專利名稱：包含熱休克蛋白和hpv16z蛋白抗原的無佐劑治療性蛋白疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熱休克蛋白與HPV16Z E6/E7的融合蛋白，該融合蛋白的獲得方法，表達(dá)該融合蛋白的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化了該表達(dá)質(zhì)粒的宿主，以及所述融合蛋白在治療和預(yù)防HPV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HPV與多種上皮來源的腫瘤和增生關(guān)系密切，高危型HPV的感染是女性宮頸癌形成的主要原因。在我國婦女宮頸癌組織中HPV感染檢出率大于99％，其中HPV16占90％以上。世界范圍內(nèi)每年有40萬新發(fā)宮頸癌病例，20萬人死于該病，位居女性腫瘤死亡人數(shù)的第二位。目前宮頸癌的治療主要是手術(shù)和放療，其治療5年生存率僅50％左右，效果不理想，另外對宮頸的早期病變的治療尚缺乏理想的方法。因此研制新的藥物用于治療HPV感染尤其是HPV16型引起的相關(guān)疾病具有重要意義。流行病學(xué)資料證實(shí)，HPV感染有種屬地域分布不均勻性，且不同地區(qū)的同型HPV往往存在變異，所以疫苗的研究必須要對我國的HPV16具有較高的針對性。張偉教授在80年代末期于HPV高發(fā)省份山西省成功克隆了一株HPV16病毒—HPV16Z(中國病毒學(xué)，8(1)45-52，1993)?，F(xiàn)經(jīng)測序并與德國HPV16標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較，證實(shí)同源性為98％，E5基因部分和一段非編碼序列較大差異，E6基因發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變，E7基因完全一致，在此病毒基礎(chǔ)上研制的HPV治療性疫苗對我國的HPV16型感染性疾病將具有較高的針對性和臨床應(yīng)用前景。
人乳頭瘤病毒是具有約8000bp的無包膜雙鏈環(huán)狀DNA病毒，廣泛感染生殖道粘膜和口腔、咽部粘膜上皮細(xì)胞等，目前已發(fā)現(xiàn)100多種型別HPV，其中35個型別與生殖道疾患有關(guān)，其基因組由早期基因編碼區(qū)、晚期基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成。晚期基因區(qū)包含2個獨(dú)立的編碼病毒衣殼蛋白L1和L2的開放讀碼框。L1是主要衣殼蛋白，在不同HPV型別之間高度保守；而早期蛋白包括6個開放讀碼框，分別形成E1、E2、E4、E5、E6、E7蛋白。蛋白E6、E7為癌基因產(chǎn)物，是HPV感染導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的主要原因。E6是大小約17KD的多肽，能與P53結(jié)合引起P53經(jīng)泛素化降解，E7是大小約11KD的多肽，能與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物RB結(jié)合，阻礙RB與E2F的復(fù)合物的形成，P53和RB的正常功能被抑制是HPV致癌的機(jī)理。
由于HPV無法體外培養(yǎng)，難以獲得減毒或滅活疫苗，所以目前對于預(yù)防HPV感染的疫苗研究只能通過基因工程的方法來獲得，研究方向主要是針對病毒晚期蛋白L1或者L1與L2；而通過基因工程的途徑獲得的抗原必須具有正確的空間表位，在體內(nèi)獲得抗HPV晚期蛋白的抗體，才能有效保護(hù)機(jī)體。目前已通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了構(gòu)象正確的病毒樣顆粒(VLP)，試驗(yàn)證明能有效抗HPV的感染。但是這種疫苗對已感染HPV者無治療作用，所以有效治療HPV相關(guān)疾病的治療性疫苗的研發(fā)具有一定的意義。E6、E7由于其在轉(zhuǎn)化方面的特性被認(rèn)為是治療HPV相關(guān)腫瘤和癌前病變理想的靶點(diǎn)，所以治療性疫苗多以E6、E7作為主攻方向。E7免疫原性強(qiáng)，易于表達(dá)，在HPV疫苗中常用作抗原部分，而E6沒有得到足夠重視，且部分疫苗采用野生型E6、E7，其具有潛在致癌性。單純的E6/E7融合蛋白免疫原性不足以激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，需要佐劑的配合，但是目前尚缺乏有效的被批準(zhǔn)應(yīng)用的佐劑。由于上述原因，目前治療性蛋白疫苗的研究正進(jìn)入無危險、無佐劑的階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及應(yīng)激蛋白與人乳頭瘤病毒蛋白抗原的融合蛋白。本發(fā)明使用的HPV16為本科室自我國山西宮頸癌高發(fā)區(qū)分離得到的HPV16常見亞型HPV16Z，從HPV16Z毒株中克隆出E6和E7基因片段用于構(gòu)建疫苗，對我國的HPV16將具有較高的針對性。