專利名稱：模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物及其在噬菌體展示中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由天然存在的L-α-氨基酸殘基組成的某些肽序列的組合物和方法，其中根據(jù)氨基酸殘基在所述鏈中的位置，某些氨基酸殘基是通過二硫鍵橋接的半胱氨酸，由此形成環(huán)肽；而且，與所述半胱氨酸相鄰的某些其它氨基酸殘基形成下文中定義的某種類型的二或三肽部分，它們一起充當(dāng)模板以利于β發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定。鑒于這些模板固定的發(fā)夾環(huán)模擬物的穩(wěn)定性和限制性，它們可以顯示出更高的或者延長的針對蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體的活性。
可以在來自噬菌體展示的發(fā)夾環(huán)模擬物的構(gòu)建中植入模板，用于文庫篩選和藥物篩選。本發(fā)明的組合物和方法可以用于體外篩選和鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。當(dāng)難于將蛋白質(zhì)表位轉(zhuǎn)移至小肽或肽模擬物中時(shí)，本發(fā)明可以充當(dāng)補(bǔ)充的、有效的、引導(dǎo)性的靶發(fā)現(xiàn)工具。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和生物活性肽的表面環(huán)常常參與蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體的識別。因此，將這些環(huán)作為藥物開發(fā)的潛在線索來研究是有意義的。尤其有意義的是β發(fā)夾β發(fā)夾基序在自然界中十分豐富，存在于許多蛋白質(zhì)配體的表面和抗體的高變區(qū)中。β發(fā)夾基序由兩個(gè)通過短環(huán)或轉(zhuǎn)角連接的反平行β鏈組成，并已經(jīng)根據(jù)H鍵成鍵網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分類[Sibanda，B.L.；Blundell，T.L.；Th或nton，J.M.J.Mol.Biol.1989，206，759-777]。
目前已經(jīng)確立了通過使用組合和平行合成方法制備β發(fā)夾肽模擬物(peptidomimetics)的能力(L.Jiang，K.Moehle，B.Dhanapal，D.Obrecht，J.A.Robinson，Helv.Chim.Acta.2000，83，3097-3112)。然而，這些分子不可能在大到1010或1012的文庫中合成。
對于基于肽的引導(dǎo)開發(fā)，一種補(bǔ)充策略是在允許制備大到1010至1012的文庫的絲狀噬菌體上展示文庫，這比合成方式可以制備的文庫大許多數(shù)量級。
此外，已有快速價(jià)廉的選擇方案可以用于鑒定與目的靶結(jié)合的文庫成員。如熟知的，噬菌體展示技術(shù)允許構(gòu)建環(huán)狀的、受約束的肽，例如二硫鍵約束的β發(fā)夾環(huán)(H.B.Lowman，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.1997，26，401-24)。
這些環(huán)表現(xiàn)出有限數(shù)量的構(gòu)象，這可能導(dǎo)致受體靶的親和配體的分離。然而，通過僅一個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的環(huán)肽仍然在構(gòu)象上具有相當(dāng)?shù)娜嵝浴６?，熟知，二硫鍵的形成和斷裂可以是可逆的，柔性隨著肽限制物(constraints)與基因III蛋白質(zhì)氨基端的融合而增加。因此，重要的是，通過鄰近二硫鍵并利于β折疊構(gòu)象的其它殘基穩(wěn)定該環(huán)結(jié)構(gòu)(R.H.Hoess，Current Opinion in Structural Biology，1993，3，572-579)。這可能不會(huì)產(chǎn)生受體靶的高親和配體?？梢詫⑾嗤碾沫h(huán)固定在天然蛋白質(zhì)支架中，其中蛋白質(zhì)支架接在環(huán)的N和C端上；此外，使所述肽環(huán)受到天然蛋白質(zhì)支架所誘導(dǎo)的反平行β折疊的氫鍵的約束。再者，也已經(jīng)提出了其它方法，例如用于輪流展示(turn display)的肽支架(A.G.Cochran，R.T.Tong，M.A.Starvasnik，E.J.Park，R.S.McDowell，J.E.Theaker，N.J.Skeleton，J.Am.Chem.Soc.2001，123，625-632)。該問題的另一可能解決方案是使用折疊蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)約束性來呈現(xiàn)小的可變肽段(P.-A.Nygren，M.Uhlen，Curr.Opin.Struc.Biol.1997，7，463-469；G.P.Smith，S.U.Patel，J.D.Windass，J.M.Thornton，G.Winter，A.D.Griffiths，J.Mol.Biol.1998，277，317-332；A.Christmann，K.Walter，A.Wenzel，R.Krazner，R.Kolmar，Protein Eng.1999，12，797-806)。
事實(shí)上，表位從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至小肽中仍是一個(gè)問題(A.G.CochranChem.Biol.2000，7，R85-R94)。

發(fā)明內(nèi)容
以下描述的本發(fā)明提供由天然存在的L-α-氨基酸的殘基組成的肽模板，其功能在于將肽環(huán)主鏈限制成具有穩(wěn)定的β發(fā)夾構(gòu)象的發(fā)夾幾何形狀(hairpin geometry)。這些模板可以用于構(gòu)建來自噬菌體展示的模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物，從而產(chǎn)生對靶標(biāo)具有非常高結(jié)合常數(shù)的噬菌體展示文庫。
本發(fā)明提供的此方法可以有利地用于篩選大的來自噬菌體展示的模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物文庫，這反過來又可以相當(dāng)大地促進(jìn)結(jié)合-活性研究，由此促進(jìn)具有強(qiáng)大活性和對不同類型的靶具有新選擇性的新分子的開發(fā)。
由于以下定義的通式I的β發(fā)夾環(huán)模擬物具有結(jié)構(gòu)和構(gòu)象已經(jīng)充分明確的構(gòu)造，所以可以按構(gòu)象鎖定的排布(arrangements)在鏈Z——在噬菌體展示文庫中以核酸序列形式編碼——中整合關(guān)鍵氨基酸殘基或基序。通過沿著β發(fā)夾結(jié)構(gòu)移動(dòng)這些關(guān)鍵氨基酸殘基或基序，可以掃描重要氨基酸的新排布(關(guān)鍵序列的位置掃描)?；蛘撸梢詫Φ鞍踪|(zhì)序列進(jìn)行作圖，以檢測β發(fā)夾環(huán)基序?？傊?，該技術(shù)允許快速確定對于大表面的平蛋白質(zhì)界面中的結(jié)合而言重要的關(guān)鍵氨基酸和基序(熱點(diǎn))的序列和空間排布。此信息最終可以用于設(shè)計(jì)小的肽模擬物藥物候選物(Cunningham，B.C.；Wells，J.A.Curr.Opin.Struct.Biol.1997，7，457；Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv.Med.Chem.Vol.4，1-68，JAI Press Inc.，1999)。
本發(fā)明的模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物是具有如下通式的化合物R1-Cys-Z-Cys-R2I其中兩個(gè)Cys殘基通過二硫鍵橋接(bridged)，由此形成環(huán)肽；R1和R2是A-B和B-C；或B-A和C-B；或C-B和B-A；或B-C和A-B；或C-A和C-A；或A-C和A-C；或C-A和C-B；或B-B和C-B；或B-B和B-C；或A-B和C-C；或B-A和C-C；或C-B和B-B；或B-C和B-B；或C-C和B-A；或C-C和A-B；或B-B和C-C；或C-C和B-B；或A-C和B-C；或C-B和C-A；或B-C和A-C；或A-C和A-B；或B-A和C-A；A-A和C-C；或C-C和A-A；或A-B-C和A-B-C；或B-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-A-B；或A-B-B和B-B-C；或C-B-B和B-B-A；或A-C-B和B-A-C；或C-A-B和B-C-A；或B-A-B和B-C-C；或B-C-B和B-A-C；或C-C-B和B-B-A；或C-C-B和B-A-B，或C-B-B和C-C-A；或A-C-C和B-B-C；或B-C-C和B-A-B；或B-C-C和B-A-C；或A-B-B和B-C-C；或B-A-B和C-C-B；或C-A-B和C-C-B；或B-B-B和B-C-C；或C-B-B和B-B-B；或B-B-B和C-C-B；或B-C-C和B-B-B；或A-B-C和B-B-C；或C-B-B和C-B-A；或A-B-C和A-C-C；或C-C-A和C-B-A；或B-A-C和A-C-B；或B-C-A和C-A-B；或C-B-A和C-B-A；或A-A-B和B-C-C；或C-C-B和B-A-A；或B-B-C和A-C-C；或B-B-C和A-B-C；或B-B-C和B-B-C；或B-B-C和B-B-B；或B-A-C和B-C-C；或C-C-B和C-A-B；或C-C-B和C-B-A；或A-B-C和B-C-C；或C-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-B-C；或C-B-B和B-C-B；或B-C-B和B-B-B；或B-B-B和B-C-B；或C-B-B和B-C-A；或A-C-B和B-B-C；或C-B-B和C-B-B；或B-B-B和B-B-B；或B-B-B和B-B-C；或A-A-C和A-C-C；或C-C-A和C-A-A；或A-A-C和A-C-B；或B-C-A和C-A-A；或A-A-C和B-C-C；或C-C-B和C-A-A；或A-A-B和C-C-B；或B-C-C和B-A-A；或A-B-A和C-B-C；或C-B-C和A-B-A；或A-B-B和C-B-C；或C-B-C和B-B-A；或B-A-A和C-C-B；或B-C-C和A-A-B；或B-B-A和C-B-B；或B-B-C和A-B-B；或B-B-A和C-C-B；或B-C-C和A-B-B；或B-B-C和A-C-B；或B-C-A和C-B-B；或B-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-B；或B-C-B和C-A-B；或B-A-C和B-C-B；或B-C-B和C-B-B；或B-A-C和A-C-B；或B-A-C和A-C-C；或C-C-A和C-A-B；或B-A-C和B-C-C；B-C-C和A-A-C；或C-A-A和C-C-B；或C-A-A和C-C-A；或A-C-C和A-A-C；或C-B-A和C-C-A；或A-C-C和A-B-C；或C-B-A和C-B-B；或C-B-A和C-C-B；或B-C-C和A-B-C；或C-B-B和C-C-A；或C-B-B和C-B-B；或C-B-B和C-C-B；或B-CC和B-B-C；或C-C-A和C-A-B；或C-C-A和C-B-B；或C-C-B和B-B-B；或C-C-B和C-A-A；或C-C-B和C-B-A；或C-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-C；或A-C-B和B-B-C；或A-C-C和B-B-C；A是Asn，Gln，Asp，Glu，Thr，Ser和Gly中之任一；B是Val，Ile，Ser，Thr，Phe，Tyr，Trp和Gly中之任一；C是Arg，Lys和Gly之任一；且Z是n個(gè)氨基酸殘基的鏈，其中n是4至20的整數(shù)，這n個(gè)氨基酸殘基中的每一個(gè)獨(dú)立地來源于任何天然存在的L-α-氨基酸。
