專利名稱：一種調控蛋白SnpR及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物及利用其進行抗生素生物轉化生產的領域，特別涉及一種新型的調節(jié)蛋白SnpR及其基因，并通過SnpR調節(jié)啟動子SnpA的轉錄水平，從而提高了柔紅霉素C-14羥化酶的表達，從而實現(xiàn)在培養(yǎng)液中直接將柔紅霉素轉化成阿霉素。
背景技術：
柔紅霉素和阿霉素是臨床上重要的蒽環(huán)類抗生素，主要用于多種實體瘤和急性白血病的治療，在臨床上作為一線抗腫瘤藥物使用。阿霉素是柔紅霉素C-14位羥化的衍生產物，具有比柔紅霉素更廣的抗腫瘤譜和更小的毒副作用。目前工業(yè)上采用化學半合成法從柔紅霉素轉化生產阿霉素，從由微生物產生的柔紅霉素出發(fā)經過七步反應獲得阿霉素。總收率從柔紅霉素算起最高為40％，而在生產中一般為33％左右。不僅工藝復雜、轉化率低，而且污染環(huán)境嚴重。
國外主要研究了波賽鏈霉菌(S.peucetics)和鏈霉菌(S.sp.)C5這兩個菌株中的柔紅霉素和阿霉素代謝生物合成途徑，經過近二十余年的努力取得了許多研究成果。一般認為柔紅霉素C-14羥化酶基因doxA的表達產物是催化柔紅霉素轉化成阿霉素的關鍵酶，國外通過克隆實驗從波賽鏈霉菌29050和波賽鏈霉菌27952及鏈霉菌S.sp.strain C5中獲得了doxA。
目前在鏈霉菌中經過詳細分析并用于基因doxA表達的啟動子有金屬蛋白酶基因SnpA啟動子，并發(fā)現(xiàn)該啟動子受其調控蛋白SnpR調控(激活)，但未有將其應用在生物轉化阿霉素生產中的報道(J.Bacteriol.1996，178(11)3389，其中SnpR序列見Genbank，登錄號為AY072041)。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題之一即為提供一種新的調控蛋白SnpR及其基因，該SnpR蛋白可調節(jié)啟動子SnpA的轉錄水平，并提高了柔紅霉素C-14羥化酶的表達。
本發(fā)明人從國內柔紅霉素產生菌天藍淡紅鏈霉菌(Streptomycescoeruleorubidus)SIPI-1482基因中通過PCR的方法擴增了含核糖體結合位點的、大小為1.3Kb的編碼C-14柔紅霉素羥化酶的doxA基因及受SnpR調控的SnpA啟動子，測序后發(fā)現(xiàn)doxA基因序列和Genbank中報道的序列(登錄號為U50973)的同源性為100％；而本發(fā)明的SnpR序列和Genbank中報道的序列(登錄號為AY072041)的同源性為99.4％，氨基酸同源性為96.5％；啟動子SnpA同源性為100％。因此，本發(fā)明的調控蛋白SnpR是一個新的蛋白，編碼其的基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
而本發(fā)明的調控蛋白SnpR，是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種表達柔紅霉素C-14羥化酶的載體及其基因工程菌，其包括上述編碼調控蛋白SnpR的基因核苷酸序列。
本發(fā)明可利用現(xiàn)有技術將上述SnpR蛋白基因、啟動子SnpA及doxA基因序列串聯(lián)，克隆至載體中構建柔紅霉素C-14羥化酶的表達載體。并進一步利用該表達載體轉化宿主細胞，構建表達柔紅霉素C-14羥化酶的基因工程菌。
在本發(fā)明一優(yōu)選例中，從天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482基因組中擴增出帶有核糖體結合位點GGAGG序列的doxA基因，克隆至質粒pUC18。同時擴增出SnpA序列及SnpR激活蛋白的序列也置于pUC18中。將doxA與SnpA和SnpR三片段亞克隆至質粒pBluescript IIKS(-)(pBlue2KSM)構建成載體pYG905，再將此串聯(lián)片段(PstI-HindIII片斷)與含有硫鏈絲菌素(tsr)抗性基因的載體pYG57(PstI-HindIII大片段)連接構建重組質粒pYG908，轉化變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24原生質體，并在含30μg/ml硫鏈絲菌素(tsr)的R2YE培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，得到本發(fā)明的表達載體及基因工程菌。
本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供上述編碼調控蛋白SnpR的基因在利用柔紅霉素生物轉化制備阿霉素中的應用。
換言之，本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供一種將柔紅霉素生物轉化為阿霉素的新方法。