本發(fā)明的HPV蛋白抗原優(yōu)選HPV16Z E6/E7融合蛋白，包括E6C端88個氨基酸和經(jīng)修飾E7完整片段，E7基因編碼第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密碼子可采用定點(diǎn)突變的方法進(jìn)行基因突變，使其喪失導(dǎo)致抑癌基因失活能力，另外在優(yōu)選的方案中通過將E7 58，91位密碼子同時突變，使其編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成甘氨酸，降低E7蛋白穩(wěn)定性，免疫呈遞效果更佳。本發(fā)明的應(yīng)激蛋白為熱休克蛋白，優(yōu)選牛結(jié)核桿菌來源的熱休克蛋白65(Hsp65)，熱休克蛋白在種屬間高度同源，健康人有識別自身應(yīng)激蛋白的T細(xì)胞群，所以自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在與正常健康相容，不會導(dǎo)致自身免疫病，這證實(shí)人體中應(yīng)激蛋白的安全性；另外卡介苗(BCG)接種的成功和相對安全性也證實(shí)了此應(yīng)激蛋白的安全。此融合蛋白在無佐劑的情況下在體內(nèi)成功誘導(dǎo)了針對E6、E7的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本發(fā)明涉及融合蛋白的獲得方法，融合蛋白最好在大腸桿菌中表達(dá)，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)具有5-9個、最好6個組氨酸殘基的組氨酸尾的所述蛋白，這在純化中是有利的。包含了組氨酸尾(His)標(biāo)志融合蛋白利用金屬親和層析柱純化(IMAC)，可以通過親和層析復(fù)性融合蛋白及達(dá)到部分純化效果。在IMAC柱產(chǎn)生高度純化的蛋白以后，可以利用離子交換進(jìn)行第二步純化，利用簡單的二步純化，可以使目的蛋白的純度達(dá)到95％以上，達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明同時也涉及了編碼融合蛋白的DNA序列及獲得表達(dá)該融合蛋白的表達(dá)載體和表達(dá)宿主的方法。
本發(fā)明還涉及到融合蛋白在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。包含本文所述的應(yīng)激蛋白和HPV抗原的融合物可用于增強(qiáng)對HPV或表達(dá)HPV抗原的HPV感染細(xì)胞或HPV轉(zhuǎn)化細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)，優(yōu)選地以所述融合蛋白在治療和預(yù)防HPV感染相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。


圖1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖3經(jīng)純化后的蛋白純度分析圖4融合蛋白對腫瘤生長的抑制作用圖5小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性殺傷作用圖6疫苗對TC-1腫瘤的治療作用圖7疫苗對荷瘤小鼠生存期的影響圖8腫瘤大小—時間曲線具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 Hsp65-E6/E7融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建1.1 E6/E7融合基因的合成使用張偉教授自山西克隆的HPV16Z病毒株全基因組序列作為模板，通過PCR的方法得到E6和E7片段，在此基礎(chǔ)上設(shè)計3對引物對E7的24、26、58、91位密碼子進(jìn)行點(diǎn)突變，同時PCR擴(kuò)增出E6C端88個氨基酸的密碼子，將獲得的部分E6片段和突變的E7片段進(jìn)行融合。
1.2 PET28a-Hsp65的獲得從中國生物制品研究所購得卡介苗2支，用STE懸浮菌體，離心后再次懸浮于400μl 0.05MTris-HCl(PH 8.5)、0.05M EDTA、15％蔗糖中，加入0.4mg溶菌酶，37℃作用30分鐘，再加入2％蛋白酶K至終濃度0.1mg/ml，25℃作用10分鐘，再加入4mg SDS，60℃作用2小時，離心分離上清，并用酚氯仿抽提2次，加入RNAase37℃作用2小時，乙醇沉淀，最終溶解在20UL的去離子水中。設(shè)計一對引物，正向引物以包含一個Nde1限制性酶切位點(diǎn)，其編碼序列為5’CAGCC ATATGGCCAAGACAAT TGCG TACGAC，反向引物包括EcoR1和Nhe1限制性酶切位點(diǎn)，其編碼序列CTCGAATTCTTATCAGCTAGCGAAATCCATGCCACCCATGTCG。利用上述方法獲得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)純化并進(jìn)行Nde1和EcoR1雙酶切，再與經(jīng)Nde1/EcoR1雙酶切的PET28a進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，在含有抗生素的平板上生長。挑取單克隆菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序，將序列和插入位點(diǎn)正確的質(zhì)粒進(jìn)行保種，并大量提取。