例如，Z含有關(guān)鍵序列-Arg-Gly-Asp-、-Glu-Leu-Arg-、-Arg-Lys-Lys-和-Lys-Gly-Phe-之一，或者由如下關(guān)鍵序列之一組成或含有如下關(guān)鍵序列之一-Val-Arg-Lys-Lys-[SEQ ID NO1]、-Lys-Lys-Tyr-Leu-[SEQ ID NO2]、-Trp-Leu-Asp-Val-[SEQ IDNO3]、-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-[SEQ ID NO4]、-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-[SEQ ID NO5]、-Ile-Lys-Val-Ala-Val-[SEQ ID NO6]、-Pro-Pro-Xaa-Xaa-Trp-[SEQ ID NO7](其中Xaa可以是任何天然存在的L-α-氨基酸的殘基)、-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO22]、-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO23]、-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO24]和-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[SEQ ID NO25]；這些關(guān)鍵序列將在下文中作更詳細(xì)的討論。
本發(fā)明的模板固定的β發(fā)夾模擬物文庫包含多個(gè)以上通式I的化合物。此模板固定的β發(fā)夾模擬物的該文庫可以與噬菌體外殼蛋白質(zhì)的至少一部分融合，將此模板固定的β發(fā)夾模擬物展示在噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。
本發(fā)明還提供篩選模板固定的發(fā)夾β模擬物的方法，以尋找具有可以在構(gòu)象上穩(wěn)定β發(fā)夾構(gòu)象的模板并能夠與特定結(jié)合配偶體結(jié)合的模板固定的發(fā)夾β模擬物，所述方法包括步驟a)提供通式I的模板固定的β發(fā)夾模擬物的文庫，該模擬物可以與噬菌體外殼蛋白的至少一部分融合，從而將模板固定的β發(fā)夾模擬物展示在噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上；b)使步驟a)的文庫與結(jié)合配偶體接觸；c)從文庫中選擇能夠與結(jié)合配偶體形成非共價(jià)復(fù)合體的噬菌體肽；和d)任選地，分離步驟c)的肽或通過DNA分析確定其序列。
在此方法中，結(jié)合配偶體通常是抗體、酶、受體或配體或者其片段或部分。
通過以上方法確定并任選地分離的噬菌體肽以及與由此確定和任選地分離的這些肽具有相同結(jié)構(gòu)的合成肽，也形成本發(fā)明的部分。
形成模板的結(jié)構(gòu)元件由兩個(gè)二硫鍵橋接的Cys殘基和殘基R1和R2一起組成，殘基R1和R2包含兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基，這些氨基酸殘基能夠穩(wěn)定β折疊構(gòu)象(見下述)并位于反平行β鏈的相對位置上鄰近二硫鍵的位置；此外，這些模板具有被定向以與鏈Z連接的N端和C端。肽鏈Z與模板的C端和N端分別通過相應(yīng)的N端和C端連接，使得模板和鏈組合成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
對于氨基酸殘基，可以考慮來源于天然存在的L-α-氨基酸的那些。下文中，給出了一系列其本身或其殘基適用于本發(fā)明目的的氨基酸，縮寫相應(yīng)于一般所采用的慣例。


R1和R2各包含兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基，這些殘基在上文中以符號A、B和C表示，其中A、B、C各代表下組之一-A組能夠形成離子鍵或氫鍵相互作用的氨基酸殘基；-B組能夠形成疏水性相互作用的氨基酸殘基；和-C組能夠形成陽離子-π相互作用或者離子鍵或者氫鍵的氨基酸殘基。
A組包括含有具有極性不帶電荷的或酸性的殘基的側(cè)鏈的氨基酸。極性不帶電荷殘基指在生理pH下不帶電荷的親水性側(cè)鏈。這些側(cè)鏈典型地含有氫鍵供體基團(tuán)，例如伯和仲酰胺或醇。酸性殘基指含有羧基基團(tuán)的親水性側(cè)鏈。天然存在的極性不帶電荷的或酸性的L-α-氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和絲氨酸。甘氨酸作為中性的β折疊形成者被包括在A組中。這些氨基酸側(cè)鏈可以與位于反平行β折疊相對位置上的C組氨基酸殘基形成鏈間離子鍵(鹽橋)或者氫鍵相互作用，此外，可以與模板中三肽部分(Ciani B等，J.Am.Chem.Soc.2003，125，9038-9047；Searle，M.S.等，J.Am.Chem.Soc.1999，121，11615-11620)的C組氨基酸殘基形成鏈內(nèi)氫鍵或離子鍵相互作用。
B組包括含有小至中等大小的疏水性、或芳香族的或雜芳族的、或極性不帶電荷的側(cè)鏈殘基的氨基酸殘基。小至中等大小的疏水性殘基指在生理pH下不帶電荷的氨基酸側(cè)鏈。芳族氨基酸殘基指具有如下側(cè)鏈的疏水性氨基酸，所述側(cè)鏈含有至少一個(gè)具有共軛π電子系統(tǒng)的環(huán)(芳族基團(tuán))。此外，它們可以含有氫鍵供體基團(tuán)，例如伯和仲胺和醇。極性不帶電荷殘基指在生理pH下不帶電荷的親水性側(cè)鏈。該類側(cè)鏈典型地含有氫鍵供體基團(tuán)，例如醇。天然存在的小至中等大小的L-α-氨基酸、芳族和雜芳族L-α-氨基酸和極性不帶電荷L-α-氨基酸是纈氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。甘氨酸作為中性β折疊形成者被包括在B組中。這些氨基酸測量可以與位于反平行β折疊的相對位置上的B組氨基酸殘基形成鏈間疏水-疏水相互作用或者與C組氨基酸殘基形成疏水(π)-陽離子相互作用，此外，還可以與模板中的三肽部分的B組或C組氨基酸殘基形成鏈內(nèi)疏水或疏水-陽離子相互作用。
C組包括含有具有極性-陽離子殘基的側(cè)鏈的氨基酸。極性陽離子指在生理pH下質(zhì)子化的堿性側(cè)鏈。天然存在的極性-陽離子L-α-氨基酸是精氨酸和賴氨酸(Ciani B.等，J.Am.Chem.Soc.2003，125，9038-9047；Searle，M.S.等，J.Am.Chem.Soc.1999，121，11615-11620)。甘氨酸作為中性β折疊形成者被包括在C組中。精氨酸和賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈可以與位于反平行β折疊的相對位置上的B型氨基酸殘基形成鏈間陽離子-疏水(π)相互作用(J.P.Gallivan，D.A.Dougherty，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，9459-9464)或者與A組氨基酸殘基形成離子鍵相互作用(鹽橋)或氫鍵相互作用，此外，還可以與模板中的三肽部分的B組氨基酸殘基形成鏈內(nèi)陽離子-疏水(π)相互作用。
R1和R2優(yōu)選是Glu-Thr和Thr-Lys；或者Lys-Thr和Thr-Glu；或者Thr-Glu和Lys-Thr；或者Thr-Lys和Glu-Thr；或者
Leu-Glu和Lys-Val；或者Val-Lys和Glu-Leu；或者Glu-Leu和Val-Lys；或者Lys-Leu和Val-Glu；或者Asn-Gly和Lys-Val；或者Val-Gly和Lys-Asn；或者Gly-Asn和Val-Lys；或者Gly-Val和Asn-Lys；或者Gly-Gly和Gly-Gly；或者Glu-Leu-Lys和Glu-Val-Lys；或者Lys-Val-Glu和Lys-Leu-Glu；或者Leu-Glu-Lys和Glu-Lys-Val；或者Val-Lys-Glu和Lys-Glu-Leu；或者Glu-Lys-Leu和Val-Glu-Lys；或者Lys-Glu-Val和Leu-Lys-Glu；或者Lys-Glu-Leu和Val-Lys-Glu；或者Glu-Lys-Val和Leu-Glu-Lys；或者Lys-Val-Gly和Gly-Leu-Glu；或者Glu-Leu-Gly和Gly-Val-Lys；或者Val-Lys-Gly和Gly-Glu-Leu；或者Leu-Glu-Gly和Gly-Lys-Val；或者Val-Gly-Lys和Glu-Gly-Leu；或者Leu-Gly-Glu和Lys-Gly-Val；或者Gly-Gly-Gly和Gly-Gly-Gly。
鏈Z中各氨基酸殘基的位置P1至Pn清楚地定義如下P1表示鏈Z中第一個(gè)氨基酸，其通過其N端與模板的C端偶聯(lián)；Pn表示鏈Z中最后一個(gè)氨基酸，其通過其C端與模板的N端偶聯(lián)。
有利地，鏈Z包含或者其組成是兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或偶爾地多達(dá)10個(gè)氨基酸殘基的關(guān)鍵序列，這些氨基酸殘基的兩個(gè)末端成員是“恒定的”(“k”)，而其它任何成員或者也是“恒定的”或者是“可變的”(“x”)，包括所有可能的組合或者排列方式。兩個(gè)末端“恒定”成員可以相同或者不同，這同樣適用于剩余的任何“恒定的”和/或任何“可變的”成員。
可以將關(guān)鍵序列翻譯成寡聚核酸序列并植入本發(fā)明噬菌體展示肽中。
尤其適宜的“恒定”成員(“k”)是Trp，Arg，Tyr，Ile，Asp，His，Lys，Glu和Thr，其它適宜的“恒定”成員(“k”)是Gln，Phe，Met和Ser，且適宜的“可變”成員(“x”)是Ala，Leu和Val。
具有二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和六個(gè)氨基酸殘基的關(guān)鍵序列可以示意性描述如下二肽-k1-k2-三肽-k1-k2-k3--k1-x1-k2-四肽-k1-k2-k3-k4--k1-x1-k2-k3--k1-k2-x1-k3--k1-x1-x2-k2-五肽-k1-k2-k3-k4-k5--k1-x1-k2-k3-k4--k1-k2-x1-k3-k4--k1-k2-k3-x1-k4--k1-x1-x2-k2-k3--k1-k2-x1-x2-k3--k1-x1-k2-x2-k3--k1-x1-x2-x3-k2-六肽
-k1-k2-k3-k4-k5-k6--k1-x1-k2-k3-k4-k5--k1-k2-x1-k3-k4-k5--k1-k2-k3-x1-k4-k5--k1-k2-k3-k4-x1-k5--k1-x1-x2-k2-k3-k4--k1-k2-x1-x2-k3-k4--k1-k2-k3-x1-x2-k4--k1-x1-k2-x2-k3-k4--k1-k2-x1-k3-x2-k4--k1-x1-k2-k3-x2-k4--k1-x1-x2-x3-k2-k3--k1-k2-x1-x2-x3-k3--k1-x1-k2-x2-x3-k3--k1-x1-x2-k2-x3-k3--k1-x1-x2-x3-x4-k2-已知某些關(guān)鍵序列存在于重要的生理活性肽中，例如RGD 在纖連蛋白(FN)、玻連蛋白(VN)、骨橋蛋白、膠原蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原(Fg)、馮.維勒布蘭德因子(vWF)中，見Obrecht，D.；Altorfer，M.；Robinson，J.A.Adv.Med.
