醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶及酶工程領(lǐng)域，具體而言，涉及一種醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶作為生物催化劑，在生物體內(nèi)能充分發(fā)揮其高效和高特異性的特點(diǎn)。但是在工 業(yè)應(yīng)用中，卻普遍存在無法適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件和對(duì)非天然底物的催化能力低等問題。必須 借助蛋白質(zhì)工程方法對(duì)酶分子進(jìn)行改造以適應(yīng)不同的應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)工程方法可以概 括為三種：理性設(shè)計(jì)（rationaldesign)、非理性設(shè)計(jì)（irrationaldesign)和半理性設(shè)計(jì) (semi-rationaldesign)〇
[0003] 理性設(shè)計(jì)是指在了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變（Site-directed Mutagenesis)或其它方法改變蛋白質(zhì)分子中的個(gè)別氨基酸，從而產(chǎn)生新性狀的蛋白質(zhì)。這 種方法在理論上針對(duì)性較強(qiáng)，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特異性、穩(wěn)定性、 改變抑制劑類型、輔酶特異性等方面。
[0004] 定點(diǎn)飽和突變技術(shù)是蛋白質(zhì)工程中的一門重要技術(shù)，屬于上述的半理性設(shè)計(jì)但又 結(jié)合了理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了各自的不足，它通過對(duì)目的蛋白的編碼基因 進(jìn)行改造，短時(shí)間內(nèi)獲取靶位點(diǎn)氨基酸分別被其它19種氨基酸替代的突變體。此技術(shù)不僅 是蛋白質(zhì)定向改造的強(qiáng)有力工具，而且是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系研宄的重要手段。研宄表 明，多點(diǎn)突變往往能獲得比單點(diǎn)突變更為理想的進(jìn)化體。多點(diǎn)突變是定點(diǎn)突變不易直接獲 得的。而對(duì)于定點(diǎn)突變技術(shù)不能解決的這些問題，恰恰是定點(diǎn)飽和突變技術(shù)所擅長(zhǎng)的獨(dú)特 之處。
[0005] 醇脫氫酶是一種氧化還原酶，在生物有機(jī)體的許多生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作 用?；谄淠艽呋a(chǎn)生高對(duì)應(yīng)選擇性的手性醇，醇脫氫酶通常作為一種非常重要的生物催 化劑應(yīng)用于化學(xué)和制藥工業(yè)中手性中間體的合成。如一種新的用于艾滋病治療的非肽類抗 逆轉(zhuǎn)病毒蛋白酶抑制劑地瑞那韋Oarunavir)。
[0006] 目前已知的醇脫氫酶可以作為生物催化劑，一步還原酮類底物，制備得到近乎單 一光學(xué)純度的手性中間體（31?，345,641〇-六氫呋喃并[2,3-8]呋喃-3-醇，簡(jiǎn)化了合成步 驟，降低了生產(chǎn)污染。但是在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用中，依然有一些問題需要進(jìn)一步解決，如催化 反應(yīng)后產(chǎn)生的非對(duì)映異構(gòu)體含量較高、酶催化活性較低等。
[0007] 因此，仍需要對(duì)現(xiàn)有的醇脫氫酶進(jìn)行改進(jìn)，以提高其催化活性、底物特異性和/或 穩(wěn)定性，進(jìn)而改善現(xiàn)有技術(shù)中如立體選擇性較低、后處理過程繁瑣、生產(chǎn)成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在提供一種醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用，以提高其催化活性和立體選擇 性。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種醇脫氫酶突變體，該醇脫 氫酶突變體的氨基酸序列是SEQIDNO:9所示氨基酸序列發(fā)生突變的氨基酸序列，發(fā)生突 變的氨基酸序列具有如下至少1個(gè)突變位點(diǎn)：：第40位、第87位、第194位和第331位，且 第40位的T突變?yōu)镾、A或C;第87位的W突變?yōu)镕、Y或H;第194位的V突變?yōu)镮、L或E; 第331位的R突變?yōu)锳、K或M;或者，醇脫氫酶突變體的氨基酸序列具有發(fā)生突變的氨基酸 序列中的突變位點(diǎn)，且與發(fā)生突變的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
[0010] 進(jìn)一步地，醇脫氫酶突變體的氨基酸序列為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQID NO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO:7 所示的氨基酸序列；或者 醇脫氫酶突變體的氨基酸序列與SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性。 [0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種DNA分子，該DNA分子編碼上述任一種醇脫氫 酶突變體。
