專利名稱：一種用于生物治療的“熱休克蛋白專用提取盒”的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高等生物體之所以能夠在復(fù)雜的環(huán)境中生存是因?yàn)闄C(jī)體具有抵御外源入侵的病原體和消除內(nèi)源變異細(xì)胞的能力。一旦這個(gè)能力減低或消退，機(jī)體就會生病或?qū)е滤劳觥?br> 高等生物體如哺乳動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng)具有體液免疫和細(xì)胞免疫的兩套機(jī)制。一種是以B淋巴細(xì)胞為介導(dǎo)的體液免疫，B淋巴細(xì)胞在脾臟和骨髓中發(fā)育成熟，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體能特異性地識別和結(jié)合外源性生物大分子，阻斷外源體對機(jī)體的侵害?？乖?抗體形成的復(fù)合物能夠激發(fā)機(jī)體的補(bǔ)體反應(yīng)和細(xì)胞反應(yīng)，對攜帶該外源生物大分子的病原體產(chǎn)生吞噬和降解以排除入侵的病原體。
另一種是以在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的T淋巴細(xì)胞為介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。抗原遞呈細(xì)胞將外源性病原體或內(nèi)源性變異細(xì)胞所攜帶的異類分子經(jīng)MHCI類和MHCII類途徑將抗原信息遞呈給CD8和CD4 T細(xì)胞，激發(fā)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTLs)。經(jīng)過MHC刺激轉(zhuǎn)化而成的細(xì)胞毒殺傷細(xì)胞能夠特異性地攻擊和消除攜帶抗原的外源性細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞還能分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，刺激巨噬細(xì)胞非特異性地吞噬外源病原細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞雖然能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng)但很難刺激CTLs激活啟動(dòng)細(xì)胞免疫，這是腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的原因之一。如果能夠?qū)Ⅲw液免疫和細(xì)胞免疫同時(shí)調(diào)動(dòng)起來就會極大地提高機(jī)體對消除外源性病原體和自身變異細(xì)胞的能力，使機(jī)體能夠戰(zhàn)勝和排除外源病原體或自身變異細(xì)胞使疾病消除恢復(fù)健康。
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白(HSP)具有識別和捕捉外源性生物大分子的能力。外源性生物大分子包括外來入侵的病原體，如細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒所攜帶的生物大分子等，還包括體內(nèi)由正常細(xì)胞發(fā)生突變(如腫瘤細(xì)胞等)而產(chǎn)生的變異細(xì)胞所攜帶的生物大分子。
熱休克蛋白(HSP)是存在于細(xì)胞漿內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一類家族性看家蛋白，根據(jù)HSP的分子大小和結(jié)構(gòu)特性可分為多個(gè)家族成員，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-gp96、HSP-110等。它們平時(shí)處于低水平的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)生理性、病理性或環(huán)境的突發(fā)性變化時(shí)，HSP的表達(dá)會急劇提高，因此熱休克蛋白又被稱為“應(yīng)激蛋白”。HSP通過參與蛋白質(zhì)的結(jié)合、折疊、亞單位的裝配、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及抗原遞呈對細(xì)胞的生長、分化、基因轉(zhuǎn)錄和自我保護(hù)發(fā)揮重要作用。