該方法利用上述的表達載體質粒pYG908轉化宿主細胞為轉化體，培養(yǎng)轉化體，該轉化體發(fā)酵將柔紅霉素生物轉化成阿霉素。
眾所周知，該宿主細胞通常為不產柔紅霉素的鏈霉菌屬細胞，本發(fā)明優(yōu)選變鉛青鏈霉菌TK24，由此構建成的轉化體為基因工程菌pYG908/TK24。
本發(fā)明從已公開的國內柔紅霉素產生菌天藍淡紅鏈霉菌(Streptomycescoeruleorubidus)SIPI-1482基因中克隆了轉錄調控蛋白SnpR激活的金屬蛋白酶基因SnpA啟動子，并證明受SnpR調節(jié)的SnpA啟動子的效率高。由此通過該新型調控蛋白SnpR調節(jié)啟動子SnpA的轉錄水平，大大升高的轉錄水平提高了柔紅霉素C-14羥化酶的表達，從而實現(xiàn)在培養(yǎng)液中直接將柔紅霉素轉化成阿霉素。


圖1SnpR+SnpA的PCR擴增電泳圖，其中1.2.3分別為天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482基因組DNA為模板，退火溫度為62.8℃，65.5℃，68℃的PCR圖，4為DNA分子量標準DL3000。
圖2重組表達質粒pYG908的構建圖譜。
圖3pYG908的酶切驗證圖譜，其中1.λDNA(HindIII)，2.DL3000，3.pYG908(EcoRI-PstI)，4.pYG908(PstI-HindIII)。
圖4表達質粒pYG908的PCR驗證圖譜，其中1.2.3為以pYG908為模板，分別以Sa+da，da+ds，Sa+Ss為引物，4.DL3000，5.λDNA(HindIII)，6.7.8為以變鉛青鏈霉菌TK24為模板，分別以Sa+da，da+ds，Sa+da為引物，9.pYG905為模板，Sa+da為引物其中S代表SnpR+SnpA，d代表doxA，s代表sense(正向)，a代表antisense(反向)。
圖5本發(fā)明工程菌pYG908/TK24表達產物的SDS-PAGE圖，其中1.pYG908/TK24，2.對照工程菌pYG57/TK24，3.TK24，4.蛋白標準分子量Mark。
圖6本發(fā)明工程菌pYG908/TK24的CO結合差光譜圖。
圖7A～C本發(fā)明工程菌pYG908/TK24及對照菌發(fā)酵產物的HPLC圖。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明。
下列實施例中的材料與方法為所采用的分子克隆技術參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。
所使用的工具酶均購自Takala公司，具體的反應條件和使用的方法均參考商品說明書。
所使用的膠回收試劑盒購自上海生工公司，使用方法參考商品說明書。
下面的商品化質粒和大腸桿菌株用于DNA文庫構建和基因克隆。
pUC18(Takala，日本)pBluescript II KS(-)(可從Promega公司購得)pYG57(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35(1)13)變鉛青鏈霉菌TK24(可從ATCC購得)
未特殊說明的培養(yǎng)基和試劑均為常規(guī)市售產品。
實施例1 doxA基因及snpR+snpA的PCR擴增及測序結果以已公開的天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482基因組為模板，對于doxA基因采用97℃ 5min，95℃ 30s，72℃ 5min，循環(huán)30次，72℃ 10min進行擴增，能擴增出單一的目的條帶，大小為1.3Kb左右。而snpR+snpA的擴增采用了梯度PCR，設計的引物為正向引物CGGAATTCGCGCATCGATGACTCCTCGAG(下劃線為EcoRI)，反向引物AACTGCAGGTACCGCCGACCCGCTGCAT(下劃線為PstI)。退火溫度分別為62.8℃，65.5℃，68℃，從圖1中可以看出在62.8℃沒有擴增出目的條帶。為增強擴增特異性，采用了68℃退火。
對上述含核糖體結合位點的doxA基因進行了測序，發(fā)現(xiàn)它的序列和Genbank中報道的序列(登錄號為U50973)的同源性為100％，而SIPI-1482來源的snpR序列和Genbank中報道的序列(登錄號為AY072041)的同源性為99.4％(SEQ ID No.1)，氨基酸同源性為96.5％(SEQ ID No.2)，啟動子snpA同源性為100％。
實施例2 重組質粒構建、酶切驗證及P C R檢驗將上述doxA與snpA和SnpR基因序列克隆至pUC18。將其中切下來的doxA與snpA和SnpR三片段亞克隆至質粒pBluescript II KS(-)，再將此串聯(lián)片段(PstI-HindIII片斷)與含有硫鏈絲菌素(tsr)抗性基因的載體pYG57(PstI-HindIII大片段)連接構建重組質粒pYG908，轉化TK24原生質體，并在含30μg/ml硫鏈絲菌素(tsr)的R2YE培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，得到本發(fā)明的表達載體及基因工程菌pYG908/TK24，重組質粒pYG908的構建過程參見圖2所示。
