專利名稱：一種用于b細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽陣列合成技術(shù)，尤指一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)。
背景技術(shù)：
在后基因組時(shí)代，科學(xué)家已經(jīng)把研究重心從基因組研究轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)功能研究，從分子整體水平對(duì)蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律等生物學(xué)功能進(jìn)行研究，并探索人類健康和疾病的奧秘，即蛋白質(zhì)組學(xué)。對(duì)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如核酸、多糖、化學(xué)物等)相互關(guān)系的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)中的關(guān)鍵熱點(diǎn)，而多肽技術(shù)正是這關(guān)鍵研究熱點(diǎn)的核心技術(shù)之一。多肽陣列是一種新型生物芯片，是后基因時(shí)代揭示各種疾病和生化現(xiàn)象的最直接的研究技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)平臺(tái)的軟件設(shè)計(jì)系統(tǒng)和自動(dòng)化設(shè)備，可以將任意設(shè)計(jì)的氨基酸序列一多肽，在經(jīng)過(guò)特殊處理的芯片上予以高密度地原位合成，每張芯片可承載幾千個(gè)甚至更多的原位合成多肽。該陣列技術(shù)可以根據(jù)已知蛋白的氨基酸序列，按序列漂移原則在芯片上原位合成多肽氨基酸序列，或者也可以根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)任意合成氨基酸序列，并將這些多肽按一定次序高密度地排列在芯片上，然后將測(cè)試物質(zhì)(如抗體、血清、靶蛋白等)和芯片反應(yīng)，經(jīng)過(guò)免疫或反射等檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)與測(cè)試物質(zhì)有結(jié)合反應(yīng)的位點(diǎn)/域；同時(shí)，結(jié)合反應(yīng)的數(shù)據(jù)可以輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)處理，從而尋找到蛋白質(zhì)與測(cè)試物質(zhì)的結(jié)合部位。另外，該技術(shù)可以根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)多肽抑制物或激動(dòng)劑，使得新藥發(fā)現(xiàn)的過(guò)程大為縮短。多肽陣列技術(shù)被認(rèn)為是后基因組時(shí)代與基因芯片、蛋白芯片相蓖美的新型蛋白位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)，而在疫苗、藥物、診斷試劑等研發(fā)領(lǐng)域具廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高密度、高通量、可同時(shí)測(cè)定上萬(wàn)個(gè)多肽相關(guān)相互作用的合成技術(shù)。本發(fā)明是一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，包括以下步驟:I)多肽芯片的合成，具體包括:1.1多肽微陣列芯片上的多肽合成:用半自動(dòng)合成儀吸取足量的氨基酸活化溶液點(diǎn)印于纖維素膜上，進(jìn)行多肽點(diǎn)合成反應(yīng)；1.2多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化；1.3多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除；1.4多肽微陣列芯片合成過(guò)程中的染色；1.5重復(fù)1.2至1.4步驟繼續(xù)合成多肽微陣列芯片，按照預(yù)先設(shè)定的程序，直至多肽合成完成；1.6將完成最后一層氨基酸合成的多肽微陣列芯片膜置于-20°C冰箱保存或直接進(jìn)行下一步反應(yīng)；2)多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除；
