專利名稱：：修飾蛋白、人工毒素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及修飾蛋白的制備方法，該蛋白是較短的和/或較低抗原性的多肽，以及含有上述多肽的組合物。本文描述了植物毒素gelonin的較短和低抗原性版本。這種修飾蛋白具有治療和診斷價(jià)值，如可以作為免疫毒素。相關(guān)領(lǐng)域說明肽、多肽和蛋白有許多預(yù)防、診斷和治療價(jià)值。但是一個(gè)缺點(diǎn)是這些蛋白化合物會(huì)在那些希望利用其價(jià)值的個(gè)體體內(nèi)激發(fā)對(duì)這些化合物的免疫反應(yīng)。對(duì)這些化合物的免疫反應(yīng)會(huì)降低或完全消除其達(dá)到的效果。因此，大家都希望降低化合物的抗原性或免疫原性，因?yàn)檫@些化合物的效應(yīng)會(huì)因其在宿受試者內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)而降低。為了獲得預(yù)防、診斷和治療價(jià)值，許多研究和開發(fā)的焦點(diǎn)集中到一類特別的蛋白質(zhì)-單克隆抗體上。在過去二十年中能識(shí)別各種細(xì)胞表面抗原的高特異性免疫毒素已得到開發(fā)和研究。免疫毒素有一個(gè)具有吸引力的特征就是，只要有少數(shù)幾個(gè)分子成功到達(dá)正確的細(xì)胞室內(nèi)就可以產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。含有各種毒素如皂甙、響尾蛇毒素、蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)、假單胞菌外毒素(PE)、diptheria毒素(DT)和gelonin的免疫毒素也已構(gòu)建出來。與免疫毒素體內(nèi)應(yīng)用有關(guān)的問題一般包括血管損傷導(dǎo)致的毛細(xì)血管滲漏綜合征，由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別毒素部分而產(chǎn)生的錯(cuò)誤靶向，靶抗原表達(dá)異質(zhì)性以及由于抗毒素抗體產(chǎn)生而導(dǎo)致的約14天的狹窄治療窗。盡管有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，但是抗毒素抗體和抗結(jié)合物抗體的產(chǎn)生也阻礙了病人反復(fù)使用免疫毒素進(jìn)行治療。延長(zhǎng)病人使用免疫毒素的時(shí)間也會(huì)引起許多問題。含有RTA和PE的免疫結(jié)合物已被發(fā)現(xiàn)在病人體內(nèi)具有很強(qiáng)的免疫原性。另外，免疫毒素構(gòu)建物(大約30KDa)內(nèi)蛋白的大小也被懷疑能阻止免疫結(jié)合物向?qū)嶓w腫瘤內(nèi)有效滲透。在大多數(shù)情況下，對(duì)I型蛋白如RTA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是不成功的(Munishkin等，1995)。但是已經(jīng)制備出來許多幾個(gè)氨基酸被修飾的RTA突變體。1995年Wool等人描述了45個(gè)單個(gè)氨基酸缺失的RTA。盡管沒有檢測(cè)這些缺失突變體與天然RTA的相對(duì)生物學(xué)活性，其中只有那些8個(gè)單個(gè)氨基酸缺失的突變體具有生物學(xué)活性。然而有趣的是，研究RTA的價(jià)值有限，因?yàn)镽TA與其他毒素如gelonin只有30％的同源序列。基于單克隆抗體(Mab)的治療通常特定應(yīng)用于人類腫瘤的診斷和治療。但是，這些藥物用在臨床上所取得的療效是很有限的，因?yàn)檫@些治療方法本身就有一些缺點(diǎn)，如抗原表達(dá)的異質(zhì)性，由于抗體分子較大而很難滲透入實(shí)體腫瘤內(nèi)，以及抗體所具有的抗原性(Roselli等，1993；Berkower，1996；Pullybland等，1997；Panchagnula等，1997；Panchal，1998)。為了解決這些問題，許多分子方法被應(yīng)用到將常規(guī)抗體結(jié)構(gòu)改裝成鼠人嵌合體、完全人源抗體或從新塑造抗體的框架使其含有親本結(jié)構(gòu)的小而簡(jiǎn)單(單鏈)形式的抗原結(jié)合區(qū)(Bird等，1988；Kipriyanov等，1994；Owens等，1994；McCartney等，1995；Worn等，1998)。單鏈抗體(scfv，sfv)保留了其親本免疫球蛋白的結(jié)合特性，含有抗體VL和VH區(qū)，二者由一個(gè)人工設(shè)計(jì)的易彎曲的肽鏈相連(Wels等，1992；Kurucz等，1993)。而且，與當(dāng)前應(yīng)用在臨床和診斷中的傳統(tǒng)抗體及其Fab片斷相比，scFvs可能更優(yōu)越，因?yàn)榉肿虞^小可以使其更好地滲透到腫瘤組織中，改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性，并且與靜脈注射的鼠抗體相比具有較低的抗原性。在黑色素瘤細(xì)胞上的表達(dá)量要比正常組織高許多的為數(shù)不多的幾個(gè)靶抗原中，有一個(gè)抗原的表面區(qū)為高分子量的糖蛋白(gp240)，見于大多數(shù)黑色素瘤細(xì)胞系和新鮮腫瘤標(biāo)本中(Kantor等，1982)。兩個(gè)識(shí)別這一抗原上不同表位的鼠抗原(定名為9.2.27和ZME-018)已被分離和描述(Morgan等，1981；Wilson等，1981)。鼠單克隆抗體ZME-018具有高度的黑色素瘤特異性，與各種正常組織很少發(fā)生反應(yīng)，因而使其成為進(jìn)一步研究中頗有前景的候選者。通過檢測(cè)這個(gè)抗體靶向到黑色素瘤部位的能力發(fā)現(xiàn)該抗體能夠選擇性地濃集在轉(zhuǎn)移瘤中(Macey等，1988；Koizumi等，1988)。要成功開發(fā)腫瘤靶向性藥物部分依賴于治療藥物的位點(diǎn)特異性投送，也依賴于所投送藥物的生物學(xué)活性。單克隆抗體已被用于賦予那些無選擇性的細(xì)胞毒藥物如毒素、放射性核酸和生長(zhǎng)因子以選擇性(Williams等，1990；Rowlinson-Busza等，1992；Wahl，1994)。其中一個(gè)分子就是gelonin，它是一種29-Kda核糖體滅活植物毒素，具有與蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)相同的活性和作用機(jī)制，但是其穩(wěn)定性更高，毒性更低(Stirpe等，1992；Rosenblum等，1995)。我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究已經(jīng)鑒定和檢測(cè)了植物毒素gelonin和各種抗體之間多種化學(xué)結(jié)合物的生物學(xué)特性(Boyle等，1995；Xu等，1996；Rosenblum等，1999)。在以前的研究中，抗體ZME-018通過化學(xué)方法偶聯(lián)到純化的gelonin上，試驗(yàn)證實(shí)這個(gè)免疫結(jié)合物對(duì)組織培養(yǎng)物和人腫瘤異種移植模型中的抗原陽(yáng)性黑色素瘤細(xì)胞具有特異的細(xì)胞毒性(Rosenblum等，1991；Mujoo等，1995)。但是與普通的免疫毒素一樣，這個(gè)免疫結(jié)合物在病人體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生抗原性的問題。鑒于免疫毒素具有副作用并且在解決這些問題上取得的進(jìn)展有限，因此有必要開發(fā)出低抗原性的蛋白、多肽和肽用于治療、預(yù)防以及診斷疾病和病情。有一種關(guān)于非抗體多肽如毒素的思路是替換毒素分子上具有抗原性的序列。這一思路已被成功地用于以人免疫球蛋白框架區(qū)替代鼠免疫球蛋白框架區(qū)從而得到了一個(gè)人/鼠嵌合分子，但是這一思路在用到其他分子特別是植物來源的毒素和酶上時(shí)還沒有成功過，利用本文所描述的方法也沒有成功實(shí)現(xiàn)這一思路。發(fā)明概述本發(fā)明涉及構(gòu)建和制備蛋白化合物的方法，該蛋白化合物是經(jīng)過修飾而形成的修飾蛋白，具有許多未修飾或天然蛋白所沒有的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及用這些方法所制備的組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，重組gelonin毒素是經(jīng)過改變天然gelonin毒素序列而得到的。與天然gelonin蛋白序列相比，重組gelonin毒素具有替代或去除的氨基酸，該毒素在美國(guó)專利5,631,348號(hào)中已有描述，本文已納入作為參考，其GenBank序列號(hào)為L(zhǎng)12243。本發(fā)明的重組gelonin毒素不含有SEQIDNO1的所有氨基酸，但是在一些實(shí)施方式中含有核心毒素區(qū)，即SEQIDNO1的110-210氨基酸殘基。本發(fā)明的其他化合物包括含有SEQIDNO1的核心區(qū)及其相鄰的10，20，30，40，50，60，70，80，90，100或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的重組gelonin毒素。需要說明的是，本發(fā)明的化合物也包括那些含有SEQIDNO1的連續(xù)氨基酸殘基的多個(gè)區(qū)的化合物。例如，一個(gè)化合物可以含有SEQIDNO1的核心區(qū)和核心區(qū)前的10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基以及核心區(qū)后的20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。本發(fā)明的重組gelonin毒素也包括將天然序列截短的gelonin毒素，這種毒素至少缺少SEQIDNO1的5，10，20，30，40，50或更多個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，毒素含有核心毒素區(qū)，但是卻不含有核心區(qū)之外的任何氨基酸。除了刪除之外，本發(fā)明的重組gelonin毒素還可以含有替代去除氨基酸的氨基酸殘基。例如，gelonin蛋白序列上的第7位甘氨酸殘基可以被非甘氨酸殘基或修飾的氨基酸所替代。如果第7位的甘氨酸殘基僅僅是被去除，則SEQIDNO1上第8位的丙氨酸就變成了第7位，但是不能認(rèn)為是替代，因?yàn)榘被岬奈恢脙H僅是移動(dòng)了一個(gè)位置。需要說明的是至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100或更多個(gè)氨基酸可以被替代。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方式中，重組gelonin毒素可以連接第二個(gè)多肽。在一些例子中，這第二多肽的作用在于引導(dǎo)gelonin毒素到達(dá)特定類型的細(xì)胞(包括具有特定基因型或表型的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞或被病原體感染的細(xì)胞)、肌體的某一部位或其他特定位置。因此，本發(fā)明的蛋白化合物包括含有重組gelonin毒素如修飾gelonin毒素和第二多肽的化合物。在一些實(shí)施方式中，兩個(gè)多肽連接在一起，而在另外一些實(shí)施方式中，多肽是通過基因工程方法重組在一起形成融合蛋白。融合化合物可以通過一個(gè)接頭彼此相連。需要說明的是本發(fā)明的修飾蛋白也可以包括附加的多肽組合物，其中的全部或部分多肽彼此共價(jià)相連。本發(fā)明涉及多聚多肽組合物，其中不止一個(gè)多肽實(shí)體以單一化合物形式存在。因此，修飾蛋白可以連接第二、第三、第四、第五、第六或多個(gè)多肽。另外，兩個(gè)或多個(gè)修飾蛋白也可以單一蛋白化合物形式存在。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，第二多肽是抗體，如具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體。需要說明的是，抗體可以直接與腫瘤抗原、癌基因產(chǎn)物、細(xì)胞受體或使多聚多肽組合物局域化的任何其他化合物結(jié)合。如本文所描述的，第二多肽可以是酶、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒分子、生長(zhǎng)因子、配基或受體，或者能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的任何分子。本發(fā)明的其他組合物包括通過下述過程制備的經(jīng)修飾的酶a)利用抗體確定酶上的一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)；b)從酶上去除一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)以形成經(jīng)過修飾的酶；以及c)確定經(jīng)修飾的酶是否具有酶的活性。酶是能催化細(xì)胞內(nèi)特定化學(xué)反應(yīng)的生物學(xué)實(shí)體；可以是蛋白或核酸分子。然而需要說明的是，與酶有關(guān)的任何方法一般都適用于多肽。多肽上的抗原區(qū)是能被抗體或特定有機(jī)體的T細(xì)胞受體識(shí)別的區(qū)域。很容易理解，這個(gè)區(qū)域?qū)σ粋€(gè)物種來說具有抗原性而對(duì)另一個(gè)物種可能就不具有抗原性，因而化合物的抗原性是一種與特定有機(jī)體相關(guān)的特征。需要說明的是，除了去除抗原區(qū)的部分氨基酸外，多個(gè)抗原區(qū)的氨基酸也可以從本發(fā)明的酶上同時(shí)去除。從多肽上去除氨基酸的抗原區(qū)可以包括下列抗原區(qū)的全部或部分1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1，3，14，15，16，17，18，19，20或更多。在一些例子中，去除的抗原區(qū)可以被低抗原性序列所替代。當(dāng)然，很容易理解抗原區(qū)兩側(cè)的氨基酸也可以被去除，例如為了方便的目的。這樣，抗原區(qū)一側(cè)或兩側(cè)的2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多個(gè)氨基酸可以被去除或替代。在一些實(shí)施方式中，抗體用于鑒定抗原區(qū)。需要說明的是抗體可以是多克隆抗體?？贵w的有機(jī)體來源是同種的其他有機(jī)體，這樣修飾蛋白可能具有較弱的抗原性。因此，如果要想使酶或蛋白在人體內(nèi)的抗原性較弱，在某些實(shí)施方式中就要用人的抗體去鑒定抗原區(qū)或確定修飾蛋白的抗原性是否比未修飾蛋白(天然的或重組全長(zhǎng)蛋白)弱。在優(yōu)選實(shí)施方式中，通過比較經(jīng)過修飾的酶或蛋白與未經(jīng)修飾的酶或蛋白的抗原性來評(píng)價(jià)經(jīng)過修飾的酶或蛋白的抗原性是否減弱或降低；可以通過以下步驟完成i)在給予有機(jī)體修飾蛋白前取樣本并用該樣本去比較修飾蛋白和該蛋白的未修飾版本的抗原性；或ii)在給予有機(jī)體修飾蛋白后取樣本并用該樣本去比較修飾蛋白和該蛋白的未修飾版本的抗原性。樣本可以是含有抗體或免疫細(xì)胞的任何組合物，包括體液如血液(血清)。然后用免疫檢測(cè)方法如ELISA檢測(cè)樣本。需要說明的是，有機(jī)體可以是沒有接觸過未修飾蛋白的，盡管提供樣本的有機(jī)體以前接觸過未修飾蛋白更合適。在一些實(shí)施方式中，比較合適的是樣本取自單克隆抗體雜交瘤的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另外一些方面，可以通過分析修飾化合物的活性如酶活性來確定修飾蛋白或酶是否具有活性。根據(jù)本發(fā)明的方法，任何酶都可以修飾。這些酶可以是水解酶(如脫胺酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、核酸酶、肽酶、磷酸酶、磷酸二酯酶和蛋白酶)；異構(gòu)酶(差向異構(gòu)酶、變位酶和消旋酶)；連接酶或合成酶(乙酰輔酶A合成酶、氨基乙酰tRNA合成酶和羧化酶)；裂解酶(如醛縮酶、脫羧酶、脫水酶和核酸環(huán)化酶)；氧化還原酶(如脫氫酶、二氧合酶、氫化酶、單加氧酶、氮還原酶、葉綠醇和還原酶)；以及轉(zhuǎn)移酶(乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、糖苷轉(zhuǎn)移酶、激酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷轉(zhuǎn)移酶、磷酸化酶和磺基轉(zhuǎn)移酶)。在一些特定實(shí)施方式中，酶被歸為毒素類，這就意味著它對(duì)細(xì)胞、組織或有機(jī)體是有毒性效應(yīng)的。特別要注意的是，植物產(chǎn)生的毒素如gelonin也是本發(fā)明的一部分。如上面所討論的經(jīng)過修飾的酶，和本發(fā)明的修飾gelonin多肽一樣可以連接到另外的多肽上。很容易理解的是，與修飾gelonin有關(guān)的任何一個(gè)實(shí)施方式都適用于經(jīng)過修飾的酶，反之亦然。本發(fā)明還涉及制備具有減弱的抗原性的修飾蛋白的方法，特別是在某些與有機(jī)體有關(guān)的例子中。在某些實(shí)施方式中，該方法包括a)選擇一個(gè)準(zhǔn)備給予第一有機(jī)體的蛋白；b)利用第一有機(jī)體或與第一有機(jī)體同類的第二有機(jī)體的抗血清確定蛋白上的抗原區(qū)；c)制備所確定的抗原區(qū)缺失的修飾蛋白；以及d)確定修飾蛋白的抗原性是否減弱。正如上述所討論的，最后一步可以用樣本如血清來完成，這種樣本來自于先前曾接觸過修飾蛋白未修飾版本的個(gè)體或來自于對(duì)修飾蛋白的免疫反應(yīng)減弱的個(gè)體。需要進(jìn)一步注意的是制備修飾蛋白的方法包括篩選人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的步驟，以便找到與蛋白的抗原區(qū)同源的低抗原性區(qū)域，然后用所確定的全部或部分低抗原性區(qū)域代替抗原區(qū)從而形成修飾蛋白。檢索大型人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)不是必須的但是是所期望的。這樣，如果通過獨(dú)立檢索人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)某個(gè)特定人源蛋白具有與抗原區(qū)同源的或一致的序列，那么這個(gè)方法就包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，有人可能發(fā)現(xiàn)人源蛋白的序列與鼠源酶具有同源性并且該序列的抗原性較弱；那么本發(fā)明就涉及到用人源蛋白上的氨基酸殘基替代鼠源蛋白上的區(qū)域。本發(fā)明的方法和組合物包括替代、刪除和/或修飾多肽上的氨基酸殘基。替代的殘基應(yīng)使剩余氨基酸的順序和數(shù)目與替代前的多肽一致?？梢杂帽Ｊ氐幕蚍潜Ｊ氐臍埢鶃硖娲?。刪除一個(gè)殘基不應(yīng)改變剩余氨基酸的順序，但卻使多肽的氨基酸數(shù)目減少一個(gè)。修飾的殘基是經(jīng)過化學(xué)改變的；這種改變也不應(yīng)改變多肽上剩余氨基酸的順序和數(shù)目。在一些實(shí)施方式中，方法包括應(yīng)用重組核酸技術(shù)達(dá)到修飾蛋白或酶的目的。這樣，想要修飾的酶的cDNA需要改造從而以編碼低抗原性區(qū)的核苷酸序列替代編碼抗原區(qū)的核苷酸序列。另外，也可以通過刪除確定的抗原區(qū)的方法獲得修飾蛋白。被刪除的區(qū)域被認(rèn)為是缺失區(qū)。缺失區(qū)可能含有至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100或更多個(gè)氨基酸殘基。而且修飾蛋白可以有不止一個(gè)抗原區(qū)被刪除或替代，該區(qū)兩側(cè)的氨基酸也可以被刪除或替代。需要說明的是缺失抗原區(qū)可以用同樣數(shù)目的氨基酸殘基替代。在本發(fā)明的方法中，可以用ELISA方法確定抗原區(qū)或評(píng)價(jià)修飾蛋白。有機(jī)體可以是哺乳動(dòng)物，如人。本發(fā)明的其他一些組合物包括人源化的重組gelonin毒素，該毒素至少有3個(gè)來源于1個(gè)和多個(gè)抗原決定簇1，2，3或4的氨基酸被低抗原性的氨基酸所替代，所說的低抗原性是指與含有替代氨基酸的重組gelonin毒素相比在人體內(nèi)的抗原性較弱。gelonin毒素的抗原決定簇在其他地方已有描述。需要說明的是至少有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，75，100或更多個(gè)來源于抗原決定簇1，2，3或4的氨基酸被替代、刪除或修飾。至少2、3或4個(gè)抗原決定簇的氨基酸可以被改造。本發(fā)明的一些附加實(shí)施方式提供了一種重組gelonin毒素，該毒素的制備過程如下a)在gelonin毒素上確定至少一個(gè)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有抗原性的區(qū)域；和b)以在該哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有較低抗原性的區(qū)至少代替抗原區(qū)的一部分。需要說明的是，gelonin毒素是重組的，也就是說編碼于經(jīng)過體外改造的核苷酸序列。該過程也可以包括比較確定的抗原區(qū)與哺乳動(dòng)物氨基酸序列，從而確定一個(gè)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有較低抗原性的區(qū)。在一些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物指的是人。如上面所提及的，此處所描述的任何方法和植物都可以適用于本文描述的其他方法和組合物。本發(fā)明也涉及利用本發(fā)明的組合物進(jìn)行治療的方法。這些方法可用于治療任何以殺傷或清除某種細(xì)胞或有機(jī)體為治療方式的疾病，本發(fā)明的毒素可以對(duì)這些細(xì)胞或有機(jī)體產(chǎn)生毒性效應(yīng)。需要說明的是，與一種組合物或方法有關(guān)的實(shí)施方式也可用于本發(fā)明的其他任何組合物或方法。在一些實(shí)施方式中，提供了一種殺傷癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的方法，該方法是通過給予細(xì)胞以有效劑量的免疫毒素，其中包括gelonin毒素的全部或部分序列，如毒素的核心區(qū)，以及抗體的全部或部分序列，抗體的作用在于引導(dǎo)免疫毒素靶向到達(dá)某種特定細(xì)胞?！坝行┝俊笔侵冈搫┝孔阋赃_(dá)到預(yù)期的目的。對(duì)于殺傷癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的方法來說，有效劑量是指該劑量足以殺傷癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的其他方法包括治療腫瘤的方法，該方法是通過給予病人以有效劑量的含免疫毒素的組合物，該免疫毒素由gelonin的核心區(qū)和能特異地引導(dǎo)免疫毒素到達(dá)癌細(xì)胞的單鏈抗體組成。對(duì)于治療來說，“有效劑量”是指該劑量足以使肌體產(chǎn)生治療效果。在整個(gè)申請(qǐng)文件中，“治療效果”是指與醫(yī)學(xué)治療相關(guān)的任何改善或增強(qiáng)肌體健康狀況的表現(xiàn)。對(duì)于包括前期癌、癌癥和過度增生性疾病的癌癥患者來說(也可適用于其他疾病)，治療效果包括而不限于下列例子患者生存期的延長(zhǎng)，腫瘤發(fā)展減緩或延遲，過度增殖減弱，腫瘤生長(zhǎng)速度減緩，轉(zhuǎn)移延遲，癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞增殖速率降低，以及由于身體狀況的改善而導(dǎo)致的患者疼痛減弱。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，毒素是指gelonin。其中的一些實(shí)施方式中的免疫毒素含有SEQIDNO1的全部或部分氨基酸序列。需要說明的是，免疫毒素的氨基酸數(shù)目可以比全長(zhǎng)gelonin蛋白少幾個(gè)，盡管在一些實(shí)施方式中免疫毒素含有全長(zhǎng)序列。需要進(jìn)一步說明的是毒素可以被人源化，也可以是本文所描述的任何毒素或構(gòu)建物。在某些實(shí)施方式中，免疫毒素中的抗體部分可以是人源化的和/或單鏈抗體。在本發(fā)明的方法中，盡管抗體可能不是全長(zhǎng)序列，但是都可以引導(dǎo)免疫毒素到達(dá)靶細(xì)胞，因此使免疫毒素具有特異性的靶向作用。在一些實(shí)施方式中，抗體(包括抗體片段)可以特異地與靶細(xì)胞表面的抗原結(jié)合。在一些特定的實(shí)施方式中，抗體的靶位是腫瘤抗原?？贵w可以是任何哺乳動(dòng)物抗體，需要特別說明的是抗體也可以是小鼠、兔、大鼠、羊或猴抗體。盡管抗體來源于不同物種，但根據(jù)本發(fā)明的方法或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的其他方法可以將其人源化。在抗體為單鏈抗體的情況下，抗體可以是9.2.27或ZME-018，這些是針對(duì)黑色素瘤的抗體。在一些特定的實(shí)施例中，免疫毒素是本文所描述的scfvMEL-2018或scfvMEL-2025(SEQIDNO11)。能作為靶向性治療靶位的癌細(xì)胞可以來自于下列組織前列腺、肺、腦、皮膚、肝、乳腺、淋巴結(jié)、胃、睪丸、卵巢、胰腺、骨、骨髓、頭頸、頸、食管、眼、膽囊、腎、腎上腺、心、結(jié)腸、或血液。另外，腫瘤病人可以患有上述器官/組織的一種癌。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，癌細(xì)胞指黑色素瘤細(xì)胞。需要說明的是癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞可以在病人體內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，給予病人有效劑量的治療組合物是指該劑量足以達(dá)到預(yù)期的目的，如治療。例如對(duì)于癌癥來說，預(yù)期效果可以指殺傷癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。免疫毒素可以包含在藥學(xué)上可接受的組合物內(nèi)。作為治療方案的一部分，病人也可以接受其他抗腫瘤治療，如化療、放療、基因治療、手術(shù)、或其他免疫治療。在一些特定實(shí)施方式中，需要說明的是免疫毒素的給藥可以通過給予細(xì)胞或病人含有編碼免疫毒素的核酸序列并能表達(dá)免疫毒素的表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體是病毒載體，包括而不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、肝炎病毒、皰疹病毒、豆?fàn)詈瞬《?、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或牛痘病毒。權(quán)利要求和/或某些特定場(chǎng)合中，數(shù)詞“一個(gè)”在和術(shù)語“含有”聯(lián)用時(shí)可以表示“一個(gè)”，但也可以表示“一個(gè)或多個(gè)”，“至少一個(gè)”，以及“一個(gè)或不止一個(gè)”。本發(fā)明的其他客體、特色和優(yōu)勢(shì)將在下面的詳細(xì)描述中加以闡明。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是詳細(xì)描述和特定實(shí)施例在說明本發(fā)明的特定實(shí)施方式時(shí)僅僅是以說明的方式闡明的，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)根據(jù)這些詳細(xì)描述就很容易地理解對(duì)本發(fā)明作出的各種變化和修正。附圖簡(jiǎn)介下面的附圖是說明書的一部分，用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個(gè)或多個(gè)附圖并結(jié)合此處對(duì)特定實(shí)施方式的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1.ELISA分析人血清標(biāo)本中的抗-rGelonin抗體。圖2.人抗-gelonin抗體識(shí)別的rGelonin上的表位。圖3A-3B.Gelonin缺失構(gòu)建物。顯示的是Gelonin缺失構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)。圖4.PCR方法構(gòu)建的sfvMEL/rGel融合毒素并連接到pET-32a來源載體上的示意圖。圖5.sfvMEL/rGel融合蛋白構(gòu)建物的全部DNA序列分析。圖6.親本ZME-rGel化學(xué)結(jié)合物和sfvMEL/rGel融合蛋白構(gòu)建物(即sfvMEL/rGel)結(jié)合能力比較。用ELISA和抗-gelonin多克隆兔抗體分析與A-375細(xì)胞的結(jié)合。兩個(gè)構(gòu)建物與靶細(xì)胞的結(jié)合相同，盡管重組融合構(gòu)建物的結(jié)合稍微高一點(diǎn)。圖7.親本ZME-rGel化學(xué)結(jié)合物和sfvMEL/rGel融合蛋白構(gòu)建物對(duì)抗原陽(yáng)性A375人黑色素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性比較。細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，然后用不同劑量的sfvMEL/rGel融合蛋白構(gòu)建物、ZME-rGel化學(xué)結(jié)合物處理72小時(shí)，以不加重組gelonin的為對(duì)照。兩個(gè)免疫結(jié)合物的IC50大約為8nM，而重組gelonin的IC50要高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，大約為2×103nM。圖8.ZME抗體對(duì)sfvMEL/rGel免疫毒素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。不同濃度的重組免疫毒素加到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375人黑色素瘤細(xì)胞中，設(shè)4復(fù)孔。在培養(yǎng)板的其他列孔中加入固定濃度的ZME抗體(50μg/ml)和不同劑量的sfvMEL/rGel免疫毒素，孵育72小時(shí)。游離ZME抗體的加入可以使免疫毒素的細(xì)胞毒性下降約3倍。圖9.在裸鼠右腹部接種黑色素瘤，腫瘤長(zhǎng)大后用鹽水(對(duì)照)或sfvMEL/rGel(2mg/kg或20mg/kg，總劑量)連續(xù)處理(靜脈注射)4天(箭頭所指)。測(cè)量腫瘤體積30天。在此期間，對(duì)照的鹽水處理組腫瘤從30mm2增加到150mm2。低劑量免疫毒素處理組腫瘤從30mm2增加到60mm2。高劑量免疫毒素處理組腫瘤大小無明顯變化，保持原來的30mm2。圖10。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)比較scfvMEL-CFR2018(也叫sfvMEL-CFR2018)和scfvMEL-CFR2025對(duì)A375-M黑色素瘤的細(xì)胞毒性。說明性實(shí)施方式的描述低抗原性蛋白和多肽作為組合物給予有免疫系統(tǒng)的有機(jī)體時(shí)具有巨大的優(yōu)勢(shì)。本文描述了涉及和制備這種蛋白和多肽的方法，蛋白和多肽是這些方法的結(jié)果分子。