生型基因"異源或同源表達的產(chǎn)物。而"酶 突變體"是指與"野生型酶"相比，其具有序列和/或功能性質(zhì)的修飾（即改變的特征）。
[0040] "載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸的核酸分子，一種類型的載體是"質(zhì) 粒"，質(zhì)粒是其他的DNA片段可與其連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體， 其可將其他的DNA片段連接至病毒基因組。某些載體整合至宿主細胞基因組中，并得以與 宿主基因組一起復(fù)制。并且，某些載體能指導(dǎo)與其可操作連接的基因的表達，一般使用的這 樣的表達載體為質(zhì)粒形式。在本發(fā)明中，可交互使用"質(zhì)粒"和"載體"。
[0041] "重組載體"是指已連接了基因的表達載體。在本發(fā)明中，可交互使用"重組質(zhì)粒" 和"重組載體"。
[0042] 引物，又名引子。是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反 應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3' -OH上， 核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3'-0H，必須是游離的。之所以需要引物是因為 在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。引物是人工合成的 兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感 興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。DNA上攜帶有編碼蛋白質(zhì)氨基酸信息的核苷酸 序列的鏈稱為正義鏈，又稱編碼鏈。另一條鏈核苷酸序列與正義鏈互補，稱為反義鏈。一般 將與正義鏈互補的一個引物成為上游引物，與反義鏈互補的一個引物稱為下游引物。
[0043] 纖維素酶，纖維素酶是指能降解纖維素0-1，4_葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維 二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶的主要組分是內(nèi)切 0-1，4_葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。前兩種酶主要溶解纖維，后一種酶將 纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，適當(dāng)調(diào)節(jié)組合物（即對組分酶系）中這三種主要成分活性的比 例，實現(xiàn)完成纖維素的降解。
【附圖說明】
[0044] 圖1(a)為編碼葡萄糖苷酶的其中兩個基因的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖；
[0045] 圖1(b)為編碼葡萄糖苷酶的另外兩個基因的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中， b所示為G8221基因，a，c和d所示為其他基因。
【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0047] 實施例1:
[0048] 首先將檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16的全基因組測序，通過生物信息學(xué)方 法以所有霉菌屬產(chǎn)生的葡萄糖苷酶蛋白序列建庫，利用blastx在檜狀青霉全基因組中 進行搜索，并進行歸類得到多個胞外分泌的葡萄糖苷酶的序列，如圖1(a)和1(b)所 示，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法分析將這幾個胞外分泌蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)其中一個基 因G8221的量最高，從而得到目的序列為檜狀青霉H16中表達量最高的胞外分泌0 -葡萄 糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，DNA分子序列如SEQIDNO:8所示。
[0049] 實施例2 :
[0050] 利用分子模擬軟件Discoverystudio將檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16 的 0-葡萄糖苷酶和熱穩(wěn)定性極好的黑曲霉（Aspergillusniger)CGMCC3. 316的0-葡萄 糖苷酶進行建模，構(gòu)建3D模型。用以下方法進行突變位點選擇：a.將距離葡萄糖苷 酶loop區(qū)最近的甘氨酸突變成脯氨酸；b.將檜狀青霉和黑曲霉CGMCC3. 316的0 -葡萄 糖苷酶進行3D結(jié)構(gòu)比對，觀察差異位點。根據(jù)以上突變方案設(shè)計突變引物，以含有野生型 0-葡萄糖苷酶DNA序列（SEQIDNO:8)的重組質(zhì)粒為模板進行突變。利用分子模擬軟件 對0 _葡萄糖苷酶進行理性設(shè)計，選定突變位點，能有效的節(jié)省突變位點篩選的時間，提高 突變效率。
[0051] 上述構(gòu)建方法中所述表達載體指pET15、pET22或pET28等。
[0052] 1、構(gòu)建pET28a(+)-bgll:編碼野生型0-葡萄糖苷酶（氨基酸序列SEQIDN0:1) 的野生型基因（核苷酸序列SEQIDN0:8)的重組載體
[0053]利用引物G8221F:5'-ATAGCTAGCATGCTCTCCAAATTGCAACATC-3'（SEQ IDN0:15)和G8221R:5'-ATACTCGAGTCAAACAGTGAAAGTGTCTGTT-3'（SEQID NO: 16)，以檜狀青霉（Penicilliumpiceum)H16的基因組為模板，進行PCR擴增后得到野生 型基因序列（SEQIDNO:8)，將野生型基因序列（SEQIDNO:8)和pET系列的一種表達載體 pET28a分別使用NheI和XhoI酶進行酶切后，純化回收酶切后的野生型基因片段和pET 載體，并將野生型基因片段連接到pET28a載體上得到連接子pET28a(+)-bgll。將該連接 子pET28a(+)_bgll轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliDH5a中，對得到的轉(zhuǎn)化子測序驗證是否為正 確的基因克隆（與核苷酸序列SEQIDN0:8相同），挑選含有正確序列的相應(yīng)菌株E.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-bgl1大量培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒即得到大量正確的pET28a(+)-bgl1的 重組載體（氨基酸序列SEQIDN0:1，核苷酸序列SEQIDN0:8)，以該pET28a(+)-bgll的 重組載體為模板進行后續(xù)突變基因的構(gòu)建。