HSP目前被應(yīng)用在預(yù)防和治療傳染性疾病和腫瘤治療就是利用其具有結(jié)合外源或自身變異細(xì)胞所攜帶的變異蛋白質(zhì)或多肽分子群的特性。HSP結(jié)合外源病原體或自身細(xì)胞變異產(chǎn)生的腫瘤特異蛋白、多肽分子群，參與抗原遞呈而其HSP本身并不產(chǎn)生抗原性。T淋巴細(xì)胞最終根據(jù)HSP遞呈的外源分子、多肽來激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來攻擊和消除攜帶遞呈抗原的外源入侵病原體。因此HSP又被稱為“分子伴侶”。研究發(fā)現(xiàn)HSP-70、HSP-90、HSP gp96等不僅參與抗原的加工遞呈，而且還可作為抗原遞呈分子直接將抗原遞呈給T細(xì)胞，激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫。因此“HSP-多肽抗原復(fù)合體”不僅能激發(fā)機(jī)體對外源病原體產(chǎn)生體液免疫，同時(shí)還能產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，恢復(fù)和提高了機(jī)體的免疫監(jiān)視功能。HSP的這一重要特性奠定了對傳染性疾病及腫瘤免疫的個(gè)性化治療和預(yù)防的理論和應(yīng)用的基礎(chǔ)。
本發(fā)明是為了方便實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院從人或哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中提取熱休克蛋白及，或熱休克蛋白-多肽復(fù)合體而設(shè)計(jì)的一種“熱休克蛋白專用提取盒”。

發(fā)明內(nèi)容
通過運(yùn)用生物化學(xué)的方法，如親和層析的方法或ADP-agarose柱層析的方法(參考Peng et al.，Journal of Immunological Methods，204(1997)13-21)可非常簡便地、特異性地將HSP蛋白及HSPPC從病理組織、細(xì)胞中、從體外被病原體感染的組織及細(xì)胞中分離純化出來。利用可識別人或哺乳動(dòng)物熱休克蛋白的抗體，如HSP-70、HSP-90或HSP gp96抗體制成親和層析柱，將手術(shù)取出的腫瘤組織經(jīng)切碎、均漿后的細(xì)胞裂解液過親和層析柱，收集洗脫下的專一性吸附的HSP及HSPPC蛋白，經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)的進(jìn)一步純化后的HSPPC可注射回該腫瘤病人的體內(nèi)。以這種方式分離純化出來的熱休克蛋白結(jié)合有腫瘤細(xì)胞中變異了的蛋白和多肽分子群，將這種取之于腫瘤病人的HSP-腫瘤抗原多肽復(fù)合體注射回病人激發(fā)腫瘤病人對自身腫瘤的體液免疫和細(xì)胞免疫的雙重識別和攻擊，這種治療方式開辟了腫瘤個(gè)性化免疫治療的新形式。
“熱休克蛋白專用提取盒”就是為了滿足為腫瘤病人提取自身變異組織內(nèi)的變異蛋白和多肽激發(fā)病人對自身腫瘤的識別和攻擊，防止病毒攜帶者可能引起的交叉感染而提供給腫瘤病人專人專用實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)性化治療的便利工具。
將病毒感染的細(xì)胞在體外大量培養(yǎng)，將被病毒感染的細(xì)胞收集并裂解。細(xì)胞裂解液通過使用“熱休克蛋白專用提取盒”中提供的HSP親和層析柱，收集洗脫下的特異性結(jié)合病毒多肽分子群的HSPPC。以這種方式分離純化出來的HSPPC結(jié)合有病毒抗原多肽分子群，即為HSP-病毒抗原多肽復(fù)合體(HSPPC)。將同源細(xì)胞內(nèi)提取出來的HSPPC給已經(jīng)感染了該病毒的動(dòng)物注射能激發(fā)其機(jī)體抵抗病毒的能力，起到治療的作用。為尚未感染的同類動(dòng)物注射起到被動(dòng)免疫預(yù)防被感染的作用。