對(duì)于這些方法來說酶是特別讓人感興趣的候選者，因?yàn)槊赣型诒３制涿富钚缘耐瑫r(shí)降低其在受試者內(nèi)的抗原性，這些受試者因而還能享受這些蛋白酶活性的益處。因此在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中提供了核酸和多肽組合物，其中包含植物毒素，如gelonin。蛋白可以設(shè)計(jì)成在提供一種多肽的毒性功能的同時(shí)與另一種多肽相結(jié)合，如靶向分子。這些人工毒素具有廣泛的應(yīng)用。I.蛋白化合物在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有蛋白分子的新型組合物，該蛋白分子是通過將天然或野生型蛋白修飾而得到的。在一些實(shí)施方式中，蛋白化合物的某些氨基酸缺失；在另外的實(shí)施方式中，蛋白分子的氨基酸殘基被替代，同時(shí)還有一些實(shí)施方式的蛋白化合物氨基酸的缺失和替代同時(shí)存在。而且蛋白化合物所包含的氨基酸分子可以來源于不同的多肽實(shí)體。在本文中，“蛋白分子”、“蛋白組合物”、“蛋白化合物”、“蛋白鏈”或“蛋白材料”通常是指但不限于大于約200個(gè)氨基酸的蛋白，或者從一個(gè)基因翻譯出的全長(zhǎng)內(nèi)源序列；大于約100個(gè)氨基酸的多肽；和/或3-100氨基酸的肽。上述所有的“蛋白”術(shù)語在此處可以交換使用。而且，這些術(shù)語也可以用于融合蛋白或蛋白結(jié)合物。在某些實(shí)施方式中一個(gè)蛋白分子的大小含有而不限于至少約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，275，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1750，2000，2250，2500或更多個(gè)氨基酸殘基，以及在此范圍內(nèi)的任何數(shù)目。本發(fā)明的化合物可以包括含有上述數(shù)目的來自于SEQIDNO1和/或SEQIDNO11的連續(xù)氨基酸殘基。需要說明的是有關(guān)SEQIDNO1的實(shí)施方式也適用于有關(guān)本文描述的其他任何氨基酸序列的實(shí)施方式，包括SEQIDNO11，如果合適，反之亦然。相應(yīng)的，術(shù)語“蛋白組合物”包含氨基分子序列，該序列至少含有天然合成蛋白中20種普通氨基酸的一個(gè)，或者至少一個(gè)修飾的或不常見氨基酸，這些氨基酸包括在而不限于下面表1A中所列出的。此處所用的“氨基分子”是指氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物，這些都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在某些實(shí)施方式中，蛋白分子的殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基分子打斷氨基分子序列。而在另外一些實(shí)施方式中，序列可以含有一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分。在某些特別的實(shí)施方式中，蛋白分子的殘基序列可以被一個(gè)或多個(gè)非氨基分子打斷。1.功能方面本發(fā)明涉及修飾蛋白，特別是那些對(duì)受試者有治療價(jià)值的修飾蛋白，因?yàn)檫@些修飾蛋白具有與未修飾蛋白相似的功能活性，并且修飾蛋白比未修飾蛋白具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如抗原性較弱和/或引起的副作用較少，和/或具有更好的或更持久的療效。因此，本申請(qǐng)?jiān)谔峒靶揎椀鞍椎墓δ芑蚧钚詴r(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解其中包括一種蛋白，該蛋白1)具有和未修飾蛋白相同的活性或特異性，但也可能具有不同的活性水平；以及2)比未修飾蛋白具有更多的優(yōu)點(diǎn)?；钚缘拇_定可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，特別是與蛋白活性有關(guān)的方法，以及為了比較的目的可以包括使用修飾蛋白和未修飾蛋白的天然和/或重組版本。2.修飾蛋白本發(fā)明的修飾蛋白可以有氨基酸的缺失和/或取代；因此，具有缺失氨基酸的蛋白、具有替代氨基酸的蛋白以及同時(shí)具有缺失和替代氨基酸的蛋白豆是修飾蛋白。在一些實(shí)施方式中，這些修飾蛋白還可以含有插入的或添加的氨基酸，例如形成融合蛋白或含有接頭的蛋白?！叭笔揎椀鞍住比鄙僖粋€(gè)或多個(gè)天然蛋白的氨基酸殘基，但是仍具有天然蛋白的特異性和/或活性?！叭笔揎椀鞍住币部梢跃哂袦p弱的免疫原性或抗原性。缺失修飾蛋白的一個(gè)例子是至少一個(gè)抗原區(qū)缺失了一個(gè)氨基酸的蛋白，所謂的抗原區(qū)是指蛋白上的一個(gè)區(qū)，該區(qū)可以決定該蛋白在某個(gè)特定有機(jī)體中的抗原性，這樣就可以確定修飾蛋白所要給予的有機(jī)體種類。替代或替換突變體一般都會(huì)在一個(gè)或多個(gè)蛋白位點(diǎn)上有一個(gè)氨基酸被另一種氨基酸所代替，并且可以通過設(shè)計(jì)而改變多肽的一種或多種特性，特別是降低其免疫原性/抗原性、減輕其在受試者內(nèi)的副作用、或者增強(qiáng)其療效。這種替代優(yōu)選保守方式，即用具有同樣形狀和電荷的氨基酸來替代。保守替代是本領(lǐng)域所熟知的，例如以下替代丙氨酸到絲氨酸；精氨酸到賴氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到絲氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；組氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸到亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸到異亮氨酸或纈氨酸；賴氨酸到精氨酸；蛋氨酸到異亮氨酸或亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；絲氨酸到蘇氨酸；蘇氨酸到絲氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及纈氨酸到異亮氨酸或亮氨酸。多肽的一個(gè)抗原區(qū)可以被一個(gè)低抗原性區(qū)所替代；低抗原性區(qū)可以含有天然蛋白一樣的相應(yīng)殘基，也可以有某些保守替代和/或非保守替代。除了刪除或替代，修飾蛋白還可以還有插入的殘基，一般為在多肽上添加至少一個(gè)殘基，其中包括靶向肽的插入、多肽的插入，或者僅僅是單個(gè)殘基的插入。下面要討論的末端添加就是所謂的融合蛋白。術(shù)語“生物學(xué)功能等效”在本領(lǐng)域已是熟知的概念，在本文中對(duì)它進(jìn)一步詳細(xì)定義。據(jù)此，如果一個(gè)序列與其天然多肽相比具有約70％到80％、或者約81％到90％、甚至約91％到99％的氨基酸都是一樣的、假如蛋白的生物活性得以保持，那么我們就認(rèn)為修飾蛋白的生物學(xué)功能與其天然蛋白是等效的。同樣可以理解的是氨基酸序列和核酸序列也可以含有添加的殘基，如添加N端或C端氨基酸，或者5’或3’堿基，如上所述在本文描述的一個(gè)序列中也是基本的，只要該序列符合前面提到的標(biāo)準(zhǔn)，包括其表達(dá)的蛋白能保持生物學(xué)活性。序列末端添加特別適于核酸序列，例如可以在編碼區(qū)的5’或3’端兩側(cè)添加各種非編碼序列，或者添加各種內(nèi)部序列，即內(nèi)含子，這在基因內(nèi)部常常出現(xiàn)。下面的討論基于蛋白上氨基酸的變化制備一個(gè)等效的，甚至是有所改善的次生分子。例如，蛋白結(jié)構(gòu)上的某些氨基酸可以被其他氨基酸替代而不會(huì)造成某些結(jié)構(gòu)如結(jié)合位點(diǎn)與底物分子結(jié)合能力的明顯丟失。由于一個(gè)蛋白的結(jié)合能力和性質(zhì)決定了其生物學(xué)功能活性，因此蛋白序列上的某些氨基酸可以被替代，或者改變其DNA的編碼序列，從而制備出一個(gè)具有相同性質(zhì)的蛋白。發(fā)明人需要認(rèn)真考慮如何在一個(gè)基因的DNA序列上引入各種變化而不導(dǎo)致其生物利用度或活性的明顯丟失，就象下面所討論的。表1顯示的是編碼特定氨基酸的密碼子。一個(gè)蛋白分子如果符合下列標(biāo)準(zhǔn)則與第二個(gè)分子有同源性或被認(rèn)為是同源的1)在同一位置上至少有30％的蛋白分子序列與次生分子一致；2)在同一位置上有一些序列與次生分子一致，并且非一致的殘基至少有30％是本文所描述的保守替代；或者3)至少有30％的蛋白分子序列與次生分子一致，但是可能有一些非一致殘基散布在一致殘基之間。本文所用到的術(shù)語“同源的”也適用于蛋白分子的一個(gè)區(qū)，而不僅僅是整個(gè)分子。如果“同源性”或“同源的”以定量方式來表示，如“50％同源性”或“50％是同源的”，則對(duì)于上面的同源性標(biāo)準(zhǔn)1)、2)、3)來說，應(yīng)從30％調(diào)整到50％。這樣，需要說明的是兩個(gè)蛋白分子或蛋白分子上的區(qū)之間可能至少具有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。在進(jìn)行這些改變時(shí)，氨基酸的親水指數(shù)是需要考慮的因素。氨基酸的親水指數(shù)對(duì)于一個(gè)蛋白內(nèi)在生物活性的重要性在本領(lǐng)域是不言而喻的(Kyte和Doolittle，1982)。氨基酸的相對(duì)親水特征影響結(jié)果蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)又決定了蛋白與其他分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物質(zhì)的相互作用。同樣在本領(lǐng)域很容易理解的是根據(jù)親水性可以更好地選擇類似氨基酸的替代。美國(guó)專利4,554,101號(hào)中提到一個(gè)蛋白的最大局部平均親水性是由其鄰近的氨基酸所決定的，并且與蛋白的生物學(xué)特性密切相關(guān)。如美國(guó)專利4,554,101號(hào)所描述的，下面是不同氨基酸殘基的親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+3.0)；天冬酰胺(+0.2)；谷胺酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。很容易理解當(dāng)一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有相同親水性值的氨基酸替代時(shí)就能夠產(chǎn)生一種生物學(xué)等效和免疫學(xué)等效的蛋白。在這些變化中，氨基酸的替代較佳的是親水性值差別在±2內(nèi)的，更佳的是在±1內(nèi)的，最佳的是在±0.5內(nèi)的。正如上面所列出的，氨基酸的替代一般是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)一致性，如親脂性、親水性、電荷、大小等。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都知道典型的替代應(yīng)該考慮上述各種因素，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。表2列出了一系列可用本發(fā)明的方法進(jìn)行修飾的蛋白和多肽。在用本發(fā)明的方法降低非人源多肽在人體內(nèi)的抗原性時(shí)需要特別注意。需要說明的是具有治療價(jià)值的非人源多肽也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。說明書中討論的任何其他蛋白或多肽也可以通過本發(fā)明的方法進(jìn)行修飾。表2按照本發(fā)明的方法制備修飾蛋白的另一個(gè)實(shí)施方式是利用肽模擬物。模擬物是含肽分子，模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件。見Johnson(1993)。利用肽模擬物的內(nèi)在原理在于蛋白質(zhì)存在一個(gè)肽主鏈，由它決定氨基酸側(cè)鏈的走向，以此來促進(jìn)分子之間的相互作用，如抗原和抗體之間的相互作用。模擬肽應(yīng)該與天然分子具有相同的分子間相互作用特性。這些原則與上面提到的其他原則一起被用于設(shè)計(jì)次生修飾蛋白分子，這些修飾蛋白與天然蛋白具有相同天然特性，但在某些情況下，甚至具有更優(yōu)越的特性。3.多聚多肽化合物本發(fā)明涉及的蛋白化合物可以含有來自多個(gè)多肽的氨基酸序列。例如，蛋白化合物或蛋白分子可能含有一個(gè)修飾毒素加上一個(gè)抗體的抗原結(jié)合區(qū)。多聚多肽蛋白分子也可能是兩個(gè)或多個(gè)蛋白化學(xué)結(jié)合而形成的，或者是由同一核酸分子編碼的兩個(gè)或多個(gè)多肽形成的融合蛋白。含有一個(gè)毒素分子和一個(gè)有活性的第二多肽的融合蛋白或結(jié)合蛋白被稱為“雙毒素”。因此，多聚多肽蛋白分子可以由第一多肽的全部或部分序列加上第二多肽、第三多肽、第四多肽、第五多肽、第六多肽、第七多肽、第八多肽、第九多肽、第十多肽、或更多多肽的全部或部分序列組成。一般來說，人工毒素本身沒有能力結(jié)合到細(xì)胞表面或進(jìn)入特定細(xì)胞內(nèi)。因此，這些藥物需要與其他藥物/蛋白化學(xué)結(jié)合或融合，這些藥物/蛋白能夠與特定靶細(xì)胞結(jié)合并且一旦結(jié)合就可以有效內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)。表3提供了一系列可與本發(fā)明的毒素結(jié)合或融合的蛋白和多肽。特別是在某些實(shí)施方式中包括引導(dǎo)人工蛋白化合物到達(dá)特定位置如特定類型的細(xì)胞或肌體的特定部位。本發(fā)明還包括將毒素分子的全部或部分序列連接到表2列出的任何一種蛋白的全部或部分序列上。需要說明的是本發(fā)明包括而不限于表2和表3列出的例子。表3a.融合蛋白一種特殊類型的插入突變體是融合蛋白。這種分子一般具有天然分子的全部或?qū)嶓w序列區(qū)，在其N端或C端連接第二多肽的全部或部分序列。例如，典型的融合蛋白是利用一個(gè)其他物種的引導(dǎo)序列使蛋白在異源宿主內(nèi)得以重組表達(dá)。另外一種有用的融合是加上一個(gè)免疫活性區(qū)，如抗體表位或其他尾巴，從而促進(jìn)融合蛋白的靶向作用或有利于其純化。使用6xHis和GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)作為尾巴是大家所熟知的。在融合蛋白連接處含有一個(gè)剪切位點(diǎn)可以使我們?cè)诩兓蠛苋菀椎厝サ敉庠炊嚯?。其他有用的融合包括連接一個(gè)功能區(qū)，如酶的活性位點(diǎn)，糖基化區(qū)，細(xì)胞靶向信號(hào)或跨膜區(qū)。免疫毒素是本發(fā)明需要特別說明的一個(gè)實(shí)施方式。免疫毒素是一種細(xì)胞毒化合物，至少由抗體的一部分和毒素分子的一部分組成?？贵w和毒素可以互相融合或結(jié)合。關(guān)于免疫毒素的更詳細(xì)描述見下文。b.結(jié)合蛋白本發(fā)明還涉及結(jié)合多肽，如通常為單克隆類型的翻譯蛋白、多肽或肽，至少連接一種藥物而形成抗體結(jié)合物。為了增強(qiáng)抗體作為診斷和治療藥物的效果，通常連接或共價(jià)結(jié)合或復(fù)合至少一種期望的分子或部分序列。這種分子或序列可以是，但不限于，至少一種效應(yīng)分子或報(bào)告分子。效應(yīng)分子包括具有期望活性即細(xì)胞毒活性的分子。連接到抗體上的效應(yīng)分子包括而不限于毒素、抗腫瘤藥、治療酶、放射性標(biāo)記核酸、抗病毒藥、鰲合劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和寡核苷酸或多聚核苷酸。與此相對(duì)應(yīng)的是，報(bào)告分子可以是能用分析方法檢測(cè)到的任何序列。連接到抗體上的報(bào)告分子包括而不限于酶、放射性標(biāo)記物、半抗原、熒光標(biāo)記物、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子、發(fā)色團(tuán)、發(fā)冷光分子、光親和分子、有色粒子或配基如生物素。任何具有足夠選擇性、特異性或親和性的抗體都可以作為抗體結(jié)合物的基礎(chǔ)。這些特性可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的傳統(tǒng)免疫分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。除了標(biāo)準(zhǔn)的抗原結(jié)合位點(diǎn)外，抗體上可與生物活性分子結(jié)合的位點(diǎn)包括位于各種能與病原體、B細(xì)胞超抗原、T細(xì)胞輔助受體CD4和HIV-1包膜蛋白結(jié)合的各種區(qū)域結(jié)合的位點(diǎn)(Sasso等，1989；Shorki等，1991；Silverman等，1995；Cleary等，1994；Lenert等，1990；Berberian等1993；Kreier等，1991)。另外還包括抗體自身結(jié)合(Kang等，1988)以及含有能被抗抗體識(shí)別的表位(獨(dú)特型表位)的各種區(qū)域?？贵w結(jié)合物的某些特定例子是那些含有連接一種可檢測(cè)標(biāo)記物的抗體的結(jié)合物。“可檢測(cè)標(biāo)記物”是一些化合物和/或元件，這些化合物和/或元件由于其特殊的功能特性和/或化學(xué)特征可以被檢測(cè)到，利用這些標(biāo)記物可以檢測(cè)到連接其上的抗體，和/或容易被純化。另外的例子是一些由抗體和連接其上的細(xì)胞毒或抗細(xì)胞藥物組成的結(jié)合物，被稱為“免疫毒素”?？贵w結(jié)合物可以作為診斷試劑使用。抗體診斷試劑一般分為兩類，體外診斷用的如用于各種免疫分析的試劑，和/或體內(nèi)診斷用的試劑，一般稱作“抗體示蹤造影”。許多適宜的造影劑都是本領(lǐng)域所熟知的，其連接到抗體上的方法也是本領(lǐng)域所熟悉的(見美國(guó)專利5,021,236；4,938,948；和4,472,509號(hào)，本文已納入作為參考)。通常所用的顯影物質(zhì)為常磁性離子、放射性同位素、熒光色素、核磁共振可檢測(cè)物質(zhì)、X射線造影劑。對(duì)于常磁性離子來說，以舉例說明的方式列舉如下鉻(III)、鎂(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和/或鉺(III)，其中優(yōu)選釓。在其他地方如X射線造影中所用的離子包括而不限于鑭(III)、金(III)、鉛(III)，特別是鉍(III)。用于治療和/或診斷的放射性同位素包括砹211、14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、67銅、152銪、67鎵、3氫、碘123、碘125、碘131、銦111、59鐵、32磷、錸186、錸188、75硒、35硫、technicium99m和/或釔90。在某些實(shí)施方式中，123I是優(yōu)選的，technicium99m和/或銦111也常常被選用，因?yàn)樗鼈兙哂休^低的能量和較寬的檢測(cè)范圍。本發(fā)明所色機(jī)的放射性標(biāo)記的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域所熟知的制備。例如，通過與碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑如次氯酸鈉或酶解氧化劑如乳過氧化物酶反應(yīng)可以使單克隆抗體被碘化。本發(fā)明的單克隆抗體可以通過配基交換過程標(biāo)記上锝99m，例如用二價(jià)錫溶液降解pertechnate，然后將降解的锝鰲合到葡聚糖凝膠柱上并將抗體加入到柱子中。另外也可以用直接標(biāo)記技術(shù)，即通過將pertechnate、降解劑乳SNCl2、緩沖液如苯二甲酸鈉-鎂溶液合抗體一起孵育。中介功能基團(tuán)常被用作將以金屬離子形式存在的放射性同位素結(jié)合到抗體上，這些基團(tuán)是二乙撐三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。能夠用作結(jié)合物的熒光標(biāo)記物包括Alexa350，Alexa430，AMCA，BODIPY630/650，BODIPY650/665，BODIPY-FL，BODIPY-R6G，BODIPY-TMR，BODIPY-TRX，CascadeBlue，Cy3，Cy5，6-FAM，F(xiàn)ITC，HEX，6-JOE，OregonGreen488，OregonGreen500，OregonGreen514，PacificBlue，REG，RhodamineRed，Renographin，ROX，TEMRA，Tetramethylrhodamine和/或TexasRed。在本發(fā)明中說明的另一類抗體結(jié)合物是那些最初打算用于體外的，其中抗體連接到一個(gè)第二結(jié)合配基和/或一個(gè)酶(酶標(biāo)記物)上，當(dāng)酶與生色底物反應(yīng)時(shí)可以產(chǎn)生有色的產(chǎn)物。適于作為連接物的酶包括尿素酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化物酶、或葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的第二結(jié)合配基是生物素和/或親和素以及鏈親和素。這些標(biāo)記物的應(yīng)用都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如在美國(guó)專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241號(hào)中有描述；本文已納入作為參考。另外一種已知的將分子以位點(diǎn)特異性的方式連接到抗體上的方法包括抗體與以半抗原為基礎(chǔ)的親和標(biāo)記物反應(yīng)。以半抗原為基礎(chǔ)的親和標(biāo)記物主要是和抗原結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸反應(yīng)，因而會(huì)破壞這個(gè)位點(diǎn)，封閉特異性抗原反應(yīng)。然而，這可能是一個(gè)缺點(diǎn)因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致抗體結(jié)合物無法與抗原結(jié)合。含有疊氮基團(tuán)的分子也可用于和蛋白形成共價(jià)鍵，該反應(yīng)是通過低強(qiáng)度紫外線照射而產(chǎn)生的活性氮中間物來完成的(Potter和Haley，1983)。特別是嘌呤核苷酸的2-和8-疊氮類似物已被作為發(fā)光探針用于鑒別細(xì)胞粗提物中的核苷酸結(jié)合蛋白(Owens和Haley，1987；Atherton等，1985)。2-和8-疊氮核苷酸也被用于尋找純化蛋白上的核苷酸結(jié)合區(qū)(Khatoon等，1989；和Dholakia等，1989)以及用作抗體結(jié)合劑。本領(lǐng)域中有幾種熟知的方法可用于將抗體黏附或結(jié)合到其結(jié)合物上。其中有些方法是利用含有附著在抗體上的有機(jī)鰲合劑如乙撐三胺五乙酸(DTPA)；乙烯三氨四乙酸(ethylenetriaminetetriaceticacid)；N-鹵代-對(duì)-甲苯磺酰胺和/或tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3的金屬鰲合復(fù)合物(美國(guó)專利4,472,509和4,938,948號(hào)，本文已納入作為參考)。在偶聯(lián)劑如戊二醛或高碘酸鹽存在的條件下單克隆抗體也可以和酶反應(yīng)。在這些偶聯(lián)劑存在的條件下或通過與異硫氰酸鹽反應(yīng)可以制備含有熒光標(biāo)記的結(jié)合物。在美國(guó)專利4,938,948號(hào)中，用單克隆抗體和可檢測(cè)造影物可以使乳腺癌顯影，可檢測(cè)造影物是通過接頭如甲基-對(duì)-氫苯甲亞胺鹽或N-琥珀酰亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸鹽結(jié)合到抗體上的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了免疫球蛋白的衍生物，該衍生物是通過在免疫球蛋白的Fc段引入巰基而生成的，所使用的反應(yīng)條件不會(huì)改變抗體的結(jié)合位點(diǎn)。用上述方法制備的抗體結(jié)合物具有更長(zhǎng)的壽命，更高的特異性和敏感性(美國(guó)專利5,196,066號(hào)，本文已納入作為參考)。在一篇文獻(xiàn)中也報(bào)道了效應(yīng)分子或報(bào)告分子的位點(diǎn)特異性連接方法，該方法是把報(bào)告分子或效應(yīng)分子連接到Fc段的碳水化合物殘基上(O’Shannessy等，1987)。已有報(bào)道用該方法制備出頗具前景的診斷和治療抗體，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。i.接頭/偶聯(lián)劑多肽可以通過一個(gè)生物可釋放鍵如一個(gè)可選擇性裂解的接頭或氨基酸序列與免疫毒素結(jié)合。例如，可以考慮選擇一個(gè)帶有裂解位點(diǎn)的肽接頭，該位點(diǎn)可以被腫瘤內(nèi)的或在腫瘤內(nèi)活化的酶裂解。這種肽接頭的例子包括可以被尿激酶、纖溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶如膠原酶、明膠酶或基質(zhì)降解酶裂解的接頭。另外，肽或多肽也可以結(jié)合在佐劑上。氨基酸如可選擇性裂解接頭、合成接頭，或其他氨基酸序列可用于把蛋白序列切開。另外，已知許多含二硫鍵的接頭也被成功用于將毒素結(jié)合到靶向性藥物上，其中有些接頭要比其他接頭優(yōu)越，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌幚韺W(xué)特征和性能。例如，含有空間隱藏的二硫鍵的接頭是較佳的，因?yàn)槠湓隗w內(nèi)具有更好的穩(wěn)定性。而且，通過使用任一毒素序列，包括gelonin和去糖基化的蓖麻蛋白A鏈，就可以使本發(fā)明的某些優(yōu)勢(shì)得以實(shí)現(xiàn)。作為一個(gè)一般的指導(dǎo)原則，任何適于免疫毒素的生化交聯(lián)子也可以被應(yīng)用于本發(fā)明中，其他的一些接頭也可以考慮。交聯(lián)子可用于形成分子橋而將兩個(gè)不同分子的功能基團(tuán)連接到一起，如穩(wěn)定劑和凝固劑。為了以step-wise方式將兩個(gè)不同的蛋白連接起來，可以使用異源雙功能交聯(lián)子將不想要的同聚物去除。需要說明的是，交聯(lián)子也可用于本發(fā)明的修飾蛋白分子。雙功能交聯(lián)劑已被廣泛用于各種目的，包括親和基質(zhì)的制備，分散結(jié)構(gòu)的修飾與穩(wěn)定，結(jié)合位點(diǎn)的鑒別以及結(jié)構(gòu)研究。在本發(fā)明中，這種交聯(lián)子也可以被用以穩(wěn)定多肽或通過提高修飾蛋白的靶向能力或整體效力而使其具有更高的治療價(jià)值。交聯(lián)子也可以被裂解，如含二硫鍵的酸敏感交聯(lián)子或其他交聯(lián)子。帶有兩個(gè)一樣功能基團(tuán)的同源雙功能分子被證明可以更有效地誘導(dǎo)同樣的兩個(gè)大分子和不同的大分子之間、或大分子的亞單位之間，以及多肽與其結(jié)合物上的特異性結(jié)合位點(diǎn)的交聯(lián)。異源雙功能分子含有兩個(gè)不同的功能基團(tuán)。利用兩個(gè)不同功能基團(tuán)的不同活性，對(duì)交聯(lián)的控制更具有選擇性和順序性。根據(jù)雙功能交聯(lián)劑功能基團(tuán)的特異性可以分為氨基、巰基、guanidino、吲哚基、羧基特異性基團(tuán)。在這些交聯(lián)劑中，針對(duì)自由氨基的交聯(lián)劑應(yīng)用特別廣泛，因?yàn)樗鼈兘?jīng)濟(jì)、易于合成、使用的反應(yīng)條件較溫和。大多數(shù)異源雙功能交聯(lián)劑含有初級(jí)氨基反應(yīng)性基團(tuán)和巰醇反應(yīng)性基團(tuán)。配基與脂質(zhì)體交聯(lián)方法的例子在美國(guó)專利5,603,872和5,401,511號(hào)中已有描述，本文已完整地納入作為參考。各種配基都可以通過氨基交聯(lián)共價(jià)結(jié)合到脂質(zhì)體表面。脂質(zhì)體，特別是含有磷脂酰乙醇胺(PE)的多層小囊(MLV)或單層小囊如微乳化脂質(zhì)體(MEL)和大單層小囊(LUVET)都可以通過已有的方法制備。脂質(zhì)體中的PE提供了一個(gè)位于脂質(zhì)體表面的用作交聯(lián)的活性功能殘基—初級(jí)氨基。配基如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)已被成功地連接到PE-脂質(zhì)體上。配基共價(jià)結(jié)合到脂質(zhì)體表面離散的位點(diǎn)上。這些位點(diǎn)在脂質(zhì)體表面的數(shù)量和密度是由脂質(zhì)體的形態(tài)和類型所決定的。脂質(zhì)體表面也可能含有非共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。為了形成配基與脂質(zhì)體的共價(jià)結(jié)合，交聯(lián)劑的效率和生物相容性已被廣泛研究。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧己烷(OXR)，乙烯甘油二環(huán)氧丙醚(EGDE)和水溶性碳化二亞胺，優(yōu)選1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)。利用交聯(lián)合成化學(xué)，可識(shí)別物質(zhì)的氨基與脂質(zhì)體的交聯(lián)得以完成。在另外一個(gè)實(shí)施例中描述了異源雙功能交聯(lián)劑及其使用方法(美國(guó)專利5,889,155號(hào)，本文已完整納入作為參考)。交聯(lián)劑將親核的酰肼基與親電子的馬來酰亞胺結(jié)合，使一個(gè)醛基與自由的巰醇耦合。交聯(lián)劑可以被修飾以交聯(lián)各種功能基團(tuán)，因而可用于交聯(lián)多肽和糖。表3列出了可用于本發(fā)明的某些異源雙功能交聯(lián)劑。有些特別的多肽如gelonin在其天然序列中不含有能被給定交聯(lián)劑修飾的殘基，這樣就需要在其一級(jí)序列中引入保守的天然或合成氨基酸改變。4.蛋白質(zhì)純化本發(fā)明除了在某些實(shí)施方式中涉及重組蛋白外，還涉及純化蛋白的方法和過程，包括修飾蛋白和重組蛋白。一般來說，這些技術(shù)包括在同一水平上的細(xì)胞內(nèi)多肽和非多肽成分的粗分離。從其他蛋白中分離出多肽后，目的多肽可以通過色譜和電泳技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的純化以達(dá)到部分或完全純化的目的(或純化為均一物)。特別適宜制備的純化肽的分析方法是離子交換層析、排阻層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳；等電聚焦電泳。一種特別有效的肽純化方法是快速蛋白液相色譜或高壓液相色譜(HPLC)。另外，這些技術(shù)所使用的條件可以根據(jù)所純化分子的特征如功能活性加以改變。本發(fā)明的某些方面涉及編碼蛋白或肽的純化，在某些特定實(shí)施方式中涉及編碼蛋白或肽的實(shí)質(zhì)純化。本文所用的術(shù)語“純化蛋白或純化肽”通常是指可從其他組分中分離出的組合物，其中蛋白或肽根據(jù)其天然獲得狀態(tài)可以被純化到任何程度。因而純化蛋白或純化肽也指從天然產(chǎn)生的環(huán)境中分離出的蛋白或肽。