1.3 Hsp65-E6/E7表達(dá)質(zhì)粒及高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建將上述獲得的E6/E7融合基因進(jìn)行Nhe1和EcoR1雙酶切，并與經(jīng)相同，酶切的PET28a-Hsp65進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，挑取單克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序，將序列和插入位點(diǎn)正確的質(zhì)粒進(jìn)行保種。并將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在含有卡那的平板上進(jìn)行篩選，隨即挑選10個單克隆菌株，在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期時加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，觀察融合蛋白的表達(dá)情況。
實(shí)施例二 融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及表達(dá)條件的優(yōu)化將上述轉(zhuǎn)化了表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)于含有卡那霉素的培養(yǎng)基中37℃生長至OD600為0.6-1.0之間時，取出部分菌液，其余加入IPTG至中濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)37℃3小時，將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌液各取1ml，離心收集菌體，加入上樣緩沖液100℃水浴5分鐘，離心取上清和直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時也進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)BSA的電泳，電泳完畢后，考馬斯亮藍(lán)染色2小時以上，再用脫色液進(jìn)行脫色處理，可用加熱的方法加速脫色的過程，通過與BSA比較，有一分子量高于65KD的明顯高表達(dá)蛋白帶，其位置接近目的蛋白80KD，如附圖一所示經(jīng)用抗Hsp65和E7抗體進(jìn)行Western-Blot分析，該蛋白為目的蛋白。
在驗(yàn)證了目的蛋白的表達(dá)以后，將表達(dá)菌株于5ml含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃，150轉(zhuǎn)/分震蕩4-6小時。重新取5支培養(yǎng)管，每管加含Kan的LB培養(yǎng)基10.5ml，分別加入500μl獲得的菌液，繼續(xù)培養(yǎng)至OD為0.4-1.0，取出1ml作為對照。分別加入20％IPTG 2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，分別于3、4、5、6小時各取1ml菌液。分別離心收集菌體，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果IPTG濃度在1mM，誘導(dǎo)時間分別為2、3、4、5、6小時，隨著誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量并未增加，而IPTG濃度分別為0.4、0.6、0.8、1、1.2mM時，IPTG在1mM時表達(dá)量達(dá)到最大值。結(jié)果說明最佳誘導(dǎo)條件是IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時間為2小時，如附圖2所示。
實(shí)施例三 融合蛋白的發(fā)酵表達(dá)及純化將保存好的表達(dá)菌種復(fù)蘇后，于10ml LB培養(yǎng)基中，37℃，150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)過夜，取5ml接種于500mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。在9.5L TB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將PH值調(diào)至6.8，300轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4小時，在此期間保證溶氧在50％以上。加入終濃度1mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)3小時，收獲菌液，離心收集菌體，按菌體濕重每克三毫升的比例懸浮于裂解緩沖液A中(10mM Tris-Hcl，0.5mM β-巰基乙醇，pH8.0，200ug/ml溶菌酶)，保存于-70℃?zhèn)溆?。使用時，將冷凍的細(xì)菌懸液在室溫中解凍，并加2ug/ml蛋白酶抑制劑PMSF，超聲破碎細(xì)菌，15000rpm離心10分鐘，收集沉淀，將沉淀用包涵體洗滌液B(20mM Tris-Hcl pH 8.0，2M尿素)洗滌2次，離心收集沉淀，沉淀最終熔解在溶液C中(20mM Tris-Hcl pH 8.0，8M尿素)，室溫放置一小時，充分溶解后。離心收集上清，4℃保存。