對重組質粒pYG908用相應的酶均能切出snpR+snpA及doxA的片段，及它們兩者的串聯(lián)片段(圖3)。通過對重組質粒進行稀釋為模板，引物的不同組合Sa、da、ds、Ss，其序列分別為SsCGGAATTCGCGCATCGATGACTCCTCGAG(EcoRI)，SaAACTGCAGGTACCGCCGACCCGCTGCAT(PstI)，dsGGAATTCGGAGGGGTGCCTCATGAGCGGCGAG(EcoRI)，daCCCAAGCTTCCATCAACGCAGCCAGACGG(HindIII)，也均能擴增出相應的目的片段(大小為1.3Kb)及串聯(lián)片段(大小為2.6Kb)，而對照TK24均不能擴增出來(圖4)。由此判定鏈霉菌表達質粒構建正確。
實施例3 重組蛋白的表達將基因工程菌pYG908/TK24接入YMB培養(yǎng)基(配方參見鏈霉菌操作手冊)20ml(+tsr 30μg/ml)，30℃，250r/min搖床振蕩培養(yǎng)2d后作為種子，然后以10(v/v)％接種量接入上述培養(yǎng)基中后繼續(xù)培養(yǎng)2d，離心(10000r/min，10min)收集菌絲體，再用100mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗滌菌絲體，然后超聲破碎(工作5s，停5s，循環(huán)80次)，離心后收集上清，用于SDS-PAGE蛋白電泳分析。
如圖5所示，從菌絲體的蛋白電泳結果分析可知基因工程菌pYG908/TK24產生了47kD左右的條帶，大小和理論上編碼423個氨基酸的柔紅霉素C-14羥化酶基因的大小46.7k D相似，對照工程菌pYG57/TK24(由表達質粒pYG57轉化TK24菌株所得)為doxA基因協(xié)同Dnrv作用受ermE啟動子控制的工程菌，其45KD左右的條帶與對照TK24沒有明顯的區(qū)別，說明不產生柔紅霉素C-14羥化酶。
實施例4 CO結合差光譜分析(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35(1)13)pYG908/TK24工程菌株在上述YMB培養(yǎng)2天后轉接至GMS培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)兩天后收集菌絲，勻漿處理。以TK24作為對照進行CO結合差光譜分析實驗。實驗樣品和對照及參比先用連二硫酸鈉(Na2S2O4)進行還原，然后再用樣品和對照通CO 3min(各自參比均不通氣)，400～500nm進行掃描。
從CO結合差光譜(圖6)可以看出，pYG908/TK24在450nm處有一小峰，這從另一個角度證明C-14柔紅霉素羥化酶基因得以表達。因為C-14柔紅霉素羥化酶基因是一P450氧化酶，當用連二硫酸鈉還原以后再用CO還原在450nm處有較小的一吸收峰。
實施例5 基因工程菌發(fā)酵轉化柔紅霉素為阿霉素從斜面上將實施例2所得基因工程菌pYG908/TK24及對照TK24菌株的新鮮孢子接種到20ml YMB(工程菌株培養(yǎng)時還要加5μg/ml tsr)培養(yǎng)基中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)2d后作為液體種子。將上述液體種子以10％(v/v)接種量接入GMS培養(yǎng)基(工程菌株培養(yǎng)時還要加5μg/ml tsr)后，在相同條件下培養(yǎng)3d后加入柔紅霉素到終濃度為2μg/ml，然后繼續(xù)培養(yǎng)3d后停止發(fā)酵。然后將培養(yǎng)液用5mol/L NaOH調節(jié)pH到8.5，加入等體積抽提劑(氯仿∶甲醇＝9∶1)后在30℃、220r/min抽提30min。離心(Beckman AvantiJ-25，轉子JA17，8,000r/min，10min)分離上述抽提混合液，棄去上層的水相和菌體，收集得到的有機相溶液在旋轉蒸發(fā)儀上抽干，紅色產物用適當體積甲醇溶解，然后對該產物進行HPLC分析。
將柔紅霉素作為底物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基，通過HPLC圖(見圖7)可以看出對照TK24菌沒有產生和阿霉素(英文縮寫dxr)保留時間相同的峰(圖7B)，但仍可以看見殘留的柔紅霉素(英文縮寫dnr)的峰，同時也看到柔紅霉素峰之前有一保留時間和它很接近的峰，根據(jù)文獻報道有可能為酮還原酶作用柔紅霉素產生的產物。而本發(fā)明基因工程菌能產生一保留時間和阿霉素標準樣品(圖7A)保留時間相同的峰(見圖7C)，可初步認為是阿霉素。同時柔紅霉素的峰仍然存在，說明也有部分沒有轉化，同時也有其他副產物生成。