“實(shí)質(zhì)純化”的蛋白或肽。一般來說，“純化的”是指蛋白或肽組合物已經(jīng)過分離去除了各種其他組分，但組合物還實(shí)質(zhì)性地保留了其表達(dá)的生物學(xué)活性。本文所用的術(shù)語“實(shí)質(zhì)純化”是指一個(gè)組合物中蛋白或肽是其主要組分，如蛋白或肽占組合物的約50％、約60％、70％、約80％、90％、約95％、96％、約97％、98％、約99％、99.2％、約99.4％、99.6％、約99.8％、99.9％或更高。按照本發(fā)明所描述的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易地掌握測(cè)定蛋白或肽純化程度的各種方法。例如，這些方法包括確定活性組分的特異性活性，或用SDS/PAGE檢測(cè)一個(gè)分離物中的蛋白量。評(píng)價(jià)一個(gè)分離物純度的優(yōu)選方法是比較一個(gè)分離物和其初提物的特異活性從而計(jì)算出純化的程度，本文中用“純化倍數(shù)”來表示。當(dāng)然，用來表示活性的實(shí)際單位依賴于純化后所用的特定分析方法以及表達(dá)的蛋白或肽是否還有可檢測(cè)的活性。適用于蛋白純化的各種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。其中包括以硫酸胺、PEG、抗體或類似物質(zhì)進(jìn)行沉淀，或者熱變性后離心；層析技術(shù)如離子交換層析、凝膠過濾、反相層析、羥磷灰石層析及親和層析；等電聚焦電泳；凝膠電泳；以及上述技術(shù)和其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，各種純化步驟的使用順序可以調(diào)整，某些步驟也可以省略，最終找到一個(gè)合適的方法制備實(shí)質(zhì)純化的蛋白或肽。沒有一個(gè)統(tǒng)一的要求將蛋白或肽純化到最大純化狀態(tài)。實(shí)際上，在某些實(shí)施方式中也用較低實(shí)質(zhì)純化的產(chǎn)物。利用較少的純化步驟或同一純化設(shè)計(jì)的不同形式可以達(dá)到部分純化的目的。例如，利用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析能比利用低壓層析系統(tǒng)得到更高倍數(shù)的純化產(chǎn)物。相對(duì)低的純化程度的方法在提高蛋白產(chǎn)物總回收率，或保持蛋白活性方面有優(yōu)勢(shì)。已知多肽的遷移率會(huì)由于SDS/PAGE的條件不同而不同，優(yōu)勢(shì)差別很明顯(Capaldi等，1977)。因而比較適宜的是根據(jù)純化或部分純化產(chǎn)物分子量的變化選擇不同的電泳條件。本發(fā)明的方法和組合物中也包括了肽標(biāo)記物的使用。標(biāo)記物利用了兩個(gè)多肽之間的相互作用。用于相互作用的多肽的一部分可以作為標(biāo)記物。例如，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的結(jié)合區(qū)可以作為標(biāo)記物，這樣谷胱甘肽鏈可用于富集含GST標(biāo)記物的化合物?？杀豢贵w或T細(xì)胞受體識(shí)別的氨基酸區(qū)是一種表位標(biāo)記物，也可以使用。標(biāo)記物可由人工連接到編碼修飾蛋白的核酸片斷上的核酸片斷編碼，這樣整個(gè)核酸分子編碼的就是一個(gè)融合蛋白。其他合適的融合蛋白是那些含有β-半乳糖苷酶、泛素、六組氨酸或類似物質(zhì)的蛋白。5.抗體在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及抗體。例如單克隆抗體、單鏈抗體或人源化抗體的全部或部分序列可以化學(xué)結(jié)合或重組融合到另一個(gè)蛋白化合物如修飾的gelonin毒素上。另外，本發(fā)明的其他方面還包括識(shí)別針對(duì)特定抗原或抗原區(qū)的免疫反應(yīng)，即抗體反應(yīng)，這樣就可以設(shè)計(jì)和/或制備出比天然形式的免疫原性低的蛋白化合物。如上面所描述的，除了針對(duì)全長(zhǎng)蛋白的抗體以外，也可以制備與只含有核心表位區(qū)的小構(gòu)建物反應(yīng)的抗體，包括野生型和突變型表位。表位是抗原決定簇?？乖梢允悄鼙豢贵w或T細(xì)胞受體特異性識(shí)別的任何物質(zhì)。免疫原是可以誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的抗原。本文說用的術(shù)語“抗體”通常是指免疫結(jié)合物如IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。一般來說，IgG和/或IgM是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪巧頎顟B(tài)下最常見的抗體而且在實(shí)驗(yàn)室條件下易于制備。單克隆抗體(Mab)有其特定優(yōu)勢(shì)，如具有再生性及可以大規(guī)模制備，因此一般優(yōu)選單克隆抗體。本發(fā)明提供人、小鼠、猴、大鼠、倉(cāng)鼠、兔甚至雞源的單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”指任何含有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子，也包括抗體片斷如Fab’，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2，抗體單鏈區(qū)(DABs)，F(xiàn)v，scFv(單鏈Fv)及其類似物質(zhì)。制備和使用各種抗體構(gòu)建物的技術(shù)都是本領(lǐng)域所熟知的。抗體制備和特征化的方式也是本領(lǐng)域所熟知的(見Harlow和Lane，“抗體實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)”，ColdSpringHarborLaboratory，1988；本文已納入作為參考)。制備單克隆抗體的方法一般是按照制備多克隆抗體的方法開始。概括地說，多克隆抗體的制備是通過用本發(fā)明的免疫原性多肽組合物免疫動(dòng)物，然后從這些免疫動(dòng)物中收集抗血清。另外，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，血清是從接受特定抗原的人體內(nèi)收集的。在工作環(huán)境中有可能接觸特定抗原，這樣那些由于職業(yè)原因接觸特定抗原的人體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生針對(duì)肽、多肽或蛋白的多克隆抗體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，來自于職業(yè)接觸特定抗原的人的多克隆血清通過免疫檢測(cè)方法被用于確定gelonin毒素上的抗原區(qū)。許多種類的動(dòng)物都可用于制備抗血清。制備抗血清的常用動(dòng)物是兔、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠或山羊。由于兔有相對(duì)大量的血液體積，因此兔是優(yōu)選的制備多克隆抗體的動(dòng)物。正如本領(lǐng)域所熟知的，一個(gè)組合物的免疫原性可能是會(huì)出現(xiàn)變化。因而常常需要激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)，這可以通過將肽或多肽免疫原連接到載體上來實(shí)現(xiàn)。常用的和優(yōu)選的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作載體。將肽結(jié)合到載體上的方式是本領(lǐng)域所熟知的，包括戊二醛、m-馬來酰苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳化二亞胺和雙-二氮化的聯(lián)苯胺。同樣是本領(lǐng)域所熟知的，某個(gè)特定免疫原組合物的免疫原性可能因?yàn)槊庖叻磻?yīng)非特異刺激物即佐劑的使用而增強(qiáng)。合適的分子佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，如細(xì)胞因子、毒素或合成組合物。可以使用的佐劑包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ干擾素、GMCSP、結(jié)核菌素(BCG)、氫氧化鋁、胞壁酰二肽化合物如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷脂質(zhì)A(MPL)。也可以考慮使用溶于2％鯊烯/吐溫80中的含有三個(gè)細(xì)菌提取組分-MPL、海藻糖dimycolate(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的RIBI。甚至MHC抗原都可用作佐劑。經(jīng)常使用的優(yōu)選佐劑包括完全福氏佐劑(非特異免疫反應(yīng)刺激物，含有死的分枝結(jié)合桿菌)、不完全福氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。除了佐劑以外，能上調(diào)T細(xì)胞免疫反應(yīng)或下調(diào)抑制細(xì)胞活性的細(xì)胞生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)也可以共同使用。這種BRM包括而不限于甲氰咪胍(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；低劑量環(huán)磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)，細(xì)胞因子如γ干擾素、IL-2或IL-12、或者具有免疫輔助功能的基因編碼蛋白如B-7。用于制備多克隆抗體的免疫原組合物的量根據(jù)免疫原的特性以及免疫的動(dòng)物的不同而有所不同。各種給藥途徑都可用于注射免疫原(皮下注射、肌肉注射、真皮內(nèi)注射、靜脈注射以及腹膜內(nèi)注射)?？梢栽诿庖吆蟛煌瑫r(shí)間點(diǎn)通過采集免疫動(dòng)物的血樣來監(jiān)測(cè)多克隆抗體的產(chǎn)生情況。也可以進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫過程和測(cè)抗體滴度的過程可以反復(fù)進(jìn)行知道達(dá)到合適的抗體滴度。當(dāng)達(dá)到預(yù)期的免疫原性水平后，給免疫動(dòng)物放血，分離血清并儲(chǔ)存，動(dòng)物還可用于制備單克隆抗體。單克隆抗體可以用熟知的技術(shù)很容易地制備出來，如美國(guó)專利4,196,265號(hào)中所描述的例子，本文已納入作為參考。典型的技術(shù)包括以所選的免疫原組合物如純化的或部分純化的多肽、肽或肽片段免疫動(dòng)物，應(yīng)該是野生型的或突變的組合物。免疫組合物應(yīng)以能有效激發(fā)抗體生成細(xì)胞的方式注射。如果需要，單克隆抗體還可以通過過濾、離心和各種層析方法如HPLC或親和層析進(jìn)一步純化。本發(fā)明的單克隆抗體的片段也可以從單克隆抗體上獲得，其方法是用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通過化學(xué)降解過程裂解二硫鍵。另外，本發(fā)明所包括的單克隆抗體片段也可用自動(dòng)化的肽合成儀進(jìn)行人工合成。也可以考慮用分子克隆技術(shù)制備單克隆抗體。其主要內(nèi)容是用免疫動(dòng)物脾中分離的RNA制備組合的免疫球蛋白噬菌體文庫(kù)，通過比較表達(dá)抗原的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞篩選表達(dá)合適抗體的噬菌體。與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比，這一方法的優(yōu)點(diǎn)在于通過一輪篩選所得到的抗體就可以提高104倍，通過重鏈和輕鏈的結(jié)合可以產(chǎn)生新的特異性，從而可以提高發(fā)現(xiàn)合適抗體的幾率。人源化的單克隆抗體是指動(dòng)物源的抗體經(jīng)過基因工程技術(shù)的改造以人源序列代替抗體上的恒定區(qū)和/或可變區(qū)序列，同時(shí)保持其原有的抗原特異性。這種抗體通常來源于嚙齒類動(dòng)物抗體并且具有針對(duì)人源抗原的特異性。這種抗體一般用于體內(nèi)治療。這種策略有助于降低宿主對(duì)外源抗體的免疫反應(yīng)同時(shí)具有人效應(yīng)功能的選擇性?！叭嗽椿笨贵w也包括在本發(fā)明之內(nèi)，這些抗體是來源于小鼠、大鼠或其他物種嵌合抗體，具有人抗體的恒定區(qū)和/或可變區(qū)，是雙特異性抗體，重組的和基因工程抗體及其片段。制備人源化免疫球蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如美國(guó)專利5,693,762號(hào)描述了含有一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體決定區(qū)(CDR’s)的人源化免疫球蛋白的制備方法和組合物。當(dāng)結(jié)合成一個(gè)完整抗體時(shí)，人源化的免疫球蛋白在人體內(nèi)實(shí)際上是非免疫原性的并且與抗原如蛋白或其他含相應(yīng)表位的化合物的親和性得以保留。其他制備人源化抗體的方法包括在美國(guó)專利6,054,297；6,861,155和6,020,192號(hào)種，本文已特地納入作為參考。根據(jù)病人的疾病量身定做的抗體的制備方法同樣也是已知的，這種量身定做的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。6.免疫檢測(cè)方法正如某些實(shí)施方式中所討論的，本發(fā)明還涉及結(jié)合、純化、去除、定量和/或其他檢測(cè)生物學(xué)組分如多肽和肽上抗原區(qū)的免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明的免疫檢測(cè)方法可用于確定肽、多肽或蛋白上的抗原區(qū)，這些肽、多肽或蛋白具有治療價(jià)值，特別是當(dāng)其免疫原性或抗原性在受體內(nèi)降低時(shí)。免疫檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ALISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫放射量測(cè)定法、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光分析法、生物發(fā)光分析法以及Western雜交，盡管還有其他幾個(gè)方法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員說熟知的。各種有用的免疫檢測(cè)方法的具體步驟在科學(xué)文獻(xiàn)中已有描述，如DoolittleMH和Ben-Zeev0，1999；GulbisB等，1993；DeJagerR等，1993；及Nakamura等，1987，本文已納入作為參考。一般的免疫檢測(cè)方法都包括獲取懷疑含有蛋白、多肽或肽的標(biāo)本，然后按照本發(fā)明的方法將標(biāo)本與單克隆或多克隆的第一抗體反應(yīng)，反應(yīng)條件要足以形成免疫復(fù)合物。這些方法包括從細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或有機(jī)體標(biāo)本中純化蛋白、多肽和/或肽的方法。在某些情況下，抗體可以去除標(biāo)本中的抗原性蛋白、多肽和/或肽。優(yōu)選的是抗體連接到固相支持物上，如以柱基質(zhì)的形式，懷疑含有蛋白、多肽和/或肽抗原成分的標(biāo)本與固定的抗體反應(yīng)。不想要的成分可以從柱子中洗脫下來，留下可以被洗脫與固定抗體結(jié)合的免疫復(fù)合物。免疫結(jié)合方法也包括檢測(cè)和定量標(biāo)本中抗原組分的方法和形成于結(jié)合過程中免疫復(fù)合物的方法。將得到的懷疑含有一種抗原或抗原區(qū)的標(biāo)本與含有該抗原或抗原區(qū)的抗體的標(biāo)本反應(yīng)，然后檢測(cè)和定量在特定條件下形成的免疫復(fù)合物。對(duì)于抗原檢測(cè)來說，所分析的生物標(biāo)本可以是懷疑含有抗原或抗原區(qū)的任何標(biāo)本，如組織切片或標(biāo)本、勻漿的組織提取物、細(xì)胞、細(xì)胞器、分離和/或純化形式的含上述抗原的任何組合物、甚至與細(xì)胞或組織接觸的任何生物液體如血液和/或血清。在適當(dāng)條件下將所選的生物標(biāo)本與抗體混和，反應(yīng)一定的時(shí)間以便足以形成免疫復(fù)合物(初級(jí)免疫復(fù)合物)，一般來說只要簡(jiǎn)單地把抗體組合物加到標(biāo)本中，混和孵育的時(shí)間要足夠使抗體與存在的抗原形成免疫復(fù)合物。孵育結(jié)束后，一般要洗滌標(biāo)本-抗體組合物如組織切片，ELISA板子，點(diǎn)雜交膜或Western雜交膜，以便去除非特異結(jié)合的抗體，使那些特異結(jié)合到初級(jí)免疫復(fù)合物上的抗體被檢測(cè)到。通常情況下，形成的抗體復(fù)合物的檢測(cè)方法都是本領(lǐng)域所熟知的并且可以用許多方法。這些方法一般都是基于檢測(cè)標(biāo)記物，如那些放射性的、熒光的、生物的和酶的標(biāo)記物。涉及上述標(biāo)記物的使用方法的有美國(guó)專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。本文已納入作為參考。當(dāng)然，如果使用第二結(jié)合配基如二抗和/或生物素和/或親和素配基結(jié)合重排可能會(huì)有更多的優(yōu)勢(shì)，這也是本領(lǐng)域所熟知的。用于檢測(cè)的抗體可以直接連接標(biāo)記物，這樣僅僅檢測(cè)這個(gè)標(biāo)記物就可以知道組合物中初級(jí)免疫復(fù)合物的量。另外，結(jié)合在初級(jí)免疫復(fù)合物中的一抗的量也可以通過能與一抗結(jié)合的第二結(jié)合配基來確定。在這種方法中，第二結(jié)合配基連接一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記物。第二結(jié)合配基本身也常常是抗體，因此被稱作“第二”抗體。在適當(dāng)條件下初級(jí)免疫復(fù)合物與標(biāo)記的第二結(jié)合配基或抗體結(jié)合，經(jīng)過一段時(shí)間后就可以形成次級(jí)免疫復(fù)合物。然后洗滌刺激免疫復(fù)合物以去除非特異結(jié)合的第二抗體或配基，檢測(cè)刺激免疫復(fù)合物中剩余的標(biāo)記物。還有一種方法是通過兩步來檢測(cè)初級(jí)免疫復(fù)合物。如上面所描述的，與一抗有結(jié)合活性的第二結(jié)合配基如抗體用于形成第二免疫復(fù)合物。洗滌后在適當(dāng)條件下次級(jí)免疫復(fù)合物與能結(jié)合二抗的第三結(jié)合配基或抗體反應(yīng)結(jié)合，經(jīng)過一段時(shí)間后就可以形成免疫復(fù)合物(第三免疫復(fù)合物)。第三配基或抗體連接有可檢測(cè)標(biāo)記物，因此可以檢測(cè)形成的第三免疫復(fù)合物。如果需要這以系統(tǒng)具有信號(hào)放大作用。CharlesCantor所設(shè)計(jì)一種免疫檢測(cè)方法利用兩種不同的抗體。在第一步中，生物素標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體用于檢測(cè)靶抗原，第二步中的抗體用于檢測(cè)生物素復(fù)合物中的生物素。在這種方法中，被檢測(cè)的標(biāo)本首先孵育在含有第一步抗體的溶液中。如果有靶抗原存在，有些抗體就會(huì)結(jié)合到抗原上形成生物素標(biāo)記抗體/抗原復(fù)合物。抗體/抗原復(fù)合物通過在鏈親和素(或親和素)溶液、生物素標(biāo)記DNA溶液和/或互補(bǔ)的生物素標(biāo)記DNA溶液中分別孵育而得以放大，每一步都在抗體/抗原復(fù)合物上添加生物素位點(diǎn)。反復(fù)進(jìn)行放大步驟直到達(dá)到合適的放大程度，然后將標(biāo)本孵育在含有抗生物素的第二步抗體溶液中。第二步抗體是標(biāo)記的，例如用酶標(biāo)記，該酶可以通過用生色底物進(jìn)行組織酶學(xué)試驗(yàn)而檢測(cè)抗體/抗原復(fù)合物的存在。達(dá)到合適的放大倍數(shù)后，可以在顯微鏡下看到形成產(chǎn)生的復(fù)合物。另外一種已知的免疫檢測(cè)方法是利用免疫PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。PCR方法的步驟在與生物素孵育之前都是和Cantor的方法一致，只是不需要多輪鏈親和素和生物素標(biāo)記DNA孵育，DNA/生物素/鏈親和素/抗體復(fù)合物用低pH或高鹽溶液洗滌以釋放抗體。所得到的洗滌液以適宜的引物和合適的對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)。至少在理論上，PCR巨大的擴(kuò)增能力和特異性可以檢測(cè)到單個(gè)的抗原分子。a.ELISA如上所述，免疫分析的最簡(jiǎn)單和/或最直接意義在于結(jié)合分析。優(yōu)選的免疫分析方法是本領(lǐng)域所熟知的各種酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)和放射免疫分析(RIA)。用于檢測(cè)組織切片的免疫組化方法也很有用處。但是，很容易理解的是檢測(cè)方法不僅僅限于這些方法，蛋白印跡、點(diǎn)雜交、流式細(xì)胞術(shù)和/或類似的方法都可以使用。在一個(gè)典型的ELISA分析中，抗體被固定在具有蛋白親和性的表面上，如聚苯乙烯微量滴定板的孔內(nèi)。然后將懷疑含有抗原的檢測(cè)組合物如臨床標(biāo)本加到孔內(nèi)。結(jié)合一段時(shí)間并將非特異結(jié)合的免疫復(fù)合物洗去后檢測(cè)結(jié)合的抗原。一般通過加入連接有標(biāo)記物的另一種抗體來檢測(cè)。這種ELISA稱為簡(jiǎn)單的“夾心ELISA”。也可以加入第二抗體，然后在加入能與第二抗體結(jié)合的第三抗體，其中的第三抗體連接有可檢測(cè)標(biāo)記物。在另一種典型ELISA中，懷疑含有抗原的標(biāo)本被固定在培養(yǎng)板孔的表面，然后與抗體反應(yīng)。結(jié)合一段時(shí)間并將非特異結(jié)合的免疫復(fù)合物洗去后檢測(cè)結(jié)合的抗抗體。如果初始抗體連接有可檢測(cè)標(biāo)記物，則可以直接之間檢測(cè)免疫復(fù)合物。另外，也可以用能與第一抗體結(jié)合的第二抗體檢測(cè)免疫復(fù)合物，其中第二抗體上連接有可檢測(cè)標(biāo)記物。另外一種ELLSA是將抗原固定，在檢測(cè)的時(shí)候利用抗體的競(jìng)爭(zhēng)作用。在這種ELISA方法中，針對(duì)抗原的標(biāo)記抗體加到孔內(nèi)，使之與抗原結(jié)合，然后檢測(cè)標(biāo)記物。未知標(biāo)本中抗原的量可以通過在包被孔內(nèi)將標(biāo)本與標(biāo)記抗體混和而確定。如果標(biāo)本中存在抗原，則這些抗原可與抗體反應(yīng)從而減少與孔內(nèi)包被抗原結(jié)合的抗體數(shù)量，因而會(huì)降低最終的信號(hào)。這種方法也適于檢測(cè)未知標(biāo)本中抗體，其中未標(biāo)記抗體與抗原包被孔結(jié)合后就會(huì)減少可與標(biāo)記抗體結(jié)合的抗原數(shù)量。不管使用的是哪一種類型的ELISA，它們都有某些共同的特征，比如包被、孵育和結(jié)合、洗滌以去除非特異結(jié)合、以及檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合物。這些過程描述如下用抗原活抗體包被培養(yǎng)板的方法一般是將抗原活抗體溶液在培養(yǎng)板的孔內(nèi)孵育，過夜或特定一段時(shí)間。然后洗滌培養(yǎng)板的孔以去除不完全吸附的物質(zhì)。然后用對(duì)于抗血清來說無抗原性的非特異蛋白包被孔內(nèi)剩余的表面，這些非特異蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。這種包被是為了封閉固定表面的非特異吸附位點(diǎn)，從而降低減少由于抗血清非特異結(jié)合到表面而引起的背景干擾。對(duì)于ELISA檢測(cè)方法來說，最常用的是使用第二或第三抗體檢測(cè)方式而不是直接標(biāo)記第一抗體的檢測(cè)方式。因此，將蛋白或抗體結(jié)合到培養(yǎng)板的孔內(nèi)后，用非反應(yīng)性材料包被以降低背景干擾，洗滌去除未結(jié)合材料，然后在能有效促進(jìn)免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的條件下固定材料的表面與生物樣品接觸。免疫復(fù)合物的檢測(cè)需要有標(biāo)記的第二結(jié)合配基或抗體的參與，第二結(jié)合配基或抗體也可以和標(biāo)記的第三抗體或第三結(jié)合配基結(jié)合?！澳苡行Т龠M(jìn)免疫復(fù)合物形成的條件”意味著該條件優(yōu)選包含用溶液如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸鹽(PBS)/Tween稀釋抗原和/或抗體。這些添加的試劑有助于降低非特異的背景干擾。“合適的”條件也指孵育的溫度和時(shí)間要足以形成有效結(jié)合。孵育時(shí)間一般為約1到2個(gè)或4個(gè)小時(shí)，優(yōu)選的溫度為25到27℃，或在4℃條件下過夜。孵育步驟結(jié)束后，接觸表面要洗滌以便去除非復(fù)合的物質(zhì)。洗滌過程通常用溶液如PBS/Tween或硼酸鹽緩沖液。試驗(yàn)樣品和包被材料結(jié)合成特異性的免疫復(fù)合物并經(jīng)過洗滌后，即使是微量的免疫復(fù)合物也可以被檢測(cè)到。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)方法是第二或第三抗體連接有標(biāo)記物以便檢測(cè)。這種標(biāo)記物可能是酶，該酶與適當(dāng)?shù)纳孜锘旌秃髸?huì)產(chǎn)生顏色。因此，可以在適于形成進(jìn)一步免疫復(fù)合物的條件下將第一和第二免疫復(fù)合物與尿素酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶連接的抗體接觸或孵育一段時(shí)間。(即室溫下在含PBS的溶液如PBS-Tween中孵育2小時(shí))。與標(biāo)記的抗體孵育結(jié)束后，接下來就需要洗滌以去除非結(jié)合的物質(zhì)，標(biāo)記的量通過與生色底物如尿素、溴甲酚紅紫、ABTS、或過氧化氫孵育而確定，以過氧化氫為底物時(shí)酶標(biāo)記物為過氧化物酶。通過可見光分光光度計(jì)測(cè)定的所產(chǎn)生顏色的深度來定量。b.免疫組織化學(xué)本發(fā)明的抗體也可用于和新鮮冷凍的和/或甲醛固定的、石蠟包埋的組織切片結(jié)合作免疫組化分析(IHC)。例如，可用免疫組化方法評(píng)價(jià)本發(fā)明的某些特定免疫毒素。由這些特定標(biāo)本制成的組織切片已被成功用于各種預(yù)后因子的IHC研究，這些方法都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的(Brown等，1990；Abbondanzo等，1990；allred等，1990)。簡(jiǎn)言之，冰凍切片的制備過程如下在室溫下將50ng冰凍的磨碎組織放到盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的小塑料管中從新水化；離心沉淀顆粒；用各種包被介質(zhì)(OCT)重懸之；顛倒小塑料管然后離心使之沉淀；在-70℃異戊烷中快速冰凍；切開塑料小管取出冰凍的組織柱；將組織柱固定到冷凍切片機(jī)的夾盤上；切成25-50個(gè)切片。固定切片也可以同樣方法制備，包括在小塑料管中從新水化50mg樣品；重懸于10％的甲醛中固定4小時(shí)；洗滌/顛倒；重懸于2.5％的暖瓊脂中；在冰水中冷卻以使瓊脂固化；從小管中取出組織/瓊脂塊；用石蠟浸潤(rùn)和/或包埋組織/瓊脂塊；切成50片固定切片。II.核酸分子A.編碼天然蛋白或修飾蛋白的多聚核苷酸本發(fā)明涉及多聚核苷酸，該多聚核苷酸可從細(xì)胞中提取，使從總基因組DNA中分離出來，能表達(dá)蛋白或多肽的全部或部分序列。編碼天然蛋白的多聚核苷酸可以被改造成編碼修飾蛋白的多聚核苷酸。另外，多聚核苷酸也可以編碼修飾蛋白，或者可以編碼一個(gè)多聚核苷酸用于制備含有修飾蛋白的融合蛋白。例如，多聚核苷酸可以編碼多個(gè)部分，如共價(jià)連接到靶向性多肽即腫瘤抗原上的修飾gelonin多肽。需要說明的是一個(gè)多聚核苷酸分子可以編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)不同的多肽(全部或部分序列)。表2中列出的任一多肽、蛋白或肽都可以作為本發(fā)明的一部分通過重組的方法制備。而且，表2中列出的任一蛋白化合物都可以和表2中的或本文描述的一個(gè)或多個(gè)其他多肽一起由同一個(gè)核酸分子編碼從而產(chǎn)生出一個(gè)融合蛋白。重組蛋白可以從產(chǎn)生活性蛋白的細(xì)胞中純化。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式包括用核酸編碼SEQIDNO1的全部或部分序列。這種核酸包括SEQIDNO2的全部或部分序列，該序列于編碼gelonin多肽的cDNA序列一致(GenBank編號(hào)為L(zhǎng)12243)。因此，需要說明的是本文所討論的關(guān)于核酸的任何方法和組合物都適用于SEQIDNO2。本文所使用的術(shù)語“DNA片段”是指從特定物種的基因組總DNA中分離出的DNA分子。因而編碼多肽的DNA片段是指從哺乳動(dòng)物或人基因組總DNA中分離或純化出的含有野生型多形性的或突變的多肽編碼序列的DNA片段。一個(gè)多肽或多個(gè)多肽、小于一個(gè)多肽的DNA片段、以及重組載體如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒及其類似物質(zhì)也包括在術(shù)語“DNA片段”的范圍之內(nèi)。本申請(qǐng)所用的術(shù)語“多聚核苷酸”是指從基因組總核酸中分離出來的核酸分子。因而，“編碼天然多肽的多聚核苷酸”是指從哺乳動(dòng)物或人基因組總DNA中分離或純化出的含有野生型或多形性的多肽編碼序列的DNA片段。因而本申請(qǐng)所指的gelonin多聚核苷酸編碼的gelonin、“天然gelonin多肽”或“修飾gelonin多肽”的功能或活性意味著這個(gè)多聚核苷酸編碼一個(gè)具有如RIP一樣的酶解活性的分子。術(shù)語“cDNA”通常是指以信使RNA(mRNA)為模板制備的DNA。與基因組DNA或從基因組非處理或部分處理RNA模板得來的DNA相比，利用cDNA有許多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閏DNA含有相應(yīng)蛋白的編碼許流。但在有些情況下優(yōu)選全部或部分基因組序列，例如為了達(dá)到最佳表達(dá)而需要非編碼區(qū)時(shí)或非編碼區(qū)如內(nèi)含子是反義治療的靶位時(shí)。還需要注意的是一個(gè)給定物種的特定多肽可以由天然突變體編碼，該突變體的序列雖然有稍許不同但編碼同一個(gè)蛋白(見上面的表1)。同樣，一個(gè)含有分離的或純化的野生型、多形性或突變型多肽基因的多聚核苷酸是指一個(gè)含有野生型、多形性或突變型多肽編碼序列的DNA片段，在某些情況下也可能含有來自于其他天然發(fā)生基因或蛋白編碼序列的調(diào)節(jié)序列。從這個(gè)意義上說，單純用一個(gè)術(shù)語“基因”是指功能蛋白、多肽或肽編碼單位。