人熱休克蛋白gp96在制備篩查肝病的產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人熱休克蛋白gp96在制備篩查肝病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明公開檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明證明人熱休克蛋白可以作為一種新的肝硬化、肝癌標(biāo)志物。本發(fā)明公開的試劑盒對于肝硬化、肝癌的早期篩查、預(yù)防、治療和治療后監(jiān)測具有重大意義。
【專利說明】人熱休克蛋白gp96在制備篩查肝病的產(chǎn)品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人熱休克蛋白gp96在制備篩查肝病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 熱休克蛋白gp96,即GRP94 (glucose-regulatedprotein94)，是存在于真核生物 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子量約為96kDa的熱休克蛋白。它屬于HSP90家族，是胞質(zhì)HSP90的旁系 同源蛋白，約占細(xì)胞總蛋白的1%。在正常的生理?xiàng)l件下，gp96定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，也存 在細(xì)胞的質(zhì)膜上。gp96N端的21個(gè)疏水性氨基酸的信號(hào)肽介導(dǎo)gp96分子進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)中在蛋白酶的作用下將信號(hào)肽被切除，gp96分子通過C端的KDEL序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 的KDEL受體相互作用使gp96分子滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被加工。gp96在進(jìn)化過程 中是高度保守，成熟的gp96蛋白由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端結(jié)構(gòu)域，含有ATP結(jié)合區(qū)及結(jié)合抗 原肽的區(qū)域；帶電鉸鏈區(qū)，是gp96發(fā)揮活性必需的，具有調(diào)節(jié)gp96構(gòu)象的改變，帶電鉸鏈區(qū) 又可以分為E/D-密集序列和多聚賴氨酸重復(fù)序列，E/D-密集序列含有1-2個(gè)鈣離子結(jié)合 位點(diǎn)；中間結(jié)構(gòu)域，含有參與蛋白-蛋白互作用的亮氨酸拉鏈區(qū)和KEKE區(qū)；C端結(jié)構(gòu)域，含 有二聚體區(qū)，還有與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上受體結(jié)合的KEDL序列。
[0003] 肝硬化是臨床常見的慢性肝病，由一種或多種病因長期或反復(fù)作用形成的彌漫性 肝損害。在我國大多數(shù)由肝炎轉(zhuǎn)變肝硬化，少部分為酒精和血吸蟲導(dǎo)致肝硬化。早期肝硬 化肝臟代償功能較強(qiáng)可無明顯癥狀，后期則以肝功能損害和門脈高壓為主要表現(xiàn)，并有多 系統(tǒng)受累，晚期常出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染、脾功能亢進(jìn)、腹水、癌變等并發(fā) 癥而死亡。因此，迫切需要找到新的標(biāo)志物作為早期肝硬化的檢測指標(biāo)。
[0004]原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC，簡稱肝癌），在全世界范圍內(nèi) 發(fā)病率排在第六位，每年全世界的發(fā)病人數(shù)是62. 6萬，我國每年死于肝癌約11萬人，占全 世界肝癌死亡人數(shù)的45%。相對于高死亡率，早期肝癌的發(fā)現(xiàn)比例卻非常低。近年來，雖然 針對肝癌的治療手段不斷更新（包括手術(shù)切除、肝移植術(shù)、放射治療、介入治療、微創(chuàng)消融 治療等），但肝癌治療的總體療效并無明顯提高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響肝癌預(yù)后的最主要 因素。目前肝硬化、肝癌的檢測主要通過影像學(xué)、組織活檢等，血清學(xué)檢測的靈敏度和特異 性不高，多數(shù)患者一旦確診即為肝硬化或肝癌的晚期，失去了最佳的治療時(shí)期。因此，急需 挖掘?qū)Ω斡不?、肝癌早期篩查的分子標(biāo)志物和簡便易行的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供人熱休克蛋白gp96在制備篩查肝病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn) 品或輔助判斷疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0007] 所述人熱休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0008]上述應(yīng)用中，所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)包含人熱休克蛋白gp96和 /或人熱休克蛋白gp96的抗體；
