專利名稱：減肥多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明
背景技術(shù)：
1.技術(shù)領(lǐng)域肥胖癥是各種組織中、特別是腹部脂肪組織中過量脂肪積聚所引起的病理障礙。過量高脂肪含量的食物吸收、缺乏運(yùn)動(dòng)、遺傳、環(huán)境、和心理因素是肥胖癥原因。
隨著社會(huì)的發(fā)展，由于攝取食物的質(zhì)和量以及遺傳、環(huán)境和心理因素引起的肥胖癥是一種病理障礙，其來自脂肪積聚，特別是在組織之間的脂肪組織中。肥胖癥被看作是糖尿病、心血管疾病、以及縮短壽命預(yù)期、和其他疾病的直接或間接原因。預(yù)防和治療肥胖癥對(duì)于健康生活而言是一個(gè)重要的保健議題。
2.現(xiàn)有技術(shù)描述許多研究表明，通過飲食控制或有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)來減少脂肪量可顯著降低上述的健康危險(xiǎn)。不幸的是，飲食控制和運(yùn)動(dòng)經(jīng)常不能成功。這種失敗與增加的食欲、喜歡高熱量食物、減少體育活動(dòng)、以及脂質(zhì)生物合成有關(guān)的各種遺傳因素緊密相關(guān)。尤其是，很難治療具有高遺傳危險(xiǎn)因素的肥胖者。因此，需要新的能治療肥胖癥的治療藥劑。
雖然飲食控制和運(yùn)動(dòng)可預(yù)防潛在的肥胖癥病人變成肥胖，但他們中的大多數(shù)最終將變成肥胖狀態(tài)。因此，為了用相對(duì)簡(jiǎn)單的治療方法來預(yù)防和治療肥胖癥，我們，在本發(fā)明中，發(fā)明了相對(duì)簡(jiǎn)單的多肽，其可以蛋白質(zhì)藥物或基因治療藥劑的形式用來預(yù)防或治療肥胖癥。
對(duì)于我們的生化和分子生物學(xué)研究而言，我們過去常常通過將由重組抗原和佐劑組成的懸浮液混合物對(duì)白兔進(jìn)行皮下注射(4至6周，約2至4次)，并通過血清收集來制備多克隆抗體。在一個(gè)這類實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，特異性多肽(在下文稱作“Synleptin”)誘導(dǎo)兔重量減輕超過20％。重量減輕的主要原因在于各種腹部區(qū)或器官、和皮下區(qū)中脂肪量的顯著降低。這種多肽可用于預(yù)防或治療肥胖癥的藥劑。
本發(fā)明提供生物減肥藥。減肥激素、來普汀、蛋白質(zhì)、飲食控制、和運(yùn)動(dòng)是傳統(tǒng)的治療肥胖癥的方法。然而，本發(fā)明提供創(chuàng)新的減肥藥，其能有效地阻遏體內(nèi)脂肪或脂肪組織的形成。更具體地，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)，當(dāng)采用由72或86個(gè)氨基酸組成并與佐劑油混合的蛋白質(zhì)注射進(jìn)入皮下組織時(shí)，該蛋白質(zhì)顯著阻遏脂肪組織的產(chǎn)生。因?yàn)橛?1或86個(gè)氨基酸組成的部分Tat(HIV的轉(zhuǎn)活性蛋白)多肽片段顯示出減肥活性，因而由所有或部分101個(gè)氨基酸組成的Tat多肽也將具有減肥效應(yīng)。本發(fā)明是基于下述新穎的發(fā)現(xiàn)Tat蛋白質(zhì)阻遏體內(nèi)脂肪生物合成。AIDS病人由于Tat蛋白質(zhì)可變瘦。Tat多肽及其各種衍生物可以蛋白質(zhì)藥物或基因治療藥劑的形式用作預(yù)防或治療肥胖癥的藥劑。
發(fā)明簡(jiǎn)述相應(yīng)地，為了克服上述問題，本發(fā)明將提供用于有效預(yù)防或治療肥胖癥的生物治療藥劑。
為了完成上述目標(biāo)，本發(fā)明提供多肽，以序列識(shí)別號(hào)1、2和3表示，或其藥用鹽。
在本發(fā)明中，序列識(shí)別號(hào)1的多肽是由101個(gè)氨基酸組成的Tat蛋白質(zhì)，序列識(shí)別號(hào)2的多肽是自Tat的N末端的86個(gè)氨基酸，而序列識(shí)別號(hào)3的多肽是自Tat的N末端的71個(gè)氨基酸。然而，在本發(fā)明中，在各種組織中具有減肥活性的多肽包括上述Tat多肽和其不同的突變型多肽(存在多種類型的Tat天然或人工突變體)，包括其部分或整體。
本發(fā)明還提供具有序列識(shí)別號(hào)2和3表示的核苷酸序列的基因，其編碼減肥多肽，以及pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2或pGEX4TSynLeptin-1和-2融合基因重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的多肽可以各種蛋白質(zhì)藥物或基因治療藥劑的形式用作肥胖癥的預(yù)防或治療藥劑。


圖1說明給予Synleptin多肽所引起的重量減輕，其能夠減肥和阻遏各種組織包括兔脂肪組織中的脂肪積聚。與對(duì)照組比較，SynLeptin-1多肽通過阻遏脂肪組織的形成誘導(dǎo)20％的重量減輕(見圖3)。
圖2說明當(dāng)SynLeptin-1或2多肽每2周2次皮下注射12周齡的具有非功能性來普汀受體的ZFD大鼠重量減輕。大約30天后，雖然用生理鹽水試驗(yàn)的對(duì)照組顯示出8.5％的重量增加，用SynLeptin-1的治療組顯示出3.5％的重量增加，但相反地用SynLeptin-2的治療組顯示出4.3％的重量減輕。