[0054] 采用定點突變方法，以野生型基因片段的重組載體為模板，通過設(shè)計突變引物進 行突變。上游引物設(shè)計中將突變位點作為中心，左右各12-30個堿基，下游引物為上游引物 的反向互補序列。之后利用突變引物重組質(zhì)粒進行高保真PCR擴增。得到的PCR產(chǎn)物是 一個缺失的環(huán)狀，即是線性的重組載體，本發(fā)明采用的Thermo公司生產(chǎn)的phusion酶通過 突變引物把重組質(zhì)粒擴增了全長，所以得到PCR產(chǎn)物是環(huán)狀的（包含突變的基因序列和載 體），將該PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5a細胞中后這個線性的重組載體又會自動修復(fù)成為 和重組載體一樣的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
[0055] 2、構(gòu)建pET28a(+)-bgll/Q325R
[0056] 利用突變引物Q325R_F:5'-GCAGCTTGGTATCTTGTTGGCCGGGATCAAGGCTAC CCATCTGTA-3'（SEQIDN0:17)和Q325R_R:5'-TACAGATGGGTAGCCTTGATCCCGGCC MCAAGATACCAAGCTGC-3'（SEQID勵：18)，以口￡128&(+)^^11為模板，進行高保真卩0? 擴增，得到pET28a(+)-bgll/Q325R(氨基酸序列SEQIDN0:2,核苷酸序列SEQIDN0:9)。 此時，pET28a(+)-bgl1/Q325R為一線性的重組載體。
[0057] -些實施例中，可利用如下表1和表2所示，采用Thermo公司phusion酶進行高 保真PCR擴增：
[0058] 表1PCR擴增體系
[0059]
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其含有一種酶，其特征在于，所述酶具有葡萄糖苷酶的活性，所述葡萄 糖苷酶的活性在纖維素降解中提供降解的功能，所述酶為如下（a)或（b)的蛋白質(zhì)： (a) 其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示， (b) 在（a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有葡萄糖苷 酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述酶為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列的第100位的甘氨酸被取代為脯氨酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述酶為SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列的第172位的甘氨酸被取代為脯氨酸。
4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述酶為以下四種蛋白質(zhì)中的任意一種 蛋白質(zhì)： SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第325位的谷氨酰胺被取代為精氨酸； SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第444位的蘇氨酸被取代為賴氨酸； SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第618位的天冬氨酸被取代為谷氨酰胺；或者， SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的第629位的谷氨酸被取代為谷氨酰胺。
5. -種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子編碼如權(quán)利要求1?4任一項的所述酶。
6. -種重組載體，其特征在于，其含有權(quán)利要求5所述的DNA分子和與所述DNA分子連 接的用于表達的調(diào)節(jié)序列。
7. 宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權(quán)利要求5所述的DNA分子或權(quán)利要求6 所述的重組載體。
8. -種產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法，其特征在于，包括： 步驟一、從檜狀青霉（Penicillium piceum)H16中克隆得到如SEQ ID NO :8所示的核 苷酸序列，并將所述多核苷酸序列連接到用于表達的調(diào)節(jié)序列上，構(gòu)建得到帶有所述核苷 酸序列的連接子，之后通過將所述連接子轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，得到含有SEQ ID NO :8所示的 核苷酸序列的重組載體；以及， 步驟二、利用突變引物，以步驟一得到的所述重組載體為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng) 方法進行循環(huán)延伸擴增得到帶有編碼酶突變體的核苷酸序列的PCR產(chǎn)物，之后通過將所述 PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，得到含有突變位點的重組載體。
9. 如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法，其特征在于，所述步 驟二中，將所述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細胞中之前，還包括將所述PCR產(chǎn)物利用Dpnl內(nèi)切酶 于溫度37°C下處理3h。
10. 如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)生編碼酶突變體的核苷酸序列的方法，其特征在于，所述步 驟二中，所述突變引物包括：其中一條引物的堿基序列如SEQ ID NO :25所示，另一條引物 的堿基序列如SEQ ID N0:26所示，SEQ ID N0:25的堿基序列與SEQ ID N0:26的堿基序列 反向互補；或者， 其中一條引物的堿基序列如SEQ ID NO :27所示，另一條引物的堿基序列如SEQ ID NO: 28所示，SEQ ID NO :27的堿基序列與SEQ ID NO :28的堿基序列反向互補。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組合物，其含有一種酶，該酶具有葡萄糖苷酶的活性，在纖維素降解中提供降解的功能，該酶為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。編碼酶的DNA分子。重組載體，其含有DNA分子和與其連接的用于表達的調(diào)節(jié)序列。宿主細胞，其含有DNA分子或重組載體。本發(fā)明的氨基酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的β-葡萄糖苷酶突變體，與β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列SEQ ID NO：1)相比，熱穩(wěn)定性提高，在酶系復(fù)配中能夠提高復(fù)配酶液整體水解率。CGMCC No.833920131015
【IPC分類】C12R1-19, C12N9-42, C12N1-21, C12N15-70, C12N15-56
【公開號】CN104531637
【申請?zhí)枴緾N201410603781
【發(fā)明人】張東遠, 宗志友, 高樂, 王國坤, 李晨, 崔超, 陳樹林
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年10月30日