利用“熱休克蛋白專用提取盒”提取HSPPC的作用是激發(fā)機(jī)體對熱休克蛋白結(jié)合的抗原多肽的免疫識別和攻擊，HSPPC作為抗原的優(yōu)點(diǎn)是1.HSP本身并不參與免疫反應(yīng)，只有它結(jié)合的外源抗原分子才會引起免疫反應(yīng)，因此不會造成自身免疫，安全性好。
2.HSP所結(jié)合的是外源目標(biāo)病原體分子群，它們激發(fā)出的抗體是針對由外到內(nèi)的整個(gè)目標(biāo)病原體，對病原體所攜帶的抗原包括面廣。
3.使用HSPPC免疫不用搭配使用佐劑，簡便易行。
4.HSPPC可以引起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，生物有效性高。
5.從取出的病理標(biāo)本中提取HSPPC再注射回該個(gè)體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)和達(dá)到了有針對性地個(gè)性化治療的目的，專一性好。
6.在畜牧業(yè)防病治病中，通過體外大量培養(yǎng)目標(biāo)病原體感染的組織或細(xì)胞，從中提取HSPPC用于對目標(biāo)病原體引起的疾病的治療和預(yù)防，該方法可廣泛應(yīng)用在因各種病原體引起的傳染性疾病的治療和預(yù)防，普遍性好。
7.HSPPC分子群對機(jī)體無毒副作用，應(yīng)用性強(qiáng)。
8.應(yīng)用“熱休克蛋白專用提取盒”使得整個(gè)提取過程和操作變得簡單、快捷、高效、特異性強(qiáng)。
制備的免疫制劑可以從經(jīng)過偶聯(lián)了HSP-60抗體、或偶聯(lián)了HSP-70抗體、或偶聯(lián)了HSP-90抗體、或偶聯(lián)了HSP-pg96抗體的親和層析住上洗脫下來的HSPPC，使用它們的洗脫產(chǎn)物，如HSP70-抗原復(fù)合體、或HSP90-抗原復(fù)合體、或HSP gp96-抗原復(fù)合體作為免疫制劑的成分。
“熱休克蛋白專用提取盒”中提供的HSP親和層析柱可以使用一種或一種以上的HSP抗體以不同組合及，或不同比列偶聯(lián)在樹脂上，如將HSP-70抗體、HSP-90抗體和HSP gp96抗體三種抗體以相同的比例偶聯(lián)在樹脂上一同裝在一個(gè)親和層析柱內(nèi)。從該親和層析柱上洗脫下來的產(chǎn)物含有HSP70-抗原復(fù)合體、HSP90-抗原復(fù)合體和HSP gp96-抗原復(fù)合體，經(jīng)過透析除去多余的鹽分并測蛋白濃度。將含有這三種HSPPC并存的洗脫產(chǎn)物可直接成為免疫制劑中的成分，將它們直接或經(jīng)過HPLC進(jìn)一步純化后可作為免疫制劑成分。
具體實(shí)施例方式
“熱休克蛋白專用提取盒”的組成制備完成的HSP親和樹脂以每10ml/袋或20ml/袋或以10ml/根、20ml/根親和層析柱為一個(gè)包裝盒。為滿足不同的提取量需求還可制成和提供不同的包裝規(guī)格放置在4℃冷庫中保存。
A.與熱休克抗體偶聯(lián)的樹脂可采用CNBr-Sepharose 4B，與其偶聯(lián)的抗體可以是HSP-60，或HSP-70，或HSP-90，或HSP gp96抗體等可識別熱休克蛋白家族的任意一種單一抗體制成親和樹脂及親和層析柱。
B.與CNBr-Sepharose 4B樹脂偶聯(lián)的抗體可以是HSP-60，或HSP-70，或HSP-90，或HSP gp96抗體等可識別熱休克蛋白家族的任意一種以上的抗體相互組合與樹脂偶聯(lián)制成的親和樹脂及親和層析柱。
*可配制1000ml平衡液的固體包裝5袋(每袋使用時(shí)只需加入1000ml蒸餾水并按照說明調(diào)節(jié)PH)*10X洗脫液500ml/瓶*10X透析液500ml/瓶。
*“熱休克蛋白專用提取盒”可包括或不包括。
防腐保存制備好的親和層析柱如需放置一段時(shí)間，應(yīng)使用防腐液(含有1/10000迭氮鈉的PBS)沖洗，使用防腐液浸泡的層析柱切勿冷凍，放置在4℃中保存以免干燥，1年之內(nèi)性能穩(wěn)定。
材料來源使用“熱休克蛋白專用提取盒”提取的HSP及、或HSPPC可以從人或哺乳動(dòng)物的如下來源提取1.手術(shù)切下的腫瘤組織。
2.體內(nèi)其它病理組織。
3.血液標(biāo)本中獲得的細(xì)胞4.在體外培養(yǎng)的被病原體感染的哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞株。
5.可能的其它來源。
