Urod自身抗體識(shí)別的抗原多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。其中，該多肽具有如SEQ?IDNO：1-5所示氨基酸序列至少之一。利用本發(fā)明的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽，能夠有效地檢測(cè)樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品（例如血清樣品）中的UROD自身抗體。
【專利說(shuō)明】UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及一種UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽、該多肽在制備檢測(cè)腫瘤血清中UROD抗體的用途、一種用于檢測(cè)樣品中UROD抗體的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)生物學(xué)特性十分復(fù)雜，早期無(wú)創(chuàng)性診斷困難，目前尋找腫瘤相關(guān)標(biāo)志物已成為NSCLC等肺癌早期診斷和免疫治療的研究熱點(diǎn)。而近年研究表明，腫瘤患者自身免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生自身抗體，這些自身抗體存在于肺癌患者體循環(huán)中，甚至在肺癌臨床癥狀出現(xiàn)5年前就可以出現(xiàn)了，因此自身抗體可能成為監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生的早期標(biāo)志物。相較于血清中腫瘤抗原型標(biāo)志物,血清中腫瘤抗原相應(yīng)自身抗體同時(shí)具有豐度高，易檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，可能成為更為可靠的血清腫瘤標(biāo)志物，將有助于腫瘤的早期診斷。因此，尋找NSCLC等肺癌抗原相應(yīng)自身抗體，對(duì)于NSCLC等肺癌的早期診斷以及預(yù)后檢測(cè)意義重大。然而，目前相關(guān)報(bào)道很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0004]發(fā)明人在肺癌T7噬菌體展示cDNA文庫(kù)結(jié)合血清學(xué)篩選研究中發(fā)現(xiàn)，UROD為肺癌相關(guān)的腫瘤相關(guān)抗原之一，血液樣本中UROD的自身抗體水平在肺癌患者中遠(yuǎn)高于健康對(duì)照者。UROD自身抗體可能成為 更為有效的腫瘤標(biāo)志物，但是目前尚未有商品化的UROD自身抗體檢測(cè)試劑盒。
[0005]其中，UROD (uroporphyrinogen decarboxylase,尿卟啉原脫羧酶)是一種參與生產(chǎn)血紅素分子的酶，而血紅素對(duì)身體所有器官都是至關(guān)重要的(盡管它在血液、骨髓和肝臟中最豐富)。血紅素是一類叫做血紅素蛋白(其中包括在血液中攜帶氧氣的蛋白:血紅蛋白)的含鐵蛋白中的主要成分。在小鼠中，阻斷UROD基因的表達(dá)可增加癌細(xì)胞的死亡。對(duì)頭頸部癌癥組織樣本的分析披露，腫瘤中的UROD蛋白表達(dá)水平比正常組織顯著升高。此外，研究人員確認(rèn)，臨床結(jié)果的改善與病人體內(nèi)較低的UROD水平有關(guān)聯(lián)，提示UROD可被用來(lái)預(yù)測(cè)病人對(duì)放療的反應(yīng)。UROD抑制劑將來(lái)可與放療和化療共同使用以降低副作用。
[0006]進(jìn)一步，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，UROD自身抗體水平檢測(cè)可能有助于腫瘤中UROD濃度的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)，另外，UROD自身抗體可能存在拮抗腫瘤中UROD的作用，UROD自身抗體具有保護(hù)性作用。
[0007]由此，本發(fā)明提出了一種UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一:
[0008]I) SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0009]2) SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0010]3) SEQ ID NO:3: SARECVGKTVTLQGN ；[0011]4) SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0012]5) SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ；
[0013]6) SEQ ID NO: 1_5所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。[0014]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0015]另外，本發(fā)明還提出了前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測(cè)腫瘤血清UROD抗體試劑盒中的用途。尤其是，該試劑盒可以用于檢測(cè)的腫瘤為肺癌。另外，利用該試劑盒還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中UROD自身抗體的存在，而對(duì)患者對(duì)治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0016]為此，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)樣品中UROD抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:陰性對(duì)照樣品，所述陰性對(duì)照樣品為UROD抗體為陰性的血清，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為UROD抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml，15U/ml的血清。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度可以為，每個(gè)反應(yīng)孔I μ g/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，尤其是，該試劑盒可以用于檢測(cè)的腫瘤為肺癌。
[0017]為此，在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該多肽具有如SEQ ID NO:1-5所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0018]SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0019]SEQ ID N0:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0020]SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；