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的那樣，這一功能性術(shù)語可以涵蓋能表達(dá)或經(jīng)改造可以表達(dá)蛋白、多肽、蛋白區(qū)、肽、融合蛋白以及突變體的DNA序列、cDNA序列以及小的基因工程基因片段。編碼天然多肽或修飾多肽的全部或部分序列的核酸含有連續(xù)的核酸序列，該核酸可以編碼上述多肽的全部或部分序列，其長(zhǎng)度如下至少或最大約為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，1000，1010，1020，1030，1040，1050，1060，1070，1080，1090，1095，1100，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，9000，10000或更多個(gè)核苷酸、核苷或堿基對(duì)。如此長(zhǎng)度的連續(xù)殘基可用于本文所描述或討論的任一核酸序列，包括SEQIDNos2-10。在某些特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的DNA片段及其重組載體，該載體插入了一個(gè)編碼野生型、多形性或修飾的多肽或肽的DNA序列，在多肽或肽氨基酸序列內(nèi)含有與天然多肽一致或基本一致的氨基酸序列。因此，分離的DNA片段或含DNA片段的載體可以編碼具有天然gelonin多肽所多具有的核糖體滅活活性和特異性的修飾gelonin多肽，但是其氨基酸序列有所不同。術(shù)語“重組的”可以與多肽或特異性多肽的名稱聯(lián)用，一般指經(jīng)過體外操作的或其體外復(fù)制產(chǎn)物的核酸分子所編碼的多肽。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的DNA片段及其重組載體，該載體插入了一個(gè)編碼多肽或肽的DNA序列，在多肽或肽氨基酸序列內(nèi)含有與天然多肽一致或基本一致的氨基酸序列。用于本發(fā)明的核酸片段，不論其本身所具有的編碼序列的長(zhǎng)度，都可以與其他核酸序列相連接，這些序列如啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)、附加的限制性酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼片段以及類似序列，因此其總長(zhǎng)度的變化是相當(dāng)大的。因而需要說明的是任意長(zhǎng)度的核酸片段都可以使用，但是總長(zhǎng)度最好有所限制以便更容易制備并易于用到需要的重組DNA操作中去。需要說明的是本發(fā)明的核酸構(gòu)建物可以編碼任意來源的全長(zhǎng)多肽，也可以編碼多肽的截短版本，如截短的gelonin多肽，這樣編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄子代表了截短的版本。因而截短的轉(zhuǎn)錄子翻譯出來的是截短的蛋白。另外，核酸序列也可以編碼一個(gè)全長(zhǎng)多肽序列加上一個(gè)異源的編碼序列，例如為了使多肽更好地純化、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、翻譯后修飾、或者為了提高其治療價(jià)值如靶向性或效力。正如上面所討論的，修飾多肽編碼序列上也可以連接一個(gè)標(biāo)記或其他異源多肽，其中“異源的”是指這個(gè)多肽與修飾蛋白不一樣。在一個(gè)非限定性實(shí)施例中，制備一種或多種核酸構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有與特定基因序列如gelonin毒素一致或互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列。核酸構(gòu)建物至少含有20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1,000，2,000，3,000，4,000，5,000，6,000，7,000，8,000，9,000，10,000，15,000，20,000，30,000，50,000，100,000，250,000，500,000，750,000，到1,000,000個(gè)核苷酸，也可以是更長(zhǎng)的構(gòu)建物，甚至大到包括一個(gè)染色體大小(包括所有中間長(zhǎng)度和中間范圍)，也包括本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的核酸構(gòu)建物如酵母人工染色體。容易理解的是“中間長(zhǎng)度”和“中間范圍”是指包括所引用數(shù)值或所引用數(shù)值之間的任一長(zhǎng)度或范圍(即包括上述數(shù)值或上述數(shù)值之間的所有整數(shù))。用于本發(fā)明的DNA片段所具有的生物功能是與修飾蛋白和修飾肽如修飾gelonin毒素一樣的。這種序列是密碼子冗余和功能等效的結(jié)果，已知核酸序列及其編碼蛋白在自然條件下也會(huì)發(fā)生。另外，功能等效蛋白或肽也可以通過重組DNA技術(shù)生成，其中蛋白結(jié)構(gòu)的改變可以在考慮所改變氨基酸特性的基礎(chǔ)上用基因工程方法達(dá)到?？梢岳梦稽c(diǎn)特異性突變技術(shù)引入人工設(shè)計(jì)的變化，如改變蛋白的抗原性、降低蛋白在宿受試者內(nèi)的毒性、或者增加包括蛋白在內(nèi)的治療方案的效力。1.載體天然蛋白和修飾蛋白可以由插入到載體內(nèi)的核酸分子編碼。所用的術(shù)語“載體”指載體核酸分子，一段核酸分子可以插入其中，并被導(dǎo)入到細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。如果說一個(gè)核酸序列是“外源性的”則是指該核酸分子對(duì)于其載體導(dǎo)入細(xì)胞來說是外來的，或者雖然該核酸分子與細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)序列同源，但是宿主細(xì)胞核酸序列內(nèi)的這個(gè)位置上不存在這樣一個(gè)序列。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(細(xì)菌噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)、以及人工染色體(如酵母人工染色體)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該很熟練地掌握利用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建載體的方法，這些方法在文獻(xiàn)Sambrook等，1989和ausubel等，1996中由描述，本文已納入作為參考。除了能編碼修飾多肽如修飾gelonin外，載體還可以編碼未修飾多肽序列如標(biāo)記物或靶向分子。編碼這種融合蛋白的可用載體包括pIN載體(Inouye等，1985)、編碼組氨酸鏈的載體、以及pGEX載體，其中pGEX載體用于生產(chǎn)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)可溶性融合蛋白以利于進(jìn)一步純化和分離或剪切。靶向分子可以引導(dǎo)修飾多肽到特定器官、組織、細(xì)胞或肌體內(nèi)的其他位置。術(shù)語“表達(dá)載體”指含有一個(gè)核酸序列的載體，該核酸序列至少能編碼被轉(zhuǎn)錄基因產(chǎn)物的一部分。在有些載體中RNA分子被翻譯成蛋白、多肽或肽。而在另一些載體中，這些序列是不翻譯的，例如只是轉(zhuǎn)錄為反義核酸分子或核酶。表達(dá)載體還可以含有各種“控制序列”，這是指這些序列是轉(zhuǎn)錄以及調(diào)控區(qū)相連的編碼序列在特定宿受試者內(nèi)翻譯所必須的。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列以外，載體和表達(dá)載體還可能含有下面所描述的執(zhí)行其他功能的核苷酸序列。a.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子“啟動(dòng)子”是一種控制序列，位于核苷酸序列的起始區(qū)，控制轉(zhuǎn)錄的效率。啟動(dòng)子還可能含有調(diào)節(jié)蛋白和調(diào)節(jié)分子如RNA多聚酶和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件。短語“調(diào)控區(qū)的”、“調(diào)控區(qū)相連的”、“控制下的”和“轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的”是指啟動(dòng)子位于一段核酸序列的正確功能位置和/或正確功能走向上，該序列可以控制基因的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。啟動(dòng)子可以連接一個(gè)也可以不連接“增強(qiáng)子”，增強(qiáng)子是一個(gè)段順式作用元件，也可以控制核酸序列的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。啟動(dòng)子可以是一個(gè)與基因或序列天然相連的序列，可以從位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼區(qū)序列中分離。這樣的啟動(dòng)子被稱作是“內(nèi)源性的”。同樣，增強(qiáng)子也可以是一個(gè)與核酸序列天然相連的序列，位于核酸序列的下游或上游。另外，將核酸編碼片段置于一個(gè)重組的或異源的啟動(dòng)子控制之下可以有某些優(yōu)點(diǎn)，所謂的重組或異源啟動(dòng)子是指該啟動(dòng)子與其天然核苷酸序列不同。重組或異源增強(qiáng)子也是指該增強(qiáng)子與其天然核苷酸序列不同。這種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可能是其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、從其他原核細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞中分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、或者非“天然發(fā)生的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的不同元件和/或能改變表達(dá)的突變體。除了通過人工合成制備啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核苷酸序列，還可以利用與本文所描述的組合物有關(guān)的重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)如PCRTM制備(見美國(guó)專利4,683,202、5,928,906號(hào)，本文已納入作為參考)。另外需要說明的是無核細(xì)胞器如線粒體、葉綠體及類似物質(zhì)內(nèi)的控制基因轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控序列也可用于本發(fā)明。可以想見的是使用啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子是十分重要的，因?yàn)樗鼈兛梢杂行Т龠M(jìn)基因片段在其所表達(dá)的細(xì)胞、細(xì)胞器以及有機(jī)體內(nèi)的表達(dá)。分子生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都知道如何選擇啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和特定細(xì)胞類型以使蛋白更好表達(dá)，例如參見Sambrook等(1989)，本文已納入作為參考。所使用的啟動(dòng)子可以是組成的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的、和/或在適當(dāng)條件下可誘導(dǎo)導(dǎo)入DNA片段的高水平表達(dá)，在大規(guī)模制備重組蛋白和/或肽時(shí)特別有利。啟動(dòng)子可以是異源的也可以是內(nèi)源的。表5列出了幾個(gè)本發(fā)明所使用的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的元件/啟動(dòng)子。這個(gè)表并沒有把啟動(dòng)基因表達(dá)的所有可能的元件都包括在內(nèi)，只是舉了一些例子。表6舉了一些可誘導(dǎo)元件，這些元件是核酸序列上的一些可被特異刺激信號(hào)激活的區(qū)。組織特異性啟動(dòng)子或元件的鑒別及其活性特征分析都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。這些區(qū)的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)，生長(zhǎng)抑素受體2基因(Kraus等，1998)，鼠附睪維甲酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)，人CD4(Zhao-Emonet等，1998)，鼠α2(XI)膠原(Tsumaki等，1998)，D1A多巴胺受體基因(Lee等，1997)，胰島素樣生長(zhǎng)因子II(Wu等，1997)，人血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(Almendro等，1996)。b.起始信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼序列的有效翻譯也需要特異性起始信號(hào)的參與。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子或其相鄰序列。外源性的翻譯調(diào)控信號(hào)，包括ATG起始密碼子，也需要提供。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易確定并提供必須的信號(hào)。大家都知道起始密碼子必須與編碼序列處于同一個(gè)閱讀框架內(nèi)以保證整個(gè)插入序列的完整翻譯。外源性的翻譯調(diào)控信號(hào)和起始密碼子可以是天然的，也可以是合成的。包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件可以增強(qiáng)表達(dá)的效率。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件被用于產(chǎn)生多基因或多順反子信使RNA。IRES元件可以使核糖體繞過5’甲基化帽子而直接在內(nèi)部的位點(diǎn)開始翻譯(pelletier和Sonenberg，1988)。來自細(xì)小核糖核酸病毒家族(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的兩個(gè)IRES元件(pelletier和Sonenberg，1988)和來自哺乳動(dòng)物信使RNA的一個(gè)IRES元件(Macejak和Samow，1991)已被分離出來。IRES元件可以連接到異源開放閱讀框架上。多個(gè)開放閱讀框架可以一起轉(zhuǎn)錄，每一個(gè)都被IRES分開，形成多順反子信使RNA。由于有IRES，每一個(gè)開放閱讀框架都可以結(jié)合核糖體而得以有效翻譯。利用單個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出一個(gè)信使RNA可以使多個(gè)基因得以表達(dá)(見美國(guó)轉(zhuǎn)錄5,925,565號(hào)和5,935,819號(hào)，本文已納入作為參考)。c.多克隆位點(diǎn)載體可以含有多克隆位點(diǎn)(MCS)，這是一個(gè)含有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸序列，任何一個(gè)酶切位點(diǎn)都可以用標(biāo)準(zhǔn)基因重組技術(shù)將載體切開(見Carbonilli等，1999，Levenson等，1998，及Cocea，1997，本文已納入作為參考)?！跋拗菩詢?nèi)切酶消化”是指用酶催化裂解核酸分子，該酶只在核酸分子上的特定位置發(fā)揮功能。這些酶中的許多都是商品化的。這種酶的使用方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。載體常常被限制性內(nèi)切酶在MCS內(nèi)切開成線性或片段以使外源序列連接到載體上?！斑B接”是指兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，兩個(gè)片段可以彼此相鄰也可以不相鄰。限制性酶切和連接反應(yīng)都是重組
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所熟知的。d.剪切位點(diǎn)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子需要經(jīng)過剪切以去除初級(jí)轉(zhuǎn)錄子上的內(nèi)含子。含有真核基因組序列的載體需要供體和/或受體的剪切位點(diǎn)以保證翻譯成蛋白的轉(zhuǎn)錄子得以加工。e.末端信號(hào)本發(fā)明的載體或構(gòu)建物一般至少含有一個(gè)末端信號(hào)?！澳┒诵盘?hào)”或“終止子”是一段DNA序列，可以使RNA多聚酶合成的RNA轉(zhuǎn)錄子特異性終止。因此，在某些實(shí)施方式中，需要考慮末端信號(hào)以使RNA轉(zhuǎn)錄子合成終止。要在體內(nèi)達(dá)到預(yù)期的信使RNA水平就需要終止子。在真核細(xì)胞體系中，終止子區(qū)域還含有特異性DNA序列以使新的轉(zhuǎn)錄子經(jīng)位點(diǎn)特異性剪切后暴露出多聚腺苷酸位點(diǎn)。這個(gè)序列可以使特異的內(nèi)源性多聚酶將一個(gè)約200腺苷酸殘基片段(polyA)加到轉(zhuǎn)錄子的3’末端。加上這種polyA尾巴的RNA分子更穩(wěn)定并且翻譯效率更高。因此在某些含有真核細(xì)胞的實(shí)施方式中，較佳的是含有RNA剪切信號(hào)的終止子，更佳的是含有多聚腺苷酸尾巴的終止子。終止子和/或多聚腺苷酸位點(diǎn)元件可以增加信使RNA水平和/或防止核糖體從一個(gè)閱讀框架進(jìn)入其他序列。本發(fā)明所考慮使用的終止子包括本文所描述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何已知的轉(zhuǎn)錄終止子，其中包括而不限于基因的終止序列如牛生長(zhǎng)激素終止子，或者病毒終止子序列如SV40終止子。在某些實(shí)施方式中，終止信號(hào)可以缺少可轉(zhuǎn)錄或可翻譯序列，如由于序列被截短的原因。f.多聚腺苷酸信號(hào)基因表達(dá)，特別是真核細(xì)胞基因表達(dá)一般都含有一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)以產(chǎn)生正確的多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄子。多聚腺苷酸信號(hào)的特性對(duì)于成功實(shí)現(xiàn)本發(fā)明并不是關(guān)鍵的，并且任何一個(gè)這種信號(hào)都可以使用。優(yōu)選的實(shí)施方式包括SV40多聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸信號(hào)，以方便在各種靶細(xì)胞內(nèi)更好地發(fā)揮功能。多聚腺苷酸化可以增加轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定性，或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄子的胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)。g.復(fù)制起始區(qū)為了使載體在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，需要一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始區(qū)(常被稱作“ori”)，這是一個(gè)特異性核酸序列，復(fù)制從這里開始。另外如果宿主細(xì)胞是酵母也可以使用自主復(fù)制序列(ARS)。h.篩選標(biāo)記在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，含有本發(fā)明核酸構(gòu)建物的細(xì)胞在體內(nèi)或體外可以通過在表達(dá)載體上連接一個(gè)標(biāo)記而被篩選出來。這種標(biāo)記可以賦予細(xì)胞一種可篩選表型從而使含有表達(dá)載體的細(xì)胞容易被篩選出來。一般來說篩選標(biāo)記是指可以賦予可篩選特性的序列。正篩選標(biāo)記是指有這個(gè)標(biāo)記就可以被篩選出來，而負(fù)篩選標(biāo)記則是指存在這個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞不被篩選。正篩選標(biāo)記的例子有藥物耐藥標(biāo)記。一般來說含有一個(gè)藥物篩選標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化子的克隆形成及鑒定，例如對(duì)新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin以及組胺醇耐藥的基因都可以作為篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記可以賦予轉(zhuǎn)化子一定的表型從而使含有篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子可以被鑒別出來，另外還有一類可篩選標(biāo)記如GFP，其原理是比色分析，也可以考慮。另外，可篩選酶如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)也可以使用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道如何使用免疫性標(biāo)記，這些標(biāo)記一般要配合FACS分析。具體使用哪一種標(biāo)記并不重要，只要標(biāo)記能和編碼基因產(chǎn)物的核酸一起表達(dá)就可以。可篩選標(biāo)記的其他例子也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。2.宿主細(xì)胞本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以替換使用。所有這些術(shù)語也包括其傳代細(xì)胞，即這些細(xì)胞所分裂產(chǎn)生的任何細(xì)胞及全部細(xì)胞?？梢岳斫獾氖莻鞔?xì)胞可以是不一致的，這是由于細(xì)微的或隨機(jī)的突變所造成的。對(duì)于表達(dá)一個(gè)異源核酸序列來說，“宿主細(xì)胞”是指原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括任何可轉(zhuǎn)化的有機(jī)體，這些有機(jī)體可以使載體在其內(nèi)復(fù)制，和/或載體編碼的異源基因在其內(nèi)表達(dá)。宿主細(xì)胞可以并且已經(jīng)用作載體的受體。宿主細(xì)胞“可轉(zhuǎn)染”或“可轉(zhuǎn)化”是指外源核酸如修飾蛋白編碼序列可以被導(dǎo)入或引入宿主細(xì)胞中?？赊D(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代細(xì)胞及其傳代細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以來源于原核細(xì)胞，也可以來源于真核細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體選擇何種宿主細(xì)胞主要考慮所期望的結(jié)果是載體的復(fù)制還是部分或全部載體編碼核酸的表達(dá)。許多細(xì)胞系及其培養(yǎng)物可作為宿主細(xì)胞，可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)獲得，這是一個(gè)專門保存活培養(yǎng)物和基因材料的機(jī)構(gòu)(www.atcc.org)。根據(jù)載體的結(jié)構(gòu)和所期望的結(jié)果，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以確定合適的宿主細(xì)胞。例如，質(zhì)?；蛘沉？梢员粚?dǎo)入到原核細(xì)胞中而獲得大量復(fù)制。用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)菌宿主細(xì)胞有DH5α，JM109和KC8，另外還有許多商業(yè)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞如SURECompetentCells和SOLOPACKTMGoldCells(STRARAGENE，LaJolla)。另外，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌LE392也可作為噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。合適作宿主細(xì)胞的酵母包括Saccharomycescerevisiae、Saccharomycespombe和Pichiapastoris。用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的真核宿主細(xì)胞包括Hela、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該知道來源于各類細(xì)胞和有機(jī)體的宿主細(xì)胞都可以使用。同樣，病毒載體可以與真核宿主細(xì)胞或原核宿主細(xì)胞聯(lián)合使用，特別是用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的宿主細(xì)胞。有些載體含有調(diào)控序列從而使其在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中都能復(fù)制和/或表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步了解培養(yǎng)上述所有宿主細(xì)胞的條件以使載體在細(xì)胞內(nèi)得以保留和復(fù)制。還應(yīng)了解大規(guī)模制備載體以及制備載體編碼核酸及其表達(dá)的多肽、蛋白或肽的技術(shù)和條件。3.表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)有的許多表達(dá)系統(tǒng)都含有上述組合物的全部或至少一部分。原核和/或真核表達(dá)系統(tǒng)都可用于本發(fā)明以制備核酸序列及其編碼的多肽、蛋白和肽。許多這樣的表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)是商業(yè)化的并且被廣泛應(yīng)用。昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可以使異源核酸片段達(dá)到高水平的蛋白表達(dá)，該系統(tǒng)在美國(guó)專利5,871,986和4,879,236好中有描述，本文已納入作為參考。這個(gè)系統(tǒng)可以買到，如INVITROGEN的MAXBAC2.0以及CLONTECH的BACPACKTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。除了本發(fā)明所描述的表達(dá)系統(tǒng)外，其他的表達(dá)系統(tǒng)包括STRATAGENE’sCOMPLETECONTROLTM的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)內(nèi)含有一個(gè)合成的蛻化素可誘導(dǎo)受體，或者該公司的pET表達(dá)系統(tǒng)，這是一個(gè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。另外的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)有INVITROGEN的T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)表達(dá))系統(tǒng)，這是一個(gè)含有全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。INVITROGEN還有一個(gè)酵母表達(dá)系統(tǒng)叫Pichiamethanolica表達(dá)系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)可以使重組蛋白在methylotrophic酵母Pichiamethanolica內(nèi)高效表達(dá)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)該知道如何使一個(gè)載體如表達(dá)構(gòu)建物產(chǎn)生核酸序列或其編碼的多肽、蛋白或肽。4.病毒載體有許多方法可以將表達(dá)載體導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方式中，表達(dá)載體含有一個(gè)病毒序列或病毒基因組來源的人工載體。某些病毒能夠通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞并整合導(dǎo)宿主基因組中，從而使病毒基因得以穩(wěn)定而高效表達(dá)，因此病毒載體是將外源基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)的較佳候選者(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。首先被用作基因載體的病毒是DNA病毒，包括乳頭多瘤空泡病毒(類人猿病毒、牛乳頭狀病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。但是這些病毒載體攜帶外源DNA序列的能力相對(duì)較低并且宿主譜也較窄。而且這些病毒在感染宿主細(xì)胞后可能成為潛在的致癌基因以及具有細(xì)胞病理效應(yīng)，因此引起了對(duì)它們安全性的關(guān)注。這類病毒載體最大只能插入8kb的外源基因但是很容易感染各種細(xì)胞系和試驗(yàn)動(dòng)物(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒，其共同的特征是可以在感染細(xì)胞內(nèi)將自己的RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA；也可以用作載體。其他病毒也可以用于制備本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物。病毒如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺相關(guān)病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒來源的載體也可用于本發(fā)明中。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說這些載體提供了幾個(gè)有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。B.