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1984，3，1463IKVAV[SEQ ID NO6] 見Cell 1987，88，989PPRXXW[SEQ ID NO7]見J.Biol.Chem.1998，273，11001-11006 & 11007-11011噬菌體展示是一項(xiàng)將變體多肽作為與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體，絲狀噬菌體顆粒，表面上的技術(shù)，見“肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示”(Phage Display of Peptides and Proteins)，B.K.Kay，J.Winter，J.Mc Cafferty 1996，Academic Press。
如本說明書中所述，術(shù)語“外殼蛋白”指至少一部分存在于病毒顆粒表面上的蛋白質(zhì)。外殼蛋白可以是主要的外殼蛋白或者可以是次要外殼蛋白。
術(shù)語“電穿孔”指通過在足以允許細(xì)胞攝取外源物質(zhì)的條件下向細(xì)胞施加電壓以將外源物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸等)引入細(xì)胞中的方法。外源物質(zhì)典型地是DNA。
“融合蛋白”是具有共價(jià)連接在一起的兩個(gè)部分的多肽，其中各部分是具有不同性質(zhì)的多肽。
“噬菌粒”是具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ColE1和噬菌體的基因間隔區(qū)拷貝的質(zhì)粒載體。噬菌粒可以基于任何已知的噬菌體，包括絲狀噬菌體。可以以質(zhì)粒形式擴(kuò)增克隆在這些載體中的DNA區(qū)段。當(dāng)給包含這些載體的細(xì)胞提供產(chǎn)生噬菌體顆粒所必需的所有基因時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制模式轉(zhuǎn)變?yōu)闈L環(huán)復(fù)制，以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？梢孕纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。
術(shù)語“噬菌體載體”指含有異源基因并能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制形式的噬菌體。噬菌體載體具有噬菌體復(fù)制起點(diǎn)，從而允許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體，例如M13噬菌體或其衍生物，λ類噬菌體例如但不限于phi80、噬菌體21、82、424、432、lambda.imm343、lambda.imm21、lambda.EMBL或lamdab.gt，或其所有衍生物、遺傳工程衍生物和雜種。
“連接”是在兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。為了連接兩個(gè)片段，兩個(gè)DNA片段的末端必需彼此相容。大多數(shù)情況下，在內(nèi)切核酸酶消化后末端直接是相容的。然而，也可能必需首先將內(nèi)切核酸酶消化后通常產(chǎn)生的粘性末端轉(zhuǎn)化成平末端以便其適用于連接。為了產(chǎn)生平末端，在供應(yīng)商描述的條件下，使用DNA修飾酶，例如T4聚合酶或Klenow。
DNA純化可以利用酚-氯仿、凝膠純化或市場上出售的試劑盒完成。
內(nèi)切核酸酶消化后，可以使用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳凝膠純化DNA，之后再進(jìn)行連接?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook等，MA Laboratory Manual，Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989)或者應(yīng)用商業(yè)試劑盒例如但不限于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，Calif.)，純化DNA。
在連接反應(yīng)之前，可以用細(xì)菌堿性磷酸酶或小牛小腸堿性磷酸酶處理線性化的載體片段以防止連接步驟過程中發(fā)生自連接。連接反應(yīng)優(yōu)選使用T4DNA連接酶催化。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，連接條件可以在時(shí)間、溫度、緩沖液濃度、待連接的DNA分子的量和連接酶及ATP的量方面改變。
“寡核苷酸”是短長度的、單或雙鏈多脫氧核苷酸，其可以利用已知方法化學(xué)合成?；蛘?，如果靶氨基酸序列是已知的，可以使用每個(gè)氨基酸殘基的已知優(yōu)選編碼殘基，推導(dǎo)出潛在的核酸序列。
“結(jié)合配偶體復(fù)合體”是指彼此以一種特異的可檢測方式結(jié)合在一起的兩個(gè)或多個(gè)分子的締合，由此指配體和受體、抗體和抗原的締合。
可以有利地以平行陣列合成方式作為獲得本發(fā)明化合物的合成方法，以產(chǎn)生以上通式I的模板固定的β發(fā)夾模擬物的文庫。此平行合成允許以高產(chǎn)率和確定的純度得到具有大量(通常地24至192個(gè)，典型地96個(gè))通式I化合物的陣列，使得二聚體和多聚體副產(chǎn)物的形成最小化。官能化固相載體(即，固相載體加上接頭分子)、模板和環(huán)化位點(diǎn)的正確選擇由此起到關(guān)鍵作用。
官能化固相載體可以方便地衍生自用(優(yōu)選地1-5％的)二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯；接枝了聚乙二醇間隔基的聚苯乙烯(Tentagel)；和聚丙烯酰胺樹脂(也參見Obrecht，D.；Villalgordo，J.-M，“小分子量化合物文庫的固相支持的組合和平行合成(Solid-SupportedCombinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-WeightCompound Libraries)”，四面體有機(jī)化學(xué)系列(Tetrahedron OrganicChemistry Series)，17卷，Pergamon，Elsevier Science，1998)。
固相載體通過接頭，即雙官能間隔分子官能化，該分子在一端包含用于連接到固相載體上的固著基團(tuán)并在另一端包含用于隨后化學(xué)轉(zhuǎn)化和斷裂程序的可選擇性地?cái)嗔训墓倌軋F(tuán)。就本發(fā)明而言，接頭必需設(shè)計(jì)成最終在不影響存在于各種氨基酸側(cè)鏈中的任何官能團(tuán)上的保護(hù)基團(tuán)的溫和酸性條件下釋放羧基。適用于本發(fā)明的接頭與氨基酸的羧基形成酸不穩(wěn)定的酯，通常是酸不穩(wěn)定的芐基、二苯甲基和三苯甲基酯；這種接頭結(jié)構(gòu)的例子包括2-甲氧基-4-羥基甲基苯氧基(SasrinR接頭)、4-(2，4-二甲氧基苯基-羥基甲基)-苯氧基(Rink接頭)、4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB接頭)、三苯甲基和2-氯三苯甲基。
優(yōu)選載體得自用(最優(yōu)選地1-5％的)二乙烯基苯交聯(lián)并通過2-氯三苯甲基接頭官能化的聚苯乙烯。
當(dāng)以平行陣列合成形式來進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明方法可有利地按下文所述來進(jìn)行，但是如果需要合成一種具有上式I的單個(gè)化合物，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯然立即可看出該工藝步驟必需如何進(jìn)行修改。
在等于待由平行法合成的化合物的總數(shù)的許多反應(yīng)容器(一般24-192，典型96個(gè))中裝載25-1000mg，優(yōu)選100mg的合適官能化固相載體，優(yōu)選1-3％交聯(lián)的聚苯乙烯或tentagel樹脂。
所用溶劑必需能夠溶脹樹脂，且包括，但不限于，二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二烷、甲苯、四氫呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、三氟乙醇(TFE)、異丙醇等。包含至少一種極性溶劑組分的溶劑混合物(例如，20％TFE/DCM、35％THF/NMP)對保證樹脂結(jié)合的肽鏈的高反應(yīng)性和溶劑化是有益的(Fields，G.B.，F(xiàn)ields，C.G.，J.Am.Chem.Soc.1991，113，4202-4207)。
隨著開發(fā)出各種能夠在不影響保護(hù)側(cè)鏈中的官能團(tuán)的酸不穩(wěn)定基團(tuán)的溫和酸性條件下釋放C-末端羧酸基團(tuán)的接頭，受保護(hù)的肽鏈片段的合成已取得顯著進(jìn)步。2-甲氧基-4-羥基芐醇-衍生的接頭(SasrinR接頭，Mergler等，Tetrahedron Lett.1988，29 4005-4008)可用稀三氟乙酸(在DCM中的0.5-1％TFA)斷裂且在肽合成過程中在Fmoc去保護(hù)條件下是穩(wěn)定的，基于Boc/tBu的其它保護(hù)基團(tuán)適合該保護(hù)方案。適用于本發(fā)明方法的其它接頭包括超酸不穩(wěn)定的4-(2，4-二甲氧基苯基-羥基甲基)-苯氧基接頭(Rink接頭，Rink，H.Tetrahedron Lett.1987，28，3787-3790)，其中肽的去除需要10％于DCM中的乙酸或0.2％于DCM中的三氟乙酸；4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸-衍生的接頭(HMPB-接頭，F(xiàn)lrsheimer & Riniker，Peptides 1991，1990131)，其也用1％TFA/DCM斷裂以得到包含所有酸不穩(wěn)定側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的肽鏈片段；以及，2-氯三苯甲基氯化物接頭(Barlos等，TetrahedronLett.1989，30，3943-3946)，它能夠通過使用冰醋酸/三氟乙醇/DCM(1∶2∶7)的混合物處理30分鐘以實(shí)現(xiàn)肽的脫離。
適用于氨基酸，以及相應(yīng)地適用于其殘基，的保護(hù)基團(tuán)是，例如-對于氨基(也存在于賴氨酸的側(cè)鏈中)Cbz芐氧基羰基Boc叔丁基氧基羰基Fmoc 9-芴基甲氧基羰基Alloc 烯丙基氧基羰基Teoc 三甲基甲硅烷基乙氧基羰基Tcc三氯乙氧基羰基Nps鄰硝基苯基磺酰基；Trt三苯基甲基或三苯甲基-對于羧基(也存在于天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈中)，用醇組分轉(zhuǎn)化成酯tBu叔丁基Bn 芐基Me 甲基Ph 苯基Pac苯甲?；谆┍?