[0009] 所述人熱休克蛋白gp96的抗體具體為人熱休克蛋白gp96的單克隆抗體、人熱休 克蛋白gp96的多克隆抗體或人熱休克蛋白gp96的基因工程抗體。
[0010] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)還包含通過酶 聯(lián)免疫吸附法測定人熱休克蛋白gp96含量所需的試劑中除人熱休克蛋白gp96和人熱休克 蛋白gp96的抗體之外的試劑和所需的儀器。
[0011] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述酶聯(lián)免疫吸附測定法為ELISA雙抗體夾心法；
[0012] 所述ELISA雙抗體夾心法中人熱休克蛋白gp96的抗體具體為人熱休克蛋白gp96 的單鏈抗體和/或人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體和/或標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白 gp96的多克隆抗體的二抗；
[0013] 所述標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗具體為酶標(biāo)記的抗所 述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗；
[0014] 所述酶標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗的酶可以催化底物 顯色；
[0015] 所述人熱休克蛋白gp96的單鏈抗體具體為gp96-scFv_comp抗體，該抗體的序列 如SEQIDNo.1所示，該抗體能特異性結(jié)合人熱休克蛋白gp96的N端；
[0016] 所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體具體的商品名稱為山羊多克隆抗體，該抗 體購自SantaCruzBiotech，產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-1794,該抗體特異性結(jié)合于人熱休克蛋白 gp96的C端；
[0017] 所述酶標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗具體的商品名稱為 兔抗山羊二抗-HRP，該二抗購自SantaCruzBiotech，產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-2922。
[0018] 含有人熱休克蛋白gp96編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌作 為制備人熱休克蛋白gp96所需的生物材料在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷 疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0019] 所述人熱休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述人熱休克蛋白gp96的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)任一所示：
[0021] 1)SEQIDNo. 3 所示的DNA分子；
[0022] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼人熱休克蛋白gp96的DNA分 子；
[0023] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼人熱休克蛋白gp96 的DNA分子。
[0024] 含有人熱休克蛋白gp96的抗體的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或 重組菌或人熱休克蛋白gp96的抗體的免疫原或抗原作為制備人熱休克蛋白gp96的抗體所 需的生物材料在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0025] 所述人熱休克蛋白gp96的抗體為人熱休克蛋白gp96的單克隆抗體或人熱休克蛋 白gp96的多克隆抗體或人熱休克蛋白gp96的基因工程抗體；
[0026] 所述人熱休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0027] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述疾病為肝硬化或肝癌。
[0028] -種篩查或輔助診斷疾病或輔助判斷疾病的預(yù)后的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍，該試劑盒包含檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)；