核酸檢測(cè)本文所描述的核酸序列除了用于表達(dá)人工毒素和修飾蛋白、多肽和/或肽之外還有許多用途。例如，在包括核酸雜交的實(shí)施方式中可用作探針或引物。編碼修飾蛋白或人工毒素的核酸的檢測(cè)也包含在本發(fā)明中。1.雜交用13到100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的探針或引物進(jìn)行雜交可以形成穩(wěn)定而特異的雙螺旋分子，優(yōu)選17到100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，在本發(fā)明的某些方面甚至可以達(dá)到1-2kb或更長(zhǎng)。一般優(yōu)選含有大于20個(gè)堿基長(zhǎng)度的連續(xù)互補(bǔ)序列的分子以增加雜交分子的穩(wěn)定性和/或特異性。一般來說較佳的是設(shè)計(jì)含有一個(gè)或多個(gè)20-30bp互補(bǔ)序列的分子進(jìn)行雜交，如果需要也可以更長(zhǎng)。這種片段易于制備，例如可以用化學(xué)方法直接合成，或者通過將一段序列插入到重組載體中擴(kuò)增探針或引物。因此，本發(fā)明的核酸序列可用于與互補(bǔ)的DNA和/或RNA形成特異的雙螺旋分子，或者作為引物從標(biāo)本中擴(kuò)增DNA或RNA。根據(jù)用途的不同可以使用各種雜交條件以達(dá)到特異性探針不同程度的結(jié)合或引物與靶序列的結(jié)合。如果要達(dá)到高特異性，就要選擇相對(duì)嚴(yán)格的雜交條件。例如相對(duì)較低的鹽濃度和較高的溫度，比如約0.02M-0.10M的NaCl，溫度為約50-70℃。如此嚴(yán)格的條件就很少出現(xiàn)探針或引物與模板或靶序列之間的錯(cuò)配，因此特別適于分離特異性基因或檢測(cè)特異性mRNA轉(zhuǎn)錄子。一般優(yōu)選通過增加加入的甲酰胺的量來使反應(yīng)條件更嚴(yán)格。對(duì)于某些特定的用途，例如位點(diǎn)特異性突變，優(yōu)選較低嚴(yán)格性的反應(yīng)條件。在此條件下即使兩條鏈的序列并不是嚴(yán)格互補(bǔ)也可以形成雜交分子，但是會(huì)在一個(gè)或多個(gè)位置上出現(xiàn)錯(cuò)配?？梢酝ㄟ^增加鹽濃度和/或提高反應(yīng)溫度來降低反應(yīng)條件的嚴(yán)格程度。例如中度嚴(yán)格的條件可能是約0.1M-0.25M的NaCl，溫度為約37-55℃，較低嚴(yán)格程度的條件是約0.15M-0.9M的NaCl，溫度為約20-55℃。雜交條件根據(jù)所期望的結(jié)果很容易調(diào)整。在另外一些實(shí)施方式中，雜交在以下條件下完成50mMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3mMMgCl2、1.0mM二硫蘇糖醇，溫度為約20-37℃。其他雜交條件可能包括約10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mMMgCl2，溫度為約42-72℃。在某些實(shí)施方式中，較佳的是利用本發(fā)明的核酸序列和合適的確認(rèn)雜交的方式如標(biāo)記物。各種合適的指示劑都是本領(lǐng)域所熟知的，包括熒光、放射性的、酶的、或其他配基如親和素/生物素，都可以被檢測(cè)到。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用熒光標(biāo)記物或酶標(biāo)記物如尿素酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶代替放射性的或其他易對(duì)環(huán)境造成污染的標(biāo)記物。對(duì)于酶標(biāo)記物來說，通過生色指示底物可以提供一種可見的或可用分光光度計(jì)檢測(cè)的檢測(cè)方式來確定與標(biāo)本中互補(bǔ)核酸分子形成了特異性雜交產(chǎn)物?？傊?，本文所描述的探針或引物可以作為試劑用于液體雜交如PCRTM以檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)，也可以用于某些固相雜交的實(shí)施方式中。在固相雜交實(shí)施方式中，被檢測(cè)的DNA(或RAN)被吸附或固定在特定的基質(zhì)或表面上，然后將這種固定的單鏈核酸與特定的探針在預(yù)設(shè)的條件下雜交。雜交條件的選擇要依據(jù)特定的環(huán)境(如G+C含量，靶核酸類型，核酸的來源，探針的大小等)。根據(jù)特定用途如何選擇最佳的雜交條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。雜交分子洗滌以去掉非特異結(jié)合的探針分子后就可以通過檢測(cè)結(jié)合的標(biāo)記物的量來確定雜交的結(jié)果。有代表性的固相雜交方法見美國(guó)專利5,843,663、5,900,481和5,919,626號(hào)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的其他雜交方法見美國(guó)專利5,849,481、5,849,486和5,851,772號(hào)。本方法的相關(guān)文獻(xiàn)以及說明書中本部分的其他文獻(xiàn)都已納入本文作為參考。2.核酸的擴(kuò)增用作模板進(jìn)行擴(kuò)增的核酸分子可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)從細(xì)胞組織或其他標(biāo)本中分離。在某些實(shí)施方式中，分析可以直接在完整細(xì)胞、組織勻漿物或生物液體標(biāo)本上進(jìn)行而不需要提取模板核酸。模板核酸可以是基因組DNA，提取的或完整細(xì)胞的RNA。如果用RNA就需要先將RNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的DNA。本文所用的術(shù)語“引物”包括能夠以模板依賴的方式引導(dǎo)初始核酸分子合成的任何核酸。一般的引物都是含有10到20或30個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，但是也可以更長(zhǎng)。引物可以是雙鏈的也可以是單鏈的，但是優(yōu)選單鏈形式?？膳cSEQIDNO1或其他SEQIDNO核酸特異性雜交的引物對(duì)在適宜的條件下與模板核酸反應(yīng)。根據(jù)雜交目的的不同選擇不同的雜交條件，選擇較嚴(yán)格的雜交條件是為了只允許完全互補(bǔ)的序列與引物雜交。而在另外一些實(shí)施方式中，雜交在較低嚴(yán)格性的條件下進(jìn)行，從而使那些含有一個(gè)或多個(gè)與引物序列不匹配堿基的核酸分子得以擴(kuò)增。雜交后將模板-引物復(fù)合物與一種或多種酶混和以促進(jìn)模板依賴的核酸合成。經(jīng)過多輪擴(kuò)增，也就是所說的“循環(huán)”，就可以得到足量的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物可以被檢測(cè)或定量。對(duì)于某些雜交可用可見方式檢測(cè)。另外也可以通過化學(xué)發(fā)光、放射性閃爍掃描摻入的放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記、甚至通過電脈沖和/或熱脈沖信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)(Sffymaxtechnology；Bellus，1994)間接確定擴(kuò)增產(chǎn)物的量。有許多模板依賴的方法可被用于擴(kuò)增給定模板標(biāo)本中的寡核苷酸序列。一個(gè)最常用的擴(kuò)增方法使多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(指“PCRTM”)，詳細(xì)描述見美國(guó)專利4,683,195，4,683,202和4,800,159號(hào)以及Innis等，1988，本文都已完整納入作為參考。反轉(zhuǎn)錄PCRTM擴(kuò)增方法可以確定所擴(kuò)增的mRNA的量。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法是本領(lǐng)域所熟知的(見，Sambrook等，1989)。另外反轉(zhuǎn)錄的方法使用熱穩(wěn)定性的DNA多聚酶。這些方法描述于WO90/07461。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。其中有代表性的RT-PCR方法描述于美國(guó)專利5,882,864號(hào)。其他的擴(kuò)增方法有連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)，見歐洲專利申請(qǐng)320308號(hào)，本文已完整納入作為參考。美國(guó)專利4,883,750號(hào)描述了一個(gè)與LCR相似的方法，該方法是將探針對(duì)與靶序列結(jié)合。美國(guó)專利5,912,148號(hào)所描述的基于PCRTM和寡核苷酸連接酶分析(OLA)的方法也可用于擴(kuò)增。還有一些擴(kuò)增本發(fā)明所用靶核酸序列的方法是描述在美國(guó)專利5,843,650，5,846,709，5,846,783，5,849,546，5,849,497，5,849,547，5,858,652，5,886,366，5,916,776，5,922,574，5,928,905，5,928,906，5,932,451，5,935,825，5,939,291，5,942,391號(hào)，英國(guó)專利申請(qǐng)2202328號(hào)以及PCT申請(qǐng)PCT/US89/01025號(hào)，本文已完整納入作為參考。PCT申請(qǐng)PCT/US87/00880號(hào)所描述的Qbeta復(fù)制酶也可用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法。該方法中，在RNA多聚酶存在的條件下將含有與靶序列互補(bǔ)區(qū)的RNA復(fù)制序列加入到標(biāo)本中，多聚酶就會(huì)拷貝復(fù)制序列，然后就可以檢測(cè)復(fù)制的序列。一種等溫?cái)U(kuò)增方法也可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子，該方法中的限制性內(nèi)切酶和連接酶用于擴(kuò)增在一條鏈上含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸限制性酶切位點(diǎn)的靶分子(Walker等，1992)。美國(guó)專利5,916,779號(hào)描述的鏈替換擴(kuò)增(SDA)是另一種等溫?cái)U(kuò)增核酸的方法，該方法需要進(jìn)行多輪鏈替換和合成，即缺刻翻譯。其他的核酸擴(kuò)增方法有以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989；PCT專利申請(qǐng)WO88/10315號(hào)，本文已納入作為參考)。歐洲專利申請(qǐng)329822號(hào)描述了一種核酸擴(kuò)增方法包括循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(“dsDNA”)，該方法也可用于本發(fā)明。PCT專利申請(qǐng)WO89/06700號(hào)(本文已完整納入作為參考)描述了一種核酸序列擴(kuò)增方法，該方法是通過將啟動(dòng)子區(qū)/引物序列與單鏈靶DNA(“ssDNA”)雜交然后轉(zhuǎn)錄出大量的RNA拷貝。這種方法不是循環(huán)性的，即合成出的RNA轉(zhuǎn)錄子不能作為新的模板。其他的擴(kuò)增方法包括“RACE”和“單面PCR”(Frohman，1990；Ohara等，1989)。3.核酸的檢測(cè)擴(kuò)增以后就需要將擴(kuò)增產(chǎn)物與模板和/或剩余引物分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物用標(biāo)準(zhǔn)方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙稀酰胺或聚丙稀酰胺凝膠電泳分離(Sambrook等，1989)。分離開的擴(kuò)增產(chǎn)物可以從凝膠中切下并洗脫出來進(jìn)行下一步的操作。例如利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，切下的條帶通過加熱可以去除瓊脂糖，然后可以提取出核酸。核酸的分離也可以用本領(lǐng)域所熟知的層析技術(shù)進(jìn)行。有許多種層析技術(shù)都可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，其中包括吸附層析、分配層析、離子交換層析、羥磷灰石層析、分子排阻層析、反相層析、柱層析、紙層析、薄層層析、氣相色譜以及HPLC。在某些實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物是可見的。典型的觀察方法是用溴化乙啶將凝膠染色然后在紫外燈下觀察顯色的條帶。另外，如果擴(kuò)增產(chǎn)物中含有放射性或熒光標(biāo)記的核苷酸，分離的擴(kuò)增產(chǎn)物就可以使X射線膠片曝光或者可以在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)下被看到。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離出擴(kuò)增產(chǎn)物后將標(biāo)記的核酸探針與擴(kuò)增的標(biāo)記序列結(jié)合。優(yōu)選的探針是連接發(fā)色基團(tuán)的，但是也可以用放射性標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針與結(jié)合伴侶如抗體、生物素或其他攜帶可檢測(cè)基團(tuán)的結(jié)合伴侶相連。在某些特定實(shí)施方式中，檢測(cè)是通過DNA印跡法與標(biāo)記探針雜交。DNA印跡法技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的(見Sambrook等，1989)。上述方法的一個(gè)例子描述在美國(guó)專利5,279,721中，本文已納入作為參考，該轉(zhuǎn)錄描述了核酸電泳及轉(zhuǎn)移的裝置和方法。該裝置不需要在外部操作凝膠就可以進(jìn)行電泳和雜交，因此很適于執(zhí)行本發(fā)明的方法。核酸檢測(cè)的其他方法也可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，這些方法描述于美國(guó)專利5,840,873，5,843,651，5,846,708，5,846,717，5,846,726，5,846,729，5,849,487，5,853,990，5,853,992，5,853,993，5,856,092，5,861,244，5,863,732，5,863,753，5,866,331，5,905,024，5,910,407，5,912,124，5,912,145，5,919,630，5,925,517，5,928,862，5,928,869，5,929,227，5,932,413，和5,935,791。本文已全部納入作為參考。4.其他分析其他基因篩選方法也可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，檢測(cè)基因組DNA、cDNA和/或RNA標(biāo)本中的基因突變。用于檢測(cè)點(diǎn)突變的方法包括變性梯度凝膠電泳(“DGGE”)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(“RFLP”)、化學(xué)或酶裂解方法、PCRTM擴(kuò)增的靶區(qū)直接測(cè)序(見上)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(“SSCP”)和本領(lǐng)域熟知的其他方法。一種篩選點(diǎn)突變的方法是基于Rnase裂解RNA/DNA或RNA/RNA異源雙螺旋中錯(cuò)配的堿基對(duì)。本文所用的術(shù)語“錯(cuò)配”是指雙鏈RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中的具有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)或錯(cuò)誤配對(duì)核苷酸的區(qū)域。因此這一定義包括那些由于插入/缺失突變以及單個(gè)或多個(gè)堿基點(diǎn)突變?cè)斐傻腻e(cuò)配。美國(guó)專利4,946,773號(hào)描述了一種RnaseA錯(cuò)配裂解分析方法，該方法是經(jīng)過退火使單鏈DNA或RNA檢測(cè)樣品與RNA探針結(jié)合，然后用RnaseA處理所形成的核酸雙螺旋。經(jīng)電泳后RnaseA處理單鏈產(chǎn)物根據(jù)大小不同而分開，然后通過與同樣處理的對(duì)照雙螺旋核酸相比較介可以檢測(cè)出錯(cuò)配的堿基。在對(duì)照雙螺旋核酸中無法看到的含有較小片段的樣品(裂解產(chǎn)物)為陽(yáng)性。其他研究人員設(shè)計(jì)了用RNaseI檢測(cè)錯(cuò)配的方法，該方法見于PromegaBiotech公司的文獻(xiàn)中。Promega公司推出了一種含有RNaseI的試劑盒，該酶可以裂解已知的四個(gè)錯(cuò)配中的三個(gè)。其他人用MutS蛋白或其他DNA修復(fù)酶來檢測(cè)單個(gè)堿基的錯(cuò)配。另外，檢測(cè)缺失、插入或替代突變的方法也可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，見美國(guó)專利5,849,483，5,851,770，5,866,337，5,925,525和5,928,870號(hào)，本文都已完整納入作為參考。C.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法合適的核酸轉(zhuǎn)移方法可以使本發(fā)明的組合物得以表達(dá)，這些方法包括任何將核酸(即DNA，包括病毒或非病毒載體)導(dǎo)入到細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或有機(jī)體中去的方法，如本文所描述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。這種方法包括而不限于直接導(dǎo)入DNA如通過注射(美國(guó)專利5,994,624，5,981,274，5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5,656,610，5,589,466和5,580,859，本文都已納入作為參考)，其中包括微注射(Harlan和Weintraub，1985；美國(guó)專利5,384,253號(hào)，本文已納入作為參考)；點(diǎn)穿孔(美國(guó)專利5,384,253號(hào)，本文已納入作為參考)；鈣磷酸鹽沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；用DEAE-葡聚糖然后用聚乙烯甘油(Gopal，1985)；直接聲波負(fù)荷(Fechheimer等，1987)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)；微發(fā)射轟擊(PCT專利申請(qǐng)WO94/09699和95/06128號(hào)；美國(guó)專利5,610,042，5,322,783，5,563,055，5,550,318，5,538,877和5,538,880，本文都已納入作為參考)；碳化硅纖維攪拌(Kaeppler等，1990；美國(guó)專利5,302,523和5,464,765號(hào)，本文都已納入作為參考)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利5,591,616和5,563,055號(hào)，本文都已納入作為參考)；PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993；美國(guó)專利4,684,611和4,952,500號(hào)，本文都已納入作為參考)；干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，1985)。通過上述的方法，細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或有機(jī)體可以被穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。III.核糖體滅活蛋白核糖體抑制毒素(RITs)是真核細(xì)胞蛋白合成強(qiáng)力抑制劑。一旦細(xì)胞內(nèi)這些蛋白上的酶催化區(qū)可以作為細(xì)胞毒性的n-糖苷酶催化滅活核糖體。這種滅活是通過裂解28srRNA4324位置上的腺嘌呤的n糖苷鍵來實(shí)現(xiàn)的，通過破壞延長(zhǎng)因子的結(jié)合位點(diǎn)來達(dá)到核糖體的不可逆滅活。RITs起初是從細(xì)菌中分離的，但在高等植物中最常見。在植物中有兩種類型的RITsI型毒素是單鏈多肽，具有核糖體抑制活性；II型毒素的A鏈與I型蛋白一樣，并且通過二硫鍵與B鏈相連，B鏈具有細(xì)胞結(jié)合活性。I型RITs的例子有g(shù)elonin，dodecandrin，tricosanthin，tricokirin，bryodin，紫茉莉抗病毒蛋白，大麥核糖體滅活蛋白(BRIP)，商陸抗病毒蛋白，saporins，luffins和momordins。II型毒素包括蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白。毒素可以和本文所描述的任一多肽結(jié)合或作為融合蛋白表達(dá)。另外，本發(fā)明的修飾蛋白還可以和小分子如化療藥或靶向藥物連接。A.免疫毒素本發(fā)明的毒素特別適于用作細(xì)胞毒治療藥物的組分。這些細(xì)胞毒藥物可以用于體內(nèi)以選擇性的清除特定類型的細(xì)胞，其中第二組分所具有的特異性結(jié)合能力可以引導(dǎo)毒素到達(dá)這些特定細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明的修飾毒素可以和單克隆抗體包括嵌合的或CDR嫁接的抗體、抗體區(qū)/片段(即Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)sub.2，單鏈抗體，F(xiàn)v或單個(gè)可變區(qū))結(jié)合形成細(xì)胞毒藥物。含有毒素的免疫結(jié)合物被稱為免疫毒素。免疫毒素也可以由融合蛋白而不是免疫結(jié)合物組成。連接含有用基因工程技術(shù)添加自由半胱氨酸殘基的單克隆抗體的修飾毒素也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中Fab’和F(ab’)sub.2的例子見PCT申請(qǐng)WO89/00999號(hào)中的描述，本文已納入作為參考。另外，修飾毒素也可以連接或融合人源化的或人工的抗體。這種人源化的抗體可從鼠抗體可變區(qū)開始構(gòu)建。1.抗體區(qū)來自各種免疫球蛋白家族的區(qū)都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。來自特異性抗體的兩個(gè)可變區(qū)都包括在本發(fā)明中，其中包括補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)，還有抗體中和區(qū)，其中包括那些可結(jié)合效應(yīng)分子的區(qū)如Fc區(qū)。抗體的抗原特異性編碼區(qū)如IgGs、IgMs或IgAs的可變區(qū)可以結(jié)合另外的分子如與抗體中和區(qū)或一種上述的治療化合物結(jié)合的毒素。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)基因可以含有一個(gè)單鏈抗體。制備單鏈抗體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。熟練技術(shù)人員可以參考美國(guó)專利5,359,046號(hào)(本文已納入作為參考)使用這些方法。單鏈抗體的制備是通過將重鏈和輕鏈的可變區(qū)用一個(gè)短肽接頭融合而成的，因此在這種單鏈分子上的抗原結(jié)合位點(diǎn)是從新形成的。通過一個(gè)含有15到25個(gè)氨基酸的肽或接頭將一個(gè)可變區(qū)的C端與另一個(gè)可變區(qū)的N端連接在一起就形成了一個(gè)單鏈抗體可變區(qū)(scFvs)，這種連接不會(huì)明顯影響抗體的抗原結(jié)合或結(jié)合特異性(Bedzyk等，1990；Chaudhary等，1990)。這些Fvs缺乏天然抗體所具有的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)(Fc)。含有單鏈抗體的免疫毒素在美國(guó)專利6,099,842號(hào)中有描述，本文特地納入作為參考。針對(duì)各種分子如癌基因、腫瘤相關(guān)抗原、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、酶、轉(zhuǎn)錄因子或受體的抗體都是本發(fā)明的考慮范圍。其他要考慮的還有抗血清、血管生成因子(VEGF/VPF；βFGF；αFGF；及其他)、凝集因子、以及血管生成所必須的內(nèi)皮細(xì)胞抗原(即V3整合素)。特別是生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)及其家族成員。本發(fā)明還包括一些靶向性組合物，這些組合物或者含有抗原特異性序列而針對(duì)特異性病原，或者可以識(shí)別細(xì)胞表面的標(biāo)記物而針對(duì)特定細(xì)胞類型。這種細(xì)胞表面標(biāo)記物的例子有腫瘤相關(guān)抗原或細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物如CD4或CD8。本發(fā)明的的抗體可以作為免疫毒素的一部分而靶向任何一種抗原?？乖梢允悄撤N有機(jī)體、某種類型的細(xì)胞或某種疾病或病原特異性的。典型的這種抗原包括細(xì)胞表面蛋白如腫瘤相關(guān)抗原、病毒蛋白、微生物蛋白、翻譯后修飾物或碳水化合物、以及受體。普通的腫瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿系腫瘤相關(guān)抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP，雌激素受體、層粘連蛋白受體、erbB和p155。其他可以作為靶位的抗原包括EGF和VEGF的受體、TIE-1和TIE-2、CD-33、CD38、CD-20、CD-52、GP-240、Lym-1、MMO-2和MMP-9。利用介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用，其中包括配基-受體相互作用的蛋白質(zhì)區(qū)域也是本發(fā)明所關(guān)注的。這個(gè)區(qū)域可以作為蛋白-蛋白相互作用的抑制劑或競(jìng)爭(zhēng)物，或者作為一個(gè)特異性靶向基序。因此，本發(fā)明包括利用靶向序列引導(dǎo)毒素或其他治療或診斷多肽到達(dá)身體的特定部位、器官、組織或細(xì)胞。一旦本發(fā)明的化合物通過其靶向基序到達(dá)特定區(qū)域，毒素或其他多肽就可以發(fā)揮其功能。靶向序列可以利用蛋白-蛋白相互作用的優(yōu)勢(shì)。其中包括蛋白之間的相互作用，如受體和配基；受體和受體；多聚復(fù)合物；轉(zhuǎn)錄因子；激酶及其下游的靶標(biāo)；酶和底物等。例如配基結(jié)合區(qū)可以介導(dǎo)配基與其同源受體之間的蛋白蛋白相互作用。因此這一區(qū)域可以用作抑制內(nèi)源性配基結(jié)合或與內(nèi)源性配基競(jìng)爭(zhēng)，或者用于靶向較特異的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)能識(shí)別配基結(jié)合區(qū)的受體，該結(jié)合區(qū)是人工連接到治療多肽上的，如gelonin毒素。配基結(jié)合區(qū)的例子包括配基如VEGF/VPF；βFGF；αFGF；黏附因子以及血管生成所必須的內(nèi)皮細(xì)胞抗原(即V3整合素)；生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、Kit配基(KL)、flk-2/flt-3和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)及其家族成員；能結(jié)合細(xì)胞表面受體如MHC分子的配基。研究最多的配基是asialoorosomucoid(ASOR)(Wu和Wu，1987)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。最近一個(gè)合成的新糖蛋白已被用作基因轉(zhuǎn)移載體，該蛋白和ASOR識(shí)別同一個(gè)受體(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)也被用于將基因轉(zhuǎn)移到鱗癌細(xì)胞中(Myers，EPO0273085)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Nicolau等人(1987)將乳糖-神經(jīng)酰胺，一種含半乳糖末端的asialganglioside，摻入到脂質(zhì)體中，觀察到可以增加肝細(xì)胞對(duì)胰島素基因的攝取。另外，人前列腺特異性抗原也可以作為受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到前列腺組織中。在其他的實(shí)施方式中，凝集素分子也可用于引導(dǎo)化合物到達(dá)在其表面表達(dá)特定碳水化合物的細(xì)胞內(nèi)。1.細(xì)胞因子本發(fā)明涉及的另一類化合物可以人工連接到治療多肽如毒素上，其中包括白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-干擾素、α-干擾素、γ-干擾素、血管他丁、血小板反應(yīng)素、內(nèi)皮他丁、METH-1、METH-2，F(xiàn)lk2/Flt3配基、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、以及腫瘤壞死因子(TNF)。2.生長(zhǎng)因子在本發(fā)明的另外一些實(shí)施方式中，生長(zhǎng)因子或配基也可以和治療藥物組成復(fù)合物。其中包括VEGF/VPF、FGF、TGFβ、與TIE結(jié)合的配基、腫瘤相關(guān)纖維連接蛋白同功酶、擴(kuò)散因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板因子(PF4)、PDGF、Kit配基(KL)、集落刺激因子(CSFs)、LIF和TIMP。3.細(xì)胞增殖誘導(dǎo)子可以與本發(fā)明的修飾蛋白如修飾gelonin毒素結(jié)合的另一組蛋白質(zhì)包括能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，毒素被人工連接到一種能滅活細(xì)胞增殖誘導(dǎo)子的核酶上，而在另外一些實(shí)施方式中，毒素被連接到誘導(dǎo)子上。另外，毒素也可以連接到能識(shí)別細(xì)胞增殖誘導(dǎo)子的抗體上。所有這些蛋白有一個(gè)共性就是其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的能力。例如，一種形式的PDGF是sis癌基因，也是一種分泌型的生長(zhǎng)因子。癌基因很少來自于編碼生長(zhǎng)因子的基因。但是在本發(fā)明中sis是唯一已知的天然癌基因性生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)特定細(xì)胞增殖誘導(dǎo)子的反義mRNA被用于抑制該細(xì)胞增殖誘導(dǎo)子的表達(dá)。