圖3表示尸體剖檢結(jié)果。在圖3A中，箭頭表示試驗(yàn)兔的各種器官中脂肪組織的分布，該試驗(yàn)兔皮下注射SynLeptin-2多肽-佐劑混合物，每2周3次。在圖3B中，箭頭表示各種器官中脂肪組織的分布，皮下注射了生理鹽水-佐劑混合物，每2周3次。如圖3所示，本發(fā)明的多肽顯著減少各種組織包括脂肪組織中的脂肪。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將通過詳述的示范性具體實(shí)施例，并參照附圖進(jìn)行說明，其僅僅是說明而不是限制本發(fā)明。
如上所述，肥胖癥是各種組織中、特別是脂肪組織中過量脂肪積聚所引起的病理障礙。肥胖癥是疾病如糖尿病、心血管疾病、以及縮短壽命預(yù)期、和其他疾病的直接或間接原因。據(jù)報(bào)道，如果病人可減少其體重的5％，則病人的上述疾病狀態(tài)可顯著改善、或甚至可以預(yù)防這些疾病。
高等脊椎動(dòng)物精確地通過關(guān)節(jié)(articulate)激素系統(tǒng)來調(diào)節(jié)其脂肪組織的大小。與增加的體重(由于脂肪組織的擴(kuò)大)成比例，調(diào)節(jié)體重或脂肪組織量的來普汀激素的濃度在血液中增加，并且來普汀結(jié)合于在腦的丘腦下部的受體。通過激素-受體相互作用會(huì)發(fā)生降低體重的一系列調(diào)節(jié)過程。該相互作用促進(jìn)促黑素細(xì)胞激素的分泌并且還增加黑皮質(zhì)素-4受體(melanocortin-4 receptor)的數(shù)目。通過降低食欲、增加體能發(fā)射、和刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)，這些過程導(dǎo)致食物吸收的降低。反之，與降低的體重(由于脂肪組織的減少)成比例，在血液中來普汀激素的量減少，并且腦的丘腦下部感覺到這種狀態(tài)。感覺來普汀的低濃度的許多調(diào)節(jié)過程可通過增加神經(jīng)肽Y濃度和Y-受體數(shù)目來增加體重。這些過程通過增加食欲、減少體能消耗、降低生殖能力和體溫、以及增加副交感神經(jīng)系統(tǒng)的刺激來導(dǎo)致食物吸收的增加。因此，如上所述，該精確的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)脂肪組織的量和體重。
在調(diào)節(jié)體重方面具有主要作用的激素基因包括ob基因、db基因、和agouti基因。具體地，ob是16kDa多肽(稱作來普汀)，其是在脂肪組織中合成并傳輸?shù)窖髦?。如果引入突變，如編碼多肽的基因的異常表達(dá)和功能、或細(xì)胞表面激素受體的數(shù)目和功能發(fā)生差錯(cuò)，則脂肪組織的大小會(huì)顯著增加，并且體重也會(huì)增加。
先前的研究已表明，注射進(jìn)血液的ob多肽(來普汀)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肥胖癥治療具有明顯的效果。應(yīng)用于人的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。臨床結(jié)果表明，在來普汀治療后，一些肥胖者減掉7.1kg的體重，而其他人則沒有減輕重量。進(jìn)一步的研究表明，肥胖癥生物學(xué)是復(fù)雜的，并由各種基因缺乏引起，包括ob受體(db)和ob基因。
利用大鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，ob多肽可通過增加葡萄糖代謝來治療II型糖尿病，而與體重?zé)o關(guān)。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是通過阻遏脂肪在各種組織中的積聚來有效預(yù)防或治療引起各種難治疾病的肥胖癥。本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)于來普汀有耐藥性的肥胖病人可能具有治療效應(yīng)。來普汀通過結(jié)合于它的受體施加其生物功能，但由于SynLeptin-1和-2具有細(xì)胞膜可通透PTD(蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域)，這些多肽可阻遏脂肪組織的產(chǎn)生而不管來普汀受體的數(shù)目和功能的變化。確實(shí)，用具有非功能性ob受體(db)的ZDF大鼠進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在用Synleptin多肽治療后體重減少(圖2)。因此，本發(fā)明的多肽對(duì)于來普汀有耐藥性的肥胖病人可能具有治療效應(yīng)。
此外，雖然來普汀必須每日注射入血流以達(dá)到明顯的重量減輕，但具有PTD域的SynLeptin-1和-2可非常容易地給予我們的身體。例如，2至3次皮下注射多肽-佐劑油混合物足以維持瘦狀態(tài)150天以上。
雖然人們進(jìn)行各種努力如飲食控制、嚴(yán)酷的運(yùn)動(dòng)、和化學(xué)治療來預(yù)防和治療肥胖癥，但當(dāng)他們停止那些努力時(shí)容易反彈到肥胖狀態(tài)。為克服上述問題，提供本發(fā)明的Synleptin多肽，從而通過有力地阻遏脂肪在各種組織中的積聚或產(chǎn)生，以預(yù)防和治療肥胖癥。