[0021]SEQ ID N0:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0022]SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測(cè)樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品(例如血清樣品)中的UROD自身抗體。由此，可以用于檢測(cè)患者是否患有腫瘤，例如肺癌。另外,還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中UROD自身抗體的存在，而對(duì)患者對(duì)治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地所述多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ IDNO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0025]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的用途。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0027]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)樣品中的UROD自身抗體。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0029]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的多肽對(duì)樣品中的UROD自身抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA檢測(cè)的試劑。由此，可以通過(guò)ELISA檢測(cè)方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對(duì)樣品中的UROD自身抗體進(jìn)行檢測(cè)，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中。由此，可以方便地高通量地進(jìn)行檢測(cè)?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者以及健康志愿者的血液樣品。
[0033]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0035]UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽
[0036]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一:
[0037]1) SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0038]2) SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
[0039]3) SEQ ID NO:3: SARECVGKTVTLQGN ；
[0040]4) SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0041]5) SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ；
[0042]6) SEQ ID NO: 1_5所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0044]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該多肽具有如SEQ ID NO:1-5所示氨基酸序列至少之一。即，多肽具有如下列所示氨基酸序列之一:
[0045]SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
[0046]SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；[0047]SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；；
[0048]SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
[0049]SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL。
[0050]上述氨基酸序列均衍生自UROD的全長(zhǎng)序列(UR0D的全長(zhǎng)序列見(jiàn)NCBI_NP_000365.3)。另外，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指至少兩個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸殘基的數(shù)目并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，多肽可以含有15~20個(gè)氨基酸，優(yōu)選15個(gè)氨基酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，還可以對(duì)上述多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到ELISA板底。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測(cè)樣品，例如肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品(例如血清樣品)中的UROD自身抗體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從UROD完整序列得到的上述多肽可以作為UROD的抗原表位，能夠與血液樣本中UROD自身抗體特異性的反應(yīng)，因而，可以有效地用于檢測(cè)對(duì)象血液樣本中的UROD自身抗體，由此，可以有效地用于篩查肺癌疑似患者血清，為肺癌的診斷提供了一個(gè)新的檢驗(yàn)指標(biāo)。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地所述多肽具有如ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ IDNO:1)所示的氨基酸序列。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。
[0052]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以有效地通過(guò)常規(guī)合成方法，合成上述多肽，從而代替重組表達(dá)的生物合成方式。 [0053]UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽的應(yīng)用及試劑盒
[0054]由此，在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了前面所述多肽在檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用上述多肽進(jìn)行檢測(cè)的樣品的類型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選的樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣本。由此，可以利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣本中的UROD自身抗體，由此可以確定患者是否患有惡性腫瘤，為惡性腫瘤檢測(cè)提供輔助手段，或者提供惡性腫瘤例如肺癌的早期篩查。
[0055]利用本發(fā)明的多肽檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，借助本發(fā)明的多肽檢測(cè)樣品中的UROD自身抗體。由此，可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體的效率。作為示例，可以采用下列方法利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD抗體:
[0056]首先，用ρΗ9.6 的碳酸鹽緩沖液(NaCO3 0.159g，NaHCO3 0.293g，加水至 100ml，pH值為9.6)稀釋多肽至I μ g/ml,以100 μ I/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4°C過(guò)夜。
[0057]接下來(lái)，棄去孔中的液體，0.P/oTBS-T洗滌緩沖液(即含0.l%Tween_20的TBS-T溶液，其配制方法為:NaCl 8.7g, Tris 1.21g，加去離子水至1000ml，pH 7.5，再加入Tween-20 lml)洗漆酶標(biāo)板5次,每次3min。
[0058]接著，向孔中添加5%BSA/0.05%TBS_T封閉緩沖液(其配制方法為:NaC10.87g，Tris 0.121g,加去離子水至 100ml, pH 7.5,再加入 Tween-20 0.5ml, BSA 5g),每孔300 μ 1，封板膜密封后37°C孵育lh。[0059]接著，添加待測(cè)樣品。用5%BSA/0.05%TBS_T封閉緩沖液稀釋血清，稀釋比例為1:100，完全棄去孔中液體，每孔加血清稀釋液100 μ 1，每例血清樣本3個(gè)復(fù)孔，每板設(shè)立2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔，加入已知陽(yáng)性血清，每板設(shè)立2個(gè)空白對(duì)照孔，加入0.P/oTBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37°C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0060]接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用5%BSA/0.05%TBS-T封閉緩沖液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加100μ 1，封板膜密封后37°C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0061]接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(例如康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒)，加入顯色底物，每孔加入100 μ 1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50 μ I 2ΜH2SO4終止反應(yīng)。
[0062]接著，酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定光密度OD值。
[0063]最后，基于所得到的光密度OD值與預(yù)定的參考值的區(qū)別，確定待測(cè)樣品是否來(lái)自于患有肺癌患者。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用確診癌癥患者和健康人(健康志愿者)的血液樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)所得到的數(shù)值作為預(yù)定的參考值。
[0064]例如，用ELISA方法檢測(cè)血液樣本中的抗UROD的自身抗體水平。如果待測(cè)樣本中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度值高于X+2SD，則待測(cè)血清為肺癌疑似患者血清，其中在X+2SD中，X為健康人血清中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度平均值，2SD為健康人血清中的酶底物顯色反應(yīng)的光密度值的二倍標(biāo)準(zhǔn)差。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所采用的X+2SD值是通過(guò)下列方法獲得的:按照前述利用本發(fā)明的多肽檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的方法，采用89例健康對(duì)照血液樣本，測(cè)定其酶底物顯色反應(yīng)的OD值，將測(cè)得的OD值以單樣本K-S檢驗(yàn)分析符合正態(tài)分布(p>0.05)后，計(jì)算獲得各OD值的平均值(X=0.15)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD=0.07)，則以X+2SD (0.29)為正常值的上限。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測(cè)腫瘤血清UROD抗體試劑盒中的用途。尤其是，該試劑盒可以用于檢測(cè)的腫瘤為肺癌。另外,利用該試劑盒還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)象血液中UROD自身抗體的存在，而對(duì)患者對(duì)治療方法例如放射療法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0066]為此，根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)樣品中UROD抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前面所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:陰性對(duì)照樣品，所述陰性對(duì)照樣品為UROD抗體為陰性的血清，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為UROD抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度可以為，每個(gè)反應(yīng)孔I μ g/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，尤其是，該試劑盒可以用于檢測(cè)的腫瘤為肺癌。在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了前面所述多肽在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)樣品中的UROD自身抗體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品。由此，可以利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD自身抗體，由此可以確定患者是否患有惡性腫瘤，為惡性腫瘤檢測(cè)提供輔助手段，或者監(jiān)控惡性腫瘤例如肺癌的進(jìn)展。
[0067]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)樣品中UROD自身抗體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的多肽。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的多肽對(duì)樣品中的UROD抗體進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA檢測(cè)的試劑。由此，可以通過(guò)ELISA檢測(cè)方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對(duì)樣品中的UROD抗體進(jìn)行檢測(cè)，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD抗體的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中，例如可以包被96孔板的孔，例如可以通過(guò)常規(guī)處理如借助包被液和阻滯液進(jìn)行。由此，可以方便地高通量地進(jìn)行檢測(cè)?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測(cè)肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品中的UROD抗體的效率。試劑盒中還可以包含其他試劑，例如沖洗緩沖液，樣品稀釋緩沖液，TMB底物溶液，反應(yīng)終止液，辣根酶標(biāo)記的二抗，陰性對(duì)照樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中，陰性對(duì)照樣品為UROD抗體為陰性的血清，標(biāo)準(zhǔn)樣品為UROD抗體濃度分別為IU/ml, 5U/ml, 10U/ml, 15U/ml 的血清。