蛋白質(zhì)FMS、ErbA、ErbB和neu是生長(zhǎng)因子受體。這些受體發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致其調(diào)節(jié)功能的喪失。例如，Neu受體蛋白跨膜區(qū)的一個(gè)點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致形成neu癌基因。ErbA癌基因來源于甲狀腺激素的胞內(nèi)受體。經(jīng)修飾的癌基因型ErbA受體被認(rèn)為可以與內(nèi)源性的甲狀腺激素受體競(jìng)爭(zhēng)而引起生長(zhǎng)失控。最大的一族癌基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(即Src，Abl和Ras)。蛋白Src是一種胞漿蛋白酪氨酸激酶，在某些情況下通過527位的酪氨酸殘基發(fā)生突變而使其從原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗颉Ｅc此相對(duì)應(yīng)的是，GTP酶蛋白ras通過其12位上的纈氨酸突變成甘氨酸而使其從原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗颍鋜asGTP酶活性降低。蛋白質(zhì)Jun、Fos和Myc作為轉(zhuǎn)錄因子直接在核內(nèi)發(fā)揮功能。4.細(xì)胞增殖抑制因子腫瘤抑制因子可以抑制細(xì)胞過度增殖。這些基因的滅活會(huì)使其抑制活性喪失，從而導(dǎo)致其無法調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。需要說明的是毒素可以連接到能識(shí)別突變的或野生型的腫瘤抑制因子上。下面描述的是腫瘤抑制基因p53、p16和C-CAM。在許多經(jīng)化學(xué)致癌、紫外照射以及幾種病毒轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞中有高水平的突變p53基因表達(dá)。在各種人類腫瘤中p53基因是很常見的突變滅活靶位，文獻(xiàn)中把它列為人類腫瘤中最常發(fā)生突變的基因。在人NSCLC(Hollstein等，1991)以及很多其他腫瘤中的突變率超過50％。P53基因編碼一個(gè)含393個(gè)氨基酸的磷酸蛋白，可以與宿主蛋白如大T抗原和E1B形成復(fù)合物。這個(gè)蛋白在正常組織和細(xì)胞中也存在，但與轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤組織相比其表達(dá)量很小。在許多種類的細(xì)胞中野生型p53基因被認(rèn)為是重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因。P53基因常常發(fā)生錯(cuò)義突變，這是其轉(zhuǎn)化為癌基因所必須的。點(diǎn)突變?cè)斐傻膯蝹€(gè)遺傳性改變就形成了致癌基因p53。但是與其他癌基因不同的是，已知在至少30個(gè)不同的密碼子上都會(huì)發(fā)生p53的點(diǎn)突變，常常生成顯性等位基因而造成細(xì)胞表型的漂移，卻不會(huì)出現(xiàn)純合性的下降。另外，許多這樣的顯性負(fù)等位基因能被有機(jī)體內(nèi)耐受并且可以在種系內(nèi)傳代。各種等位基因突變表現(xiàn)為從微小的功能障礙到強(qiáng)滲透性的顯性負(fù)等位基因(Weinberg，1991)。另外一種細(xì)胞增殖抑制因子是p16。真核細(xì)胞周期的過渡主要依靠周期素依賴性蛋白激酶即CDK’s的激發(fā)。一種CDK，周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)調(diào)節(jié)細(xì)胞通過G1期。這個(gè)酶的活性在G1晚期可能使Rb磷酸化。CDK4的活性由活化亞單位，D型周期素和抑制亞單位控制，抑制亞單位p16INK4的生化特征已經(jīng)被確定，作為一個(gè)蛋白它可以特異性地結(jié)合并抑制CDK4，因此可以調(diào)節(jié)Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。p16INK4屬于一類新發(fā)現(xiàn)的CDK抑制蛋白，這一類蛋白還包括p16B、p19、p21waf1和p27KIP1。p16INK4基因位于染色體9p21位置，該位點(diǎn)在許多類型的腫瘤中出現(xiàn)缺失。人類腫瘤細(xì)胞系中常常發(fā)生p16INK4基因的純合缺失或突變。這些都表明p16INK4基因是一個(gè)腫瘤抑制基因。但是這一觀點(diǎn)最近受到挑戰(zhàn)，研究發(fā)現(xiàn)在最初未經(jīng)培養(yǎng)的腫瘤中p16INK4基因突變的幾率比培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中的突變幾率低很多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)。通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)載體恢復(fù)野生型p16INK4基因的功能可以降低某些人腫瘤細(xì)胞系的克隆形成能力(Okamoto，1994；Arap，1995)。可以用于本發(fā)明中的其他基因包括Rb、APC、mda-7、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合子、p21/p27融合子、抗血栓基因(即COX-1，TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、gsp、hst、abl、E1A、p300、參與血管形成的基因(即VEGF，F(xiàn)GF，血小板凝血酶敏感蛋白，BAI-1，GDAIF，及其受體)以及MCC。5.程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子調(diào)亡或程序性細(xì)胞死亡是正常胚胎發(fā)育、維持成年組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及抑制腫瘤發(fā)生的必需過程(Kerr等，1972)。Bcl-2蛋白家族和ICE樣蛋白酶已被證實(shí)是其他系統(tǒng)中細(xì)胞調(diào)亡的重要調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白與濾泡淋巴瘤相關(guān)，在控制調(diào)亡和增加受各種調(diào)亡刺激的細(xì)胞的存活率方面發(fā)揮主要作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。進(jìn)化保守的Bcl-1蛋白現(xiàn)在被認(rèn)為是相關(guān)蛋白家族的一個(gè)成員，這一家族被分類為細(xì)胞死亡激動(dòng)劑或細(xì)胞死亡拮抗劑。Apo2配基(Apo2L，也叫TRAIL)是腫瘤壞死因子家族的一個(gè)成員。TRAIL可以使許多類型的腫瘤細(xì)胞快速調(diào)亡，但對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。各種組織內(nèi)都有TRAIL的mRNA。大多數(shù)正常細(xì)胞對(duì)TRAIL的細(xì)胞毒活性耐受，說明正常細(xì)胞內(nèi)存在一種機(jī)制可以保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗TRAIL誘導(dǎo)的調(diào)亡。首先發(fā)現(xiàn)的一個(gè)TRAIL受體叫死亡受體4(DR4)，該受體含有一個(gè)胞漿“死亡區(qū)”。DR4可以傳遞TRAIL攜帶的信號(hào)。還有一些受體被確定可以和TRAIL結(jié)合，其中一個(gè)受體叫DR5，含有胞漿死亡區(qū)并能象DR4一樣傳遞調(diào)亡信號(hào)。在許多正常組織和腫瘤細(xì)胞系中都有DR4和DR5mRNA的表達(dá)。最近發(fā)現(xiàn)誘餌受體如DcR1和DcR2可以阻止TRAIL通過DR4和DR5誘導(dǎo)調(diào)亡。因此這些誘餌受體代表了一種新型的調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)直接作用于細(xì)胞表面的前調(diào)亡細(xì)胞因子的敏感性的作用機(jī)制。這些抑制受體在正常組織內(nèi)優(yōu)先表達(dá)說明TRAIL可以作為一種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡而對(duì)正常細(xì)胞不發(fā)生作用(Marsters等，1999)。在此發(fā)現(xiàn)以后又觀察到Bcl-2可以抑制各種刺激激發(fā)的細(xì)胞死亡。而且現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)明顯存在一個(gè)Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白家族，該家族具有相同的結(jié)構(gòu)和序列同源性。這一家族的成員中有的與Bcl-2的功能相同(即BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、Al、Bfl-1)，有的則對(duì)抗Bcl-2的功能促進(jìn)細(xì)胞死亡(即Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。需要說明的是，這些多肽中的任意一個(gè)，包括TRAIL和其他誘導(dǎo)或促進(jìn)調(diào)亡的多肽，都可以連接一個(gè)毒素，或者在毒素上連接一個(gè)能識(shí)別這些多肽的抗體。IV.修飾蛋白和人工毒素的制備方法本發(fā)明包括確定一個(gè)蛋白質(zhì)上抗原區(qū)的方法、確定低抗原性區(qū)的方法、制備低抗原性而具有和天然蛋白相同活性的蛋白的方法、以及分析和確定抗原性和活性的方法。A.抗原區(qū)在上述部分已經(jīng)概括地討論了抗體和抗體檢測(cè)方法。術(shù)語“抗原區(qū)”是指能被抗體或T細(xì)胞受體特異識(shí)別的蛋白上的一部分。術(shù)語“較低抗原性”是指蛋白或蛋白的一部分激發(fā)較低程度的抗體反應(yīng)，或者只有少數(shù)抗體(多克隆)能識(shí)別或其結(jié)合的抗體下降?？乖耘c特定有機(jī)體有關(guān)。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式中，有機(jī)體指人，但是抗原性也可指其他有機(jī)體如其他哺乳動(dòng)物-猴、大猩猩、牛、兔、小鼠、綿羊、貓、狗、豬、山羊等，也可以是鳥類或其他任何可以激發(fā)免疫反應(yīng)的有機(jī)體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，多克隆血清用于上述的免疫檢測(cè)方法以確定特定蛋白上的抗原區(qū)。多克隆血清可以從各種來源收集，包括懷疑從事接觸特定蛋白職業(yè)的工作人員；被懷疑或診斷為具有某種狀態(tài)或疾病的病人，這種狀態(tài)或疾病伴隨或有特定蛋白或有機(jī)體的抗體存在；患有不再治療的某種狀態(tài)或疾病的病人，這種狀態(tài)或疾病伴隨或有特定蛋白或有機(jī)體的抗體存在；以及隨機(jī)受試者。B.數(shù)據(jù)庫(kù)在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，特定蛋白上的理論抗原區(qū)確定后就要運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。然后將這個(gè)區(qū)與含有有機(jī)體來源蛋白序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比較以便找到對(duì)該區(qū)有較低免疫反應(yīng)的序列。現(xiàn)在已有許多商業(yè)的或公共的數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank、GenPept、SwissProt、PIR、PRF、PDB，所有這些數(shù)據(jù)庫(kù)都可以從國(guó)家生物技術(shù)信息網(wǎng)站中心獲得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。C.去除和/或替代抗原區(qū)抗原區(qū)一旦被確定就可以被去除制備一個(gè)截短的蛋白。另外，該區(qū)也可以用被認(rèn)為抗原性較低的區(qū)替代。為了去除抗原區(qū)，可以用蛋白酶裂解多肽，或者改造編碼多肽的多聚核苷酸以去除抗原區(qū)?？梢杂贸Ｒ?guī)的重組DNA技術(shù)將抗原區(qū)從多聚核苷酸上去掉，如用限制性酶或DNA酶。抗原區(qū)也可以被替代氨基酸替換?！疤娲笔侵柑囟ㄎ恢玫陌被峥梢杂貌煌陌被釟埢蛐揎椀陌被崽鎿Q。有許多方式可以完成這種替換。如首先去掉抗原區(qū)，然后將替代區(qū)插入到多聚核苷酸或多肽中。利用重組DNA技術(shù)可以將特定編碼區(qū)插入到多聚核苷酸序列中。另外也可以用位點(diǎn)同源性突變技術(shù)突變抗原區(qū)，這也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。需要說明的是抗原區(qū)任何一側(cè)的氨基酸都可以被去掉或替換以獲得修飾蛋白或改善蛋白的某些特征，如降低其抗原性、增加蛋白的穩(wěn)定性、增加蛋白的活性、降低蛋白的活性等。而且抗原區(qū)和抗原區(qū)兩側(cè)的多個(gè)氨基酸可以被同時(shí)替換或去掉。因此能被去掉或替換的氨基酸數(shù)目為正好或至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，620，640，660，680，700，720，740，760，780，800，820，840，860，880，900，920，940，960，980，1000，或更多個(gè)。確定修飾蛋白抗原性或活性的分析方法在本文中也有描述，如免疫檢測(cè)方法部分，這些方法都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。蛋白不同合適的分析方法也不同。酶催化分析適于評(píng)價(jià)酶的活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該能夠評(píng)價(jià)與天然蛋白相關(guān)的修飾蛋白的活性。如上所述，修飾蛋白可以附著(結(jié)合或融合)在另一個(gè)多肽、肽或蛋白上。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)多肽組分的活性應(yīng)該能夠評(píng)價(jià)本發(fā)明的任何一種經(jīng)修飾的結(jié)合或融合蛋白。V.聯(lián)合治療為了增加本發(fā)明的任一治療組合物的效率，需要將這些組合物與能有效治療特定疾病或病情的其他藥物聯(lián)合使用。需要說明的是可以治療的病情或疾病的范圍很寬，如微生物引起的疾病，AIDS，自身免疫病，過度增生性疾病如癌癥、淋巴瘤、關(guān)節(jié)炎，心血管疾病、病原性疾病，以及糖尿病。AIDS、腫瘤及其他過度增生性疾病的治療是特別要考慮的。所使用的聯(lián)合治療方案如下，其中含有修飾蛋白的組合物是“A”，另一種藥物是“B”。A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA.過度增生性疾病的治療過度增生性疾病包括腫瘤，治療腫瘤的方案有多種，如抗腫瘤藥物或手術(shù)?！翱鼓[瘤”藥物是指能夠?qū)◇w的腫瘤產(chǎn)生負(fù)性效應(yīng)的藥物，例如通過殺傷腫瘤細(xì)胞，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、降低轉(zhuǎn)移的幾率或轉(zhuǎn)移癌的數(shù)量、使腫瘤縮小、抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤或癌細(xì)胞的血供、增強(qiáng)抗癌細(xì)胞或腫瘤的免疫反應(yīng)、阻止或抑制腫瘤的惡性度增加、或者延長(zhǎng)癌癥患者的生存期。抗腫瘤藥物包括生物藥(生物治療)、化療藥和放療藥。比較常用的是這些藥物聯(lián)合使用并以有效劑量殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這一過程包括使細(xì)胞與表達(dá)構(gòu)建物和藥物或多種因子同時(shí)接觸。這可以通過使細(xì)胞與單個(gè)組合物或藥用制劑接觸，該組合物或制劑中含有兩種藥物，或者使細(xì)胞與兩種不同組合物或藥用制劑同時(shí)接觸，其中一種組合物含有表達(dá)構(gòu)建物，另一種組合物含有第二藥物。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥或放療藥耐受是臨床腫瘤學(xué)遇到的主要問題。當(dāng)前腫瘤研究的一個(gè)目標(biāo)是找到結(jié)合基因治療提高化療或放療效果的途徑。例如單純皰疹-胸腺激酶(HS-tK)基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)移到腦腫瘤中時(shí)可以成功誘導(dǎo)腫瘤對(duì)抗病毒藥物9-1；3-二羥-2-丙氧甲基鳥嘌呤變?yōu)槊舾?Culver等，1992)。對(duì)于本發(fā)明來說需要考慮的是修飾蛋白治療方法同樣也可以與化療、放療、免疫治療或其他生物干預(yù)措施聯(lián)合使用，另外還有其他的前調(diào)亡調(diào)節(jié)藥或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)藥。另外，在其他藥物治療前或治療后數(shù)分鐘到數(shù)周內(nèi)可以進(jìn)行基因治療或修飾蛋白治療。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，其他藥物和表達(dá)構(gòu)建物分別給予細(xì)胞，其間隔時(shí)間一般不超過每一藥物的有效作用時(shí)間，這樣藥物和表達(dá)構(gòu)建物還能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生聯(lián)合效應(yīng)。這種治療方式中，細(xì)胞與兩種藥物接觸的時(shí)間約間隔12-24小時(shí)以內(nèi)，優(yōu)選6-12小時(shí)之內(nèi)。在某些情況下，兩種治療的間隔時(shí)間可能到數(shù)天(2，3，4，5，6，或7天)至數(shù)周(2，3，4，5，6，7或8周)。本發(fā)明的治療性表達(dá)構(gòu)建物的給藥途徑按照一般的化療藥給藥途徑，只是要考慮載體的毒性。如果需要治療周期可以重復(fù)。還要說明的是各種標(biāo)準(zhǔn)治療措施，包括手術(shù)，也可以與本文所描述的過度增生性細(xì)胞治療措施聯(lián)合使用。a.化療癌癥治療措施也包括各種聯(lián)合化學(xué)治療和放射治療的措施。例如聯(lián)合化療藥包括順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二甲磺酸丁酯、亞硝脲、放線菌素、正定霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊甙(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合藥、紫杉醇、gemcitabien、navelbine、farnesyl蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、transplatinum、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和氨甲蝶呤、temazolomide(DITC水溶液)，或者上述藥物的類似物或衍生物?；熃Y(jié)合生物資料就是大家都知道的生物化療。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，化療藥被人工連接到修飾蛋白如毒素分子上。b.放療廣泛使用的引起DNA損傷的其他因素包括大家都知道的γ射線、X射線、和/或直接將放射性同位素運(yùn)送到腫瘤細(xì)胞。其他形式的DNA損傷因子還有微波和紫外線輻射。最可能的是所有這些因子都可以對(duì)DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的裝配和維持造成廣泛的損傷。X射線的照射劑量范圍從每日50-200倫琴持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間(3到4周)，到單次劑量2000-6000倫琴。放射性同位素的使用劑量范圍很寬，要根據(jù)同位素的半衰期、輻射的強(qiáng)度和類型以及腫瘤細(xì)胞的攝取量而定。本文中所用的術(shù)語“接觸”和“暴露于”用到細(xì)胞上時(shí)是指將治療構(gòu)建物和化療藥或放療藥運(yùn)送到靶細(xì)胞的過程或直接與靶細(xì)胞并列放置的過程。為了達(dá)到殺傷細(xì)胞或抑制細(xì)胞的目的，兩種藥物都以有效劑量運(yùn)送到細(xì)胞從而殺傷細(xì)胞或阻止細(xì)胞分裂。c.免疫治療一般來說免疫治療依賴免疫效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子靶向到達(dá)并殺傷癌細(xì)胞。免疫效應(yīng)物可以是具有腫瘤細(xì)胞表面某些標(biāo)記物特異性的抗體。抗體單獨(dú)就可以作為治療效應(yīng)分子，也可以通過其他細(xì)胞來達(dá)到殺傷靶細(xì)胞的目的。如上述關(guān)于權(quán)利要求的組合物的討論，抗體也可以連接到藥物或毒素分子上(化療藥、放射性核酸、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)僅僅作為靶向分子。另外，效應(yīng)細(xì)胞也可以是淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞上攜帶能直接或間接與腫瘤細(xì)胞靶位相互作用的表面分子。各種效應(yīng)細(xì)胞都可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞。聯(lián)合使用各種治療措施如直接細(xì)胞毒活性和免疫活化對(duì)癌癥的治療有益，因此可以考慮將免疫治療措施與本發(fā)明的其他治療化合物聯(lián)合使用。例如，兩種不同的免疫毒素可以同時(shí)給予一個(gè)病人，或者免疫毒素與其他治療化合物聯(lián)合使用治療疾病如治療腫瘤。對(duì)于免疫治療來說，腫瘤細(xì)胞必須攜帶能作為靶點(diǎn)并且在大多數(shù)其他類型的細(xì)胞中不存在的標(biāo)記物。腫瘤中有許多標(biāo)記物，其中任何一個(gè)都可以作為本發(fā)明的靶點(diǎn)。免疫治療的另外一個(gè)方式是pro-apoptotic效應(yīng)結(jié)合免疫刺激效應(yīng)。但是替代免疫刺激分子也可以存在，包括細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，化學(xué)因子如MIP-1、MCP-1、IL-8，以及生長(zhǎng)因子如FLT3配基。免疫刺激分子作為一個(gè)蛋白或與直接抗腫瘤的免疫毒素結(jié)合用作基因轉(zhuǎn)移都可以增加其抗腫瘤效應(yīng)。如上所討論的，當(dāng)前正在研究或正在使用的免疫治療措施有免疫佐劑(如mycobactriumboovis，Plasmodiumfalciparum，二硝基氯苯和芳香族化合物)(美國(guó)專利5,801,005號(hào)；美國(guó)專利5,739,169號(hào)；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)，細(xì)胞因子治療(如干擾素α、β和γ，IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)，基因治療(如TNF，IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美國(guó)專利5,830,88和5,846,945號(hào))以及單克隆抗體(如抗神經(jīng)節(jié)甘脂GM2抗體，抗HER-2抗體，抗p185抗體)(Pirtras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國(guó)專利5,824,311號(hào))。Herceptin(trastuzumab)是一種封閉HER2-neu受體的嵌合(鼠-人)單克隆抗體。該抗體具有抗腫瘤活性，已被證實(shí)可用于治療惡性腫瘤(Dillman，1999)。i.被動(dòng)免疫治療現(xiàn)有的癌癥被動(dòng)免疫治療方法有很多種。如下列所示單獨(dú)抗體注射；抗體聯(lián)合毒素或化療藥物注射；抗體結(jié)合同位素注射；抗獨(dú)特型抗體注射；以及從骨髓中凈化腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選人單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，因?yàn)樵摽贵w在病人體內(nèi)的毒副作用較少或沒有。但是由于其來源缺乏而使其應(yīng)用受到限制，到目前為止只能注射到病變部位。神經(jīng)節(jié)甘脂的人單克隆抗體已用于注射到有復(fù)發(fā)皮膚黑色素瘤病人的病變部位(Irie和Morton，1986)。每天或每周病變部位注射抗體后10個(gè)病人中有6個(gè)病人的腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。在另一個(gè)試驗(yàn)中，通過在病變部位注射兩種人單克隆抗體獲得了適度的成功(Irie等，1989)。較好的方法是注射針對(duì)兩種不同抗原的多種單克隆抗體，或具有多種抗原特異性的抗體。治療方案也可以包括注射淋巴因子或其他免疫增強(qiáng)劑，如Baiorin等人的描述(1988)。人單克隆抗體的制備方法在說明書的其他部分有詳細(xì)描述。ii.主動(dòng)免疫治療主動(dòng)免疫治療注射的是抗原性肽、多肽或蛋白，或者自體的或同種異體的腫瘤細(xì)胞組分或者叫“疫苗”，通常情況下都要輔以細(xì)菌佐劑(Ravindranath和Morton，1991；Morton和Ravindranath，1996；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。在黑色素瘤的免疫治療中，產(chǎn)生高滴度IgM抗體的病人的生存狀態(tài)要好于無或低滴度IgM的病人(Morton等，1992)。通常IgM抗體都是一過性抗體，但抗神經(jīng)節(jié)甘脂的抗體和抗碳水化合物的抗體是例外。iii.獲得性免疫治療在獲得性免疫治療中，從病人的血液中分離淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，在體外用淋巴因子如IL-2活化或轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤壞死基因，然后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)(Rosenberg等，1988；1989)。為了達(dá)到這一目的，將免疫有效量的活化淋巴細(xì)胞聯(lián)合本文所描述的含佐劑的抗原肽組合物輸注給動(dòng)物或病人。最佳的活化淋巴細(xì)胞是來自于病人自身的細(xì)胞，這些細(xì)胞預(yù)先從病人的血液或腫瘤標(biāo)本中分離出來并再體外活化(或“擴(kuò)增”)。這種免疫治療措施已使幾例黑色素瘤病人和腎癌病人的腫瘤受到抑制，但是響應(yīng)者的百分?jǐn)?shù)要少于未有反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)。d.基因治療在另外一個(gè)實(shí)施方式中，輔助治療措施是基因治療，其中在給予修飾蛋白或編碼修飾蛋白的多聚核苷酸之前、之后或同時(shí)給予治療性多聚核苷酸。另外也可以用編碼兩種不同治療性多肽的單一載體。本發(fā)明所涵蓋蛋白質(zhì)的種類很多，其中有些在上面已經(jīng)描述過。例如，基因治療可用于向癌細(xì)胞提供野生型的腫瘤抑制基因。e.手術(shù)治療大約60％的癌癥患者要做某種手術(shù)，其中包括預(yù)防性手術(shù)、為診斷或分期而進(jìn)行的手術(shù)、治療性手術(shù)以及緩解性手術(shù)。治療性手術(shù)是一種可以結(jié)合其他治療措施的腫瘤治療措施，如本發(fā)明的治療措施、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他治療措施。治療性手術(shù)包括切除，就是將全部或部分癌組織去掉、切去和/或毀壞。腫瘤切除是指物理去除至少一部分腫瘤。除了切除腫瘤以外，手術(shù)治療還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)、以及顯微外科手術(shù)(Mohs’手術(shù))。需要進(jìn)一步說明的是本發(fā)明也可和切除淺表癌、癌前組織或附帶量的正常組織結(jié)合使用。癌細(xì)胞、組織或腫瘤被切除以后會(huì)在體內(nèi)的該位置上形成腔隙。因此可以通過灌注、直接注射或局部使用附加抗腫瘤藥物進(jìn)行治療。這種治療方案可以重復(fù)進(jìn)行，如每1，2，3，4，5，6或7天，或者每1，2，3，4或5周，或者每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12個(gè)月進(jìn)行一次。治療劑量也可以變化。f.其他藥物需要說明的是其他藥物也可以和本發(fā)明的組合物聯(lián)合使用以增強(qiáng)治療效果。這些藥物包括免疫調(diào)節(jié)劑、上調(diào)細(xì)胞表面受體和GAP連接的藥物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和分化劑、細(xì)胞黏附抑制劑、增加過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡誘導(dǎo)物敏感性的藥物、或其他生物藥物。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β、γ；IL-2及其他細(xì)胞因子；F42K及其他細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES及其他化學(xué)因子。需要進(jìn)一步說明的是，細(xì)胞表面受體或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配基)的表達(dá)上調(diào)可以通過對(duì)過度增殖細(xì)胞的自分泌或旁分泌效應(yīng)而賦予本發(fā)明的化合物以抗腫瘤的能力。GAP連接數(shù)目的增加而導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)增強(qiáng)可以對(duì)鄰近的過度增殖細(xì)胞產(chǎn)生抗過度增殖效應(yīng)。在另外一些實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和分化劑可以和本發(fā)明的組合物聯(lián)合使用以增強(qiáng)抗過度增殖效應(yīng)。細(xì)胞黏附抑制劑也可以增強(qiáng)本發(fā)明組合物的治療效果。細(xì)胞黏附抑制劑的例子有病灶黏附激酶(FAKs)抑制劑和洛伐他丁。需要進(jìn)一步說明的是增加過度增殖細(xì)胞對(duì)調(diào)亡敏感性的其他藥物如抗體c225也可以和本發(fā)明的組合物聯(lián)合使用以增強(qiáng)治療效果。在通過引入細(xì)胞毒化療藥物進(jìn)行癌癥治療的研究方面已取得了許多進(jìn)展。