分離純化操作過程將“熱休克蛋白專用提取盒”的包裝打開，取出10mlHSP親和層析柱安裝在冷室中或放置在4℃冰柜中的架子上固定好。層析柱的下端用管子連接紫外監(jiān)測器然后進(jìn)入收集瓶。將預(yù)冷的平衡液加到層析柱的頂端，保持柱下端的流速約為3ml/min，沖洗10分鐘后可用夾子下端管子等待上樣。
樣品的制備將組織塊剪成小碎塊，放到勻漿器中在冰浴中勻漿，用預(yù)冷的平衡液沖洗勻漿器并收集勻漿器內(nèi)的漿液。離心將漿液中的大塊組織及細(xì)胞碎片除去，取上清液加到親和層析柱上。保持柱下端的流速小于0.5ml/min，在此期間還可采取幾次分別中斷流出5分鐘的措施保障上清液中的HSP與樹脂偶聯(lián)的抗體充分地起反應(yīng)。當(dāng)上的組織細(xì)胞漿液全部流進(jìn)樹脂后再用平衡液沖洗親和柱，直至非特異性的蛋白從柱中全部被沖洗干凈為止，紫外吸收值OD280＜0.02。
洗脫液能將與親和柱中樹脂偶聯(lián)的HSP抗體反應(yīng)的HSP蛋白從柱上的抗體上解離下來。使用洗脫液將特異性被親和柱吸附的HSP蛋白洗脫并收集。經(jīng)過親和層析柱的一步法純化后，存在于組織或細(xì)胞裂解液中的HSP最大可達(dá)到1萬倍的富集濃縮。
親和層析是生物化學(xué)領(lǐng)域中一種非常成熟的常規(guī)技術(shù)，洗脫液的配制可根據(jù)不同的親和層析柱的具體情況按照由實(shí)驗(yàn)室摸索出來的最佳洗脫條件來制定，如洗脫液的PH呈較強(qiáng)的酸性，收集到的洗脫液應(yīng)該立刻用呈堿性的緩沖液予以中和，防止洗脫得到的蛋白變性。
由于經(jīng)過洗脫并中和后的收集物中含有高濃度鹽份，因此對洗脫收集組分要進(jìn)行透析除鹽。將收集組分裝入分子量透過值低于所收集蛋白的透析袋中對預(yù)冷的生理鹽水透析3次，每次2小時(shí)以上。
純化出的蛋白可直接用做免疫原或采用HPLC做更進(jìn)一步的純化。取樣做蛋白分析和濃度鑒定之后按照需求分裝，然后冷凍干燥保存在4℃。
操作流程為能夠簡明扼要地說明HSPPC的提取過程，將提取HSPPC的工藝流程以圖形的方式表示出來，附圖
是“提取HSPPC的工藝流程”圖。
經(jīng)過分離純化處理后的HSPPC可分裝在瓶中經(jīng)冷凍干燥后內(nèi)容物呈絮狀或粉末狀。瓶中的HSPPC保存在4℃冰箱中1年之內(nèi)效果不變。
使用時(shí)用注射用生理鹽水將瓶中的內(nèi)容物HSPPC溶解，做多點(diǎn)皮下、皮內(nèi)注射或黏膜內(nèi)注射。成人治療注射劑量范圍在5ug-1mg/次之間，免疫間隔2-8個(gè)星期。治療同時(shí)可搭配使用細(xì)胞因子、胸腺肽α1等免疫增強(qiáng)劑。注射四次為一個(gè)治療療程。預(yù)防保護(hù)性可為注射一次或多次，劑量范圍在1ug-1mg/次之間。注射間隔為1個(gè)星期至4個(gè)月之間。
家畜使用時(shí)使用注射用生理鹽水溶解瓶中的內(nèi)容物HSPPC，在動(dòng)物的四肢、背部、頸部等不同部位進(jìn)行多點(diǎn)皮下、皮內(nèi)注射或黏膜注射。根據(jù)動(dòng)物的體重差異，注射劑量在1ug-1mg/次范圍之內(nèi)。每次免疫間隔1-10個(gè)星期之間。作為預(yù)防和治療用可注射一次或多次。
實(shí)施例1目的使用“熱休克蛋白專用提取盒”快速、高效、特異性地從乳腺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織中提取HSPPC。從乳腺癌患者腫瘤組織中提取的熱休克蛋白結(jié)合有腫瘤細(xì)胞變異后產(chǎn)生的腫瘤特異性抗原，經(jīng)過提純后將病人的腫瘤抗原再回注到該病人體內(nèi)，用于調(diào)動(dòng)該病人的免疫系統(tǒng)對自身所患腫瘤的免疫監(jiān)控，激發(fā)該病人自身的體液免疫和細(xì)胞免疫對自身所患的腫瘤細(xì)胞做特異性的識別和攻擊，清除擴(kuò)散和彌散在全身各個(gè)部位的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到對腫瘤生物治療的目的。利用“熱休克蛋白專用提取盒”可方便醫(yī)院生物治療部門提取HSPPC為患有實(shí)體瘤的腫瘤患者提供個(gè)性化免疫治療的服務(wù)。提取出的乳腺癌HSPPC還可為該患者的直系女性親屬提供預(yù)防性免疫保護(hù)，使她們防患于未然。