實(shí)施例1制備pGEX4T-3-SynLeptin-1和-2表達(dá)質(zhì)粒和生產(chǎn)SynLeptin-1和-2多肽對(duì)SynLeptin-1的PCR反應(yīng)是利用有義引物(GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTAAATCCTAGCCTAG)和反義引物(GATCGAATTCCTTTGATAGAGAAACTTGATG)進(jìn)行。PCR條件如下。Tat cDNA在94℃變性5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)(94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒)并在72℃進(jìn)行最終反應(yīng)5分鐘。從2.0％的瓊脂糖膠分離PCR產(chǎn)物，純化，然后用限制性內(nèi)切酶BamH1和EcoR1進(jìn)行消化。pGEX4T-3(Pharmacia公司)表達(dá)載體用相同的限制性內(nèi)切酶(BamH1和EcoR1)進(jìn)行消化，然后利用T4 DNA連接酶將經(jīng)消化的載體連接于Synleptin-1 cDNA/BamH1-EcoR1片段。連接的混合物通過轉(zhuǎn)化作用被引入表達(dá)宿主大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)。
為了制備pGEX4T-3-SynLeptin-2表達(dá)質(zhì)粒(含有86個(gè)氨基酸的Tat多肽)，以及生產(chǎn)SynLeptin-2蛋白質(zhì)，PCR反應(yīng)是利用有義引物(GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGC)、反義引物(GATCGAATTCTTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCT)、以及Tat cDNA作為模板進(jìn)行。制備pGEX4T-3-SynLeptin-2的PCR條件和方法與上述條件和方法相同。
經(jīng)pGEX4T-3-SynLeptin-1或-2轉(zhuǎn)染表達(dá)宿主細(xì)菌(大腸桿菌BL21 DE3)接種于含有100μg/ml的氨芐西林的TY液體培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)過夜。將1ml過夜細(xì)菌培養(yǎng)物加入含有100μg/ml的氨芐西林的100ml的TY液體培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)1.5小時(shí)。融合蛋白的合成是在30℃用0.2mM IPTG誘導(dǎo)10小時(shí)。SynLetin-l和-2蛋白質(zhì)是用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析法進(jìn)行純化。
pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是用下述方法進(jìn)行制備。pcDNA3.0(Clontech，克隆技術(shù))質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH1和EcoR1進(jìn)行消化。上述Synleptin cDNA-1或-2基因(大約220個(gè)堿基對(duì))的BamH1-EcoR1片段和經(jīng)消化的質(zhì)粒用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，然后通過轉(zhuǎn)染法引入大腸桿菌DH5α。重組質(zhì)粒是用堿性溶胞作用法進(jìn)行制備。
實(shí)施例2通過阻遏脂肪組織的積聚來降低體重的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將具有1.2kg體重的4只白兔分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組分別有2只兔。純化的SynLeptin-1或-2蛋白質(zhì)(500-700μg)或生理鹽水與2ml佐劑(Sigma)進(jìn)行混合，然后皮下注射兔的4個(gè)不同部位。2周后，注射相同量的蛋白質(zhì)-佐劑混合物，然后在2周后進(jìn)行第3次注射。其后，在10天后測(cè)量體重減少。結(jié)果如下。用SynLeptin-1治療的實(shí)驗(yàn)組的體重分別是1.8kg和2.08kg(平均1.94kg)，而對(duì)照組的體重分別是2.5kg和2.45kg(平均2.48kg)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組顯示大約減少22％的體重(見圖1)。我們還用SynLeptin-1或-2多肽治療具有非功能性來普汀受體基因的ZDF大鼠30天(圖2)。用SynLeptin-1治療的實(shí)驗(yàn)組顯示3.5％的體重增加。相反，對(duì)照組顯示8.5％的體重增加。特別是，與對(duì)照組相比較，用SynLeptin-2治療的實(shí)驗(yàn)組反而顯示4.3％的體重下降(圖2)。
