胃癌抗原肽與熱休克蛋白的復(fù)合物及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一類與熱休克蛋白結(jié)合的胃癌抗原，包括胃癌特異性抗原LY6K、IEX-1和SUrvivin-2B來源的肽段。本發(fā)明同時(shí)還提供了抗原與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物及其制備方法，復(fù)合物包括gp96和HSP78與抗原多肽以非共價(jià)鍵結(jié)合的復(fù)合體，和二者以共價(jià)鍵連接形成的融合蛋白。這種復(fù)合物可用于制備治療胃癌的治療性疫苗?！緦＠f明】胃癌抗原肽與熱休克蛋白的復(fù)合物及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，特別涉及胃癌抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物以及它們的用途。【
背景技術(shù)：
】[0002]熱休克蛋白（HeatShockProtein,HSP)是一類高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)，在熱休克、葡萄糖缺乏、細(xì)菌和病毒感染等應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)表達(dá)升高。gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（EndoplasmicReticulum)，能夠阻止蛋白質(zhì)聚集，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的分泌。gp96在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達(dá)。gp96分子除了具備分子伴侶的功能，gp96分子還具有多肽結(jié)合的能力，能結(jié)合細(xì)胞中5-25個(gè)氨基酸的多肽序列。熱休克蛋白hsp78是細(xì)胞質(zhì)中hsp70家族中的成員，分子量約78kDa。HSP78分子也能夠和細(xì)胞中各種短肽結(jié)合。[0003]近年來的研究發(fā)現(xiàn)，組織提取的gp96、HSP78蛋白具有很強(qiáng)免疫原性，能夠有效的激起組織特異性的免疫反應(yīng)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這種抗原性由這些HSP結(jié)合的短肽所決定。HSP將結(jié)合的短肽呈遞給I類MHC分子，激活特異性的效應(yīng)和記憶T細(xì)胞，引發(fā)長期的細(xì)胞免疫反應(yīng)。gp96還可以活化樹突細(xì)胞（DC)促進(jìn)MHCI類和MHCII類分子以及共刺激因子的表達(dá)，從而提商免疫反應(yīng)。[0004]胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于肺癌，位居第二位。在我國2012年胃癌發(fā)病率高達(dá)36/10萬，為惡性腫瘤中的第二位；死亡率約為26/10萬，為惡性腫瘤的第三位?，F(xiàn)行胃癌治療常規(guī)方案是手術(shù)切除腫瘤組織并輔以化療。但即便使用紫杉類、口服氟尿嘧啶、伊立替康等新的化療藥物中位生存時(shí)間仍維持在10個(gè)月左右，并無根本性的突破。這是由于休眠腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療的耐受度很高,并且腫瘤細(xì)胞的免疫原性差不能有效激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此多數(shù)患者治療后腫瘤仍會(huì)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致死亡高的主要因素。[0005]近年來研究發(fā)現(xiàn)自體腫瘤組織中分離純化的gp96和HSP78結(jié)合有腫瘤組織特異的抗原肽庫，可以激活腫瘤特異性T細(xì)胞，起到抑制腫瘤生長、延緩復(fù)發(fā)的作用。臨床試驗(yàn)已證實(shí)胃癌患者接受自體腫瘤gp96復(fù)合物免疫治療后中位總生存期大于16個(gè)月，而常規(guī)的治療方案的中位生存期為9.2個(gè)月，延長74%;同時(shí)中位無進(jìn)展生存期也達(dá)到7個(gè)月。自體gp96復(fù)合物免疫治療起到了推遲胃癌復(fù)發(fā)的作用。[0006]然而作為消化系統(tǒng)中最嚴(yán)重的惡性腫瘤，胃癌從總體上仍然不能治愈。新的化療藥物、靶向藥物的進(jìn)展緩慢。即便目前最具希望的自體gp96免疫治療由于需要的足夠大的腫瘤組織來制備疫苗，同時(shí)自體疫苗制備的一次性，影響了該方法的療效和受眾。[0007]目前已證實(shí)gp96和HSP78分子能結(jié)合泡狀口炎病毒抗原區(qū)肽、鼠H_2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、La限制的白血病抗原肽、乙肝病毒抗原肽等抗原多肽。但目前為止未見從胃癌患者腫瘤組織中分離鑒定與HSP結(jié)合的抗原多肽?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是篩選胃癌特異性的肽段?？朔[瘤細(xì)胞免疫編輯導(dǎo)致的低免疫原性，能夠在胃癌患者或者健康個(gè)體中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（殺傷性T細(xì)胞，CTL)，而且CTL具有強(qiáng)大的抗胃癌作用，對(duì)正常細(xì)胞及組織無破壞作用。[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與gp96和HSP78結(jié)合的胃癌抗原的復(fù)合物。