3)多肽芯片的雜交反應(yīng)。所述步驟1.1中的的氨基酸活化溶液的配制方法為:I)配制氨基酸激活劑:以DMF為溶劑，配制0.5M DIC溶液；2)配制各種氨基酸儲(chǔ)備液溶液:以DMF為溶劑，配制0.5M HOBt溶液，再將配制好的0.5M的HOBt溶液作為溶劑分別配制不同種類的Fmoc保護(hù)氨基酸，使溶液達(dá)到濃度為
0.5M的氨基酸儲(chǔ)備液；3)配制氨基酸激活溶液:用步驟I)中配制0.5M的DIC氨基酸激活劑和步驟2)中各種氨基酸儲(chǔ)備液溶液以1:1的比例混合，所得溶液即濃度為0.25M的氨基酸激活溶液。所述氨基酸激活溶液配制后室溫靜置15min以上使用。還包括步驟4)多肽微陣列芯片的再生。所述步驟1.2多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化的方法為:在多肽微陣列芯片合成每一層結(jié)束后，纖維素膜正面朝下置于玻璃平皿中，用鈍化溶液I完全浸潤(rùn)IOmin后，棄去鈍化溶液I，加入鈍化溶液II，再次靜置lOmin，棄去鈍化溶液II，將纖維素膜正面朝上，力口入DMF溶液，再震蕩洗膜6次，每次2min，所述鈍化溶液I為2%乙酸酐的DMF溶液，所述鈍化溶液II為含2%酸酐、2%二異丙基胺的 DMF溶液。所述步驟1.3多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除方法為:多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化后，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保護(hù)基團(tuán)溶液后震蕩反應(yīng)去除Fmoc氨基保護(hù)基團(tuán)，此步驟重復(fù)兩次，每次lOmin，之后用DMF溶液震蕩洗膜6次，每次2min ;再用無(wú)水乙醇震蕩洗膜兩次，每次2min，室溫晾干，所述去Fmoc保護(hù)基團(tuán)溶液為含20% Piperidine的DMF溶液。所述步驟1.4多肽微陣列芯片合成過(guò)程中的染色方法為:在多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除后，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量無(wú)水乙醇完全浸沒(méi)纖維素膜，并加入5-6滴溴酚藍(lán)染色溶液，搖動(dòng)染色2min至膜上呈現(xiàn)藍(lán)色多肽點(diǎn)時(shí)用無(wú)水乙醇震蕩洗膜2-5次直至洗液無(wú)藍(lán)色出現(xiàn)，取出纖維素膜室溫晾干或者使用冷風(fēng)從芯片反面使纖維素膜干燥，所述溴酚藍(lán)染色溶液為含0.1%溴酚藍(lán)的乙醇溶液。所述步驟步驟2)多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除方法為:I)將完成最后一層氨基酸合成的多肽芯片膜，面向上置于玻璃平皿中，去保護(hù)基溶液浸沒(méi)，搖動(dòng)反應(yīng)兩次，每次5min ;此后，用DMF溶液搖動(dòng)沖洗纖維素洗膜4次，每次2min ;再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保護(hù)基溶液為含20% Piperidine的DMF溶液；2)將玻璃平皿中殘余DCM溶液棄盡，多肽芯片膜完全浸入cocktail I溶液中后蓋嚴(yán)玻璃蓋，置于通風(fēng)櫥中靜置反應(yīng)30min,所述cocktail I溶液為5%的去離子水,3%的三異丙基硅烷，I %的濃度為90 %的苯酚溶液，I %的二氯甲烷及90 %的TFA溶液混合制成；3)倒出盒中cocktail I溶液，使用DCM溶液震蕩洗滌盒中膜片5次，每次2min，完全洗凈cocktail I殘液；4)棄盡洗膜盒中殘余DCM溶液，多肽芯片膜完全浸入cocktail II液體中后蓋嚴(yán)，置于通風(fēng)櫥中靜置反應(yīng)2h，所述cocktail II為2%去離子水，3%三異丙基硅烷，I %濃度為90%的苯酚溶液，44% DCM，及50% TFA混合制成；5)倒出盒中TFA cocktail II溶液，使用DCM溶液震蕩洗膜5次，每次2min ;用DMF洗膜3次，每次2min完全洗凈cocktail II殘液，之后用無(wú)水乙醇溶液震蕩洗膜5次，每次2min ；6)使用吹風(fēng)機(jī)涼風(fēng)干燥多肽芯片膜后，密封于干凈塑料袋中置于-80°C冰箱長(zhǎng)期保存；或者置于_20°C冰箱中待用。