實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尸體剖檢通過尸體剖檢和病理檢查，我們分析了體重下降的原因。在尸體剖檢前，對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的兔均顯示出正常的活動(dòng)或行為。當(dāng)處死兔并進(jìn)行尸體剖檢時(shí)，在它們的器官中未觀察到病理異常。然而，不僅在腹部和皮下脂肪組織中，而且在各種器官周圍的組織中，脂肪量的顯著減少是明顯的。特別地，腹部脂肪組織的尺寸顯著減小(圖3)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過阻遏各種動(dòng)物組織中脂肪組織的形成對(duì)預(yù)防和治療肥胖癥具有強(qiáng)效應(yīng)。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以蛋白質(zhì)藥物或基因治療藥劑的形式用作減肥藥。
序列表<110>許晚旭<120>減肥多肽<150>KR2001-21450<151>2001-04-20<160>6<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>101<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>101個(gè)氨基酸Tat蛋白<400>1Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Met Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Thr Asp Pro Phe Asp
100<210>2<211>86<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>86個(gè)氨基酸Tat突變異種<400>2Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Met Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85<210>3<211>71<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>71個(gè)氨基酸Tat突變異種
<400>3Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys65 70<210>4<211>303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>101個(gè)氨基酸Tat的堿基序列<400>4atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag180aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac240ccgacaggcc cgaaggaaca gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc300gat 303
<210>5<211>258<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>86氨基酸Tat的堿基序列<400>5atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag180aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac240ccgacaggcc cgaaggaa 258<210>6<211>213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>71個(gè)氨基酸Tat的堿基序列<400>6atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aag 21權(quán)利要求
1.一種用序列識(shí)別號(hào)1表示的具有脂肪組織降低活性的多肽、或其藥用鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有脂肪組織降低活性的多肽，其中所述多肽是由從N末端開始的86個(gè)氨基酸組成，以序列識(shí)別號(hào)2表示，或其藥用鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有脂肪組織降低活性的多肽，其中所述多肽是由自N末端的71個(gè)氨基酸組成，以序列識(shí)別號(hào)3表示，或其藥用鹽。
4.以序列識(shí)別號(hào)4至6表示的基因，分別編碼權(quán)利要求1至3所述的多肽。
5.重組質(zhì)粒、pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2、或pGEX4TSynLeptin-1和-2，包括權(quán)利要求4所述基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、或3所述的具有脂肪組織降低活性的多肽，其中所述多肽是Tat多肽或其不同的突變或變異型，包括其部分或整體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制體內(nèi)脂肪組織產(chǎn)生的減肥多肽。該減肥多肽可用作肥胖癥預(yù)防疫苗或治療藥劑以及用于治愈糖尿病。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1520422SQ02808528
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者許晚旭, 李東奇 申請(qǐng)人:延世大學(xué)校