Tse三甲基甲硅烷基乙基Tce三氯乙基；-對于胍基(存在于精氨酸的側(cè)鏈中)Boc叔丁氧羰基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基Ts 對甲苯磺?；?即，對甲苯磺酰基)Cbz芐氧基羰基Pbf五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?對于羥基(存在于例如蘇氨酸和絲氨酸的側(cè)鏈中)tBu叔丁基Bn 芐基Trt三苯甲基-以及對于巰基(存在于半胱氨酸的側(cè)鏈中)Acm乙酰氨基甲基tBu叔丁基Bn 芐基Trt三苯甲基Mtr4-甲氧基三苯甲基.
9-芴基甲氧基羰基-(Fmoc)-保護(hù)的氨基酸衍生物優(yōu)選用作結(jié)構(gòu)單元以構(gòu)建具有式I的模板固定的β-發(fā)夾環(huán)模擬物。對于去保護(hù)，即，F(xiàn)moc基團(tuán)的斷裂除去，可以使用在DCM中的20％哌啶或在DMF中的2％DBU/2％哌啶。
基于每克原始稱重到反應(yīng)管中的官能化固相載體的荷載量的毫摩爾數(shù)/克(meq/g)(對于聚苯乙烯樹脂，通常為0.1-2.85mmol/g)，反應(yīng)物，即氨基酸衍生物，的量通常是1-20當(dāng)量。如果驅(qū)動(dòng)反應(yīng)在合理時(shí)間內(nèi)完成需要的話，可以使用外加當(dāng)量的反應(yīng)物。將反應(yīng)管以及夾具部件和歧管重新插入儲(chǔ)集部件中并將該裝置固定在一起。啟動(dòng)通過歧管的氣流以提供受控環(huán)境，例如氮?dú)?、氬氣、空氣和類似物。氣流也可在流過歧管之前加熱或冷卻。反應(yīng)孔的加熱或冷卻通過加熱反應(yīng)部件或外部用異丙醇/干冰和類似物進(jìn)行冷卻而實(shí)現(xiàn)，由此獲得所需的合成反應(yīng)。攪拌通過振蕩或磁力攪拌(在反應(yīng)管內(nèi))而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的工作臺(但不限于此)是ACT90，Symphoni abi 433A肽合成儀和MultiSynTech′s-Syro合成儀。
酰胺鍵形成需要活化α-羧基以用于酰化步驟。當(dāng)這種活化通過常用的碳二亞胺如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，Sheehan & Hess，J.Am.Chem.Soc.1955，77，1067-1068)或二異丙基碳二亞胺(DIC，Sarantakis等Biochem.Biophys.Res.Commun.1976，73，336-342)來進(jìn)行時(shí)，所得二環(huán)己基脲和二異丙基脲分別是不溶性的和可溶于一般使用的溶劑。在該碳二亞胺方法的一個(gè)變型中，1-羥基苯并三唑(HOBt，Knig & Geiger，Chem.Ber 1970，103，788-798)作為偶聯(lián)混合物的添加劑而包括在內(nèi)。HOBt防止脫水、抑制活化氨基酸的外消旋化并用作催化劑以改善緩慢的偶聯(lián)反應(yīng)。已經(jīng)使用某些磷試劑作為直接偶聯(lián)試劑，如苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-磷六氟磷酸鹽(BOP)(Castro等，Tetrahedron Lett.1975，14，1219-1222；Synthesis，1976，751-752)、或苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸鹽(Py-BOP，Coste等，Tetrahedron Lett.1990，31，205-208)、或2-(1H-苯并三唑-1-基-)1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、或六氟磷酸鹽(HBTU，Knorr等，Tetrahedron Lett.1989，30，1927-1930)；這些磷試劑也適合與受保護(hù)的氨基酸衍生物原位形成HOBt酯。更新近的是，還使用二苯氧基磷酰基疊氮化物(DPPA)或O-(7-氮雜-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽(TATU)或O-(7-氮雜-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)/7-氮雜-1-羥基苯并三唑(HOAt，Carpino等，Tetrahedron Lett.1994，35，2279-2281)作為偶聯(lián)試劑。
由于接近定量的偶聯(lián)反應(yīng)是必需的，因此期望有反應(yīng)完成的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。可在每個(gè)偶聯(lián)步驟之后容易并迅速地進(jìn)行茚三酮試驗(yàn)(Kaiser等，Anal.Biochemistry 1970，34，595)，其中對樹脂結(jié)合肽的等分試樣的陽性比色反應(yīng)定性地表示伯胺的存在。當(dāng)用堿釋放Fmoc生色團(tuán)時(shí)，F(xiàn)moc化學(xué)允許分光光度檢測Fmoc生色團(tuán)(Meienhofer等，Int.J.Peptide Protein Res.1979，13，35-42)。
每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的樹脂結(jié)合的中間體利用以下兩種方法之一，通過重復(fù)暴露于純?nèi)軇┒磧暨^量的保留試劑、溶劑、和副產(chǎn)物1)用溶劑(優(yōu)選5ml)加入反應(yīng)孔，浸泡反應(yīng)管以及夾具部件和歧管并攪拌5-300分鐘，優(yōu)選15分鐘，并利用重力，隨后利用通過歧管入口(在關(guān)閉出口的同時(shí))施加的氣壓進(jìn)行排液以排出溶劑；2)將歧管從夾具部件上移開，分配溶劑的等分試樣(優(yōu)選5ml)使之通過反應(yīng)管的頂部并利用重力通過過濾器排放到接收容器如試管或小瓶中。
以上兩種洗滌方法都重復(fù)最高約50次(優(yōu)選約10次)，利用TLC、GC、或洗滌液的視覺檢測之類的方法監(jiān)控試劑、溶劑、和副產(chǎn)物去除的效率。
每一相繼轉(zhuǎn)化都重復(fù)上述將樹脂結(jié)合的化合物與試劑在反應(yīng)孔內(nèi)反應(yīng)并隨后去除過量試劑、副產(chǎn)物和溶劑的程序，直到獲得最終的、樹脂結(jié)合的、完全被保護(hù)的線性肽。
通過將反應(yīng)管以及夾具部件和歧管浸在包含斷裂試劑溶液(優(yōu)選3-5ml)的反應(yīng)孔中，使完全被保護(hù)的線性肽脫離固相載體。氣流、溫度控制、攪拌、和反應(yīng)監(jiān)測如上所述并根據(jù)需要進(jìn)行，以實(shí)現(xiàn)此脫附反應(yīng)。反應(yīng)管以及夾具部件和歧管從儲(chǔ)集部件上拆開并升高到溶液液位之上但低于反應(yīng)孔的上唇，然后通過歧管入口(同時(shí)關(guān)閉出口)施加氣壓以有效地將最終產(chǎn)物溶液排出到儲(chǔ)集井中。留在反應(yīng)管中的樹脂隨后如上所述用3-5ml的合適溶劑洗滌2-5次以提取(洗出)盡可能多的脫離產(chǎn)物。合并如此得到的產(chǎn)物溶液，小心以避免交叉混合。各溶液/提取物隨后根據(jù)需要進(jìn)行處理以分離最終化合物。典型的處理包括，但不限于，蒸發(fā)、濃縮、液/液萃取、酸化、堿化、中和或其它溶液中的反應(yīng)。
將包含已從固相載體上斷裂下來并用堿中和的完全被保護(hù)的線性肽衍生物的溶液蒸發(fā)。在使該完全被保護(hù)的線性肽脫離固相載體前，如果期望，可以選擇性地將N端氨基酸殘基的被保護(hù)的α-氨基去保護(hù)，并使用對應(yīng)于待引入的酰基取代基的?；瘎；纱酸尫诺脑摪被鶊F(tuán)?；蛘?，可以首先選擇性地除去半胱氨酸的保護(hù)基，并可以按如下所述進(jìn)行環(huán)化。自樹脂上的斷裂和環(huán)肽的去保護(hù)可以按如下所述實(shí)施。
該完全被保護(hù)的肽衍生物用82.5％TFA、5％H2O、5％苯酚、5％苯硫基甲烷(thioanisol)、2.5％乙硫醇(ethanthiol)或其它用于斷裂保護(hù)基的清除劑的組合進(jìn)行處理。斷裂反應(yīng)時(shí)間通常為30分鐘至12小時(shí)，優(yōu)選大約5小時(shí)。然后蒸發(fā)掉大多數(shù)TFA并用醚或其它適用于此的溶劑沉淀該產(chǎn)物。在小心去除溶劑之后，可以純化由此獲得的肽衍生物。
然后在溶液中使用溶劑，例如水、DMF等實(shí)現(xiàn)環(huán)化(二硫鍵形成)?？梢詫⒏鞣N氧化試劑，例如H2O2、空氣或者碘用于環(huán)化。環(huán)化持續(xù)時(shí)間大約15分鐘至24小時(shí)，優(yōu)選地大約40分鐘。通過例如RP-HPLC(反相高效液相色譜)和質(zhì)譜跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。然后通過蒸發(fā)除去溶劑，并經(jīng)RP-HPLC純化環(huán)肽衍生物。
本發(fā)明噬菌體展示方法可以按如下進(jìn)行將本發(fā)明的模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物與噬菌體外殼蛋白的至少一部分融合，形成含有所述模板固定的β發(fā)夾環(huán)模擬物的融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白可以通過使用已知的噬菌體展示技術(shù)，例如如下所述的技術(shù)，表達(dá)編碼此融合蛋白的基因融合物而制備。
噬菌體展示是一種將變體多肽以和外殼蛋白質(zhì)融合的融合蛋白質(zhì)形式展示在噬菌體顆粒表面上的已知技術(shù)(Scott，J.K.和Smith，G.P.，Science，1990，249；386)。此應(yīng)用的基礎(chǔ)在于如下事實(shí)可以快速有效地分揀由選擇性隨機(jī)化的蛋白質(zhì)變體(或者隨機(jī)克隆的cDNA)組成的大型文庫以找到與靶分子以高親和力結(jié)合的那些序列。
典型地，將變體多肽，例如本發(fā)明的模板固定的β發(fā)夾模擬物，與展示在病毒體一端的基因III蛋白質(zhì)融合。
單價(jià)噬菌體展示是將蛋白質(zhì)或肽序列與基因III蛋白質(zhì)的一部分融合并在野生型基因III蛋白質(zhì)存在下以低水平表達(dá)該融合蛋白的一種方法，由此病毒顆粒將展示大部分為野生型的基因III蛋白質(zhì)和一個(gè)或零個(gè)拷貝的融合蛋白質(zhì)，該技術(shù)也可以用于本發(fā)明中。
適用于展示本發(fā)明模板固定的β發(fā)夾模擬物的基因III載體包括fUSE5，MKE 13(New England Biolabs，Inc)，fAFF1(Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，1990，87，6378-6382)，fd-CAT1，fdtetDOG，33，88，pComb3，pComb8，m663，pHEN1，pCANTAB5E genentech載體CB等。
用于蛋白質(zhì)、肽和其突變變體的噬菌體展示方法是已知的并可以用于本發(fā)明，該方法包括構(gòu)建一系列含有可操作地與編碼融合多肽的基因融合物連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的變體可復(fù)制載體，轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以形成在其表面上展示該融合多肽的噬菌體顆粒，使該重組噬菌體顆粒與靶分子接觸以使該顆粒的至少一個(gè)部分與靶結(jié)合，和將結(jié)合的和未結(jié)合的顆粒分開(O`NeilK.and Hoess R.，Curr.Opin Struct.Biol.1995 5，443-449)。