所述的胃癌抗原可以分別是胃癌腫瘤抗原LY6K蛋白上第91-99位的氨基酸序列，其序列可以是RTDEGDNRV，或其變異序列；胃癌腫瘤抗原LY6K蛋白上第127-135位的氨基酸序列，其序列可以是IAAVMLRWL，或其變異序列；胃癌腫瘤抗原LY6K蛋白上第118-126位的氨基酸序列，其序列可以是CKWTEPYCV，或其變異序列；胃癌腫瘤抗原IEX-I蛋白上第86-94位的氨基酸序列，其序列可以是LLFLLLTIV，或其變異序列；胃癌腫瘤抗原SURVIVIN-2B蛋白上第79-87位的氨基酸序列，其序列可以是VAYACNTST，或其變異序列。[0010]本發(fā)明的復(fù)合物既包括熱休克蛋白以非共價(jià)鍵與多肽結(jié)合，又包括熱休克蛋白以共價(jià)鍵與多肽結(jié)合。本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物的方法。[0011]本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)形成特異性的CTL。[0012]本發(fā)明所訴的表位肽可以在體外單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式刺激HLA-A2陽性胃癌患者PBMC分泌IFN-g，且這種作用在自體gp96復(fù)合物免疫后顯著增強(qiáng)。[0013]本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式提高HLA-A2陽性胃癌患者特異性T細(xì)胞反應(yīng)。[0014]本發(fā)明所述的特異性CTL的誘導(dǎo)可以被Treg細(xì)胞的抑制劑增強(qiáng)。[0015]首次從五例胃癌腫瘤組織中與熱休克蛋白gp96結(jié)合的多肽中分離出一特異9肽，經(jīng)氨基酸序列分析為"RTDE⑶NRV"，經(jīng)查詢發(fā)現(xiàn)該序列位于胃癌特異性抗原LY6K的91-99位，人工合成該序列并與體外表達(dá)的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-9肽復(fù)合物，將9肽與gp96-9肽復(fù)合物免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，均能刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制劑的預(yù)處理可以增強(qiáng)gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果2倍以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gp96-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型胃癌的治療性藥物。[0016]附圖簡要說明圖1.小鼠（BALB/Chla-A2+)的特異性CTL反應(yīng)。以gp96-9肽復(fù)合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后檢測特異性細(xì)胞裂解率。效應(yīng)細(xì)胞CTL對(duì)特異性靶細(xì)胞的裂解百分率以4小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放法測定，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比分別是10、25、50和100，圖中裂解率為10只小鼠的平均值。[0017]圖2.胃癌患者免疫自體腫瘤gp96復(fù)合物后9肽特異性T細(xì)胞的變化。以IFN-g的ELISP0T方法檢測患者外周血中9肽特異性T細(xì)胞。無關(guān)肽HBcAg82_9(l肽為陰性對(duì)照。[0018]【具體實(shí)施方式】：下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。[0019]實(shí)施例1·從胃組織中純化gp96蛋白將五份胃癌組織和一份正常胃組織勻漿后離心，用30%/70%飽和度（NH4)2S03沉淀，沉淀溶解后采用ConASepharose(GE公司）進(jìn)行親和層析，用8%的a-甲基葡萄糖苷洗脫結(jié)合的蛋白，糖苷洗脫液以Hitrap-Q(GE公司層析系統(tǒng)）進(jìn)行陰離子層析，經(jīng)過這三步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體（SantaCruz公司）進(jìn)行Western鑒定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相HPLC鑒定。[0020]實(shí)施例2.從gp96蛋白釋放非共價(jià)結(jié)合的多肽將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸（TFA)使其終濃度達(dá)到0.2%(pH約2.0)，然后用超濾法（分子截留為30kDa，Millipore公司）分離多肽，將多肽混合物進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜(ABI4700)分析，多肽分子量大多在600-1100Da之間。[0021]實(shí)施例3.反相HPLC分析多肽多肽混合物凍干后溶于溶液A(0.065%TFA，2%乙腈)，上樣于反相C18層析柱(S印hasilp印tideC18;5mm粒度；4·6X250mm，GE公司），從0至65%溶液B(0·05%TFA，100%乙腈）進(jìn)行梯度洗脫，流速為ImL/min，用214nm波長檢測。比較腫瘤組織和正常組織HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)一個(gè)五份胃癌組織共有而正常胃組織中沒有的肽峰。