取材和保存將手術(shù)切除的人乳腺癌腫瘤組織立即放置在4℃冰壺中帶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行HSPPC的提取。如不能馬上開展提取或還有多余的組織需要保存，將腫瘤組織置于密閉的容器中放置到-80℃的冰箱中或液氮中保存。
制備“熱休克蛋白專用提取盒”中的親和層析柱購買已活化的瓊脂糖凝膠樹脂CNBr-Sepharose 4B。
偶聯(lián)前處理稱取100g CNBr-Sepharose 4B用1mMo/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠樹脂再用偶聯(lián)緩沖液(0.1Mol/L NaHCO3，0.1Mol/L Na2CO3和0.5Mol/L NaCl，pH8.5)洗2次。
偶聯(lián)抗體到樹脂上處理完畢的凝膠樹脂與等體積含有10μMol/L HSP-70抗體的偶聯(lián)緩沖液混合裝在瓶中，旋緊瓶蓋以防溶液泄露，在4℃冷室中固定在搖床上溫和搖動(dòng)混合過夜。次日棄去溶液保留凝膠樹脂。
封閉樹脂上多余的結(jié)合位點(diǎn)向凝膠樹脂中加入封閉溶液(0.2Mol/L甘氨酸)直至浸沒瓶中樹脂，4℃下旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)，棄去溶液再以同樣方式做封閉反應(yīng)一次以徹底封閉Sepharose4B上未與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。用偶聯(lián)緩沖液和醋酸鹽緩沖液(0.1Mol/L NaCH2COOH和0.5Mol/L NaCl，pH4.0)交替清洗樹脂2次，再用0.15Mol/L PBS緩沖液(pH7.2)清洗凝膠樹脂2次。將偶聯(lián)好HSP-70抗體的瓊脂糖凝膠樹脂以每10ml的量分裝到層析柱中。避免裝柱時(shí)在樹脂床體中留有氣泡。制備完成的HSP-70親和層析柱使用封口膜將層析柱的上下兩端封閉以保持樹脂浸沒在PBS緩沖液中防止干燥。使用鋁塑薄膜將親和層析柱整個(gè)包裝起來防止污染。
制備“HSP-70蛋白專用提取盒”將每支包裝好的HSP-70親和層析柱放置到塑料盒中4℃冷庫或冰箱中保存，有效期1年。制備完成的親和層析柱不得冷凍，也不能放置在室溫下保存。制備完成的HSP-70親和層析柱隨時(shí)可供上樣做親和層析用?！癏SP-70蛋白專用提取盒”在運(yùn)輸?shù)倪^程中需放置在冰盒中。
組織液的制備將手術(shù)取得的乳腺癌組織剔去正常組織后切割成小碎塊放入-20℃冰箱中冷凍1小時(shí)，然后再將其置入勻漿器中在冰浴中研磨。向研磨器中逐漸加入20ml預(yù)冷的PBS緩沖液并繼續(xù)研磨。研磨液經(jīng)冷凍離心機(jī)8000rpm 10分鐘離心取上清液。離心下來的沉淀再用20ml預(yù)冷的PBS緩沖液分散并繼續(xù)研磨，研磨液離心收集上清夜。合并兩次離心的上清液過親和層析柱。
上親和層析柱將離心后的研磨上清液加到親和層析柱上，保持流速不超過0.5ml/min以保障上清夜中的HSP-70蛋白與親和柱上偶聯(lián)的HSP-70抗體得到充分反應(yīng)。待樣品流完后用大量的PBS流洗親和柱，其目的在于將雜蛋白洗脫干凈直至流出液的紫外吸收值OD280＜0.02。
洗脫親和物用0.1Mol/L的甘氨酸-鹽酸溶液(pH2.4)洗脫親和層析柱中與HSP-70抗體結(jié)合的蛋白。收集的洗脫組分迅速用0.1Mol/L Tris-Cl緩沖液(pH8.0)中和以免蛋白變性。
洗脫后的處理將收集的洗脫組分對預(yù)冷的生理鹽水透析3次，每次2小時(shí)以上。純化產(chǎn)物可取出小部分做分離純化和蛋白含量的鑒定。其余的可進(jìn)行分裝然后冷凍干燥保存。
分離物的鑒定利用親和層析的方法純化出的HSP70-乳腺癌抗原復(fù)合體可用高效液相色譜(HPLC)或聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫產(chǎn)物的純度，并用紫外分光光度法做蛋白含量的測定。
制備免疫制劑的分裝和保存從乳腺癌組織中分離純化出的HSP是一類結(jié)合有乳腺癌特異抗原多肽的HSP，即HSP-乳腺癌多肽抗原復(fù)合體。將它們以每5ug/安瓿分裝再冷凍干燥。