所述步驟3)多肽芯片的雜交反應(yīng)的方法為:I)多肽微陣列芯片活化:將干燥的多肽微陣列芯片膜，置于玻璃平皿中使用無(wú)水乙醇震蕩洗滌3次，每次5min，活化多肽微陣列芯片；2)多肽芯片平衡:活化后多肽微陣列芯片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震蕩洗滌3次，每次lOmin，平衡膜片使膜片的微環(huán)境與平衡液相似，所述TBS-T溶液為將Tween20加入TBS溶液中并且使Tween20濃度為0.2%的溶液；3)多肽芯片封閉:將平衡后的多肽微陣列芯片膜放入平皿中，加入封閉液，室溫震蕩封閉4h，所述封閉液為以TBS-T溶液作為溶劑配制含蔗糖5%、脫脂奶粉4%的封閉液；4)使用TBS-T溶液震蕩洗滌膜一次，5min，洗去微陣列芯片膜表面附著的封閉液；5)使用TBS-T封閉液稀釋樣品溶液使之含有的總蛋白量終濃度為0.1-lug/ml的反應(yīng)溶液，將多肽微陣列芯片膜與反應(yīng)溶液4°C震蕩孵育過(guò)夜或室溫震蕩孵育至少2h充分反應(yīng);6)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min ；7)用封閉液稀釋HRP 標(biāo)記的二抗溶液至終濃度為0.1-0.5ug/ml的反應(yīng)溶液，將多肽芯片膜置于反應(yīng)液中震蕩孵育2h ；8)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min ；9)棄去多肽芯片膜上多余緩沖溶液，在膜上滴加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，反應(yīng)液完全覆蓋膜片表面后充分反應(yīng)2min，保持膜片濕潤(rùn)；10)將膜片放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中掃描膜片上發(fā)光斑點(diǎn)，保存掃描圖片；11)使用TBS-T溶液震蕩洗膜一次，5min，使用去離子水洗膜三次，每次5min ;洗完后可進(jìn)行膜再生。所述步驟4)多肽微陣列芯片的再生的方法為:I)用足量去離子水洗多肽微陣列芯片膜三次，每次5min ;用足量DMF洗滌多肽微陣列芯片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的雜質(zhì)；2)用足量再生液A浸潤(rùn)多肽微陣列膜片，放入密閉容器內(nèi)，室溫，過(guò)夜，使多肽微陣列膜片上的蛋白質(zhì)變性脫離下來(lái)，所述再生液A為；用去離子水配制足量的蛋白變性液使其含有濃度為8M的尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)I %的SDS、體積比為0.1 %巰基乙醇，即為再生溶液A ；3)用25ml再生液B洗膜三次，每次lOmin，將變性完成后的蛋白洗脫下來(lái)，再生液B為；用去離子水配制足量洗滌溶液使之含有體積比為50%乙醇、體積比為10%乙酸即為再生溶液B ；4)用25ml無(wú)水乙醇洗膜二次，每次lOmin，冷風(fēng)吹干或室溫晾干膜；5)再生膜可_20°C保存或者置于_80°C保存或者直接用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
1.高密度、高通量:可同時(shí)測(cè)定上萬(wàn)個(gè)蛋白-多肽生化反應(yīng)。2.高特異性:深層揭示蛋白結(jié)合機(jī)制，準(zhǔn)確定位抗體特異表位和蛋白結(jié)合區(qū)域。3.成本低、周期短、操作簡(jiǎn)單:基于化學(xué)合成的多肽陣列芯片成本為基于生物培養(yǎng)的抗體芯片、全蛋白芯片的數(shù)百分之一。4.準(zhǔn)確可靠(純度穩(wěn)定、結(jié)果明確、直觀、易分析)。5、高速陣列膜合成:采用自控機(jī)器人逐層氨基酸點(diǎn)膜技術(shù)，比多肽逐點(diǎn)點(diǎn)膜技術(shù)速度提高幾十倍。6、介質(zhì)-多肽分子“立式”固定:與多數(shù)其他多肽芯片合成采用的“臥式”分子固定方式相比，更接近于生物液相反應(yīng)環(huán)境。


圖1:本發(fā)明單張芯片示意圖表。
圖2:圖編號(hào)為N的陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(血吸蟲(chóng)病人血清印跡反應(yīng)實(shí)驗(yàn))。
