。利用纖維素酶降解木質(zhì)纖維素產(chǎn)生葡萄糖，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)包括乙醇在內(nèi)的 生物基產(chǎn)品對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，由于纖維素酶降解天然纖維素底 物的效率低，成本高，因此由纖維素轉(zhuǎn)化為生物燃料的過程依然具有很大挑戰(zhàn)性。同時(shí)，由 于底物的特異性，以及纖維素酶發(fā)酵液酶系的不平衡限制了其應(yīng)用。在纖維素降解過程中， 纖維素酶的水解效率是纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的一個(gè)瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種葡萄糖苷酶，本發(fā)明的葡萄糖苷酶具有葡萄糖苷酶的活 性，所述葡萄糖苷酶的活性在纖維素降解中提供降解的功能，能用于降解纖維素。
[0004] 同時(shí)，為了提高葡萄糖苷酶的耐熱性，本發(fā)明對(duì)野生型葡萄糖苷酶突變體 進(jìn)行了突變，得到了幾種耐熱性顯著提高的0 -葡萄糖苷酶的突變體。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] -種組合物，其含有一種酶，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄糖苷酶的活 性在纖維素降解中提供降解的功能，所述酶為如下（a)或（b)的蛋白質(zhì)：
[0007] (a)其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，
[0008] (b)在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有葡萄 糖苷酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 目前有一株經(jīng)過誘變育種篩選到的能大量高產(chǎn)0-葡萄糖苷酶的檜狀青霉 (Penicilliumpiceum)H16，檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16 的保藏號(hào)為CGMCC No. 8339,保藏時(shí)間為：2013年10月15日，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（CGMCC)。本發(fā)明的申請(qǐng)人首先將檜狀青霉（PenicilliumpiCeum)H16的全基因組測(cè)序， 通過生物信息學(xué)方法以所有霉菌屬產(chǎn)生的0 _葡萄糖苷酶蛋白序列建庫，利用blastx在 檜狀青霉全基因組中進(jìn)行搜索，并進(jìn)行歸類最終得到表達(dá)量最高的胞外分泌0 _葡萄糖苷 酶，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。如SEQIDNO: 1所示的葡萄糖苷酶的表達(dá)量 最高，且活性達(dá)到20IU/mL以上。高活力的葡萄糖苷酶可用于酶系復(fù)配中，平衡水解酶 系，提尚轉(zhuǎn)化效率。
[0010] 本發(fā)明提供的所述酶與其他用于降解纖維素比如e-l，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖 酶的酶共同作用，用于降解纖維素。本發(fā)明提供的酶也可單獨(dú)用于降解纖維二糖。
[0011] 優(yōu)選的是，所述的組合物中，所述酶為SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的第100位 的甘氨酸被取代為脯氨酸（G100F)，其氨基酸序列如SEQIDNO: 6所示。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的組合物中，所述酶為SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的第172位 的甘氨酸被取代為脯氨酸（G172F)，其氨基酸序列如SEQIDNO: 7所示。
[0013] 本發(fā)明還提供氨基酸序列SEQIDN0:6和氨基酸序列SEQIDN0:7的所示的 0 _葡萄糖苷酶突變體，與0 _葡萄糖苷酶（氨基酸序列SEQIDNO: 1)和-葡萄糖苷酶 突變體（氨基酸序列SEQIDN0:2、3、4、和5)相比，酶活大致相同，且熱穩(wěn)定性顯著提高，使 其在酶系復(fù)配中能夠提高復(fù)配酶液整體水解率。熱穩(wěn)定性提高使得相對(duì)于野生型葡萄 糖苷酶（氨基酸序列SEQIDNO: 1)，氨基酸序列SEQIDNO:6和氨基酸序列SEQIDNO:7 的所示的葡萄糖苷酶突變體在更適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的組合物中，所述酶為以下四種蛋白質(zhì)中的任意一種蛋白質(zhì)：