使用指導(dǎo)提純的HSP-乳腺癌多肽抗原復(fù)合體再注射回手術(shù)患者的體內(nèi)，HSPPC將特異性地激發(fā)該腫瘤病人對自身所患的乳腺癌細(xì)胞所攜帶的特異性抗原而產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的雙重功效。另外，大量的研究和觀察發(fā)現(xiàn)乳腺癌具有明顯的家族傾向性。利用分離純化的HSP-乳腺腫瘤多肽抗原復(fù)合體給該乳腺癌患者的直系女性親屬進(jìn)行預(yù)防性免疫，降低直系親屬中乳腺癌的發(fā)病率。
用注射用生理鹽水溶解安瓿中冷凍干燥的HSP70-乳腺癌多肽抗原復(fù)合體。每次在皮下或皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每次共注射5ug或5ug以上。相隔3星期后再進(jìn)行第二次注射，第三次和第四次免疫治療與前次免疫相隔4個(gè)星期，注射劑量和方式與第一次相同。治療方式為四次免疫為一個(gè)療程。
預(yù)防性注射為一次性免疫，每個(gè)直系女性親屬采取在皮下或皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射，一次共注射5ug HSPPC。
實(shí)施例2目的使用“熱休克蛋白專用提取盒”快速、高效、特異性地從因感染豬地方性流行性肺炎而死亡的病理臟器組織中提取HSPPC用于預(yù)防其它豬感染地方性流行性肺炎和對已感染的豬進(jìn)行治療。
豬地方性流行性肺炎是一種由支原體引起的流行性疾病，豬被傳染后死亡率很高。該病是集約化養(yǎng)殖場內(nèi)的常見疫病，每次發(fā)生會給養(yǎng)殖場帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。
制備“熱休克蛋白專用提取盒”中的親和樹脂購買已活化的瓊脂糖凝膠樹脂CNBr-Sepharose 4B。
偶聯(lián)前處理稱取100g CNBr-Sepharose 4B用1mMo/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠樹脂再用偶聯(lián)緩沖液(0.1Mol/L NaHCO3，0.1Mol/L Na2CO3和0.5Mol/L NaCl，pH8.5)洗2次。
偶聯(lián)HSP抗體到樹脂上處理完畢的凝膠樹脂分別加入等體積的含有10μMol/L豬HSP-70抗體的偶聯(lián)緩沖液和等體積含有10μMol/L含有豬HSP gp96抗體的的偶聯(lián)緩沖液在瓶中混合，旋緊瓶蓋以防溶液泄露。將混合了樹脂和抗體的瓶固定在搖床上在4℃的環(huán)境中溫和搖動(dòng)過夜。次日棄去溶液保留凝膠樹脂。
封閉樹脂上多余的結(jié)合位點(diǎn)向瓶中凝膠樹脂加入封閉溶液(0.2Mol/L甘氨酸)直至浸沒樹脂，在4℃下旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。棄去溶液，再向瓶中樹脂加入封閉溶液混合30分鐘后棄去溶液保留樹脂，經(jīng)此處理充分封閉Sepharose 4B上未與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。用偶聯(lián)緩沖液和醋酸鹽緩沖液(0.1Mol/L NaCH2COOH和0.5Mol/L NaCl，pH4.0)交替沖洗樹脂2次，再用大量0.15Mol/L PBS緩沖液(pH7.2)清洗凝膠樹脂2次。
HSP-70和HSP gp96親和樹脂制備完成后分裝在鋁塑薄膜袋中或塑料瓶中以防以防止污染和干燥。
制備“HSP-70和HSP gp96蛋白專用提取盒”將親和樹脂以10ml、20ml、50ml等不同量分裝到塑料瓶中裝入到盒中。包裝好的“HSP-70和HSP gp96蛋白專用提取盒”隨時(shí)可供使用?！癏SP-70和HSPgp96蛋白專用提取盒”不得冷凍并保存在4℃環(huán)境中有效期為1年。
取材和保存將患有嚴(yán)重流行性肺炎的豬的病理性肺臟取出，用水清洗干凈后用絞肉機(jī)絞碎。絞碎的組織放置在-20℃冰箱中冷凍1小時(shí)，然后再按照每500克組織加入500毫升預(yù)冷的蒸餾水用超聲破碎細(xì)胞，目的是要使細(xì)胞裂解釋放出胞內(nèi)溶液。將超聲后的組織細(xì)胞漿液以3000rpm/min離心15分鐘，收集上清液。離心后的沉淀再用預(yù)冷的300ml蒸餾水分散，經(jīng)過再次超聲及離心，收集上清液。將兩次離心的上清液合并用于與HSP-70和HSP gp96親和樹脂做親和反應(yīng)。