編碼噬菌體外殼蛋白的基因和編碼融合蛋白中的目的模板固定的β發(fā)夾模擬物部分的基因可以通過本領(lǐng)域已知方法(Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，pp.A1-A4 1989)獲得。編碼所述基因的DNA可以化學(xué)合成(Letzinger和Khorona.J.Am.Chem.Soc.1965，87，3526，ibd.1966，88，3181；L.J.McBride，M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.1983，24，245-248)，然后按如下述方式突變以制備變體文庫。
為了將DNA片段連接在一起以形成含有融合基因的功能載體，DNA片段的末端必需彼此相容?？赡鼙匦枋紫葘?nèi)切核酸酶消化后通常產(chǎn)生的粘性末端轉(zhuǎn)化成平端，以便它們適于連接。為了使末端平端化，在適宜的緩沖液中15℃用DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)在四種脫氧核苷三磷酸存在下處理DNA至少15分鐘。然后利用酚-氯仿提取和乙醇沉淀或者其它DNA純化技術(shù)，純化DNA。
切割的DNA片段可以使用凝膠電泳按大小分離和選擇。DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺基質(zhì)進(jìn)行電泳。電泳后，利用電洗脫或者用于純化和連接的方法，從基質(zhì)中提取DNA。
將待連接在一起的DNA片段以大約等摩爾量置于溶液中。溶液還含有ATP、連接酶緩沖液和連接酶例如T4 DNA連接酶。
連接后，通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，LaboratoryPress，1989)，純化目前插入了外源基因的載體，并轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿孔，這可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行。對于文庫構(gòu)建，優(yōu)選地DNA以每100微升感受態(tài)細(xì)胞懸浮液0.05-0.2微克的終濃度存在。
優(yōu)選純化DNA以除去雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^任何已知方法純化DNA；然而，優(yōu)選的純化方法是使用DNA親和純化。使用DNA結(jié)合樹脂和親和試劑純化DNA是熟知的，并且在本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域熟知的任何此類方法。
可以通過電穿孔轉(zhuǎn)化的任何適宜細(xì)胞均可以作為宿主細(xì)胞用于本發(fā)明方法中?？梢员晦D(zhuǎn)化的適宜宿主細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)胞例如大腸桿菌(E.coli)。適宜的大腸桿菌菌株包括但不限于XL1 Blue(Stratagene)，ElectroTen-Blue(Stratagene，)，ER2738(NewEngland Biolabs)，DH5α(Gibco)，MC1061(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATTC)，ATTC號53338)。
電穿孔過程中優(yōu)選使用的細(xì)胞濃度為每ml有生活力的活細(xì)胞懸液大約1010或更高菌落形成單位。電穿孔后，優(yōu)選在SOC培養(yǎng)基(對于SOC培養(yǎng)基的制備，見例如Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp.A1-A4，1989)中培養(yǎng)細(xì)胞。
如果氨基酸在多肽鏈中緊靠在一起，則可以使用編碼所有期望的氨基酸替代的一個(gè)寡核苷酸同時(shí)突變這些氨基酸。可以合成在預(yù)定位置含有多義的或非多義的核苷酸(例如編碼本發(fā)明模板)的寡核苷酸。在多義位置，在合成過程中包括所有核苷酸的混合物或者選定的一個(gè)核苷酸子集的混合物。編碼完整集合氨基酸的密碼子可以通過例如NNK或NNS密碼子體現(xiàn)，其中N是A、C、G或T，且K是G或T且S是G或C。
選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，培養(yǎng)細(xì)胞，然后可以分離載體DNA。可以使用本領(lǐng)域已知方法，分離、純化和采用DNA測序方法分析噬菌體或噬菌粒載體DNA。
本發(fā)明證明了新系統(tǒng)在合理設(shè)計(jì)和分析具有充分確定的結(jié)構(gòu)特征的肽方面的優(yōu)點(diǎn)。包含此類模板固定的β發(fā)夾模擬物的組合文庫及其使用方法為探索蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了有用信息和工具。本文中公開的或者根據(jù)本發(fā)明公開制備的模板固定的β發(fā)夾模擬物，可以是各種生物劑或治療劑的候選物，包括但不限于，酶抑制劑、配體拮抗劑或配體激動(dòng)劑。
以下實(shí)施例更詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明，但無意于以任何方式限定其范圍。將以下縮寫用于這些實(shí)施例HBTU1-苯并三唑-1-基-四甲基脲六氟磷酸鹽(Knorr等 Tetrahedron Lett.1989，30，1927-1930)HOBt1-羥基苯并三唑DIEA二異丙基乙胺實(shí)施例1.模板限制的β發(fā)夾模擬物的肽合成a)合成第一個(gè)被保護(hù)的氨基酸殘基的偶聯(lián)將0.5g 2-氯三苯甲基氯化物(2-chlorotritylchoride)樹脂(Barlos等Tetrahedron Lett.1989，30，3943-3946)(0.83mmol/g，0.415mmol)裝到一干燥燒瓶中。該樹脂懸浮于CH2Cl2(2.5ml)中并在室溫下在恒定攪拌下溶脹30分鐘。樹脂用在CH2Cl2(2.5ml)中的0.415mMol(1當(dāng)量)第一個(gè)適宜地被保護(hù)的氨基酸殘基(參見下文)和284μl(4當(dāng)量)二異丙基乙胺(DIEA)處理，將該混合物在25℃下振蕩4小時(shí)。樹脂顏色變成紫色且溶液保持微黃色。振蕩(30ml的CH2Cl2/MeOH/DIEA17/2/1)樹脂30分鐘，然后用CH2Cl2(1x)，DMF(1x)，CH2Cl2(1x)，MeOH(1x)，CH2Cl2(1x)，MeOH(1x)，CH2Cl2(2x)，Et2O(2x)按此順序洗滌并真空干燥6小時(shí)。
載荷典型地是0.45-0.5mMol/g。
制備以下預(yù)載荷的樹脂F(xiàn)moc-Cys(Trt)-氯三苯甲基樹脂；Fmoc-Glu(OtBu)-氯三苯甲基樹脂；Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂；Fmoc-Val-氯三苯甲基樹脂；和Fmoc-Gly-氯三苯甲基樹脂。
程序1使用Syro-肽合成器(Multisyntech)用24-96個(gè)反應(yīng)容器進(jìn)行合成。在每一容器中放置60mg(加載之前樹脂的重量)上面的樹脂。編程和實(shí)施以下反應(yīng)循環(huán)步驟 試劑 時(shí)間1CH2Cl2，洗滌和溶脹(手工) 3×1分鐘2DMF，洗滌和溶脹 1×5分鐘340％哌啶/DMF 1×5分鐘4DMF，洗滌5×2分鐘55當(dāng)量Fmoc氨基酸/DMF+5當(dāng)量1×120分鐘HBTU+5當(dāng)量HOBt+5當(dāng)量DIEA6DMF，洗滌4×2分鐘7CH2Cl2，洗滌(在合成結(jié)束時(shí))3×2分鐘重復(fù)步驟3-6以便添加每個(gè)氨基酸。
氨基端氨基酸的乙?；瘜?shí)施程序1的步驟1-4以從合成的序列的N端除去Fmoc保護(hù)基。
然后，將加載了肽的樹脂轉(zhuǎn)移至15ml配備有釉料(frit)和活塞的注射器中。用5ml CH2Cl2溶漲樹脂30分鐘。向每一個(gè)反應(yīng)器中加入DIEA(0.4ml)和乙酸酐(0.1ml)。振蕩樹脂6小時(shí)至1夜。過濾樹脂并相繼用CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/MeOH/CH2Cl2/二乙基醚洗滌。真空干燥樹脂。
完全被保護(hù)的肽片段的斷裂和去保護(hù)在完成合成之后，樹脂懸浮在1ml于CH2Cl2中的1％TFA(v/v)和1ml于CH2Cl2中的20％DIEA中3分鐘。該過程重復(fù)3次以保證斷裂完成。濾液蒸發(fā)至干，并且產(chǎn)物用包含82.5％三氟乙酸(TFA)、5％水、5％苯酚、5％苯硫基甲烷和2.5％乙二硫醇(ethanedithiol)的斷裂混合物室溫處理5小時(shí)以完全地去保護(hù)，然后真空濃縮。通過添加10ml二乙基醚沉淀肽、然后離心、除去醚相。用5ml二乙基醚重復(fù)該操作兩次。
粗肽溶解在1ml 10％CH3CN水溶液和0.5至1ml DMF中，硅藻土過濾，并通過制備性反相-HPLC純化。
線性去保護(hù)肽的環(huán)化將所獲得的線性肽以10-4M濃度溶解在1.5ml水中，加入15μlH2O2(0.01M，1當(dāng)量)。環(huán)化時(shí)間不超過700分鐘。所獲環(huán)肽利用分析性HPLC和ESI-MS分析。包含HPC保持時(shí)間和ESI-MS的分析數(shù)據(jù)顯示在實(shí)施例中。
使用VYDAC 218MS5215柱(尺寸0.21cm×15cm，5μm填充側(cè)(packing side)(二氧化硅))用如下溶劑A(H2O+0.02％TFA)和B(CH3CN)及如下梯度0min92％A，8％B；8min62％A 38％B；9-12min0％A，100％B，流速0.4ml/min，確定分析性HPLC保持時(shí)間(RT，單位分鐘)。
實(shí)施例1(n＝8)顯示在表1中。以氨基酸Cys起始，合成肽，將Cys嫁接至樹脂上。起始樹脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基樹脂(按以上所述制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的進(jìn)行?；嗔?、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝7.26min，[M+H]+＝1281.3。
實(shí)施例2(n＝8)顯示在表1中。以氨基酸Lys起始，合成肽，將Lys嫁接至樹脂上。起始樹脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.41min，[M+H]+＝871.4。
實(shí)施例3(n＝10)顯示在表2中。以氨基酸Cys起始，合成肽，將Cys嫁接至樹脂上。起始樹脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝5.74min，[M+H]+＝779.2。
實(shí)施例4(n＝10)顯示在表2中。以氨基酸Lys起始，合成肽，將Lys嫁接至樹脂上。起始樹脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝5.13min，[M+H]+＝1009.2。
實(shí)施例5(n＝10)顯示在表2中。以氨基酸Cys起始，合成肽，將Cys嫁接至樹脂上。起始樹脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的對肽進(jìn)行酰化、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.81min，[M+H]+＝1482.6。
實(shí)施例6和7(n＝10)顯示在表2中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Val起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Val-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量實(shí)施例6RT＝7.24min，[M+H]+＝977.0；實(shí)施例7RT＝6.24min，[M+H]+＝941.2。