[0015] SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的第325位的谷氨酰胺被取代為精氨酸（Q325R)， 其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；
[0016] SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的第444位的蘇氨酸被取代為賴氨酸（T444K)，其 氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；
[0017]SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的第618位的天冬氨酸被取代為谷氨酰胺 (D618Q)，其氨基酸序列如SEQIDN0:4所示；或者，
[0018] SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的第629位的谷氨酸被取代為谷氨酰胺（E629Q)， 其氨基酸序列如SEQIDN0:5所示。
[0019] 本發(fā)明的申請(qǐng)人將如SEQIDNO: 1所示的0-葡萄糖苷酶進(jìn)行如上四種突變，得 到的四種葡萄糖苷酶突變體（氨基酸序列SEQIDN0:2、3、4、和5)的仍然具有葡萄糖 苷酶的活性，且酶活大致相同，能夠用于降解纖維素?？蓪⒁吧推咸烟擒彰竼为?dú)用于 酶系復(fù)配從而用于降解纖維素，也可將這幾種酶中的一種或任意幾種同時(shí)用于酶系復(fù)配中 從而用于降解纖維素。
[0020] 本發(fā)明還提供一種DNA分子，所述DNA分子編碼如上的所述酶，該DNA分子的序列 選自：SEQID勵(lì):8、9、10、11、12、13和14。由于氨基酸密碼子存在簡(jiǎn)并性，同一種氨基酸 具有兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的現(xiàn)象稱為密碼子的簡(jiǎn)并性（degeneracy)。對(duì)應(yīng)于同一種氨基 酸的不同密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon)。簡(jiǎn)并性使得那些即使密碼子中堿 基被改變，仍然能編碼出原氨基酸。密碼的簡(jiǎn)并也使DNA分子上堿基組成有較大余地的變 動(dòng)。所以，本發(fā)明所述的DNA分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，還存在很多能夠編碼 所述酶的可能的多核苷酸序列，這里不在一一列舉。
[0021] 本發(fā)明也提供一種重組載體，其含有能夠編碼所述酶的所述的DNA分子和與所述 DNA分子連接的用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，該DNA分子的序列選自：SEQIDN0:8、9、10、ll、12、 13和14,本發(fā)明中使用的用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列為pET系列載體，當(dāng)然，也可以使用其他適于 編碼所述酶的核苷酸序列的表達(dá)載體，它們能夠在多種真核宿主細(xì)胞和原核宿主細(xì)胞中表 達(dá)。
[0022] 本發(fā)明還提供給宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括能夠編碼所述酶的所述的DNA分子或 所述的重組載體，所述的重組載體所含的DNA分子能夠編碼所述酶，該DNA分子的序列選 自：SEQID勵(lì):8、9、10、11、12、13和14。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為大腸桿菌 細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法，包括：
[0024] 步驟一、從檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16中克隆得到如SEQIDNO:8所示 的核苷酸序列，并將所述多核苷酸序列連接到用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列上，構(gòu)建得到帶有所述 核苷酸序列的連接子，之后通過將所述連接子轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到含有SEQIDNO:8所 示的核苷酸序列的重組載體；以及，