親和反應(yīng)“熱休克蛋白專用提取盒”中已偶聯(lián)好HSP-70和HSP pg96抗體的瓊脂糖凝膠樹脂50ml裝到瓶中，再加入肺組織裂解離心上清液，旋緊瓶蓋防止溶液泄露。將混和有抗體的樹脂和組織細(xì)胞裂解上清液的瓶固定在搖床上在4℃下溫和搖動(dòng)過夜。
裝柱及清洗次日將經(jīng)過一夜充分混合反應(yīng)好的樹脂裝到層析柱中，讓瓶中的反應(yīng)液從柱的下端出口緩緩流出，使樹脂沉積到柱中。避免柱中樹脂床內(nèi)留有氣泡。待最后余留的溶液進(jìn)入樹脂界面后，開始用大量的PBS流洗親和柱直至流出液的紫外吸收值OD280＜0.02，其目的在于將柱內(nèi)樹脂床中的雜蛋白清洗干凈。
洗脫親和物用0.1Mol/L的甘氨酸-鹽酸溶液(pH2.4)洗脫親和層析柱中與HSP-70抗體、HSP gp96抗體結(jié)合的蛋白，即HSP-70和HSP gp96結(jié)合的豬肺炎多肽抗原復(fù)合體。收集的洗脫組分迅速用0.1Mol/L Tris-Cl緩沖液(pH8.0)中和以免蛋白變性。
洗脫后的處理將收集的洗脫組分對預(yù)冷的生理鹽水透析3次，每次2小時(shí)以上。純化產(chǎn)物可取出小部分做分離純化和蛋白含量的鑒定。其余的可進(jìn)行分裝再冷凍干燥后保存。
分離物的鑒定利用親和層析的方法純化出的HSp70和gp96-抗原復(fù)合體可用高效液相色譜(HPLC)或聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫產(chǎn)物的純度，并用紫外分光光度法做蛋白含量的測定。
分離純化產(chǎn)物的分裝和保存將分離純化的HSP-70、gp96-豬肺炎多肽抗原復(fù)合體以1mg/安瓿分裝再進(jìn)行冷凍干燥。凍干后的純化產(chǎn)物呈現(xiàn)絮狀或粉末狀。保存在4℃中一年內(nèi)有效。
使用指導(dǎo)從病豬的肺組織中提取出來的熱休克蛋白HSP-70和HSP gp96結(jié)合了外來入侵的致病支原體的多肽抗原分子群。將它們提取出來用于對尚未感染的豬做預(yù)防性免疫注射，使豬被動(dòng)接種含有地方性流行性肺炎的抗原分子群。經(jīng)過免疫的豬當(dāng)遇到肺炎病原體時(shí)，體內(nèi)的淋巴細(xì)胞會對病原體所攜帶的抗原有所識別并激發(fā)劇烈的體液免疫和細(xì)胞免疫來殺滅和清除病原體，對流行性肺炎襲來時(shí)有抗病能力。
對沒有感染豬地方流行性肺炎的豬采取被動(dòng)免疫，每只豬在皮下或皮內(nèi)給予多點(diǎn)注射，共注射50ug/只/次。
結(jié)論熱休克蛋白中的HSP-70、HSP-90和HSP gp96具有結(jié)合外來異體分子的能力。它們將外來入侵的病原體外表面和內(nèi)部的異源分子群、機(jī)體自身變異的細(xì)胞外表面和內(nèi)部的變異分子群作為抗原遞呈給淋巴細(xì)胞，激發(fā)機(jī)體對外源致病體或自身變異細(xì)胞的排斥和攻擊，最后達(dá)到清除外源異物的目的。
由于熱休克蛋白結(jié)合的是外源性抗原分子群形成HSPPC，把它們作為目標(biāo)抗原免疫可以調(diào)動(dòng)被免疫者全身的抗體免疫和細(xì)胞免疫兩大系統(tǒng)對攜帶有目標(biāo)抗原的病原體或機(jī)體內(nèi)部變異了的細(xì)胞所攜帶的異類蛋白多肽進(jìn)行整體性地全方位地識別、攻擊和清除。調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)進(jìn)行有針對性地排除目標(biāo)病原體的效率高、安全性好。
目前在牲畜中多數(shù)致病體引發(fā)的流行性傳染病還沒有制備出高效疫苗。致病體，如流感病毒等在環(huán)境因素的影響下還保持著高頻率的突變，花費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)研制出的疫苗依然難以追趕病原體的高頻突變速率。導(dǎo)致養(yǎng)殖戶和飼養(yǎng)場在日常飼料中添加大量的抗生素以期望達(dá)到抗病的目的。由此引發(fā)的惡果是抗生素泛濫對食用肉和乳制品造成的污染。
利用“熱休克蛋白專用提取盒”從牲畜流行病造成的病理臟器中直接提取結(jié)合了致病體多肽抗原分子群的熱休克蛋白，在新疫情爆發(fā)時(shí)，建立快速對應(yīng)機(jī)制，無須對病原體進(jìn)行詳細(xì)分類鑒定就可以直接快速制備抗流行病的免疫疫苗，迅速遏止流行性疾病的快速蔓延。應(yīng)用“熱休克蛋白專用提取盒”建立對流行病的快速，有針對性的反應(yīng)還避免了使用大劑量的抗生素，降低化學(xué)藥物在體內(nèi)的殘留量，提高食用肉制品和奶制品的安全性。