序列表<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院<120>一種調控蛋白SnpR及其基因和應用<130>051760C<160>2170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1306<212>DNA<213>天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)<220>
<221>promoter<222>(1)..(267)<223>
<220>
<221>CDS<222>(268)..(1206)<223>
<400>1gaattcgcgc atcgatgact cctcgaggtg gggggatgag tcagacatcg tgagtgtccg 60tgcccgtacg gccgttgtga tgatggcaac cgccgatagg gccgccctat ccccctccgt120ccccacctgc cccgccctgc ccggcggccc cggccggggc ccctcccgat ccgggccgac180gcctcgcgcc gtgaaggccg atggtcctga tcggtcgcca tttgtatgtc tggtgaaggc240tgaacttccg ccttaccctc ccaggac atg gag ctt gag gtc agg cac ctc agg294Met Glu Leu Glu Val Arg His Leu Arg
1 5gcg ctg tgc gcc atc gcc gac acc ggc agc ctg cac cgc gcg gca cgc 342Ala Leu Cys Ala Ile Ala Asp Thr Gly Ser Leu His Arg Ala Ala Arg10 15 20 25caa ctg gga gtg aca cag ccc tcg ttg agc acg cag ctg cgg cgc atc 390Gln Leu Gly Val Thr Gln Pro Ser Leu Ser Thr Gln Leu Arg Arg Ile30 35 40gaa cac gag ctg ggc ggt gcc ctg ttc gtc cgg gcc cgc gcc ggc tgc 438Glu His Glu Leu Gly Gly Ala Leu Phe Val Arg Ala Arg Ala Gly Cys45 50 55cgc ccc aca ccg ctg ggc cgg ctg gtg ctc agt cgt gcc cgc ccc ctg 486Arg Pro Thr Pro Leu Gly Arg Leu Val Leu Ser Arg Ala Arg Pro Leu60 65 70gtg gcc gaa ttg cgc tcc ctc gtc agc gag gcc cgc gcc gcc gcc gtc 534Val Ala Glu Leu Arg Ser Leu Val Ser Glu Ala Arg Ala Ala Ala Val75 80 85ggc gga cgc cag ctg cgc gtc ggc tcc acg gcc agc cgg gcc ctg gcg 582Gly Gly Arg Gln Leu Arg Val Gly Ser Thr Ala Ser Arg Ala Leu Ala90 95 100 105ggc tgg ctg cgc cgg ctc cgc cgg cac tgg cag gaa ccc acc ctg cac 630Gly Trp Leu Arg Arg Leu Arg Arg His Trp Gln Glu Pro Thr Leu His110 115 120atg gac gtc tcc gcc aac gcc ctg ctg cgc atg gtg gcc gac ggc cac 678Met Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Arg Met Val Ala Asp Gly His125 130 135ctc gac gtc gcc ttc gtg cac gag gtc gag ggc agc ccg ctg cgc gtc 726Leu Asp Val Ala Phe Val His Glu Val Glu Gly Set Pro Leu Arg Val140 145 150ccc gaa ggg ctc cgg gtc cgc gta ctg gtc cag cgg gaa ccg cag ttc 774Pro Glu Gly Leu Arg Val Arg Val Leu Val Gln Arg Glu Pro Gln Phe155 160 165gtc tgc ctg ccg gcc gac cac ccg gcc gcg gcg aag ccg gtc gta cgc 822Val Cys Leu Pro Ala Asp His Pro Ala Ala Ala Lys Pro Val Val Arg170 175 180 185