[0029] 所述人熱休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0030] 上述試劑盒中，所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)包含人熱休克蛋白gp96 和/或人熱休克蛋白gp96的抗體；
[0031] 所述人熱休克蛋白gp96的抗體為人熱休克蛋白gp96的單克隆抗體或人熱休克蛋 白gp96的多克隆抗體或人熱休克蛋白gp96的基因工程抗體。
[0032] 上述任一所述的試劑盒中，所述疾病為肝硬化或肝癌；
[0033] 所述試劑盒還包含使用說明書，說明書中記載如以下1)和/或2)和/或3)所示 的內(nèi)容：
[0034] 1)以待測患者的血清為檢測對象，如果待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量 < 70ng/mL，該待測患者候選為非肝硬化患者或非肝癌患者；如果待檢血清中人熱休克蛋 白gp96含量彡220ng/mL并且<800ng/mL,該待測患者候選為肝硬化患者；如果待檢血清中 人熱休克蛋白gp96含量彡500ng/mL,該待測患者候選為肝癌患者；
[0035] 2)以肝硬化患者的血清為檢測對象，待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量<500ng/ mL的肝硬化患者預(yù)判斷為5年內(nèi)肝癌發(fā)病率低于待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量 彡500ng/mL的肝硬化患者5年內(nèi)肝癌發(fā)病率的肝硬化患者；
[0036] 或，
[0037] 血清中人熱休克蛋白gp96含量<500ng/mL的肝硬化患者的5年內(nèi)肝癌發(fā)病率低， 血清中人熱休克蛋白gp96含量彡500ng/mL的肝硬化患者的5年內(nèi)肝癌發(fā)病率高；
[0038] 所述低是指肝癌發(fā)病率彡4. 3 % ;
[0039] 所述高是指肝癌發(fā)病率彡12. 7% ;
[0040] 3)以肝癌患者的血清為檢測對象，待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量<800ng/mL 的肝癌患者預(yù)判斷為總生存期長于待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量> 800ng/mL的肝癌 患者的總生存期的肝癌患者；
[0041] 或，
[0042] 血清中人熱休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝癌患者的總生存期為2. 8±0. 7 年，血清中人熱休克蛋白gp96含量彡800ng/mL的肝癌患者的總生存期為1. 2±0. 4年； [0043] 所述總生存期為從隨機(jī)化開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。
[0044] 上述任一所述的試劑盒中，所述酶聯(lián)免疫吸附測定法為ELISA雙抗體夾心法；
[0045] 所述ELISA雙抗體夾心法中人熱休克蛋白gp96的抗體具體為人熱休克蛋白gp96 的單鏈抗體和/或人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體和/或標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白 gp96的多克隆抗體的二抗；
[0046] 所述標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗具體為酶標(biāo)記的抗所 述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗；
[0047] 所述酶標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗的酶可以催化底物 顯色；
[0048] 所述人熱休克蛋白gp96的單鏈抗體具體為gp96-scFv_comp抗體，該抗體的序列 如SEQIDNo. 1所示，該抗體能特異性結(jié)合人熱休克蛋白gp96的N端；
[0049] 所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體具體的商品名稱為山羊多克隆抗體，該抗 體購自SantaCruzBiotech，產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-1794,該抗體特異性結(jié)合于人熱休克蛋白 gp96的C端；
[0050] 所述酶標(biāo)記的抗所述人熱休克蛋白gp96的多克隆抗體的二抗具體的商品名稱為 兔抗山羊二抗-HRP，該二抗購自SantaCruzBiotech，產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-2922。