將上清上樣于溶液C平衡的CU2+整合柱，上樣后，溶液C洗滌2個柱體積，直至達(dá)到基線水平，然后進(jìn)行蛋白的復(fù)性工作，具體為通過含溶液D(1M NaCl、20mMTris pH 8.0)與溶液C形成尿素逐漸降低的連續(xù)梯度，以逐漸降低流經(jīng)層析柱中的尿素濃度，當(dāng)溶液C被完全取代后，繼續(xù)3倍柱體積溶液D洗脫，完全去除殘余的尿素，以達(dá)到復(fù)性的目的。復(fù)性程序完成后，利用20-300mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫目的蛋白。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后脫鹽處理，利用20mM Tris(PH 8.0)平衡脫鹽柱，將樣品上樣(最大不超過柱體積的1/3)，3ml/min，收集第一個出現(xiàn)的蛋白峰，進(jìn)行SOURCE 30Q陰離子洗脫，具體方法為用50mM Tris(PH8.0)平衡脫鹽柱后，樣品上樣，用50mM Tris(PH8.0)洗滌至基線穩(wěn)定，利用A液(50mM Tris，PH7.5)與B液(50mM Tris PH7.5，1M NaCl)形成梯度，結(jié)果獲得純化的蛋白，經(jīng)HPLC分析，純度高于95％，如附圖3所示。
實(shí)施例四 疫苗對免疫組和對照組脾淋巴細(xì)胞的增殖活性C57BL/6雌鼠6只分2組，每組3只，分別在頸背部皮下注射200μg/0.2ml Hsp65-E6/E7融合蛋白(疫苗組)和0.2ml緩沖液(緩沖液組)。14天后再次免疫，方法、劑量和部位同第一次免疫，第二次免疫10天后脫頸處死小鼠，70％酒精中浸泡3分鐘。在無菌操作臺上剪開腹部，取出脾臟，用玻璃注射器芯在200目不銹鋼網(wǎng)上輕輕研磨。PBS沖洗不銹鋼網(wǎng)，反復(fù)3次，制成單細(xì)胞懸液備用。取預(yù)先放置到室溫的淋巴細(xì)胞分離液3ml，加入15ml玻璃離心管中，將6～10ml單細(xì)胞懸液輕輕加到分離液上，在水平離心機(jī)中2000rpm，離心20min，中間的白色界面層即為淋巴細(xì)胞。吸取界面層細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，計數(shù)，重懸于含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，將疫苗組和緩沖液組淋巴細(xì)胞各分為4組，分別加入培養(yǎng)液(空白對照)、GST(終濃度為50μg/ml)、Hsp65-E6/E7融合蛋白(終濃度為100μg/ml)和Con A(終濃度為10μg/ml)。用MTT法檢測小鼠脾細(xì)胞的增殖，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入40萬脾淋巴細(xì)胞，總體積為150μl。在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)3天后，加入1mg/mlMTT溶液50μl。37℃孵育4-6小時后，用酶標(biāo)儀測定波長為570nm時的吸光值(OD)。
此試驗(yàn)結(jié)果顯示Hsp65-E6/E7重組疫苗對免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的刺激作用，刺激指數(shù)為3.4；而對對照小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用刺激較弱，刺激指數(shù)為1.1，二者差異有顯著性意義(P＜0.01)。無關(guān)蛋白GST對免疫和對照二組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激增殖作用均較弱，二組的差異無顯著性意義。ConA對免疫和對照小鼠脾細(xì)胞增殖都有強(qiáng)烈刺激作用，二組的差異無顯著性意義。結(jié)果說明，疫苗激發(fā)小鼠的淋巴細(xì)胞的分裂，如附圖4所示。
實(shí)施例五 免疫和未免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的裂解活性從小鼠中取出脾細(xì)胞直接進(jìn)行殺傷試驗(yàn)可以反映當(dāng)時體內(nèi)的抗腫瘤能力。結(jié)果如附圖5所示，Hsp65-E6/E7重組疫苗免疫小鼠的脾細(xì)胞對HPV16陽性TC-1細(xì)胞的裂解明顯高于對照組，在效靶比為25∶1的情況下，殺傷率分別為13.28％和4.26％，差異有顯著性(P＜0.01)意義。另外我們還檢測了小鼠脾細(xì)胞對HPV16陰性L929細(xì)胞的殺傷作用。免疫組和對照組殺傷率均很低，效靶比為25∶1時分別為3.79％和2.5％，差異無顯著性意義。