[0025] 步驟二、利用突變引物，以步驟一得到的所述重組載體為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)方法進(jìn)行循環(huán)延伸擴(kuò)增得到帶有編碼酶突變體的核苷酸序列的PCR產(chǎn)物，之后通過將所 述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到含有突變位點(diǎn)的重組載體。利用如SEQIDNO: 17和 SEQIDNO: 18所示的引物序列通過PCR擴(kuò)增得到如SEQIDN0:9所示的核苷酸序列，利用 如SEQIDN0:19和SEQIDN0:20所示的引物序列通過PCR擴(kuò)增得到如SEQIDN0:10所示 的核苷酸序列，利用如SEQIDN0:21和SEQIDN0:22所示的引物序列通過PCR擴(kuò)增得到 如SEQIDN0:11所示的核苷酸序列，利用如SEQIDN0:23和SEQIDN0:24所示的引物序 列通過PCR擴(kuò)增得到如SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列，利用如SEQIDNO: 25和SEQID N0:26所示的引物序列通過PCR擴(kuò)增得到如SEQIDNO: 13所示的核苷酸序列，利用如SEQ IDN0:27和SEQIDN0:28所示的引物序列通過PCR擴(kuò)增得到如SEQIDN0:14所示的核苷 酸序列。
[0026] 優(yōu)選的是，所述的產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法，所述步驟二中，將所述 PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中之前，還包括將所述PCR產(chǎn)物利用Dpnl內(nèi)切酶于溫度37°C下處 理3h。
[0027] 優(yōu)選的是，所述的產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法中，所述步驟二中，所述 突變引物包括：其中一條引物的堿基序列如SEQIDN0:25所示，另一條引物的堿基序列如 SEQIDN0:26所示，SEQIDN0:25的堿基序列與SEQIDN0:26的堿基序列反向互補(bǔ)；或 者，
[0028] 其中一條引物的堿基序列如SEQIDN0:27所示，另一條引物的堿基序列如SEQID N0:28所示，SEQIDN0:27的堿基序列與SEQIDN0:28的堿基序列反向互補(bǔ)。引物序列不 限于此提供的序列，也可以是其他序列，只要能夠得到目的核苷酸序列即可。
[0029] 本發(fā)明的有益效果為：
[0030] 本發(fā)明的e-葡萄糖苷酶的表達(dá)量很高，且活性很高。高活力的e-葡萄糖苷酶 可用于酶系復(fù)配中，平衡水解酶系，提高轉(zhuǎn)化效率。
[0031] 本發(fā)明的申請(qǐng)人將如SEQIDNO: 1所示的0-葡萄糖苷酶進(jìn)行如上四種突變，得 到的四種葡萄糖苷酶突變體（氨基酸序列SEQIDN0:2、3、4、和5)的仍然具有葡萄糖 苷酶的活性，能夠用于降解纖維素。可將野生型葡萄糖苷酶單獨(dú)用于酶系復(fù)配從而用 于降解纖維素，也可將這幾種酶中的一種或任意幾種同時(shí)用于酶系復(fù)配中從而用于降解纖 維素。
[0032] 本發(fā)明還提供氨基酸SEQIDNO: 6和氨基酸序列SEQIDNO: 7的0 -葡萄糖苷酶 突變體，與0 -葡萄糖苷酶（氨基酸序列SEQIDNO: 1)和0 -葡萄糖苷酶突變體（氨基酸 序列SEQIDN0:2、3、4、和5)相比，熱穩(wěn)定性提高，使其在酶系復(fù)配中能夠提高復(fù)配酶液整 體水解率。
[0033]耐熱性提高可以提高單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖苷酶的水解效率，降低酶用量，提高 在酶系復(fù)配中平衡酶系提高整體水解率的作用。另外，0 _葡萄糖苷酶能將風(fēng)味前體物質(zhì)水 解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)，耐熱性的提高可以使其在啤酒、茶葉中發(fā)揮更好作用， 具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0034] 定義
[0035] 為了便于理解本發(fā)明，定義了大量術(shù)語和短語
[0036] 本發(fā)明中的"反向互補(bǔ)"，指通過堿基配對(duì)原則關(guān)聯(lián)的核苷酸序列。例如，序列 ''5' -A-T-G-3'" 與序列 "5' -C-A-T-3'" 反向互補(bǔ)。
[0037] 術(shù)語"基因"是指一種DNA分子，基因是遺傳變異的主要物質(zhì)，是控制生物性狀的 基本遺傳單位，基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的堿基序列成為結(jié)構(gòu)基因，本發(fā)明中所稱的基因 為結(jié)構(gòu)基因。
[0038] "野生型基因"是指一種從來源中分離的基因，本發(fā)明的"野生型基因"是從誘變 的檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16克隆得到的。而"突變的基因"是指一種基因，與"野 生型基因"相比，其具有序列和/或功能性質(zhì)的修飾（即改變的特征）。
[0039] "野生型酶"是指一種蛋白質(zhì)，本發(fā)明的"野生型酶"是從誘變的檜狀青霉 (PenicilliumpiceUm)H16分離得到的，或者"野