圖3:圖編號(hào)為L(zhǎng)的血吸蟲(chóng)病人血清印跡反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖4:圖編號(hào)為C的重度血吸蟲(chóng)病人血清印跡反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明是多肽微陣列芯片的合成與生物樣本檢測(cè)技術(shù)。采用軟件設(shè)計(jì)多肽微陣列，采用自控機(jī)器人逐層氨基酸點(diǎn)膜技術(shù)進(jìn)行多肽微陣列的化學(xué)合成。合成多肽微陣列可用于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分子生物學(xué)試驗(yàn)，例如尋找藥物的靶位點(diǎn)、蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理研究、篩查特定疾病試劑盒，建立與某種疾病相關(guān)的多肽數(shù)據(jù)庫(kù)、探討蛋白質(zhì)作用的機(jī)理等等。1、氨基酸儲(chǔ)備液、工作溶液的制備本發(fā)明采用邊配制邊用的方法，提高多肽微陣列芯片上氨基酸的結(jié)合效率；并且相較于應(yīng)用與活化氨基酸溶液大大節(jié)省成本。1.1氨基酸激活劑的配制以DMF為溶劑，配制0.5M DIC(注解:DIC，二異丙基碳化二亞胺diisopropylcarbodiimide,MW126.2)溶液，所得溶液即為氨基酸激活劑。此濃度的氨基酸激活液可與0.5M的氨基酸溶液等體積混合得到0.25M的活化的氨基酸溶液，操作方便易行。此配置方法得到的溶液是為了制作多肽微陣列專門優(yōu)化處理的最佳試劑比例。1.2各種氨基酸儲(chǔ)備液溶液的配制稱取一定量的HOBt用DMF為溶劑溶解，完全溶解后，加DMF定量，使配制的HOBt溶液濃度達(dá)到0.5M。以配好的0.5M的HOBt溶解作為溶劑分別配制不同種類的Fmoc保護(hù)氨基酸，配制完成后使他們濃度為0.5M的氨基酸儲(chǔ)備液。由于氨基酸溶液沒(méi)有被DIC激活，處于相對(duì)穩(wěn)定的水平，此儲(chǔ)備液可在_20°C保存至少一周；下表給出各種Fmoc保護(hù)的氨基酸的分子量，和配制2.5ml、5ml、10ml氨基酸儲(chǔ)備液所需的Fmoc保護(hù)的氨基酸的質(zhì)量供操作者參考。這樣就不必每次合成前配制氨基酸溶液，可大大降低實(shí)驗(yàn)工作量量。

權(quán)利要求
1.一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟: 1)多肽芯片的合成，具體包括: 1.1多肽微陣列芯片上的多肽合成:用半自動(dòng)合成儀吸取足量的氨基酸活化溶液點(diǎn)印于纖維素膜上，進(jìn)行多肽點(diǎn)合成反應(yīng)； 1.2多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化； 1.3多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除； 1.4多肽微陣列芯片合成過(guò)程中的染色； 1.5重復(fù)1.2至1.4步驟繼續(xù)合成多肽微陣列芯片，按照預(yù)先設(shè)定的程序，直至多肽合成完成； 1.6將完成最后一層氨基酸合成的多肽微陣列芯片膜置于_20°C冰箱保存或直接進(jìn)行下一步反應(yīng)； 2)多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除； 3)多肽芯片的雜交反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟1.1中的的氨基酸活化溶液的配制方法為: 1)配制氨基酸激 活劑:以DMF為溶劑，配制0.5M DIC溶液； 2)配制各種氨基酸儲(chǔ)備液溶液:以DMF為溶劑，配制0.5M HOBt溶液，再將配制好的0.5M的HOBt溶液作為溶劑分別配制不同種類的Fmoc保護(hù)氨基酸，使溶液達(dá)到濃度為0.5M的氨基酸儲(chǔ)備液； 3)配制氨基酸激活溶液:用步驟I)中配制0.5M的DIC氨基酸激活劑和步驟2)中各種氨基酸儲(chǔ)備液溶液以1:1的比例混合，所得溶液即濃度為0.25M的氨基酸激活溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述氨基酸激活溶液配制后室溫靜置15min以上使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，還包括步驟4)多肽微陣列芯片的再生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟1.2多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