實(shí)施例8(n＝10)顯示在表2中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Gly起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Gly-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.39min，[M+H]+＝856.0。
實(shí)施例9(n＝10)顯示在表2中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Lys起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.18min，[M+H]+＝972.3。
實(shí)施例10(n＝10)顯示在表3中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Lys起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝5.49min，[M+H]+＝1142.0。
實(shí)施例11(n＝10)顯示在表3中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Glu起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Glu(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；?、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.85min，[M+H]+＝1033.8。
實(shí)施例12(n＝10)顯示在表3中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Gly起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Gly-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行?；嗔?、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝6.41min，[M+H]+＝913.0。
實(shí)施例13(n＝12)顯示在表4中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Cys起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Cys(Trt)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys，然后按所指明的對肽進(jìn)行酰化、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝5.74min，[M+H]+＝836.5。
實(shí)施例14(n＝12)顯示在表4中。以嫁接至樹脂上的氨基酸Lys起始，合成肽。起始樹脂是Fmoc-Lys(Boc)-氯三苯甲基樹脂(按以上制備)。根據(jù)程序1以如下順序在固相載體上合成線性肽樹脂-R2-Cys-P12-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1-Cys-R1，然后按所指明的對肽進(jìn)行酰化、斷裂、去保護(hù)、純化和環(huán)化。使用上述梯度確定HPLC保持時(shí)間(分鐘)和質(zhì)量RT＝5.01min，[M+H]+＝1065.1。
2a.模板固定的β發(fā)夾模擬物的二硫鍵形成動(dòng)力學(xué)的測量方法制備每個(gè)線性去保護(hù)的純化肽的儲(chǔ)備溶液，含有1.5ml濃度為10-4M的肽在水中的溶液。按上述，在分析性LC-MS上監(jiān)測二硫鍵形成。在時(shí)間t0，無氧化試劑H2O2存在時(shí)得到第一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。加入氧化劑H2O2(15μl，0.01M，1當(dāng)量)后15分鐘，獲取第二個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。每隔33分鐘記錄數(shù)據(jù)點(diǎn)，直到檢測到無轉(zhuǎn)化進(jìn)展之后。
通過波長220nm下時(shí)間t時(shí)環(huán)肽的峰面積百分?jǐn)?shù)(手工積分)減去時(shí)間t0時(shí)環(huán)肽的峰面積百分?jǐn)?shù)(手工積分)，計(jì)算二硫鍵橋接的環(huán)肽的量。
2b.測量圓二色性的方法園二色性測量對于肽和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)敏感，并且已經(jīng)廣泛地用于檢查兩者的構(gòu)象(M.Jourdan，S.R.Griffiths-Jones，M.S.Searle，Eur.J.Biochem.2000，267，3539-3548；J.T.Pelto，L.R.Mc.Lean，Analytical Biochemistry，2000，277，167-176)。
在配備有Windows 95/NT的光譜管理程序(1.52.01版本[Build2])的Jasco J-715旋光分光計(jì)上，獲得園二色性光譜。所有測量均在室溫下在具有0.1cm光程的石英室中在水中進(jìn)行。以1nm帶寬(Bandwidth)記錄光譜，收集5個(gè)掃描以提高信噪比，記錄溶劑基線并從樣品光譜中扣除。將所有CD譜進(jìn)行平滑化(以相同值)，并以肽殘基的分子橢圓度單位(Mol.Ellip.)形式報(bào)告。
測量參數(shù)帶寬1.0nm，反應(yīng)1s，靈敏度標(biāo)準(zhǔn)，測量范圍240-190nm，數(shù)據(jù)傾斜度(pitch)0.5nm，掃描速度50nm/min。線性、去保護(hù)的純化的肽溶液的濃度TFA鹽形式在水中10-4M。作為以下實(shí)施例的前體的線性脫保護(hù)的純化肽的pH和純度是實(shí)施例3pH 6.38，純度91％；實(shí)施例4pH 6.77，純度89％；實(shí)施例5pH6.01，純度98％；實(shí)施例9pH 6.00，純度94％。
2c.結(jié)果

圖1-6比較了直到檢測不到轉(zhuǎn)化進(jìn)程之前的時(shí)間，二硫鍵橋接的β發(fā)夾模擬物的形成百分?jǐn)?shù)。
圖1實(shí)施例1和2(n＝8)；具有模板的實(shí)施例2的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例1參照物的比較。
圖2實(shí)施例3和4(n＝10)；具有模板的實(shí)施例4的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例3參照物的比較。
圖3實(shí)施例5-9(n＝10)；具有模板的實(shí)施例6-9的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例5參照物的比較。
圖4實(shí)施例3和10(n＝10)；具有模板的實(shí)施例10的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例3參照物的比較。
圖5實(shí)施例5、11和12(n＝10)；具有模板的實(shí)施例11和12的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例5參照物的比較。
圖6實(shí)施例13和14(n＝12)；具有模板的實(shí)施例14的化合物的二硫鍵形成速度與不具有模板的實(shí)施例13參照物的比較。
圖7實(shí)施例3、4、5和9的化合物的線性肽前體(即，在二硫鍵形成之前)的CD譜(ε，degxcm2/mol)。
2d.討論設(shè)計(jì)實(shí)施例序列Z選擇了兩種不同類型的核心肽序列Z，以研究模板是否將利于模板固定的β發(fā)夾模擬物的形成和穩(wěn)定序列-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO22]取自抗體的CDR L3環(huán)(L.Jiang，K.Moehle，J.Robinson，Chimia(2000)54，558-563)，并修飾成序列-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO23]，后一序列含有根據(jù)P.Y.Chou G.D Fasman，J.Mol.Biol.(1977)115，135-175的穩(wěn)定性β轉(zhuǎn)角和β折疊序列，作為參照β-發(fā)夾。第二序列Z-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO24]構(gòu)建自序列-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[SEQ ID NO25]，其不含有根據(jù)P.Y.Chou G.D Fasman，J.Mol.Biol.(1977)115，135-175的專門的穩(wěn)定性β-轉(zhuǎn)角序列或β折疊序列。
圖1-6所示的結(jié)果說明，具有模板和核心序列-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO24]的化合物的二硫鍵形成速度比含有相同核心序列但不含有模板的化合物的二硫鍵形成速度快。這些結(jié)果清楚地說明，本發(fā)明模板有效地促進(jìn)了β發(fā)夾模擬物的形成。甚至在核心序列Z-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQID NO23](它自身已經(jīng)含有穩(wěn)定性β轉(zhuǎn)角和β折疊序列)的情況下，也可以證明(見圖2和4)模板促進(jìn)了β發(fā)夾模擬物的形成。
此外，含有核心序列-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO24]但不含有模板的實(shí)施例5化合物的線性前體的CD譜(見圖7)顯示出高含量的卷曲-和α-螺旋結(jié)構(gòu)以及痕量的β折疊結(jié)構(gòu)，而實(shí)施例9化合物的線性前體(含有模板和相同核心序列)顯示出高含量的β折疊結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。含有核心序列Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO23]但不含有模板的實(shí)施例3化合物的線性前體的CD譜顯示出卷曲結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu)的混和，而實(shí)施例4化合物的線性前體(含有模板和相同核心結(jié)構(gòu))的CD譜顯示出高含量的β折疊結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)說明，本發(fā)明模板誘導(dǎo)了β發(fā)夾模擬物形成。
3.構(gòu)建噬菌體展示的、并入了模板的、模板固定的β發(fā)夾模擬物序列程序1本發(fā)明寡核苷酸文庫可以根據(jù)Ph.D.肽展示克隆系統(tǒng)，技術(shù)公報(bào)#E801(8/21/02，New England Biolabs，Inc)和K.Noren，C.Noren，Methods，2001，23，169-178的方法和絲狀噬菌體M13KE的基因III融合。
按如下部分所述完成實(shí)施例3模板固定的發(fā)夾模擬物[SEQ ID NO10]的噬菌體展示。對于表5-9中列出的所有其它序列，除了用于產(chǎn)生插入DNA的寡核苷酸不同外，使用相應(yīng)的程序。
使用寡核苷酸1和2(見下述)構(gòu)建插入DNA。下劃線表示用于向載體DNA中進(jìn)行克隆的單一AccI和EagI限制性位點(diǎn)的位置。