ctc gcc gac ctg gcc cac gac cgc tgg atg atc gac ccc acc gtc gac 870Leu Ala Asp Leu Ala His Asp Arg Trp Met Ile Asp Pro Thr Val Asp190 195 200ggc gag tgg gac gcg gtg cgc cgg gtc ctg cgc gcc gag gga ctc gac 918Gly Glu Trp Asp Ala Val Arg Arg Val Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asp205 210 215ccg cgc atc ctg cac ggg gac tac cac acc gcc gcg tcc ctg gtc gcc 966Pro Arg Ile Leu His Gly Asp Tyr His Thr Ala Ala Ser Leu Val Ala220 225 230acc ggc gag gtc gtg acc gtg gtc cag ccg acc tcg ccc tcc cgc gcc 1014Thr Gly Glu Val Val Thr Val Val Gln Pro Thr Ser Pro Ser Arg Ala235 240 245gag acg gcc gtc cgc cgg ctg cac ggc gac ccg ctc ggc gta cgg ctg 1062Glu Thr Ala Val Arg Arg Leu His Gly Asp Pro Leu Gly Val Arg Leu250 255 260 265ctg ctg gcg gcc cgc acg gac acg gaa ctg gag ggc gtc tac ccc gac 1110Leu Leu Ala Ala Arg Thr Asp Thr Glu Leu Glu Gly Val Tyr Pro Asp270 275 280ctc gcg gag gcc tac ggg gag gtc gcc cgg cag gcc ccg gcg tac cgg 1158Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Glu Val Ala Arg Gln Ala Pro Ala Tyr Arg285 290 295gag tgg ctg gaa cgc agt ggg tcg ggg gca ctc gtc cca gcc ctc ccg 1206Glu Trp Leu Glu Arg Ser Gly Ser Gly Ala Leu Val Pro Ala Leu Pro300 305 310tgacgaccgc gtaccccggc ccccttcccg taacccgacg ggagatgccc tgggggggga1266cggcggtgcg ggggatgcag cgggtcggcg gtacctgcag 1306<210>2<211>313<212>PRT<213>天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)<400>2
Met Glu Leu Glu Val Arg His Leu Arg Ala Leu Cys Ala Ile Ala Asp1 5 10 15Thr Gly Ser Leu His Arg Ala Ala Arg Gln Leu Gly Val Thr Gln Pro20 25 30Ser Leu Ser Thr Gln Leu Arg Arg Ile Glu His Glu Leu Gly Gly Ala35 40 45Leu Phe Val Arg Ala Arg Ala Gly Cys Arg Pro Thr Pro Leu Gly Arg50 55 60Leu Val Leu Ser Arg Ala Arg Pro Leu Val Ala Glu Leu Arg Ser Leu65 70 75 80Val Ser Glu Ala Arg Ala Ala Ala Val Gly Gly Arg Gln Leu Arg Val85 90 95Gly Ser Thr Ala Ser Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Arg Leu Arg100 105 110Arg His Trp Gln Glu Pro Thr Leu His Met Asp Val Ser Ala Asn Ala115 120 125Leu Leu Arg Met Val Ala