[0051] 本發(fā)明證明人熱休克蛋白gp96可以作為一種新的肝硬化、肝癌標(biāo)志物。本發(fā)明提 供的試劑盒對于肝硬化、肝癌的早期篩查、預(yù)防、治療和治療后監(jiān)測具有重大意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 圖1為人熱休克蛋白gp96含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0053] 圖2為健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人熱休克蛋白gp96水平的檢測與統(tǒng)計(jì) 分析結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0055] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056] 下述實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0057] 包被液（簡稱CB)按照如下方法制備：將1. 59gNa2C03、2. 93NaHC03、0. 2gNaN3溶 于適量蒸餾水，加蒸餾水定容至1L，再調(diào)溶液的pH至9. 6,最后將溶液用0. 22yM的濾膜過 濾。
[0058]PBS緩沖液按照如下方法制備：將 8gNaCl、0. 2gKC1、3. 625gNa2HP04 ? 12H20、 0. 24gKH2P04溶于適量蒸餾水，加蒸餾水定容至1L，再調(diào)溶液的pH至7. 3。
[0059]PBST緩沖液按照如下方法制備：將 8gNaCl、0. 2gKC1、3. 625gNa2HP04 ? 12H20、 0. 24gKH2P04溶于適量蒸餾水，加5mL的吐溫-20,再加蒸餾水定容至1L，再調(diào)溶液的pH至 7. 3。
[0060] 封閉液按照如下方法制備：將5g牛血清白蛋白（BSA)用PBS緩沖液溶解，再用PBS 緩沖液定容至l〇〇mL。
[0061] 終止液按照如下方法制備：將21. 7ml濃硫酸（98%)加入到蒸餾水中，并用蒸餾 水定容至200mL。
[0062] gp96-scFv_comp抗體按照文獻(xiàn)"桂明明，武慧英，孫I路，等.畢赤酵母表達(dá) gp96-SCFv抗體及生物活性測定[J].生物工程學(xué)報(bào)，2014, 30 (4) : 595?604. "公開的方法 進(jìn)行制備，該抗體特異性結(jié)合于人熱休克蛋白gp96的N端。
[0063] 山羊多克隆抗體購自SantaCruzBiotech,產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-1794,該抗體特異性 結(jié)合于人熱休克蛋白gp96的C端。
[0064] 兔抗山羊二抗-HRP購自SantaCruzBiotech，產(chǎn)品目錄號(hào)為SC-2922。
[0065]TMB購自eBioscience，產(chǎn)品目錄號(hào)為 00-4201-56。
[0066] 下述實(shí)施例中的健康人血液、肝硬化患者血液、肝癌患者血液或未知血液樣本由 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院和北京佑安醫(yī)院提供，所有血樣采集均經(jīng)過血液提供者的知情同 意，并且均簽署知情同意書。
[0067]實(shí)施例1、采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)建立人熱休克蛋白gp96含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲 線
[0068] 人熱休克蛋白gp96標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立是采用ELISA雙抗體夾心法，具體如下：[0069]一、包被：用包被液稀釋gp96-scFv_comp抗體（其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所 示）至其濃度為1Ug/mL,包被于96孔板中，每孔100iiL,于4°C包被過夜。
[0070] 二、洗滌：用PBST緩沖液洗滌3次，每次lmin。
[0071] 三、封閉：每孔加入200iiL封閉液，置于37°C封閉2h。
[0072] 四、洗滌：用PBST緩沖液洗滌3次，每次lmin。
[0073] 五、加樣：將人熱休克蛋白gp96(其氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，編碼基因序 列如SEQIDNo. 3所示）用封閉液稀釋，配制成20000ng/mL的濃度，并用封閉液進(jìn)行2倍 倍比稀釋，最終濃度為31. 25ng/mL，得到系列梯度稀釋的gp96蛋白溶液，將具有不同濃度 的系列梯度稀釋的gp96蛋白溶液加入96孔板，每孔100iiL，每1個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)孔，為實(shí) 驗(yàn)孔。同時(shí)設(shè)置空白孔（不加gp96蛋白溶液只加100iiL封閉液），于37°C孵育2h。
[0074] 六、洗滌：用PBST緩沖液洗滌5次，每次lmin。
[0075] 七、加檢測抗體：用封閉液稀釋檢測抗體（山羊多克隆抗體）（封閉液與檢測抗體 的體積比為1000:1)得到檢測抗體溶液，每孔加入100UL，置于37°C孵育lh。
[0076] 八、洗滌：用PBST洗滌5次，每次lmin。
[0077] 九、加酶標(biāo)抗體：用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗（兔抗山羊 二抗-HRP)(封閉液與兔抗山羊二抗-HRP的體積比為1000:1)得到二抗溶液，每孔加入lOOuL，置于 37°C孵育lh。