對于退火，將2μg(大約170pmol)寡核苷酸1和4.5μg寡核苷酸2(大約170pmol)在含有100mM NaCl的50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中加熱至大約95℃。經(jīng)15至30分鐘緩慢地冷卻后，用DNA聚合酶I的Klenow片段在200μl總體積中延伸退火的雙螺旋。反應(yīng)條件概述于Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press中。所得插入DNA用EagI和Acc65I按照供應(yīng)商(New England Biolabs)推薦的條件消化。用酚/氯仿和氯仿抽提混合物，之后用乙醇沉淀水相。沉淀物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)程序(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，Laboratory Press)純化。
用EagI和Acc65I根據(jù)New England Biolabs推薦的條件消化15μg M13KE載體(New England Biolabs)?；旌衔镌诃傊巧霞兓?，并用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)回收線性化的載體DNA。
1號寡核苷酸Acc65I5′CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC 3′[SEQ ID NO26]2號寡核苷酸EagI5’CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAGGTCTGATAATGGTTGCTGAACCATTTGGTGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG’3′[SEQ ID NO27]對于插入DNA的克隆，未優(yōu)化連接條件。
簡言之，在總體積20μl的T4 DNA連接酶緩沖液中16℃過夜連接，所述緩沖液含有大約40ng線性化的載體、大約3∶1摩爾過量的雙鏈和200單位T4連接酶。對照反應(yīng)僅含有載體并加上和減去連接酶，實(shí)施此對照反應(yīng)以確定連接效率和由于載體重新連接導(dǎo)致的背景。連接混合物65℃加熱滅活15分鐘，用1μl等分試樣對100μl ElectroTen-blue電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)按照New England Biolabs所述進(jìn)行隨后的電穿孔。電穿孔后立即向每個(gè)小杯中加入1ml SOC培養(yǎng)基(2％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％細(xì)菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)，37℃孵育30分鐘。使用其等分試樣，利用含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基，通過蘭/白篩選滴定每一培養(yǎng)物。選擇用于序列驗(yàn)證的各個(gè)克隆，37℃孵育4-4.5小時(shí)后在1ml 1∶100稀釋的XL1-Blue過夜培養(yǎng)物中溫育。從這些液體培養(yǎng)物，應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的方案，獲得用于長期儲(chǔ)存和測序目的的噬菌體。
程序2(隨機(jī)化的模板固定的β發(fā)夾模擬物文庫)實(shí)施例15序列[SEQ ID NO42](見表9)的噬菌體展示代表隨機(jī)化的模板固定的β發(fā)夾模擬物文庫的制備，并描述在以下部分。
使用寡核苷酸1和3(分別見上文和下文)構(gòu)建插入DNA。下劃線表示用于向載體DNA中進(jìn)行克隆的單一AccI和EagI限制性位點(diǎn)的位置。
對于退火，將2μg(大約170pmol)寡核苷酸1和4.5μg寡核苷酸2(大約170pmol)在含有100mM NaCl的50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中加熱至大約95℃。經(jīng)15至30分鐘緩慢地冷卻后，用DNA聚合酶I的Klenow片段在200μl總體積中延伸退火的雙螺旋，反應(yīng)條件是本領(lǐng)域熟知的(Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)。所得插入DNA用EagI和Acc65I按照New England Biolabs推薦的條件消化。用酚/氯仿和氯仿抽提混合物，之后用乙醇沉淀水相。沉淀物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)程序(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)純化。
用EagI和Acc65I根據(jù)New England Biolabs推薦的條件消化15μg M13KE載體。混合物在瓊脂糖上純化，并用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)回收線性化的載體DNA。
1號寡核苷酸Acc65I5′CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAAACCTGC 3′[SEQ ID NO26]3號寡核苷酸EagI5’CATGTTTCGGCCGAGCCACCACCTTTGGTGCAMNNMNNMNNMNNGTCACCACGMNNMNNMNNGCAGGTTTCAGAGTGAGAATAG 3’[SEQ ID NO43]在20μl總體積中通過變化插入物載體的摩爾比(從3∶1，5∶1至10∶1)以及分別使用40和100ng消化的載體，確定最佳連接條件。此外，實(shí)施僅含有載體以及有和無連接酶存在的對照反應(yīng)，以確定連接效率和由于載體重新連接導(dǎo)致的背景。在1×連接緩沖液和200NEB單位(＝3Weiss單位)T4DNA連接酶中16℃過夜反應(yīng)。試驗(yàn)連接物在65℃熱滅活15分鐘。隨后根據(jù)廠商描述的推薦條件，用1μl等分試樣電穿孔100μl Eelctro Ten-blue電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。電穿孔后立即向每個(gè)小杯中加入1ml SOC培養(yǎng)基(2％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％細(xì)菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖)，37℃孵育30分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，Laboratory Press)，通過X-gal的蘭/白篩選，確定每個(gè)長出的培養(yǎng)物的噬斑形成單位滴度。
將展示最高噬斑/微克投入載體比率的連接按比例放大以獲得期望的文庫復(fù)雜度。對于文庫的構(gòu)建，DNA以每100μl感受態(tài)細(xì)胞懸浮液大約0.1μg的終濃度存在。電穿孔后立即向每個(gè)小杯中加入1mlSOC培養(yǎng)基，將SOC生長物(outgrowths)分成5個(gè)庫，37℃溫育30分鐘。通過滴定幾個(gè)生長物確定文庫復(fù)雜度，剩余的生長物用于噬菌體擴(kuò)增。對于擴(kuò)增，將每個(gè)SOC生長物庫加入1升1∶100稀釋的XL1-Blue過夜培養(yǎng)物中。37℃溫育4.5至5小時(shí)并伴隨有力通氣。從這些液體培養(yǎng)物，通過離心澄清上清液兩次、并用聚乙二醇(終濃度3.3％聚乙二醇-8000，0.4M NaCl)4℃過夜沉淀噬菌體顆粒，獲得噬菌體。離心后，所獲沉淀重新溶解在TBS中，離心澄清懸浮液，通過用聚乙二醇(如上述)4℃沉淀1小時(shí)，從上清液獲得噬菌體顆粒。離心后，噬菌體沉淀重新懸浮在TBS(50mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM NaCl)中，并存儲(chǔ)在4℃。
表1實(shí)施例1-2，n＝8實(shí)施例Sequ.ID R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Cys R21 SEQ ID NO8Ac-NH-Cys Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Cys-H2 SEQ ID NO9 Ac-NH-Glu Thr Cys Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Cys Thr Lys-H半胱氨酸通過二硫鍵連接表2實(shí)施例3-9，n＝10實(shí)施例 Sequ.IDR1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cys R23SEQ ID NO10 Ac-NH-Cys Thr Lys Trp Phe Ser Asn His Tyr Gln Thr Cys-H4SEQ ID NO11 Ac-NH-Glu Thr Cys Thr Lys Trp Phe Ser Asn His Tyr Gln Thr Cys Thr Lys-H5SEQ ID NO12 Ac-NH-Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys-H6SEQ ID NO13 Ac-NH-Leu Glu Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Lys Val-H7SEQ ID NO14 Ac-NH-Asn Gly Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Lys Val-H8SEQ ID NO15 Ac-NH-Gly Gly Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Gly Gly-H9SEQ ID NO16 Ac-NH-Glu Thr Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Thr Lys-H半胱氨酸通過二硫鍵連接Ac＝乙?；?實(shí)施例10-12，n＝10實(shí)施例 Sequ.ID R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cys R210 SEQ ID NO17 Ac-NH-Glu Leu Lys Cys Thr Lys Trp Phe Ser Asn His Tyr Gln Thr Cys Glu Val Lys-H11 SEQ ID NO: 18 Ac-NH-Lys Val Gly Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Gly Leu Glu-H12 SEQ ID NO19 Ac-NH-Gly Gly Gly Cys Thr Lys Trp Phe Leu Ala His Tyr Ala Thr Cys Gly Gly Gly-H半胱氨酸通過二硫鍵連接表4實(shí)施例13-14，n＝12實(shí)施例Sequ.ID R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 Cys R213SEQ ID NO20Ac-NH-Cys Gly Thr Lys Trp Phe Ser Asn His Tyr Gln Thr Gly Cys-H14SEQ ID NO21 Ac-NH-Glu Thr Cys Gly Thr Lys Trp Phe Ser Asn His Tyr Gln Thr Gly Cys Thr Lys-H半胱氨酸通過二硫鍵連接Ac＝乙?