[0068]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來(lái)自肺癌或疑似肺癌患者的血液樣品。
[0069]需要說(shuō)明的是，在本文中，有時(shí)也將“UR0D自身抗體識(shí)別的抗原多肽”簡(jiǎn)稱為“多肽”，將“UR0D自身抗體”簡(jiǎn)稱為“UR0D抗體”。
[0070]下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。需要說(shuō)明的是，下列實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明。另外，下列實(shí)施例中所采用的所有儀器、材料等均為市售可得的，如在下列實(shí)施例中沒(méi)有明確指出的操作，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的操作方法進(jìn)行。
[0071]實(shí)施例1多肽的制備
[0072]按照中國(guó)肺癌雜志2008年10月第11卷第5期第686~690頁(yè)的描述，構(gòu)建噬菌體cDNA展示文庫(kù)，篩選獲得 陽(yáng)性克隆。將所得到的陽(yáng)性克隆中插入的cDNA片段編碼氨基酸序列制備成多肽芯片(Piptide Array)。
[0073]實(shí)施例2篩選與肺癌相關(guān)的多肽
[0074]2.1多肽芯片的水化
[0075]首先，將實(shí)施例1所制備的多肽芯片浸入40ml 100%乙醇中，搖床上搖5分鐘。然后，將該多肽芯片浸入40ml 75%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接下來(lái)，將多肽芯片浸入40ml50%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接著，加入150ml PBS浸泡30分鐘(以膜上的白點(diǎn)完全退色為準(zhǔn))。最后，將多肽芯片浸入40ml 5%脫脂奶粉/PBS-T溶液中，室溫下孵育3小時(shí)進(jìn)行封閉。
[0076]2.2多肽陣列與血清反應(yīng)
[0077]將10例肺癌患者血清等量混合，制備肺癌血清池，用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀釋制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按0.lml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡，封膜機(jī)封口，4°C輕輕振蕩過(guò)夜。
[0078]將10例健康對(duì)照血清混合，制備健康對(duì)照血清池，用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液
I: 1000稀釋制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按0.lml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡，封膜機(jī)封口，4°C輕輕振蕩過(guò)夜。
[0079]血清免疫反應(yīng)結(jié)束后，剪開(kāi)雜交袋，棄去反應(yīng)液，PBS-T 40ml洗多肽芯片6次，每次10分鐘，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，加1:10000稀釋的山羊抗人IgG溶液，按0.lml/cm2加二抗反應(yīng)液，封好雜交袋，室溫下輕輕振蕩2小時(shí)，40ml PBS-T洗膜3次，每次10分鐘，40ml PBS洗膜3次，每次10分鐘。
[0080]接下來(lái)，進(jìn)行ECL顯影，曝光，將膠片進(jìn)行掃描，用AlphaView軟件系統(tǒng)分析圖像。
[0081]2.3 篩選
[0082]根據(jù)上述Piptide Array免疫反應(yīng)結(jié)果,挑選與肺癌患者血清反應(yīng)陽(yáng)性而與健康對(duì)照組血清反應(yīng)陰性的差異多肽點(diǎn)(序列見(jiàn)表1 )，組成多肽原位Dot-Blot膜，按照實(shí)施例1中所述制備方法，制備包含這4條多肽及對(duì)照在內(nèi)的多肽芯片，通過(guò)與15例肺癌患者血清進(jìn)行免疫反應(yīng)計(jì)算各點(diǎn)陽(yáng)性頻度值，確定特異性序列(見(jiàn)下表1)。
[0083]表1
【權(quán)利要求】
1.一種UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段為下列至少之
1)SEQ ID NO:1:ARECVGKTVTLQGNLDPCAL ；
2)SEQ ID NO:2:DPNSARECVGKTVTL ；
3)SEQ ID NO:3:SARECVGKTVTLQGN ；
4)SEQ ID NO:4:ECVGKTVTLQGNLDP ；
5)SEQ ID NO:5:GKTVTLQGNLDPCAL ； 6)SEQ ID NO: 1-5所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽，其特征在于，所述多肽具有如 ARECVGKTVTLQGNLDPCAL (SEQ ID NO:1)所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測(cè)腫瘤血清UROD抗體試劑盒中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為肺癌。
5.一種用于檢測(cè)樣品中UROD抗體的試劑盒，其特征在于，包括: 權(quán)利要求1或2所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，包括: 96孔板，所述96孔板的孔中包被 權(quán)利要求1或2所述的UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:陰性對(duì)照樣品，所述陰性對(duì)照樣品為UROD抗體為陰性的血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為UROD抗體濃度分別為lU/ml，5U/ml，10U/ml, 15U/ml的血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述UROD自身抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為，每個(gè)反應(yīng)孔I μ g/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品為腫瘤血清， 任選地，所述腫瘤為肺癌。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103848892SQ201210507755
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月30日
【發(fā)明者】岳文濤, 張麗娜, 趙曉婷, 顧勐, 王玥 申請(qǐng)人:北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所