[0022]實(shí)施例4.多肽微量測序與序列分析收集該特異肽峰用MALDI-T0F質(zhì)譜（PE公司Voyager-DE系統(tǒng)）鑒定其純度，只發(fā)現(xiàn)分子量為1061Da的單一峰。對(duì)該肽微量測序（Procise491.蛋白測序儀，ABI公司），其氨基酸序列為"RTDE⑶NRV"，5份腫瘤組織得到的序列一致。將該序列在網(wǎng)上蛋白數(shù)據(jù)庫（NCBI)查詢，發(fā)現(xiàn)它位于LY6K蛋白的91-99位。[0023]實(shí)施例5.gp96蛋白與人工合成的多肽體外快速組裝人工合成9肽"RTDE⑶NRV"（委托吉爾生化有限公司合成），將gp96蛋白與多肽進(jìn)行體外組裝，體外結(jié)合反應(yīng)體系：2.7mmol/LKC1,1.47mmol/LKH2PO4,8.Immol/LNa2HPO4,138mmol/LNaCl,10%(V/V)甘油，3.0mmol/L9肽，0.421mmol/Lgp96蛋白，60°C反應(yīng)10分鐘，超濾法（分子截留30kDa，Millipore公司）去除未結(jié)合的多肽。[0024]實(shí)施例6表達(dá)胃癌抗原肽1和熱休克蛋白gp96的融合蛋白本實(shí)例提供了胃癌抗原肽I(RTDEGDNRV)與熱休克蛋白gp96以共價(jià)鍵形成的融合蛋白的方法。我們?nèi)斯ず铣蓪?duì)應(yīng)于該肽的核酸序列（CGCACCGATGAAGGCGATAACCGCGTG)，引入限制性酶切位點(diǎn)BglII將該9肽的核酸序列與gp96基因5'端用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物的5'和3'端引入2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI，連接到表達(dá)載體pPICZaA中在畢赤酵母中分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是gp96與該9肽的融合蛋白。[0025]實(shí)施例7.免疫小鼠選用生長8-10周的HLA-A2轉(zhuǎn)基因的BALB/c小鼠（HLA-A2+)用于本實(shí)驗(yàn)。[0026]免疫方式采用將樣品溶于IOOmL的PBS中頸背皮下注射。皮下注射操作相對(duì)簡單，要求免疫劑量適中，故采用該種免疫方式。同時(shí)在每次免疫前1天腹腔注射0.4mg的環(huán)磷酰胺。低劑量環(huán)磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg細(xì)胞從而能增強(qiáng)免疫效果。[0027]gp96蛋白-9肽復(fù)合物的最適免疫劑量為0.Inmol。[0028]免疫時(shí)間為0、1、3周進(jìn)行三次的強(qiáng)化免疫，優(yōu)于免疫一次或二次的效果。[0029]因此采用皮下注射免疫，將9肽溶于緩沖液（90%PBS10%DMSO0.1%TFA)gp96-9肽復(fù)合物溶于PBS中，注射前劇烈振蕩1分鐘，每只小鼠免疫劑量9肽分別為0.2nmol，2nmol和20nmol，將肽與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠。gp96-9肽復(fù)合物免疫劑量分別是0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol,米用頸背皮下注射，第一次免疫1周后進(jìn)行第二次免疫，2周后加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞毒性分析。每一處理使用10只小鼠。[0030]實(shí)施例8.細(xì)胞毒性（CTL)分析小鼠加強(qiáng)免疫3天后，從每只小鼠收獲得約3XIO7脾細(xì)胞懸于含有10mMHEPES緩沖液、5XKT5M琉基乙醇，抗生素和10%(V/V)FCS培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)瓶中與經(jīng)幅射（4500Rad)的T2細(xì)胞（3:1)和lmg/mL肽在完全培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)。6天后收集脾細(xì)胞進(jìn)行4小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)（具體方法見Kuhrober,A,etal.1997.InternationalImmunology,9(8):1203-1212)測定細(xì)胞毒性活性。簡而言之，靶細(xì)胞用lOmg/mL目標(biāo)肽或者無關(guān)肽于37°C致敏30分鐘后加入不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，反應(yīng)體系為100mL的完全培養(yǎng)基。37°C共培養(yǎng)4小時(shí)后收集上清測定特異裂解率。[0031]從51Cr釋放實(shí)驗(yàn)可以看出gp96-9肽復(fù)合物可刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，每只小鼠免疫〇.Inmol(約IOmg)的gp96-9肽復(fù)合物即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞毒性測定靶細(xì)胞的裂解率在60%以上，通過注射環(huán)磷酰胺的預(yù)處理可以明顯的提高gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果，且這種細(xì)胞毒效應(yīng)是表位肽特異性的（圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gp96-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型胃癌的治療藥物。