化的方法為:在多肽微陣列芯片合成每一層結(jié)束后，纖維素膜正面朝下置于玻璃平皿中，用鈍化溶液I完全浸潤(rùn)IOmin后，棄去鈍化溶液I，加入鈍化溶液II，再次靜置lOmin，棄去鈍化溶液II，將纖維素膜正面朝上，加入DMF溶液，再震蕩洗膜6次，每次2min，所述鈍化溶液I為2%乙酸酐的DMF溶液，所述鈍化溶液II為含2%酸酐、2%二異丙基胺的DMF溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟1.3多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除方法為:多肽微陣列芯片合成中側(cè)鏈鈍化后，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保護(hù)基團(tuán)溶液后震蕩反應(yīng)去除Fmoc氨基保護(hù)基團(tuán)，此步驟重復(fù)兩次，每次lOmin，之后用DMF溶液震蕩洗膜6次，每次2min ;再用無(wú)水乙醇震蕩洗膜兩次，每次2min，室溫晾干，所述去Fmoc保護(hù)基團(tuán)溶液為含20% Piperidine的DMF溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟1.4多肽微陣列芯片合成過(guò)程中的染色方法為:在多肽微陣列芯片合成中每層Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除后，將纖維素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量無(wú)水乙醇完全浸沒(méi)纖維素膜，并加入5-6滴溴酚藍(lán)染色溶液，搖動(dòng)染色2min至膜上呈現(xiàn)藍(lán)色多肽點(diǎn)時(shí)用無(wú)水乙醇震蕩洗膜2-5次直至洗液無(wú)藍(lán)色出現(xiàn)，取出纖維素膜室溫晾干或者使用冷風(fēng)從芯片反面使纖維素膜干燥，所述溴酚藍(lán)染色溶液為含0.1%溴酚藍(lán)的乙醇溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟步驟2)多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除方法為: 1)將完成最后一層氨基酸合成的多肽芯片膜，面向上置于玻璃平皿中，去保護(hù)基溶液浸沒(méi)，搖動(dòng)反應(yīng)兩次，每次5min ;此后，用DMF溶液搖動(dòng)沖洗纖維素洗膜4次，每次2min ;再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保護(hù)基溶液為含20% Piperidine的DMF溶液； 2)將玻璃平皿中殘余DCM溶液棄盡，多肽芯片膜完全浸入cocktailI溶液中后蓋嚴(yán)玻璃蓋,置于通風(fēng)櫥中靜置反應(yīng)30min,所述cocktail I溶液為5%的去離子水,3%的三異丙基硅烷，I %的濃度為90 %的苯酚溶液，I %的二氯甲烷及90 %的TFA溶液混合制成； 3)倒出盒中cocktailI溶液，使用DCM溶液震蕩洗滌盒中膜片5次，每次2min，完全洗凈cocktail I殘液 ； 4)棄盡洗膜盒中殘余DCM溶液，多肽芯片膜完全浸入cocktailII液體中后蓋嚴(yán)，置于通風(fēng)櫥中靜置反應(yīng)2h，所述cocktail II為2%去離子水，3%三異丙基硅烷，I %濃度為90%的苯酚溶液，44% DCM，及50% TFA混合制成； 5)倒出盒中TFAcocktail II溶液，使用DCM溶液震蕩洗膜5次，每次2min ;用DMF洗膜3次，每次2min完全洗凈cocktail II殘液，之后用無(wú)水乙醇溶液震蕩洗膜5次，每次2min ； 6)使用吹風(fēng)機(jī)涼風(fēng)干燥多肽芯片膜后，密封于干凈塑料袋中置于-80°C冰箱長(zhǎng)期保存；或者置于_20°C冰箱中待用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟3)多肽芯片的雜交反應(yīng)的方法為: 1)多肽微陣列芯片活化:將干燥的多肽微陣列芯片膜，置于玻璃平皿中使用無(wú)水乙醇震蕩洗滌3次，每次5min，活化多肽微陣列芯片； 2)多肽芯片平衡:活化后多肽微陣列芯片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震蕩洗滌3次，每次lOmin，平衡膜片使膜片的微環(huán)境與平衡液相似，所述TBS-T溶液為將TWeen20加入TBS溶液中并且使TWeen20濃度為0.2%的溶液； 