但是化療的一個(gè)結(jié)果就是具有耐藥表型細(xì)胞的出現(xiàn)及多藥耐藥的發(fā)生。耐藥的發(fā)生依然是腫瘤治療的一大障礙，因而急需尋找其他治療措施如基因治療。許多研究者的試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)TRAIL耐藥的腫瘤細(xì)胞可以用亞毒性濃度的藥物/細(xì)胞因子致敏，致敏的腫瘤細(xì)胞可以被TRAIL顯著殺傷(Bonavida等，1999；Bonavida等，2000；Gliniak等，1999；Keane等，1999)。而且TRAIL與化療藥如CPT-11或阿霉素聯(lián)合使用也可以增強(qiáng)其抗腫瘤活性，增加其誘導(dǎo)調(diào)亡的效果。這些效應(yīng)中的某些效應(yīng)是通過上調(diào)TRAIL或其同源受體而介導(dǎo)的，其他的效應(yīng)則不是通過這種機(jī)制。與化療、放療或生物治療聯(lián)合應(yīng)用的其他治療措施包括溫?zé)岑煼?，該療法是將病人的組織置于高溫下(可高達(dá)106oF)。外部或內(nèi)部加熱裝置可用于局部、區(qū)域或全身的溫?zé)岑煼?。局部溫?zé)岑煼ㄊ羌訜嵋粋€(gè)小的區(qū)域如腫瘤部位。從外部加熱可以使用置于體外的能產(chǎn)生靶向腫瘤的高頻微波裝置。內(nèi)部加熱可以通過一個(gè)無菌探針，如加熱的細(xì)金屬絲或裝滿熱水的中空管、植入的微波天線、或射頻電極。病人的器官或肢體可以被加熱進(jìn)行區(qū)域治療，用能產(chǎn)生高能量的裝置如磁鐵就可以實(shí)現(xiàn)。另外，可以將病人的血液抽出加熱后回輸?shù)叫枰M(jìn)行內(nèi)部加熱的部位。某些腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到全身的病人可以進(jìn)行全身加熱。熱水套、熱石蠟、感應(yīng)線圈和加熱室都可用于全身加熱。激素治療也可與本發(fā)明的治療措施或上面所描述的其他腫瘤治療措施聯(lián)合使用。激素可用于治療某些特定的癌癥如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或頭頸癌以降低某種激素如睪酮或雌激素的水平或阻斷其效應(yīng)。這種治療措施通常和至少一種其他治療措施聯(lián)合使用作為備選治療方案或降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。B.病毒致病機(jī)理本發(fā)明的組合物和方法顯然與病毒性疾病的治療或診斷有關(guān)。例如，本發(fā)明可用于由HIV感染而引起的AIDS。因此本發(fā)明可與傳統(tǒng)的治療措施相結(jié)合。這些治療措施描述如下1.AZT大家所熟知的AIDS的傳統(tǒng)治療藥物是zovidovudine(BurroughsWellcome有AZTTM)。這是一類核苷類似物，是一種二聚脫氧核苷酸，可以通過抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶二阻斷HIV的復(fù)制。如Burger等人的描述，抗AIDS藥物zovidovudine(也稱作齊多夫定)也可在一定的范圍內(nèi)應(yīng)用，大多數(shù)情況下是與利福平聯(lián)合應(yīng)用。本文所描述的組合物和方法與其他治療措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí)特別有效，如AZT和/或抑制病毒復(fù)制的蛋白酶抑制劑，這些藥物可以使白細(xì)胞維持在一個(gè)較理想的水平上。這就為病人爭(zhēng)取到了抗病毒治療所需的時(shí)間。2.HAART新的藥物聯(lián)合治療方案在治療HIV感染的病人中獲得了有希望的結(jié)果。用高效抗HIV藥物進(jìn)行聯(lián)合治療被稱作“高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療”(HAART)，這種治療方案可以改善所有四期HIV病人的臨床癥狀、延長(zhǎng)生存期、提高生活質(zhì)量。HAART包括蛋白酶抑制劑(印地那韋、那非那韋、利托那韋、利托那韋/沙喹那韋、沙喹那韋)和兩種核苷類似物(AZT/ddI，d4T/ddI，AZT/ddC，AZT/3TC，或d4T/3TC)。V.藥學(xué)上可接受的組合物和給要途徑本發(fā)明涉及編碼修飾蛋白(包括融合蛋白)的核酸分子及可與其他蛋白化合物或小分子結(jié)合的修飾蛋白。在某些實(shí)施方式中，給予試驗(yàn)對(duì)象以藥學(xué)上可接受的組合物。本發(fā)明的不同方面都包括給予有效劑量的水性組合物。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中特別將修飾gelonin作為免疫毒素給予。這種組合物一般溶解或分散于藥用載體或水性介質(zhì)中。另外，根據(jù)所治療的疾病或病情將這種化合物與其他治療措施聯(lián)合應(yīng)用。AIDS的治療包括給予HAART或AZT，或者二者聯(lián)合使用，而癌癥的治療包括手術(shù)或化療、放療、免疫治療或激素治療。A.給藥途徑本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該熟知如何在體內(nèi)和體外應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移措施。對(duì)于病毒載體來說一般需要制備病毒載體庫(kù)。根據(jù)病毒的種類及滴度的不同，可以將1到100，10到50，100-1000，或者高達(dá)1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011或1×1012感染性病毒顆粒給予病人。通過比較相對(duì)攝取效率可以推斷出脂質(zhì)體或其他非病毒制劑的給藥劑量。以藥學(xué)上可接受的組合物形式存在的制劑討論如下術(shù)語“藥用的”是指將分子或組合物以適當(dāng)方式給予動(dòng)物或人時(shí)不會(huì)產(chǎn)生相反的、過敏性的或其他意外的反應(yīng)。本文所用的術(shù)語“藥用載體”包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗細(xì)菌或抗真菌藥、等滲的吸收延遲藥物、以及類似物質(zhì)。這些介質(zhì)或藥物用作藥理活性物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。除了那些與活性組分不相容的傳統(tǒng)介質(zhì)或藥物以外，其他的都可以用在治療組合物中。附加的活性組分如其他抗癌藥物也可以包括在組合物中。除了可以將化合物制備成胃腸道外途徑如靜脈或肌肉注射給藥的制劑以外，其他的藥學(xué)上可接受的組合物形式還包括口服的片劑或其他固體物；控釋膠囊；以及現(xiàn)在所使用的其他形式如乳膏、洗液、漱口液、吸入劑及類似物質(zhì)。本發(fā)明的活性化合物可以制備成胃腸道外途徑給藥的制劑，如通過靜脈、肌肉、胸內(nèi)、皮下、甚至腹膜內(nèi)注射給藥的制劑。根據(jù)本文所描述的本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該能夠知道如何制備含有化合物或能增加MHCI類分子表達(dá)的化合物的水性組合物。一般來說，這種組合物都是制備成可注射的溶液或懸液；在注射前通過加入液體可制備成溶液或懸液的固體；以及可乳化形式。用混以適當(dāng)比例表面活性劑如羥丙纖維素的水可以將活性化合物制備成自由堿溶液或藥用鹽溶液。也可以用甘油、液體聚乙烯甘油或二者混合物以及油將活性化合物制備成分散液。在普通儲(chǔ)存和使用條件下需要在制備物中加入防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。適于注射用的藥用制劑包括無菌水溶液或分散液；用香油、花生油或水性丙稀甘油制成的制劑；以及可以即時(shí)制備成無菌注射液或分散液的滅菌粉末。所有的制劑必須是無菌的并且在一定程度上保持液態(tài)以便易于注射。在制備和儲(chǔ)存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且應(yīng)該經(jīng)防腐處理以避免微生物如細(xì)菌和真菌的污染。活性化合物液可以制備成溶于中性溶液或鹽溶液中的組合物。藥用鹽溶液包括加酸的鹽溶液(與蛋白上的自由氨基結(jié)合)，其中所用的酸為無機(jī)酸如鹽酸、磷酸，或者是有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、mandelic等。與自由羧基結(jié)合的鹽可以是來自于無機(jī)堿的鹽，如鈉鹽、鉀鹽、氨鹽、鈣鹽，或者來自于有機(jī)堿的鹽如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等。載體可以是溶劑或含有水、乙醇、多元醇(如甘油、丙稀甘油、液體聚丙稀甘油等)、上述物質(zhì)的適當(dāng)混合物以及植物油的分散介質(zhì)。另外還需要加入包被劑如卵磷脂以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，加入表面活性劑以維持在分散液中顆粒直徑。阻止微生物污染的方法是通過加入各種抗細(xì)菌或抗真菌藥物如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下優(yōu)選加入等滲試劑如糖或氯化鈉。延遲可注射組合物的吸收可通過在組合物中加入吸收延遲劑如單硬脂酸鋁和明膠來實(shí)現(xiàn)。滅菌注射液的制備是通過將溶于適當(dāng)溶劑中的一定量的活性化合物與上面所列舉的各種其他組分混和，如果需要的話則經(jīng)過過濾滅菌。一般來說，分散液的制備是通過將各種滅菌活性組分加入到含有基本分散物和上面所列舉的各種其他組分的無菌載體中。能制成無菌注射液的粉末制備方法優(yōu)選真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，通過這兩種技術(shù)可以制備成活性成分的粉末，然后可以加入來自于上述過濾除菌溶液的組分。在某些情況下，本發(fā)明的治療制劑也可以制備成適于局部使用的形式，如乳膏和洗液。這種制劑用于治療皮膚相關(guān)疾病如各種肉瘤。本發(fā)明的治療化合物可以通過任何一種常用途徑給藥，只要能使其達(dá)到靶組織。如果本發(fā)明作為病毒載體的形式使用，主要要考慮的使載體攜帶的異源序列所期望的定位。給藥途徑包括口服、鼻腔給藥、口腔給藥、直腸給要、陰道給要或局部給藥。例如，局部給要特別適于治療黑色素瘤或AIDS相關(guān)的皮膚癥狀，或者用病毒載體攜帶的異源基因治療皮膚病癥。另外也可通過orthotopic、真皮內(nèi)注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈注射給藥。這些組合物通常以藥學(xué)上可接受的組合物的形式給藥，其中藥學(xué)上可接受的組合物含有生理相容性載體、緩沖液或其他賦形劑。如果要治療肺部癥狀就要考慮向肺內(nèi)噴氣霧劑，氣霧劑的體積約在0.01-0.05ml之間。同樣，治療結(jié)腸相關(guān)疾病的優(yōu)選方式是通過灌腸給藥。灌腸劑的體積約在1-100ml之間。直接進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射也是一種優(yōu)選的給要方式，持續(xù)的瘤內(nèi)灌注是一種較特異的實(shí)施方式。在某些特定實(shí)施方式中，期望持續(xù)給予病人治療組合物。靜脈或動(dòng)脈途徑給藥可以通過滴注系統(tǒng)實(shí)施。局部給藥可以反復(fù)實(shí)施局部涂抹。在各種給藥途徑中，緩釋制劑可用于在治療期內(nèi)提供有限而持續(xù)量的治療藥物。對(duì)于內(nèi)部給藥來說，持續(xù)灌注攜帶目的異源核酸片段區(qū)的病毒載體是優(yōu)選的。這種給藥方式可以通過在某些病例術(shù)后插入導(dǎo)管持續(xù)給予治療藥物。給藥的持續(xù)時(shí)間由臨床醫(yī)師根據(jù)病人的病情及特定形勢(shì)而選擇，但是一般為約1-2小時(shí)，到約2-6小時(shí)，約6-10小時(shí)，約10-24小時(shí)，約1-2天，約1-2周或更長(zhǎng)。一般來說，通過持續(xù)灌注所給予的治療藥物量與單次或多次注射所給予的藥量相同，但根據(jù)給藥的持續(xù)時(shí)間不同可作調(diào)整。但是一般認(rèn)為通過灌注給予的藥量要稍高。水性溶液如果通過胃腸道外途徑給要一般應(yīng)該需要將溶液用合適的緩沖液緩沖，首先用足量的鹽水或葡萄糖溶液稀釋以達(dá)到等滲。這些特殊的水溶液特別適于靜脈注射、肌肉注射、皮下注射以及腹膜內(nèi)注射。本發(fā)明的技術(shù)人員可以通過本文的描述而了解所使用的水性介質(zhì)。例如，一個(gè)單位的藥物可以溶解到1毫升NaCl等滲溶液中，或者加到1000mL皮下輸液溶液中或者注射到適當(dāng)部位(見，Remington’sPharmaceuticalScience，1990)。根據(jù)病人的狀況可以對(duì)給藥劑量進(jìn)行調(diào)整。在任何情況下都應(yīng)該由負(fù)責(zé)注射的人確定每個(gè)個(gè)體的合適劑量。根據(jù)治療目的而確定治療組合物的有效劑量。術(shù)語“單位劑量”或“劑量”是指適于給治療對(duì)象使用的物理離散單位，含有預(yù)先確定量治療組合物的一個(gè)單位藥物所產(chǎn)生的治療效果與給藥途徑及治療方案有關(guān)。根據(jù)治療數(shù)目和單位劑量確定的給藥量依賴于所預(yù)期的保護(hù)效果。治療組合物的準(zhǔn)確劑量也依賴醫(yī)生的判斷，每一個(gè)體都是不同的。影響使用劑量的因素包括病人的物理及臨床狀況，給藥途徑，治療目的(緩解癥狀或是治愈)以及特定治療藥物的效力、穩(wěn)定性及毒性。制備成制劑以后，組合物溶液的給藥途徑要與其劑量形式相適應(yīng)，以此劑量治療應(yīng)該是有效的。各種劑量形式的制劑都很容易給藥，如上述的注射溶液，但是藥物釋放膠囊等也可使用。本文所使用的術(shù)語“體外”給藥是指給動(dòng)物來源的細(xì)胞以藥物，包括而不限于培養(yǎng)的細(xì)胞。術(shù)語“體外注射”是指經(jīng)體外操作的細(xì)胞，然后將細(xì)胞回輸給活體動(dòng)物。術(shù)語“體內(nèi)注射”包括在動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞上的各種操作。在本發(fā)明的某些方面，組合物可以通過體外或體內(nèi)給藥。在某些體外實(shí)施方式中，編碼修飾蛋白的表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用于體外分析或回輸?shù)襟w內(nèi)。美國(guó)專利4,690,915和5,199,942號(hào)描述了通過體外操作的血單個(gè)核細(xì)胞核骨髓細(xì)胞用于治療的方法。體內(nèi)給予組合物也是本發(fā)明所涉及的范圍。體內(nèi)給藥的例子包括而不限于通過一個(gè)插入到膽囊的小泡導(dǎo)管給予膽囊上皮細(xì)胞以本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)組合物(Bass，1995)和通過一個(gè)插入門靜脈的導(dǎo)管給予肝細(xì)胞以適量的本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)組合物(Bao，1996)。另外的例子還包括將轉(zhuǎn)導(dǎo)組合物直接注射到腫瘤內(nèi)，以及通過鼻內(nèi)或氣管內(nèi)滴注(Dong，1996)轉(zhuǎn)導(dǎo)組合物到肺細(xì)胞。本發(fā)明可以通過下列途徑給藥?kù)o脈、真皮下、動(dòng)脈、腹膜內(nèi)、病變部位內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、intravitreally、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部的、瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、泡囊內(nèi)、粘膜、心包內(nèi)、口服、局部、區(qū)域和/或氣霧劑、注射、輸注、持續(xù)輸注、局部灌注直接或通過導(dǎo)管或腔隙洗浴靶細(xì)胞。B.脂質(zhì)組合物在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有一種或多種脂質(zhì)的新型組合物，該脂質(zhì)與本發(fā)明權(quán)利要求所述的多聚核苷酸或多肽相連。脂質(zhì)的特征在于不溶于水但可用有機(jī)溶劑抽提。本文所描述的化合物可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解為脂質(zhì)，這些化合物包括在本發(fā)明的組合物和方法中。脂質(zhì)可以是天然產(chǎn)生的也可以是人工合成的(即人工設(shè)計(jì)和制備的)。但是脂質(zhì)通常是一種生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知的，包括天然脂肪、磷脂、磷脂酰甘油、類固醇、萜烯、lysolipids、鞘糖脂、糖脂、sulphatides、與脂肪酸相連的醚和酯類脂質(zhì)和多聚脂質(zhì)、以及上述物質(zhì)的結(jié)合物。1.脂質(zhì)種類天然脂肪含有甘油和脂肪酸。典型的甘油是一種三碳乙醇。脂肪酸是一種含有碳鏈的分子，在其鏈末端連接有酸性基團(tuán)(即羧酸)。脂肪酸可以具有任意長(zhǎng)度的碳鏈，但是優(yōu)選的碳鏈長(zhǎng)度為約2，約3，約4，約5，約6，約7，約8，約9，約10，約11，約12，約13，約14，約15，約16，約17，約18，約19，約20，約21，約22，約23，約24，約25，約26，約27，約28，約29，到約30或更多個(gè)碳原子，以及上述范圍內(nèi)的任意長(zhǎng)度。優(yōu)選的長(zhǎng)度范圍為脂肪酸的主鏈部分含有約14到約24個(gè)碳原子，在某些實(shí)施方式中，特別優(yōu)選約16到約18個(gè)碳原子。在某些實(shí)施方式中，脂肪酸的碳鏈可以由奇數(shù)碳原子組成，但在另外一些實(shí)施方式中優(yōu)選偶數(shù)碳原子。碳鏈上只含有單鍵的脂肪酸被稱為是飽和的，而碳鏈上含有至少一個(gè)雙鍵的脂肪酸被稱為是不飽和的。特異脂肪酸包括而不限于亞油酸、油酸、軟脂酸、順-9，12-十八碳-二烯酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、軟脂烯酸、花生四烯酸、蓖麻油酸、tuberculostericacid、乳桿菌酸。一個(gè)或多個(gè)脂肪酸的酸性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到甘油的一個(gè)或多個(gè)羥基上。因此，單酸甘油酯由一個(gè)甘油和一個(gè)脂肪酸組成，甘油二酯由兩個(gè)甘油和兩個(gè)脂肪酸組成，甘油三酯由三個(gè)甘油和三個(gè)脂肪酸組成。磷脂一般含有甘油或鞘氨醇、產(chǎn)生兩性化合物的磷酸基團(tuán)以及一個(gè)或多個(gè)脂肪酸。磷脂的種類包括磷脂酰甘油，其中磷酸基團(tuán)連接到甘油二酯和鞘氨醇磷脂(即鞘磷脂)上的甘油的第一個(gè)碳原子上，其中磷酸基團(tuán)被酯化成鞘氨醇氨基乙醇。鞘磷脂的另外一個(gè)例子是硫腦脂，含有一個(gè)硫酸基團(tuán)可以使分子兩性。當(dāng)然，磷脂也可以含有其他化學(xué)基團(tuán)，如連接到磷酸基團(tuán)上的乙醇。這種乙醇基團(tuán)包括絲氨酸、乙醇胺、膽堿、甘油和肌醇。因此，特異性的磷脂酰甘油包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇。其他的磷脂包括磷脂酸或磷酸聯(lián)乙醯。一方面，磷脂酰膽堿含有二油酰磷脂酰膽堿(a.k.a.心磷脂)、卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、單肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、單棕櫚酰磷脂酰膽堿、單硬脂酰磷脂酰膽堿，單油酰磷脂酰膽堿、二丁酰磷脂酰膽堿、二戊酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二庚酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿或二硬脂酰磷脂酰膽堿。糖脂與鞘磷脂相似，但是是通過一個(gè)糖基而不是磷酸基團(tuán)連接到鞘氨醇的第一個(gè)羥基上。有一類糖脂叫腦苷脂，含有一個(gè)連接到鞘氨醇第一個(gè)羥基上的糖基(即葡萄糖或半乳糖)。另外一種糖脂是神經(jīng)節(jié)苷脂(即monosialoganglioside，GM1)，含有連接到鞘氨醇第一個(gè)羥基上的約2、約3、約4、約5、約6、到約7個(gè)或更多個(gè)糖基，這些糖基可以位于支鏈上。在另外的實(shí)施方式中，糖脂是神經(jīng)酰胺(即乳糖基?；拾贝?。類固醇是一種四元環(huán)的菲衍生物。類固醇通常具有調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織和有機(jī)體的功能，包括激素及與黃體激素(黃體酮)、糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素(醛固酮)、雄激素(睪酮)及雌激素(雌酮)家族相關(guān)的化合物。膽固醇是另一類類固醇，一般發(fā)揮結(jié)構(gòu)功能而不是調(diào)節(jié)功能。維生素D是另一類固醇，參與小腸的鈣吸收調(diào)節(jié)。萜烯是一種含有一個(gè)或多個(gè)五碳異戊二烯基團(tuán)的脂質(zhì)。萜烯具有多種生物學(xué)功能，萜烯包括維生素A、輔酶Q和類胡蘿卜素(即番茄紅素和β胡蘿卜素)。2.帶電荷的和中性的脂質(zhì)組合物在某些實(shí)施方式中，組合物的脂質(zhì)成分是不帶電荷的或基本不帶電荷的。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物的脂質(zhì)成分為一種或多種中性脂質(zhì)。在另一方面，組合物的脂質(zhì)成分基本不含有陰離子和陽(yáng)離子脂質(zhì)，如某些磷脂和膽固醇。在某些方面，不帶電荷或基本不帶電荷的脂質(zhì)組合物中的脂質(zhì)成分為約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％的不帶電荷、基本不帶電荷的脂質(zhì)和/或含有等量正電荷和負(fù)電荷的脂質(zhì)混合物。在另外一個(gè)方面，脂質(zhì)組合物可以是帶電荷的。例如帶電荷的磷脂用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)組合物就帶有凈正電荷或凈負(fù)電荷。在一個(gè)非限定性實(shí)施例中，磷酸聯(lián)乙醯被用于賦予脂質(zhì)組合物負(fù)電荷，而硬脂胺被用于賦予脂質(zhì)組合物正電荷。3.脂質(zhì)制備脂質(zhì)可以從天然資源中獲取，也可以從市場(chǎng)上買到，還可以通過化學(xué)方法合成，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如磷脂可以從天然資源中獲得，如蛋或大豆卵磷脂、腦磷脂酸、腦或植物磷脂酰肌醇、心肌磷脂以及植物或細(xì)菌的磷脂酰肌醇。在另外的實(shí)施例中，使用于本發(fā)明的脂質(zhì)是從市場(chǎng)上買到的，例如SigmaChemicalCo.的二肉豆寇基磷脂酰膽堿(″DMPC″)；K&KLaboratories(Plainview，NY)的磷脂酸；Calbiochem-Behring的膽固醇；AvantiPolarLipids，Inc.(Birmingham，Ala.)的二肉豆寇基磷脂酰甘油(″DMPG″)和其他脂質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，保存在氯仿或氯仿/甲醇中的脂質(zhì)溶液可以存放在約-20℃。氯仿是優(yōu)選的唯一溶劑，因?yàn)槁确卤燃状几菀渍舭l(fā)。4.脂質(zhì)組合物的結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)相關(guān)的化合物可以分散在含脂質(zhì)的溶液中，溶解于脂質(zhì)中，以脂質(zhì)乳化，與脂質(zhì)混和，與脂質(zhì)結(jié)合，與脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合，懸浮于脂質(zhì)中或以其他方式與脂質(zhì)相聯(lián)系。本發(fā)明的脂質(zhì)或脂質(zhì)相關(guān)組合物不限于任何一種特定結(jié)構(gòu)。例如，它們可以簡(jiǎn)單的散布于溶液中，可能形成聚集物，但沒有均一的大小和形狀。在另外的實(shí)施例中，它們可以以雙層結(jié)構(gòu)、微膠?；颉暗顾苯Y(jié)構(gòu)存在。在另外的非限制性實(shí)施例中，也可以是lipofectamine(GibcoBRL)或Superfect(Qiagen)復(fù)合物。在某些實(shí)施方式中，脂質(zhì)組合物含有的特定脂質(zhì)、脂類或非脂質(zhì)組分如藥物、蛋白、糖、核酸或本文描述的其他材料的量為約1％，約2％，約3％，約4％約5％，約6％，約7％，約8％，約9％，約10％，約11％，約12％，約13％，約14％，約15％，約16％，約17％，約18％，約19％，約20％，約21％，約22％，約23％，約24％，約25％，約26％，約27％，約28％，約29％，約30％，約31％，約32％，約33％，約34％，約35％，約36％，約37％，約38％，約39％，約40％，約41％，約42％，約43％，約44％，約45％，約46％，約47％，約48％，約49％，約50％，約51％，約52％，約53％，約54％，約55％，約56％，約57％，約58％，約59％，約60％，約61％，約62％，約63％，約64％，約65％，約66％，約67％，約68％，約69％，約70％，約71％，約72％，約73％，約74％，約75％，約76％，約77％，約78％，約79％，約80％，約81％，約82％，約83％，約84％，約85％，約86％，約87％，約88％，約89％，約90％，約91％，約92％，約93％，約94％，約95％，約96％，約97％，約98％，約99％，約100％，或其中任意范圍，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在一個(gè)非限定性實(shí)施例中，脂質(zhì)組合物含有約10％到約20％的中性脂質(zhì)、約33％到約34％腦苷脂和約1％的膽固醇。在另一個(gè)非限定性實(shí)施例中，脂質(zhì)體含有約4％到約12％的萜烯萜，其中約1％的微膠粒是特異性的番茄紅素，和約10％到約35％的卵磷脂，以及約1％的藥物。因此本發(fā)明的脂質(zhì)組合物可以含有任何脂質(zhì)、脂類或其他組分，這些組分可以任意組合，百分比也可以包括各種范圍。a.乳化劑脂質(zhì)可以包含在乳化液中。脂質(zhì)乳化液是由兩種或多種正常情況下互不相溶的脂質(zhì)混和而成的永久異源脂質(zhì)混合物，通過機(jī)械攪拌或加入小量的乳化劑而形成。制備脂質(zhì)乳化液和添加附加成分的方法是本領(lǐng)域所熟知的(即《現(xiàn)代藥理學(xué)》，1990，本文已納入作為參考)。例如，將一種或幾種脂質(zhì)加入到甲醇、氯仿或任何其他合適的有機(jī)溶劑中，手動(dòng)攪拌或機(jī)械攪拌，然后將溶劑從混合物中蒸發(fā)掉剩下脂質(zhì)。將脂質(zhì)從新懸浮于水性介質(zhì)如磷酸鹽緩沖液中就得到了乳化液。為了使乳化脂質(zhì)的大小更具有均一性，可以用常規(guī)超聲技術(shù)進(jìn)行超聲處理，然后通過微液化(例如用Microfiuidizer，Newton，Mass.)進(jìn)一步乳化混合物，和/或用擠出儀(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)高壓(如600psi)擠出。b.微膠粒脂質(zhì)可以包含在微膠粒中。微膠粒是一簇或一團(tuán)脂質(zhì)化合物，通常以脂單層的形式存在，可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何微膠粒制備方法制備(如Canfield等，1990；EI-Gorab等，1973；ColloidalSurfactant，1963；和CatalysisinMicellarandMacromolecularSystems，1975，本文都已納入作為參考)。例如，典型的制備方法是將一種或幾種脂質(zhì)加入到有機(jī)溶劑中制成懸液，蒸發(fā)掉溶劑后將脂質(zhì)從懸于水性介質(zhì)中，超聲處理然后離心。5.脂質(zhì)體在特定實(shí)施方式中，脂質(zhì)構(gòu)成脂質(zhì)體?！爸|(zhì)體”是一個(gè)類別術(shù)語，包括各種通過包裹脂雙層或聚集物而形成的單層或多層脂質(zhì)載體。脂質(zhì)體的典型特征是具有雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu)，一般含有磷脂及由水溶性組合物組成的內(nèi)容物。多層脂質(zhì)體具有多層脂質(zhì)，各層之間被水溶性介質(zhì)分開。將含有磷脂的脂質(zhì)懸浮于過量的水溶液中自然就會(huì)形成多層脂質(zhì)體。在形成閉合結(jié)構(gòu)之前脂質(zhì)組分會(huì)經(jīng)過自身重排，在脂雙層之間包裹水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。親脂性分子或含有親脂性區(qū)的分子也可以溶于脂雙層中，或與脂雙層相連。在某些特殊的例子中，脂質(zhì)和/或修飾蛋白或編碼修飾蛋白的多聚核苷酸可以被包裹在脂質(zhì)體的水溶性內(nèi)核中、散布于脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)、通過一個(gè)能連接脂質(zhì)體和組合物的分子附著在脂質(zhì)體上、陷入脂質(zhì)體內(nèi)、與脂質(zhì)體形成復(fù)合物等。a.脂質(zhì)體制備用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可以通過不同的方法制備，這些方法都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，磷脂(avantipolarlipids，Alabaster，AL)如中性磷脂二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)溶于叔丁醇。然后將脂質(zhì)與多聚核苷酸或多肽、和/或其他組分混和。將Tween20加入到脂質(zhì)混合物中，Tween20約占組合物重量的5％。將過量的叔丁醇加入上述混合物，其中叔丁醇的體積至少要占到95％?；旌衔镄D(zhuǎn)攪拌、在干冰/丙酮浴中冷凍使之凍干過夜。凍干的制備物促存在-20℃中可以保存3個(gè)月。利用Tween20包裹化合物所得到的顆粒平均直徑約為0.7-1.0μm。另外，脂質(zhì)體還可以通過在裝有溶劑的容器如玻璃梨型燒瓶中混和脂質(zhì)而制備。容器的體積至少要有預(yù)懸浮的脂質(zhì)體體積的10倍。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在負(fù)壓、約40℃條件下將溶劑去除。根據(jù)脂質(zhì)體體積的不同，一般在約5分鐘到2小時(shí)內(nèi)可將溶劑去除。組合物可在真空干燥器內(nèi)進(jìn)一步干燥。干燥的脂質(zhì)一般在約1周后廢棄因?yàn)橹|(zhì)體隨時(shí)間而逐漸變質(zhì)。干燥的脂質(zhì)可溶于約25-50mM磷脂無菌無熱源水溶液中水化，不斷振蕩知道所有的脂質(zhì)都從新懸浮起來。然后可以將水性脂質(zhì)體分成小份，每份裝入一小玻璃瓶中，真空下凍干密封。