[0012] 進(jìn)一步地，DNA分子的序列為SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQ IDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16 或SEQIDN0:17;或者DNA分子的序列與SEQID N0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16 或SEQ IDNO: 17具有95%以上的同源性。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了一種重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒含有上述任一種DNA分 子的序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種醇脫氫酶突變體，其特征在于，所述醇脫氫酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO :9所示氨基酸序列發(fā)生突變的氨基酸序列，所述發(fā)生突變的氨基酸序列具有如下至少1 個(gè)突變位點(diǎn)：：第40位、第87位、第194位和第331位，且所述第40位的T突變?yōu)镾、A或 C ;第87位的W突變?yōu)镕、Y或H ;第194位的V突變?yōu)镮、L或E ;第331位的R突變?yōu)锳、K或 M ;或者，所述醇脫氫酶突變體的氨基酸序列具有所述發(fā)生突變的氨基酸序列中的所述突變 位點(diǎn)，且是與所述發(fā)生突變的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶突變體，其特征在于，所述醇脫氫酶突變體的氨基 酸序列為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列；或者 所述醇脫氫酶突變體的氨基酸序列與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列具有95%以上的 同源性。
3. -種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子編碼權(quán)利要求1或2中所述的醇脫氫酶突 變體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的序列為SEQ ID NO : 11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16 或 SEQ ID NO :17 ;或者 所述 DNA 分子的序列與 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO :16 或 SEQ ID NO :17 具有 95% 以上的同源性。
5. -種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒含有權(quán)利要求3或4所述的DNA分子的序 列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為pET-22b(+)、 pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-1Ia(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、 pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、 pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、 pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、 pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、 pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-l、 pGEX-6p-l、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwinl、pEZZ18、pKK232-18、 pUC-18 或 pUC-19。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求5或6所述的重組質(zhì)粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或 真核細(xì)胞；優(yōu)選所述原核細(xì)胞為大腸桿菌BL21細(xì)胞或大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。
9. 一種生產(chǎn)醇類化合物的方法，包括醇脫氫酶對(duì)酮類化合物進(jìn)行催化加氫以形成醇類 化合物的反應(yīng)步驟，其特征在于，所述醇脫氫酶為權(quán)利要求1或2所述的醇脫氫酶突變體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述酮類化合物為通式I所示的酮類化 合物：
其中，Rl選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜環(huán) 基、環(huán)狀雜焼基或環(huán)狀雜焼化焼基；R2選自焼基、環(huán)焼基、齒焼基或齒環(huán)焼基D
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醇脫氫酶突變體及其應(yīng)用。該脫氫酶突變體的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列發(fā)生突變的氨基酸序列，發(fā)生突變的氨基酸序列具有如下至少1個(gè)突變位點(diǎn)：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突變?yōu)镾、A或C；第87位的W突變?yōu)镕、Y或H；第194位的V突變?yōu)镮、L或E；第331位的R突變?yōu)锳、K或M；或者，醇脫氫酶突變體的氨基酸序列具有發(fā)生突變的氨基酸序列中的突變位點(diǎn)，且與發(fā)生突變的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。具有上述至少一個(gè)突變位點(diǎn)或者保留上述突變位點(diǎn)且與其具有90％以上氨基酸序列同源性的醇脫氫酶突變體，其立體選擇性和酶活性大大提高。
【IPC分類】C12P7-62, C12N1-21, C12N15-70, C12P17-18, C12N15-53, C12N9-04
【公開號(hào)】CN104531628
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410814234
【發(fā)明人】洪浩, 詹姆斯·蓋吉, 高峰, 劉立輝, 劉芳, 于文燕, 崔瑜霞, 唐芳榮, 張娜
【申請(qǐng)人】凱萊英醫(yī)藥集團(tuán)（天津）股份有限公司, 凱萊英生命科學(xué)技術(shù)(天津)有限公司, 天津凱萊英制藥有限公司, 凱萊英醫(yī)藥化學(xué)（阜新）技術(shù)有限公司, 吉林凱萊英醫(yī)藥化學(xué)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日