；鄳?yīng)于實(shí)施例1-14的DNA序列的表表5實(shí)施例1-2，n＝8R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 Cys R2SeqID No28TGC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG TGCSeqID No29GAA ACC TGC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG TGC ACC AAA表6實(shí)施例3-9，n＝10R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cys R2SeqID No30 TGC ACC AAA TGG TTC AGC AAC CAT TAT CAG ACC TGCSeqID No31GAA ACC TGC ACC AAA TGG TTC AGC AAC CAT TAT CAG ACC TGC ACC AAASeqID No32 TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGCSeqID No33CTG GAA TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC AAA GTTSeqID No34AAC GGT TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC AAA GTTSeqID No35GGT GGT TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC GGC GGTSeqID No36GAA ACC TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC ACC AAA表7實(shí)施例10-12 n＝10R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cys R2SeqID No37GAA CTG AAA TGC ACC AAA TGG TTC AGC AAC CAT TAT CAG ACC TGC GAA GTT AAASeqID No38AAA GTT GGT TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC GGT CTG GAASeqID No39GGT GGT GGC TGC ACC AAA TGG TTC CTG GCG CAT TAT GCG ACC TGC GGC GGT GGT表8實(shí)施例13-14，n＝12Seq.ID R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 Cys R2SeqID No40 TGC GGT ACC AAA TGG TTC AGC AAC CAT TAT CAG ACC GGT TGCSeqID No41 GAA ACC TGC GGT ACC AAA TGG TTC AGC AAC CAT TAT CAG ACC GGT TGC ACC AAA
表9實(shí)施例15，n＝10，隨機(jī)化的模板固定的β發(fā)夾模擬物噬菌體文庫的DNA序列實(shí)施例Seq.ID R1Cys P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cys R2Ex.15SeqID No42 GAA ACC TGC NNK NNK NNK CGT GGT GAC NNK NNK NNK NNK TGC ACC AAAGlu Thr Cys X X X Arg Gly Asp X X X X Cys Thr LysX隨機(jī)化的氨基酸位置半胱氨酸通過二硫鍵連接
權(quán)利要求
1.以下通式的模板固定的β發(fā)夾模擬物R1-Cys-Z-Cys-R2I其中兩個(gè)Cys殘基通過二硫鍵橋接，由此形成環(huán)肽；R1和R2是A-B和B-C；或B-A和C-B；或C-B和B-A；或B-C和A-B；或C-A和C-A；或A-C和A-C；或C-A和C-B；或B-B和C-B；或B-B和B-C；或A-B和C-C；或B-A和C-C；或C-B和B-B；或B-C和B-B；或C-C和B-A；或C-C和A-B；或B-B和C-C；或C-C和B-B；或A-C和B-C；或C-B和C-A；或B-C和A-C；或A-C和A-B；或B-A和C-A；A-A和C-C；或C-C和A-A；或A-B-C和A-B-C；或B-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-A-B；或A-B-B和B-B-C；或C-B-B和B-B-A；或A-C-B和B-A-C；或C-A-B和B-C-A；或B-A-B和B-C-C；或B-C-B和B-A-C；或C-C-B和B-B-A；或C-C-B和B-A-B，或C-B-B和C-C-A；或A-C-C和B-B-C；或B-C-C和B-A-B；或B-C-C和B-A-C；或A-B-B和B-C-C；或B-A-B和C-C-B；或C-A-B和C-C-B；或B-B-B和B-C-C；或C-B-B和B-B-B；或B-B-B和C-C-B；或B-C-C和B-B-B；或A-B-C和B-B-C；或C-B-B和C-B-A；或A-B-C和A-C-C；或C-C-A和C-B-A；或B-A-C和A-C-B；或B-C-A和C-A-B；或C-B-A和C-B-A；或A-A-B和B-C-C；或C-C-B和B-A-A；或B-B-C和A-C-C；或B-B-C和A-B-C；或B-B-C和B-B-C；或B-B-C和B-B-B；或B-A-C和B-C-C；或C-C-B和C-A-B；或C-C-B和C-B-A；或A-B-C和B-C-C；或C-A-B和B-C-B；或B-C-B和B-B-C；或C-B-B和B-C-B；或B-C-B和B-B-B；或B-B-B和B-C-B；或C-B-B和B-C-A；或A-C-B和B-B-C；或C-B-B和C-B-B；或B-B-B和B-B-B；或B-B-B和B-B-C；或A-A-C和A-C-C；或C-C-A和C-A-A；或A-A-C和A-C-B；或B-C-A和C-A-A；或A-A-C和B-C-C；或C-C-B和C-A-A；或A-A-B和C-C-B；或B-C-C和B-A-A；或A-B-A和C-B-C；或C-B-C和A-B-A；或A-B-B和C-B-C；或C-B-C和B-B-A；或B-A-A和C-C-B；或B-C-C和A-A-B；或B-B-A和C-B-B；或B-B-C和A-B-B；或B-B-A和C-C-B；或B-C-C和A-B-B；或B-B-C和A-C-B；或B-C-A和C-B-B；或B-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-B；或B-C-B和C-A-B；或B-A-C和B-C-B；或B-C-B和C-B-B；或B-A-C和A-C-B；或B-A-C和A-C-C；或C-C-A和C-A-B；或B-A-C和B-C-C；B-C-C和A-A-C；或C-A-A和C-C-B；或C-A-A和C-C-A；或A-C-C和A-A-C；或C-B-A和C-C-A；或A-C-C和A-B-C；或C-B-A和C-B-B；或C-B-A和C-C-B；或B-C-C和A-B-C；或C-B-B和C-C-A；或C-B-B和C-B-B；或C-B-B和C-C-B；或B-CC和B-B-C；或C-C-A和C-A-B；或C-C-A和C-B-B；或C-C-B和B-B-B；或C-C-B和C-A-A；或C-C-B和C-B-A；或C-C-B和C-B-B；或B-B-C和B-C-C；或A-C-B和B-B-C；或A-C-C和B-B-C；A是Asn，Gln，Asp，Glu，Thr，Ser和Gly中的任一個(gè)；B是Val，Ile，Ser，Thr，Phe，Tyr，Trp和Gly中的任一個(gè)；C是Arg，Lys和Gly中的任一個(gè)；且Z是n個(gè)氨基酸殘基的鏈，其中n是4至20的整數(shù)，這n個(gè)氨基酸殘基中的每一個(gè)獨(dú)立地來源于任何天然存在的L-α-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2是Glu-Thr和Thr-Lys；或者Lys-Thr和Thr-Glu；或者Thr-Glu和Lys-Thr；或者Thr-Lys和Glu-Thr；或者Leu-Glu和Lys-Val；或者Val-Lys和Glu-Leu；或者Glu-Leu和Val-Lys；或者Lys-Leu和Val-Glu；或者Asn-Gly和Lys-Val；或者Val-Gly和Lys-Asn；或者Gly-Asn和Val-Lys；或者Gly-Val和Asn-Lys；或者Gly-Gly和Gly-Gly；或者Glu-Leu-Lys和Glu-Val-Lys；或者Lys-Val-Glu和Lys-Leu-Glu；或者Leu-Glu-Lys和Glu-Lys-Val；或者Val-Lys-Glu和Lys-Glu-Leu；或者Glu-Lys-Leu和Val-Glu-Lys；或者Lys-Glu-Val和Leu-Lys-Glu；或者Lys-Glu-Leu和Val-Lys-Glu；或者Glu-Lys-Val和Leu-Glu-Lys；或者Lys-Val-Gly和Gly-Leu-Glu；或者Glu-Leu-Gly和Gly-Val-Lys；或者Val-Lys-Gly和Gly-Glu-Leu；或者Leu-Glu-Gly和Gly-Lys-Va1；或者Val-Gly-Lys和Glu-Gly-Leu；或者Leu-Gly-Glu和Lys-Gly-Val；或者Gly-Gly-Gly和Gly-Gly-Gly。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中Z含有-Arg-Gly-Asp-，-Glu-Leu-Arg-，-Arg-Lys-Lys-或者-Lys-Gly-Phe-或者，由以下序列組成，或者含有以下序列-Val-Arg-Lys-Lys-[SEQ ID NO1]，-Lys-Lys-Tyr-Leu-[SEQ ID NO2]，-Trp-Leu-Asp-Val-[SEQ ID NO3]，-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-[SEQ ID NO4]，-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-[SEQ ID NO5]，-Ile-Lys-Val-Ala-Val-[SEQ ID NO6]，-Pro-Pro-Xaa-Xaa-Trp-[SEQ ID NO7]，其中Xaa可以是任何天然存在的L-α-氨基酸的殘基，-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-[SEQ ID NO22]，-Lys-Trp-Phe-Ser-Asn-His-Tyr-Gln-[SEQ ID NO23]，-Phe-Leu-Ala-His-Tyr-Ala-[SEQ ID NO24]或者-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val-Lys-Trp-[SEQ ID NO25]。
4.包含多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的化合物的模板固定的β發(fā)夾模擬物文庫。
5.權(quán)利要求4的文庫，其中模板固定的β發(fā)夾模擬物與噬菌體外殼蛋白的至少一個(gè)部分融合，且該模板固定的β發(fā)夾模擬物被展示在噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。
6.篩選模板固定的發(fā)夾β-模擬物的方法，其中所述模擬物具有在構(gòu)象上穩(wěn)定β發(fā)夾的模板并能夠與特定結(jié)合配偶體結(jié)合，所述方法包括步驟a)提供權(quán)利要求3或4的模板固定的β發(fā)夾模擬物的文庫；b)使步驟a)的文庫與結(jié)合配偶體接觸；c)從該文庫中選擇能夠與結(jié)合配偶體形成非共價(jià)復(fù)合體的肽；和d)任選地，分離步驟c)的肽或者通過DNA分析確定其序列。
7.權(quán)利要求6的方法，其中結(jié)合配偶體選自抗體、酶、受體和配體。
8.已通過權(quán)利要求6或7的方法確定和任選地分離的肽。
9.合成肽，其具有與權(quán)利要求8的肽的結(jié)構(gòu)相同的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明提供通式R
文檔編號C07K7/04GK1910280SQ200380110980
公開日2007年2月7日 申請日期2003年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月15日
發(fā)明者J·W·維瑞吉布羅德, D·奧布瑞徹特, S·羅庫里歐, F·O·格姆勃特, C·盧丁, F·榮格 申請人:波利弗爾有限公司, 蘇黎世大學(xué)