[0032]實(shí)施例9胃癌患者免疫自體gp96復(fù)合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的胃癌患者需完成10個(gè)療程的治療。一周為一個(gè)療程，每個(gè)療程注射一次。試驗(yàn)組在術(shù)后8周內(nèi)在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上開始自體gp96免疫治療。[0033]操作流程i患者入選：初發(fā)III期或IV期的胃癌患者，可進(jìn)行根治性手術(shù)。[0034]ii腫瘤組織中g(shù)p96-腫瘤抗原復(fù)合物的純化按照孟頌東等發(fā)表的三步法（MengS，SongJ，RaoZ，TienP，GaoG.2002.Three-steppurificationofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolationofgp96-boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)對(duì)腫瘤組織中g(shù)p96蛋白進(jìn)行提取純化。首先通過ConA柱親和層析，再通過HitrapQ柱離子交換洗脫，得到純度95%以上gp96蛋白。[0035]考馬斯亮藍(lán)顯色法測定蛋白濃度，每份樣本的蛋白提取量應(yīng)能滿足10個(gè)療程的治療需要。[0036]蛋白應(yīng)滿足疫苗的微生物要求(檢測方法參照生物制品規(guī)程)。[0037]蛋白的內(nèi)毒素含量需滿足疫苗制劑的要求（鱟試劑法檢測）。[0038]iiigp96-腫瘤抗原復(fù)合物的使用患者在手術(shù)后8周內(nèi)接受第一次免疫治療。每次免疫前1天，靜脈注射環(huán)磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自體gp96復(fù)合物。每周1次，共注射10次。[0039]iv免疫學(xué)指標(biāo)檢查以自體腫瘤裂解液及自體gp96復(fù)合物抗原為刺激物檢測自體腫瘤特異性T細(xì)胞活性。比較胃癌患者免疫前后特異性T細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)自體gp96復(fù)合物免疫顯著激活了患者特異性T細(xì)胞，預(yù)示了良好的預(yù)后。[0040]V隨訪注射完成后，于3個(gè)月、6個(gè)月、1年、1年半、2年時(shí)各訪視1次；之后每半年訪視1次，直至患者復(fù)發(fā)或死亡。[0041]①2年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次：a)第3、9、15、21月復(fù)查內(nèi)容：腫瘤標(biāo)志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA);腹、盆腔B超；胸部X線。[0042]b)第6、12、18、24月復(fù)查內(nèi)容：腫瘤標(biāo)志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA);胸、腹、盆腔增強(qiáng)CT;胃鏡。[0043]②2年后每6個(gè)月復(fù)查1次，復(fù)查內(nèi)容：腫瘤標(biāo)志物（CA-199、CA-724、CA-125、CEA);胸、腹、盆腔增強(qiáng)CT;胃鏡。[0044]患者隨訪期間疾病復(fù)發(fā)，達(dá)到研究終點(diǎn)，由研究者詳實(shí)記錄患者疾病復(fù)發(fā)情況，并按照臨床診療規(guī)范(如NCCN指南等）給予其他治療。[0045]實(shí)施例10ELISP0T法檢測特異性T細(xì)胞ELISP0T檢測胃癌患者PBMC中表位特異性CTL。按照ELISP0T試劑盒的說明書操作.先用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基封閉ELISP0T預(yù)包被板一小時(shí)，臨用前倒掉封閉液，加入IOOmL含3XIO5的人的PBMCX直接用新鮮的PBMC或者將PBMC體外擴(kuò)增培養(yǎng)7天).實(shí)驗(yàn)組中加入10mg/mL的肽1、陽性對(duì)照加入4mg/mL的PHA進(jìn)行刺激，陰性對(duì)照加入無關(guān)肽。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)26-36小時(shí)后，檢測特異性斑點(diǎn)的形成，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。我們選取HLA-A2陽性的胃癌患者作為研究組，選取HLA-A2陰性患者作為對(duì)照組，通過ELISP0T方法檢測患者新鮮血液中表位特異性CTL，特異性CTL的頻率通過計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量來確定。在3例經(jīng)自體gp96復(fù)合物免疫的HLA-A2陽性胃癌患者中均檢測到高頻率的RTDEGDNRV特異性CTL，且比免疫前有顯著的提高，同時(shí)并沒有檢測到無關(guān)肽HBcAg82-90(陰性對(duì)照)特異性T細(xì)胞，說明ELISP0T結(jié)果是表位特異的（圖2)。[0046]實(shí)施例11其它gp96-多肽復(fù)合物的免疫活性測定除上述抗原9肽之外，我們又選取其它4個(gè)胃癌抗原多肽與gp96體外組裝并測定其免疫活性，這4個(gè)抗原多肽分別是I)LY6K抗原多肽"IAAVMLRWL"，2)LY6K抗原多肽"CKWTEPYCV"，3)IEX-I抗原多肽"LLFLLLTIV"，4)SURVIVIN-2b抗原多肽"VAYACNTST"。