[0078] 十、洗滌：用PBST洗滌7次，每次lmin。
[0079] i^一、加底物液顯色：每孔加入100ULTMB底物液，37°C避光反應(yīng)10min。
[0080] 十二、終止反應(yīng)：每孔加入50iiL終止液，室溫反應(yīng)5min。
[0081] 十三、讀數(shù)：將96孔板置于酶標(biāo)檢測儀上，于450nm處讀取各孔的吸光值。
[0082] 十四、數(shù)據(jù)分析：計(jì)算每一濃度的3個(gè)重復(fù)孔的吸光值的平均值，再分別減去空白 孔的吸光值，得到實(shí)驗(yàn)孔的0D450。
[0083] 十五、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以實(shí)驗(yàn)孔的0D450為橫坐標(biāo)，人熱休克蛋白gp96的質(zhì)量為縱 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。
[0084] 人熱休克蛋白gp96含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
[0085] 圖1表明，當(dāng)人熱休克蛋白gp96溶液的濃度在0?20000ng/mL范圍內(nèi)，0D450與 人熱休克蛋白gp96質(zhì)量的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9991。空白孔0D450在0.05以下， 本方法可以特異的檢測到濃度為Ing/mL的人熱休克蛋白gp96,靈敏度高。
[0086] 實(shí)施例2、健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人熱休克蛋白gp96水平的檢測與 統(tǒng)計(jì)分析
[0087] 一、健康人群、肝硬化和肝癌患者血清分離
[0088] (1)按照臨床采血方法抽取患者的血液5mL于離心管中，4°C靜置3h。
[0089](2)將離心管于 4°C，2000rpm?3000rpm離心 10min。
[0090] (3)移液器吸取上層淡黃色的血清，將收集的血清于-20°c保存。
[0091] 共臨床收集健康人血清樣本20例，肝硬化患者血清樣本30例，肝癌患者血清樣本 30例。
[0092] 二、采用實(shí)施例1的ELISA雙抗體夾心法檢測健康人群、肝硬化和肝癌患者血清樣 本中人熱休克蛋白gp96蛋白含量。其中僅將步驟五中的人熱休克蛋白gp96溶液替換為步 驟一制備的待檢血清樣本，得到樣本的0D450值，將該值帶入實(shí)施例1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線公 式，計(jì)算得到樣本的人熱休克蛋白gp96的質(zhì)量，并換算得到樣本的人熱休克蛋白gp96的含 量。
[0093] 健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人熱休克蛋白gp96水平的檢測與統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果如圖2所示。圖2中，正常代表健康人群的血清；肝硬化代表肝硬化患者的血清；肝癌 代表肝癌患者的血清。
[0094] 圖2表明，分別與健康人群相比，肝硬化患者、肝癌患者血清中人熱休克蛋白gp96 含量顯著升高且具有極顯著性差異（p〈0.01)。
[0095] 通過對大量健康人血清，肝硬化患者血清，肝癌患者血清樣本進(jìn)行上述人熱休克 蛋白gp96水平的檢測與統(tǒng)計(jì)分析，建立如下評判標(biāo)準(zhǔn)：
[0096] 檢測對象的血清中人熱休克蛋白gp96含量< 70ng/mL，該檢測對象候選為非肝硬 化患者或非肝癌患者。
[0097] 檢測對象的血清中人熱休克蛋白gp96含量彡220ng/mL并<800ng/mL，該檢測對象 候選為肝硬化患者。
[0098] 檢測對象的血清中人熱休克蛋白gp96含量> 500ng/mL，該檢測對象候選為肝癌 患者。
[0099] 實(shí)施例3、評判標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性分析
[0100] 一、對未知血液樣本進(jìn)行實(shí)施例2的檢測，根據(jù)實(shí)施例2的評判標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)得到健康 人的檢測樣本數(shù)，肝硬化患者的檢測樣本數(shù)，肝癌患者的檢測樣本數(shù)。
[0101] 二、根據(jù)腫瘤標(biāo)記物的檢測、超聲顯像、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描CT、磁共振成像、放射 性、肝組織活檢或細(xì)胞學(xué)檢查等綜合指標(biāo)對未知血液樣本進(jìn)行檢測，得到健康人的實(shí)際樣 本數(shù)，肝硬化患者的實(shí)際樣本數(shù)，肝癌患者的實(shí)際樣本數(shù)。
[0102] 三、對檢測結(jié)果按金標(biāo)準(zhǔn)確定的二項(xiàng)分類總體，如病例與對照（分別記為D+與 D-)，采用診斷試驗(yàn)檢測的結(jié)果可分別寫成陽性與陰性（記為T+與T-)，資料可列成四格表 形式，如表1所示。表1中有四個(gè)可能結(jié)果，其中兩個(gè)是正確的，即病例（肝硬化或肝癌患 者）被診斷為陽性（真陽性，TP)和對照（健康人）被診斷為陰性（真陰性，TN);兩個(gè)是錯(cuò) 誤的，即病例（肝硬化或肝癌患者）被診斷為陰性（假陰性，F(xiàn)N)和對照（健康人）被診斷 為陽性（假陽性，F(xiàn)P)。