權(quán)利要求
1.一種熱休克蛋白(heat shock protein簡稱HSP)及熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(heat shock protein peptide complexes簡稱HSPPC)專用提取盒。
2.利用可識別熱休克蛋白的抗體與固相樹脂相偶聯(lián)，制備出熱休克蛋白親和樹脂。
3.利用可識別熱休克蛋白的抗體與固相樹脂相偶聯(lián)，制備出熱休克蛋白親和層析柱。
4.與固相樹脂偶聯(lián)的熱休克蛋白抗體包括可識別熱休克蛋白家族中的任意成員，如HSP-60、HSP-70、HSP-90和HSP gp96等。
5.固相樹脂可同時(shí)與任意一種或多種熱休克蛋白抗體相偶聯(lián)制備成親和樹脂或親和層析柱。
6.制備出的熱休克蛋白親和樹脂或親和層析柱可單獨(dú)或與配制好的層析柱平衡液、洗脫液、透析液的母液，或與已稱量配制好的固體成分用于配置平衡液、洗脫液和透析液等，將它們配套組成“熱休克蛋白專用提取盒”。
7.應(yīng)用“熱休克蛋白專用提取盒”方便、快捷、高效及特異性地從人或哺乳動(dòng)物的病理組織、細(xì)胞或血液標(biāo)本中提取出的熱休克蛋白(HSP)及，或熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)。
8.應(yīng)用“熱休克蛋白專用提取盒”方便、快捷、高效及特異性地從人或哺乳動(dòng)物被外源性病原體包括細(xì)菌、衣原體、支原體、病毒等感染的體外培養(yǎng)的組織及細(xì)胞中提取出的熱休克蛋白(HSP)及，或熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)。
9.“熱休克蛋白專用提取盒”分離純化出來的熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)作為免疫原用于對人或哺乳動(dòng)物因外源性病原體(包括細(xì)菌、支原體、衣原體和病毒等)引起的感染性疾病的治療和預(yù)防。
10.“熱休克蛋白專用提取盒”分離純化出來的熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)作為免疫原用于對人或哺乳動(dòng)物因自身正常細(xì)胞變異(如腫瘤等)而引起的疾病的治療和預(yù)防。
11.“熱休克蛋白專用提取盒”分離純化出來的熱休克蛋白作為免疫原用于對人或哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的治療和預(yù)防。
12.“熱休克蛋白專用提取盒”用于從腫瘤患者手術(shù)切除的實(shí)體瘤組織中分離純化熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)用于該腫瘤患者的免疫個(gè)性化治療和對患者直系親屬的預(yù)防性免疫。
13.“熱休克蛋白專用提取盒”分離純化出來的熱休克蛋白-多肽復(fù)合體(HSPPC)作為免疫原的使用方式可為體內(nèi)使用，如皮下注射、皮內(nèi)注射、黏膜內(nèi)注射等；及體外使用，如鼻腔噴霧，吸入性肺黏膜免疫、黏膜腔涂抹等，但不局限于此。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備一種熱休克蛋白專用提取盒。該提取盒可以是由熱休克蛋白親和樹脂或親和層析柱單獨(dú)組成，或與實(shí)施親和層析所需配制的各種母液等配套組成。其目的是為了方便、快捷、高效、特異性地從組織或細(xì)胞中提取熱休克蛋白(heat shock protein)及、或熱休克蛋白－多肽復(fù)合體(heat shock protein complexes)。使用熱休克蛋白專用提取盒分離純化出來的熱休克蛋白—多肽抗原復(fù)合體用于因自身細(xì)胞變異、因外源性病原體感染以及自身免疫等疾病的治療和預(yù)防。
文檔編號C07K1/14GK1640887SQ200410000060
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者韓蘇, 許佐良 申請人:北京中天康泰生物科技有限公司