實(shí)施例六 融合蛋白疫苗誘導(dǎo)的TC-1移植瘤的消退實(shí)驗(yàn)動物采用C57BL/6小鼠，接種的腫瘤細(xì)胞TC-1腫瘤細(xì)胞系，TC-1細(xì)胞系是來源于C57BL/6的肺上皮細(xì)胞，經(jīng)共轉(zhuǎn)染HPV16 E6/E7和激活的c-H-ras基因后轉(zhuǎn)化而得到的HPV16 E6/E7陽性細(xì)胞株，源于T-C Wu實(shí)驗(yàn)室，該細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)方案如下實(shí)驗(yàn)動物35只，腋窩下接種1.3×105TC-1細(xì)胞，接種TC-1細(xì)胞4天后，即可觀察到部分小鼠腫瘤皮下生長。10天后，腫瘤形成率達(dá)100％。腫瘤大小均勻，體積約8mm3。我們選擇其中的32只小鼠，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別注射PBS、50ug、100ug、200ug融合蛋白疫苗，14天后再次免疫接種。此后觀察腫瘤的消退以及小鼠的生存時間。觀察期間對照組小鼠腫瘤生長迅速。40天后，對照組小鼠由于腫瘤負(fù)荷過大開始死亡；而治療組小鼠的腫瘤生長受到抑制(附圖8)。在接種腫瘤細(xì)胞的第32天，對照組小鼠的平均腫瘤為7.5cm3，而治療組的50μg、100μg和200μg 3個劑量組的腫瘤體積分別為4.1、1.6、0.2cm3。3個劑量的融合蛋白都有顯著的抑瘤作用(與對照組相比，3組的P＜0.05)，而且較高劑量的融合蛋白抑瘤作用要好于較低劑量(200μg vs 100μg，100μg vs50μg，P＜0.05)(附圖7)，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯，特別是高劑量(200μg/只)治療組，7只小鼠中的2只在第二次免疫后的3～6天腫瘤完全消退，且持續(xù)20天以上(附圖6)。治療組(3個劑量)小鼠的生存期明顯長于對照組(P＜0.05)。到第64天，所有的對照小鼠(8只)全部死亡，而治療組的50μg、100μg和200μg組分別有30％、70％和100％的小鼠存活。到第120天，200μg組仍有5只存活。說明疫苗明顯延長了小鼠的生存期。
權(quán)利要求
1.用于在體內(nèi)誘導(dǎo)針對HPV16Z蛋白抗原的特異性免疫應(yīng)答的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白至少包括應(yīng)激蛋白與HPV16Z蛋白抗原。
2.權(quán)利要求1所要保護(hù)的目的蛋白，其中所述的應(yīng)激蛋白為熱休克蛋白65，蛋白抗原為HPV16ZE6與E7的融合蛋白。
3.權(quán)利要求1和2所要保護(hù)的目的蛋白，其中所述的E6為截短的E6片斷，其至少包括E6蛋白C端88個氨基酸，E7為突變的E7蛋白，其24、26、58、91位氨基酸突變成苷氨酸。
4.權(quán)利要求1所要保護(hù)的目的蛋白，還至少包含4個組氨酸殘基的純化標(biāo)記。
5.編碼本文要求保護(hù)的目的蛋白的DNA序列。
6.含權(quán)利要求3的DNA序列的載體。
7.權(quán)利4所要保護(hù)的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
8.本文要求保護(hù)的融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括表達(dá)所述序列并分離所需產(chǎn)物。
9.本文要求保護(hù)的融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括將本文要求保護(hù)的蛋白與合適的稀釋劑或其他藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
10.本文要求保護(hù)的融合蛋白的用途，在治療和預(yù)防HPV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及熱休克蛋白與HPV16Z E6/E7的融合蛋白，該融合蛋白的獲得方法，表達(dá)該融合蛋白的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化了該表達(dá)質(zhì)粒的宿主，以及所述融合蛋白在治療和預(yù)防HPV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。此融合蛋白以包涵體的形式在大腸桿菌中表達(dá)后，通過柱上復(fù)性和層析純化后，純度大于95％，在無佐劑的情況下在小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)了針對E6、E7的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，對TC－1細(xì)胞小鼠移植瘤有顯著的治療作用。
文檔編號A61K39/12GK1900118SQ20051008546
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者王小兵, 張偉 申請人:張偉