[0103] 表1診斷資料2x2四格表。

【權(quán)利要求】
1. 檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì)在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷 疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的物質(zhì) 包含人熱休克蛋白gp96和/或人熱休克蛋白gp96的抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的 物質(zhì)還包含通過酶聯(lián)免疫吸附法測定人熱休克蛋白gp96含量所需的試劑中除人熱休克蛋 白gp96和人熱休克蛋白gp96的抗體之外的試劑和所需的儀器。
4. 含有人熱休克蛋白gp96編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌作為 制備人熱休克蛋白gp96所需的生物材料在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷疾 病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述人熱休克蛋白gp96的編碼基因?yàn)槿?下1)-3)任一所示： 1. SEQ ID No. 3所示的DNA分子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼人熱休克蛋白gp96的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼人熱休克蛋白gp96的 DNA分子。
6. 含有人熱休克蛋白gp96的抗體的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌或人熱休克蛋白gp96的抗體的免疫原或抗原作為制備人熱休克蛋白gp96的抗體所需 的生物材料在制備篩查或輔助診斷疾病的產(chǎn)品或輔助判斷疾病的預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述疾病為肝硬化或肝癌。
8. -種篩查或輔助診斷疾病或輔助判斷疾病的預(yù)后的試劑盒，該試劑盒包含檢測人熱 休克蛋白gp96含量的物質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述檢測人熱休克蛋白gp96含量的物 質(zhì)包含人熱休克蛋白gp96和/或人熱休克蛋白gp96的抗體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于：所述疾病為肝硬化或肝癌； 所述試劑盒還包含使用說明書，說明書中記載如以下1)和/或2)和/或3)所示的內(nèi) 容： 1) 以待測患者的血清為檢測對象，如果待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量< 70ng/ mL，該待測患者候選為非肝硬化患者或非肝癌患者；如果待檢血清中人熱休克蛋白gp96含 量彡220ng/mL并且<800ng/mL，該待測患者候選為肝硬化患者；如果待檢血清中人熱休克 蛋白gp96含量彡500ng/mL,該待測患者候選為肝癌患者； 2) 以肝硬化患者的血清為檢測對象，待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量<500ng/mL的 肝硬化患者預(yù)判斷為5年內(nèi)肝癌發(fā)病率低于待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量> 500ng/ mL的肝硬化患者5年內(nèi)肝癌發(fā)病率的肝硬化患者； 或， 血清中人熱休克蛋白gp96含量<500ng/mL的肝硬化患者的5年內(nèi)肝癌發(fā)病率低，血清 中人熱休克蛋白gp96含量彡500ng/mL的肝硬化患者的5年內(nèi)肝癌發(fā)病率高； 3) 以肝癌患者的血清為檢測對象，待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝 癌患者預(yù)判斷為總生存期長于待檢血清中人熱休克蛋白gp96含量> 800ng/mL的肝癌患者 的總生存期的肝癌患者； 或， 血清中人熱休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝癌患者的總生存期為2. 8±0. 7年，血 清中人熱休克蛋白gp96含量彡800ng/mL的肝癌患者的總生存期為1. 2±0. 4年。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104330570SQ201410535528
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】孟頌東, 桂明明, 趙報(bào) 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所