Asp Gly His Leu Asp Val Ala Phe Val His130 135 140Glu Val Glu Gly Ser Pro Leu Arg Val Pro Glu Gly Leu Arg Val Arg145 150 155 160Val Leu Val Gln Arg Glu Pro Gln Phe Val Cys Leu Pro Ala Asp His165 170 175Pro Ala Ala Ala Lys Pro Val Val Arg Leu Ala Asp Leu Ala His Asp180 185 190Arg Trp Met Ile Asp Pro Thr Val Asp Gly Glu Trp Asp Ala Val Arg195 200 205Arg Val Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asp Pro Arg Ile Leu His Gly Asp210 215 220Tyr His Thr Ala Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Glu Val Val Thr Val225 230 235 240Val Gln Pro Thr Ser Pro Ser Arg Ala Glu Thr Ala Val Arg Arg Leu245 250 255His Gly Asp Pro Leu Gly Val Arg Leu Leu Leu Ala Ala Arg Thr Asp260 265 270
Thr Glu Leu Glu Gly Val Tyr Pro Asp Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Glu275 280 285Val Ala Arg Gln Ala Pro Ala Tyr Arg Glu Trp Leu Glu Arg Ser Gly290 295 300Ser Gly Ala Leu Val Pro Ala Leu Pro305 310
權利要求
1.一種編碼調控蛋白SnpR的基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQ ID No.1所示的堿基序列；2)編碼由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
2.一種調控蛋白SnpR，是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
3.一種表達柔紅霉素C-14羥化酶的載體，其包括權利要求1所述的編碼調控蛋白SnpR的基因核苷酸序列。
4.一種用于表達柔紅霉素C-14羥化酶的基因工程菌株，其是將權利要求3所述的表達載體轉化到變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24中得到的基因工程菌株。
5.如權利要求1所述的編碼調控蛋白SnpR的基因在利用柔紅霉素生物轉化制備阿霉素中的應用。
6.一種將柔紅霉素生物轉化為阿霉素的方法，其特征在于利用權利要求3所述的表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)轉化體，該轉化體發(fā)酵將柔紅霉素生物轉化成阿霉素。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于該宿主細胞為不產柔紅霉素的鏈霉菌屬細胞。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于該不產柔紅霉素的鏈霉菌屬細胞為變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24，該轉化體為權利要求4所述的基因工程菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼調控蛋白SnpR的基因核苷酸序列及該蛋白的氨基酸序列。提供了含有該基因的表達柔紅霉素C－14羥化酶的載體和基因工程菌，及其在利用柔紅霉素生物轉化制備阿霉素中的應用。并提供一種柔紅霉素生物轉化為阿霉素的新方法，通過克隆本發(fā)明SnpR蛋白基因，及受其調節(jié)的SnpA啟動子序列至質粒表達載體，來表達編碼柔紅霉素C－14羥化酶基因doxA，并轉化宿主細胞變鉛青鏈霉菌TK24可以在培養(yǎng)液中直接將柔紅霉素轉化成阿霉素。
文檔編號C07K14/195GK1962869SQ20051011013
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月9日 優(yōu)先權日2005年11月9日
發(fā)明者朱春寶, 謝麗萍, 吳大治, 胡又佳, 朱寶泉 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院