[0047]分別人工合成這4種多肽，采用實(shí)施例5中所述的反應(yīng)體系在體外與gp96結(jié)合，這4種多肽與gp96均有較高的親和力，通過測定結(jié)合反應(yīng)平衡常數(shù)K，4種肽與gp96結(jié)合反應(yīng)中K值均在6以上。采用實(shí)施例7中所述的方法用上述4種胃癌抗原多肽與gp96形成的復(fù)合物，和上述gp96與4種胃癌抗原多肽的融合蛋白分別免疫小鼠，并采用實(shí)施例7中所述的方法分別對(duì)這4種復(fù)合物進(jìn)行CTL分析，從51Cr釋放實(shí)驗(yàn)可以看出這4種胃癌抗原多肽與gp96形成的復(fù)合物均可刺激HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，4種多肽與gp96形成的復(fù)合物的免疫活性比單獨(dú)多肽高100-200倍，且通過Treg細(xì)胞抑制劑預(yù)處理可以進(jìn)一步提高免疫效果。每只小鼠免疫劑量為0.1nmol(約IOmg)時(shí)即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過對(duì)這4種多肽與gp96形成的復(fù)合物的細(xì)胞毒性測定發(fā)現(xiàn)靶細(xì)胞的裂解率在60%-75%之間。[0048]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gp96與胃癌抗原多肽體外組裝合成的復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型胃癌的治療或預(yù)防藥物。由于實(shí)驗(yàn)條件所限本發(fā)明專利不可能對(duì)每一種胃癌抗原多肽進(jìn)行體外組裝及免疫活性測定，但我們通過選取5種有代表性的腫瘤抗原作研究對(duì)象，在體外與gp96結(jié)合并進(jìn)行免疫活性測定，大量實(shí)驗(yàn)表明gp96與這些抗原多肽形成的復(fù)合物均能刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，可開發(fā)成為一種新型治療疫苗。因此，除上述5種抗原多肽之外，其它任何胃癌抗原多肽與gp96結(jié)合作為新型疫苗也應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。[0049]實(shí)施例12.HSP78-多肽免疫原性測定將HSP78與5種多肽體外組裝形成的復(fù)合物，反應(yīng)體系同gp96(見實(shí)施例5)，將體外合成的復(fù)合物和HSP78與5種多肽的融合蛋白（見實(shí)施例6)免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫劑量以及免疫程序同gp96(見實(shí)施例7)細(xì)胞毒性（CTL)分析方法同gp96(見實(shí)施例8)。從51Cr釋放實(shí)驗(yàn)可以看出HSP78-9肽復(fù)合物可刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，HSP78-9肽復(fù)合物的免疫原性為單獨(dú)9肽的150倍以上，每只小鼠免疫0.Inmol(約IOmg)即能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞毒性測定靶細(xì)胞的裂解率在50%以上。實(shí)驗(yàn)表明HSP78-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型胃癌的治療藥物?！緳?quán)利要求】1.一種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽RTDEGDNRV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。2.-種與熱休克蛋白結(jié)合表位肽IAAVMLRWL，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。3.-種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽CKWTEPYCV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。4.一種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽LLFLLLTIV，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。5.-種與熱休克蛋白結(jié)合的表位肽VAYACNTST，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.5所示。6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的表位肽與gp96或HSP78的共價(jià)或非共價(jià)連接的復(fù)合物。7.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的表位肽在體外單獨(dú)或與熱休克蛋白形成如權(quán)利要求6所述的復(fù)合物單獨(dú)或共同免疫人體誘導(dǎo)生成殺傷性T細(xì)胞中用途。8.如權(quán)利要7所述的免疫誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞在預(yù)防或治療胃癌中的用途?！疚臋n編號(hào)】A61P35/00GK104211797SQ201310550994【公開日】2014年12月17日申請(qǐng)日期:2013年11月9日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月9日【發(fā)明者】方巧慧,張小俊,高華申請(qǐng)人:深圳市康爾諾生物技術(shù)有限公司