3)多肽芯片封閉:將平衡后的多肽微陣列芯片膜放入平皿中，加入封閉液，室溫震蕩封閉4h，所述封閉液為以TBS-T溶液作為溶劑配制含蔗糖5%、脫脂奶粉4%的封閉液； 4)使用TBS-T溶液震蕩洗滌膜一次，5min，洗去微陣列芯片膜表面附著的封閉液； 5)使用TBS-T封閉液稀釋樣品溶液使之含有的總蛋白量終濃度為0.1-lug/ml的反應(yīng)溶液，將多肽微陣列芯片膜與反應(yīng)溶液4°C震蕩孵育過(guò)夜或室溫震蕩孵育至少2h充分反應(yīng)； 6)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min； 7)用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗溶液至終濃度為0.1-0.5ug/ml的反應(yīng)溶液，將多肽芯片膜置于反應(yīng)液中震蕩孵育2h ； 8)使用TBS-T溶液震蕩洗膜3次，每次5min；9)棄去多肽芯片膜上多余緩沖溶液，在膜上滴加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，反應(yīng)液完全覆蓋膜片表面后充分反應(yīng)2min，保持膜片濕潤(rùn)； 10)將膜片放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中掃描膜片上發(fā)光斑點(diǎn)，保存掃描圖片； 11)使用TBS-T溶液震蕩洗膜一次，5min，使用去離子水洗膜三次，每次5min;洗完后可進(jìn)行膜再生。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，其特征在于，所述步驟4)多肽微陣列芯片的再生的方法為: 1)用足量去離子水洗多肽微陣列芯片膜三次，每次5min;用足量DMF洗滌多肽微陣列芯片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的雜質(zhì)； 2)用足量再生液A浸潤(rùn)多肽微陣列膜片，放入密閉容器內(nèi)，室溫，過(guò)夜，使多肽微陣列膜片上的蛋白質(zhì)變性脫離下來(lái)，所述再生液A為；用去離子水配制足量的蛋白變性液使其含有濃度為8M的尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS、體積比為0.1 %巰基乙醇，即為再生溶液A ; 3)用25ml再生液B洗膜三次，每次lOmin，將變性完成后的蛋白洗脫下來(lái)，再生液B為；用去離子水配制足量洗滌溶液使之含有體積比為50%乙醇、體積比為10%乙酸即為再生溶液B ; 4)用25ml無(wú)水乙醇洗膜二次，每次lOmin，冷風(fēng)吹干或室溫晾干膜； 5)再生膜可_20°C保存 或者置于_80°C保存或者直接用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明是一種用于B細(xì)胞抗原表位篩查的多肽陣列合成技術(shù)，包括以下步驟1)多肽芯片的合成，用半自動(dòng)合成儀吸取足量的氨基酸活化溶液點(diǎn)印于纖維素膜上，進(jìn)行多肽點(diǎn)合成反應(yīng)；2)多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除；3)多肽芯片的雜交反應(yīng)。本發(fā)明提供一種高密度、高通量、可同時(shí)檢測(cè)上萬(wàn)個(gè)多肽相關(guān)相互作用的合成技術(shù)。本發(fā)明采用自控機(jī)器逐層氨基酸點(diǎn)膜技術(shù)進(jìn)行多肽微陣列的化學(xué)合成。合成多肽微陣列可用于蛋白質(zhì)間以及蛋白質(zhì)與其它生物大分子間的相互作用研究，例如尋找抗體識(shí)別多肽序列、藥物的作用靶位點(diǎn)、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)、篩查特定疾病相關(guān)蛋白的抗原表位，建立與某種疾病相關(guān)的多肽數(shù)據(jù)庫(kù)、探討蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理等。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103245788SQ201310093099
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者趙樹(shù)民, 鮑勇剛, 石松傳 申請(qǐng)人:趙樹(shù)民