在另外一種方法中，脂質(zhì)體可以根據(jù)其他已知的實(shí)驗(yàn)方法制備(見Bangham等，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster1983，Szoka和Papahadjopoulos，1978；本文已將其相關(guān)部分納入作為參考)。這些方法的區(qū)別在于其不同的包裹水性材料的能力以及水-脂比例。按照上述方法制備的干燥的或凍干的脂質(zhì)體可以在抑制性肽溶液中脫水和重建，并以合適的溶劑如DPBS稀釋到適當(dāng)濃度。然后將混合物在振蕩混和器中劇烈振蕩。未被包裹的附加材料如試劑，包括而不限于激素、藥物、核酸構(gòu)建物以及類似物質(zhì)可以通過29,000×g離心并洗滌脂質(zhì)體顆粒去除。經(jīng)過洗滌的脂質(zhì)體重懸于合適濃度的磷脂溶液中，總的濃度約為50-200mM。被包裹的附加材料或活性試劑的量可以用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。確定了包裹在脂質(zhì)體中的附加材料或活性試劑的量以后，就可以將脂質(zhì)體稀釋到適當(dāng)濃度并促存在4℃?zhèn)溆?。含有脂質(zhì)體的藥學(xué)上可接受的組合物通常含有無菌的藥用載體或稀釋劑，如水或鹽溶液。由于制備方法的不同，脂質(zhì)體的大小差別也很大。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以有各種尺寸。在某些實(shí)施方式中，脂質(zhì)體很小，即外徑小于約100nm，90nm，80nm，70nm，60nm，或小于50nm。要制備這種脂質(zhì)體，本文所描述的任何一種方法或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何方法都可以使用。其他制備脂質(zhì)體的非限定性例子見以下文獻(xiàn)的描述美國(guó)專利4,728,578，4,727,575，4,737,323，4,533,254，4,162,282，4,310,505和4,921,578號(hào)；國(guó)際申請(qǐng)PCT/US85/01161和PCT/US89/05040號(hào)；英國(guó)專利申請(qǐng)GB2193095A號(hào)；Mayer等，1986；Hope等，1985；Mayhew等，1987；Mayhew等，1984；Cheng等，1987；以及《脂質(zhì)體技術(shù)》(LiposomeTechnology)，1984，本文都已納入作為參考)。懸浮于水溶液中的脂質(zhì)體一般呈球形，具有一層或多層同心狀的脂雙層分子。每一層由一層平行排列的分子組成，由通用結(jié)構(gòu)式XY代表，其中X是親水性部分，Y是親脂性部分。在水性懸液中，由于每一層都呈同心狀排列，因此親水性部分趨向于與水相接觸，而親脂性區(qū)域趨向于自身相連。例如，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)外都有水相時(shí)，脂質(zhì)分子形成雙層，其排列方式是已知的薄層，XY-YX。當(dāng)多個(gè)脂質(zhì)分子的親水部分和親脂部分互相接觸時(shí)易形成脂質(zhì)聚集物。聚集物的尺寸和形狀由于多種不同變量如溶劑的性質(zhì)和溶液中其他化合物的存在而不同。脂質(zhì)制劑的制備通常通過聲處理或一系列的脂質(zhì)體混合物的擠出來完成，主要過程如下(I)反相蒸發(fā)(II)脫水-從新水化(III)去污劑透析(IV)薄膜水合。一方面，某些實(shí)施方式中制備脂質(zhì)體的方法是通過熱聲處理，經(jīng)過遞減孔徑的膜或?yàn)V器依次擠壓，最后形成小而穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)形式。這一制備過程制備的脂質(zhì)體/治療化合物或脂質(zhì)體具有合適而均一的尺寸，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且具有最大活性。這種技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的(見Martin，1990)。制備出來后脂質(zhì)結(jié)構(gòu)就可用于包裹毒性的(即化療藥)或在循環(huán)中不穩(wěn)定的(如核酸)的化合物。脂質(zhì)體包裹可以使這些化合物的毒性降低，在血液中的半衰期延長(zhǎng)(Gabizon等，1990)。許多疾病治療措施用到脂質(zhì)以轉(zhuǎn)移基因從而改善常規(guī)治療措施或建立新的治療方法，特別過度增生性疾病的治療。脂質(zhì)體制劑的優(yōu)勢(shì)在于其可以提高體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的效率(Templeton等，1997)和用這些方法制備的脂質(zhì)體。其他制備脂質(zhì)制劑進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的方法也有描述(WO99/18933)。另外一種脂質(zhì)體制劑是一種雙親性的載體，叫溶劑稀釋微載體(SDMC)，可以將特定分子整合到脂質(zhì)載體的脂雙層中(美國(guó)專利5,879,703號(hào))。SDMC可用于轉(zhuǎn)移脂多糖、多肽、核酸以及類似物質(zhì)。當(dāng)然，其他任何制備脂質(zhì)體的方法都可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員便用以獲得預(yù)期的本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑。b.脂質(zhì)體靶點(diǎn)與脂質(zhì)體有關(guān)的本發(fā)明的組合物可以改善其生物分布和其他特征。例如，脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移和外源DNA體外表達(dá)都已非常成熟(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。在培養(yǎng)的雞胚胎、Hela細(xì)胞和肝細(xì)胞中進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和外源DNA表達(dá)已被證明是可行的(Wong等，1980)。徑靜脈注射在大鼠中進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移也已成功實(shí)現(xiàn)(Nicolau等，1987)。需要說明的是脂質(zhì)體組合物可以含有附加材料以便運(yùn)送到組織中。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，脂質(zhì)或脂質(zhì)體可以與紅細(xì)胞凝集病毒(HVJ)相連。這種方法已被證實(shí)可以促進(jìn)脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合因此可以促使脂質(zhì)體包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(Kaneda等，1989)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)或脂質(zhì)體可以與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)形成復(fù)合物或結(jié)合在一起(Kato等，1991)。還有一個(gè)實(shí)施方式是將脂質(zhì)與HVJ和HMG-1相連。可以通過添加配基達(dá)到靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的目的，這種添加不會(huì)降低脂質(zhì)體大量轉(zhuǎn)運(yùn)本發(fā)明的化合物的能力。需要說明的是這種方法可以使其轉(zhuǎn)移到特定細(xì)胞、組織和器官。配基轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的靶向特異性是基于不同類型的細(xì)胞上都有該配基受體的分布。靶向配基既可以非共價(jià)也可以共價(jià)連接到脂質(zhì)復(fù)合物上，也可以用各種方法連接到脂質(zhì)體上。將配基交聯(lián)到脂質(zhì)體上(如上所述)的典型方法見美國(guó)專利5,603,872和5,401,511號(hào)的描述，本文已特地完整納入作為參考)。各種配基都可以通過氨基交聯(lián)共價(jià)結(jié)合到脂質(zhì)體表面。脂質(zhì)體，特別是含有磷脂酰乙醇胺(PE)的多層小泡(MLV)或單層小泡如微乳化脂質(zhì)體(MEL)和大單層脂質(zhì)體(LUVET)已用已有方法制備出來。脂質(zhì)體內(nèi)含有PE可以在脂質(zhì)體表面提供一種活性功能殘基-伯胺以利于交聯(lián)。配基如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)已成功連接到PE-脂質(zhì)體上。配基共價(jià)結(jié)合在脂質(zhì)體表面的離散位點(diǎn)上。位點(diǎn)的數(shù)量和表面密度受脂質(zhì)體制備和脂質(zhì)體類型的控制。脂質(zhì)體表面也有非共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。為了制備配基和脂質(zhì)體的共價(jià)結(jié)合物，已經(jīng)研究了交聯(lián)劑的效率和生物相容性。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧乙烷(OXR)、乙烯甘油二環(huán)氧丙醚(EGDE)和水溶性的碳化二亞胺，優(yōu)選1-乙基-3-(3-二甲基丙氨基)碳化二亞胺(EDC)。通過交聯(lián)復(fù)合化學(xué)，可以制備出能識(shí)別底物和脂質(zhì)體的氨基交聯(lián)物。i.靶向配基靶向配基既可以錨定于復(fù)合物的親脂性部分也可以附著在復(fù)合物親水性部分的末端活性基團(tuán)上。靶向配基通過一個(gè)連接到親水性多聚物末端的活性基團(tuán)上的連接物附著在脂質(zhì)體上。優(yōu)選的活性基團(tuán)包括氨基、羧基、酰肼基和巰醇基。靶向配基和親水性多聚物的耦合可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)方法完成。在某些特定實(shí)施方式中，靶向配基的總濃度為約0.01mol到10％mol。靶向配基可以是任何具有靶向區(qū)域特征性組分特異性的任何配基。優(yōu)選的靶向配基包括蛋白如多克隆或單克隆抗體、抗體片段或嵌合抗體、酶、或激素、或糖如單糖、寡糖或多糖(見Heath等，1986)。例如，disialogangliosideGD2是一種腫瘤抗原，該抗原已被證實(shí)來源于神經(jīng)外胚層腫瘤如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和某些肉瘤(Cheresh等，1986，Schulz等，1984)。含有抗disialogangliosideGD2單克隆抗體的脂質(zhì)體已被用于幫助脂質(zhì)體靶向表達(dá)該腫瘤抗原的細(xì)胞(Montaldo等，1999；Pagnan等，1999)。在例外一個(gè)非限定性例子中，乳腺癌和婦科腫瘤抗原特異性的抗體被描述在美國(guó)專利5,939,277號(hào)中，本文已納入作為參考。還有一個(gè)非限定性例子是前列腺癌抗原特異性的抗體被描述在美國(guó)專利6,107,090號(hào)中，本文已納入作為參考。因此，本文所描述的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的抗體可以結(jié)合本發(fā)明的組合物和方法用于引導(dǎo)脂質(zhì)體靶向到達(dá)特定組織或細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所用的靶向配基可與整合素、蛋白多糖、糖蛋白、受體或運(yùn)輸?shù)鞍鬃饔谩＿m宜的配基包括任何具有靶器官細(xì)胞特異性的配基，或者靶器官結(jié)構(gòu)特異性的配基，這些靶器官由于局部出現(xiàn)病理狀態(tài)如腫瘤而暴露于血液循環(huán)中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，為了增加向細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)、增加向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)或限制向非靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，將抗體或環(huán)肽靶向序列(配基)與脂質(zhì)復(fù)合物相連。這種方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，脂質(zhì)體已被進(jìn)一步描述可以特異性地靶向哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞(美國(guó)專利5,786,214號(hào)，本文已納入作為參考)。脂質(zhì)體基本由N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇和油酸組成，其中神經(jīng)膠質(zhì)特異性的單克隆抗體與脂質(zhì)體相連。需要說明的是單克隆抗體或抗體片段可用于靶向轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的特定細(xì)胞、組織或器官，如腦、心、肺、肝等。另外，化合物也可以通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和/或含有脂質(zhì)或脂質(zhì)體的靶向載體轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞。這是利用發(fā)生在靶細(xì)胞上的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用選擇性攝取大分子。由于各種受體在細(xì)胞上的分布具有細(xì)胞類型特異性，因此這種轉(zhuǎn)運(yùn)方法為本發(fā)明添加了另一種程度的特異性。因此在本發(fā)明的某些方面，可以根據(jù)特異性表達(dá)于靶細(xì)胞群上的受體來選擇配基。本發(fā)明化合物的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和/或靶向載體可以含有與脂質(zhì)體結(jié)合的特異性結(jié)合配基。被轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物被包裹在脂質(zhì)體中，特異性結(jié)合配基被功能性地?fù)饺氲街|(zhì)體膜上。因而脂質(zhì)體可以特異性地結(jié)合靶細(xì)胞的受體并把脂質(zhì)體內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞。這種系統(tǒng)已被證實(shí)是具有功能的，例如，含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的系統(tǒng)被用于將核酸通過受體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到EGF受體表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和/或靶向載體含有細(xì)胞受體特異性配基和結(jié)合藥物。其他的一些含有細(xì)胞受體特異性配基，被轉(zhuǎn)運(yùn)的修飾蛋白或編碼修飾蛋白的多聚核苷酸被人工附著在配基上。例如，幾種配基已被用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Wu和Wu，1987；Wagner等，1990；Perales等，1994；Myers，EPO0273085)，上述文獻(xiàn)確立了該技術(shù)的可操作性。在另外一個(gè)實(shí)施例中，描述了轉(zhuǎn)運(yùn)到另外一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特異性方法(Wu和Wu，1993，本文已納入作為參考)。還有一種實(shí)施方式的特異性結(jié)合配基含有一種或多種可直接與細(xì)胞特異性結(jié)合的脂質(zhì)或糖蛋白。例如，乳糖基神經(jīng)酰胺是一種含有半乳糖末端的asialganglioside，被摻入到脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)可以增加肝細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取(Nicilau等，1987)。Asialoglycoprotein、asialofetuin含有末端半乳糖殘基，也被證實(shí)可以引導(dǎo)脂質(zhì)體靶向到達(dá)肝臟(Spanjer和Scherphof，1983；Hara等，1996)。連接到多肽主鏈上的甘露糖基、巖藻糖基或N乙?；咸烟前放cmanose受體可以高親和力結(jié)合(美國(guó)專利5,432,260號(hào)，本文特地完整納入作為參考)。需要說明的是本發(fā)明的細(xì)胞或組織特異性轉(zhuǎn)化構(gòu)建物也可以以同樣的方式被特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞或靶組織。在另外一個(gè)實(shí)施例中，乳糖基神經(jīng)酰胺和針對(duì)LDL受體相關(guān)蛋白的肽如載脂蛋白E3(“ApoE”)被用于將脂質(zhì)體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟(Spanjer和Scherphof，1983；WO98/0748)。葉酸鹽和葉酸鹽受體也被證實(shí)可用作細(xì)胞靶向物(美國(guó)專利5,871,727號(hào))。在這個(gè)實(shí)施例中，維生素葉酸鹽被連接到復(fù)合物上。葉酸鹽受體與其配基具有高親和力并在幾種腫瘤細(xì)胞系表面過量表達(dá)，其中包括肺、乳腺和腦腫瘤?？谷~酸物質(zhì)如氨甲蝶呤也可用作靶向配基。運(yùn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的靶位是多種表達(dá)運(yùn)鐵蛋白受體的可復(fù)制細(xì)胞(Gilliland等，1980)。c.脂質(zhì)體/核酸結(jié)合物需要說明的是脂質(zhì)體組合物含有細(xì)胞或組織特異性核酸時(shí)，這一技術(shù)就可適用于本發(fā)明。在某些實(shí)施方式中，脂質(zhì)非病毒制劑提供了一種病毒基因治療的替代方法。盡管許多細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)脂質(zhì)非病毒基因轉(zhuǎn)移、通過脂質(zhì)制劑進(jìn)行系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移有許多限制。脂質(zhì)非病毒基因轉(zhuǎn)移的主要限制在于組成非病毒轉(zhuǎn)移載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)有毒性。脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性可以部分解釋體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移結(jié)果的差異。造成這種矛盾數(shù)據(jù)的其他因素是在血清蛋白存在和不存在時(shí)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性是不同的。脂質(zhì)體與血清蛋白之間的相互作用嚴(yán)重影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性(Yang和Huang，1997)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以吸附和結(jié)合帶負(fù)電荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂質(zhì)體要么被溶解要么被巨噬細(xì)胞吞噬，因而脂質(zhì)體被從循環(huán)中清除?，F(xiàn)在的脂質(zhì)體體內(nèi)轉(zhuǎn)移方法用霧化、皮下注射、真皮內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射或顱內(nèi)注射以避免脂質(zhì)體在循環(huán)中出現(xiàn)與陽(yáng)離子相關(guān)的毒性和穩(wěn)定性的問題。脂質(zhì)體和血漿蛋白的相互作用是引起體外(Felgner等，1987)和體外(Zhu等，1993；Philip等，1993；Solodin等，1995；Liu等，1995；Thierry等，1995；Tsukamoto等，1995；Aksentijevich等，1996)基因轉(zhuǎn)移差異的主要原因。將病毒顆粒靶向轉(zhuǎn)移到缺乏單個(gè)細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)的典型方法已被描述(美國(guó)專利5,849,718)。在此方法中，比如抗體A是腫瘤特異性的，但是對(duì)正常的心、肺組織也有特異性，抗體B是腫瘤特異性的，但是對(duì)正常的肝細(xì)胞也有特異性。如果單獨(dú)使用抗體A或抗體B轉(zhuǎn)運(yùn)抗增殖核酸到腫瘤細(xì)胞就可能正常的心和肺或肝細(xì)胞造成損傷。但是可以將抗體A和抗體B結(jié)合使用以改善細(xì)胞靶向性。其中，抗體A連接一個(gè)編碼抗增殖核酸的基因，通過受體介導(dǎo)的攝取系統(tǒng)被轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞中，同時(shí)也被轉(zhuǎn)運(yùn)到心和肺組織中。但是基因在這些細(xì)胞內(nèi)不會(huì)轉(zhuǎn)錄因?yàn)槿狈Ρ仨毜霓D(zhuǎn)錄因子。抗體B連接一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的通用活性基因，該轉(zhuǎn)錄因子可以使抗增殖核酸轉(zhuǎn)錄，然后被轉(zhuǎn)移到腫瘤和肝細(xì)胞中。這樣心和肺細(xì)胞中只有滅活的抗增殖核酸，由于其不能被轉(zhuǎn)錄因此不會(huì)產(chǎn)生毒性。在肝細(xì)胞中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因被轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)錄，但是由于沒有抗增殖核酸基因存在因此也不會(huì)產(chǎn)生毒性。而在腫瘤細(xì)胞中，兩個(gè)基因都被轉(zhuǎn)移因此轉(zhuǎn)錄因子可以使抗增殖核酸轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生腫瘤特異性的毒性效應(yīng)。另外一些用于基因轉(zhuǎn)移治療過度增殖性疾病的靶向配基可以轉(zhuǎn)移基因，這些基因的產(chǎn)物在靶向系統(tǒng)中的毒性比非靶向系統(tǒng)要大。這種基因的例子包括前調(diào)亡基因如Bax和Bak，來源于病毒和其他病原體的基因如腺病毒E4或f4、大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶即所謂的“自殺基因”，該基因可以將前藥6-甲基嘌呤脫氧核苷轉(zhuǎn)化成毒性嘌呤6-甲基嘌呤。用前藥治療的其他自殺基因有大腸桿菌胞嘧啶脫胺酶基因和HSV胸腺嘧啶激酶基因。還有一種可能就是利用非靶向性的或靶向性的脂質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)產(chǎn)生重組或修飾蛋白。例如，兩個(gè)或多個(gè)質(zhì)?？捎糜谝龑?dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒序列加上治療基因進(jìn)入過度增殖的細(xì)胞內(nèi)。一個(gè)質(zhì)粒來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白可以包裝第二攜帶基因的治療質(zhì)粒。因此轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞成為攜帶治療基因的非復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生位點(diǎn)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)而可以感染鄰近的細(xì)胞。治療基因的啟動(dòng)子可以是也可以不是可誘導(dǎo)的或組織特異性的。同樣，被轉(zhuǎn)移的核酸可以代表一個(gè)有復(fù)制能力或條件復(fù)制能力病毒基因組，如缺乏全部或部分腺病毒E1a或E2b區(qū)，或者含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄自E1a和/或E2b區(qū)的組織特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的腺病毒基因組。這種有復(fù)制能力或條件復(fù)制能力的核酸可以含有或不含有附加的治療基因如腫瘤抑制基因或抗癌基因。d.脂質(zhì)給藥途徑給予病人的脂質(zhì)組合物(即脂質(zhì)體-修飾蛋白或編碼修飾蛋白的多聚核苷酸)的實(shí)際劑量要根據(jù)病人的物理的或生理狀況決定，如體重、病情嚴(yán)重程度、病人的特發(fā)癥以及給要途徑?？紤]到這些因素，給予特定病人的脂質(zhì)組合物的量和/或療程就很容易確定。V.實(shí)施例下面的實(shí)施例用于證明本發(fā)明的特定實(shí)施方式。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過實(shí)施例中描述的技術(shù)按照發(fā)明者披露的方法可以很好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，并且可以考慮不同的實(shí)現(xiàn)模式。但是，根據(jù)本發(fā)明的精神本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)某些特定實(shí)施方式加以改進(jìn)在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下也能得到相似的或同樣的結(jié)果。實(shí)施例1序列缺失研究編碼重組gelonin(SEQIDNO2)的核苷酸序列用作模板制備這些毒素。rGel的序列分析和結(jié)構(gòu)模型顯示分子折疊成折疊片、β盤繞和發(fā)卡環(huán)。根據(jù)這些研究結(jié)果，氨基酸200-277(C末端)折疊成結(jié)合袋，類似于RTA的B鏈入塢口。由于rGel沒有B鏈，從理論上分析這種“入塢口”可能是毒素的退化部分，對(duì)維持這個(gè)蛋白的生物學(xué)活性來說并不是必須的。從C末端和N末端序列缺失突變編碼rGel的cDNA分子見圖3A和3B以及表7，所得到的分子命名為CFR1901-CFR1905。在預(yù)試驗(yàn)中，經(jīng)過兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解分析(RRLA)證實(shí)構(gòu)建物CFR1904、1905、2001、2007和2024有可檢測(cè)活性。這些構(gòu)建物的活性比CFR1888地105-103倍，CFR1888被認(rèn)為是具有活性的毒素分子(Munishkin等，1995)。CFR1901為了構(gòu)建缺失1-46氨基酸殘基的CFR1901，將1μg純化的含CFR1888cDNA的pX2載體用50單位的限制性內(nèi)切酶NcoI和SmaI(Boeringer-Mannheim)消化。5’NcoI位點(diǎn)上的突出部分用1個(gè)單位的綠豆核酸酶(NewEnglandBiolabs)鈍化30℃孵育0.5小時(shí)。用QiagenPCR純化試劑盒去除綠豆核酸酶。所得到的DNA通過與3’鈍化的SmaI位點(diǎn)連接而環(huán)化。CFR1902用限制性內(nèi)切酶NcoI和ClaI消化CFR1888。末端補(bǔ)平以維持正確的閱讀框架，在從新連接前用Klenow酶(NewEnglandBiolabs)處理3’突出端以使其鈍化。為了表達(dá)蛋白，50ng質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化50μlBL21(DE3)pLysScompetent大腸桿菌宿主細(xì)胞(Novagen，Inc)。挑取單個(gè)克隆，接種到100ml含200μg/ml氨芐青霉素的LuriaBroth中，37℃振搖使其生長(zhǎng)直到OD600達(dá)到0.6-0.8。然后加入終濃度為0.1mM的IPTG(Boeringer-Mannheim)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)物在離心收獲之前再于37℃孵育2小時(shí)。表7名稱設(shè)計(jì)號(hào)描述和/或氨基酸缺失氨基酸替代/添加其他功能1888CFR1888無C末端KDPE轉(zhuǎn)變成KDEL無KSCFR1901CFR1888缺失AA1-46無無KCCFR1902CFR1888缺失AA1-67無無KBCFR1903CFR1888缺失AA198-251AA25前添LAAA無SBCFR1904CFR1888缺失AA1-46和198-251AA252前添LAAA無CBCFR1905CFR1888缺失AA1-67和198-251AA253前添LAAA無3825CFR2018CFR1888缺失AA104-111AA43＝K，C；AA164后添加L無CFR2018CFR1888AA252-257被替代VDKDPKA無N10CFR2001CFR2018缺失AA1-9無無N43CFR2007CFR2018缺失AA43-70無無N87CFR2015CFR2018缺失AA87-107無無N4389CFR2024CFR2018缺失AA43-70和89-109無無N100130CFR2005CFR2018缺失AA100-109和130-155無無C211CFR2004CFR2018缺失AA194-223和235-252無無3825-Y1CFR2019CFR2018缺失AA202-252FQMVTIDQLKPKIALLKFVK無3825-Y2CFR2020CFR2018的AA28-43被替代NQWDOTQHGVELRQQ無3825-Y3CFR2021CFR2018的AA73-89被替代IYIGTQERNEKLFYR無3825-Y4CFR2022CFR2018的AA187-196被替代EENETTCYMG無4389-Y1CFR2025CFR2024的AA153-203被替代FQMVTIDQLKPKIALLKFVK無4389-Y2CFR2026CFR2024的AA28-42被替代NQWDOTQHGVELRQQ無4389-Y3CFR2027CFR2024的AA45-60被替代IYIMGTQERNEKLFYR無4389-Y4CFR2028CFR2024的AA138-147被替代EENETTCYMG無3825-Y1.2CFR2029CFR2019的AA28-43被替代NQWDGTQHGVELRQQ無3825-Y1.3CFR2030CFR2019的AA73-89被替代IYIMGTQERNEKLFYR無3825-Y1.4CFR2031CFR2019的AA187-196被替代EENETTCYMG無3825-Y2.3CFR2032CFR2020的AA73-89被替代IYIMGTQERNEKLFYR無3825-Y2.4CFR2033CFR2020的AA187-196被替代EENETTCYMG無3825-Y2.3.4CFR2034CFR2032的AA187-196被替代EENETTCYMG無3825-Y1.2.3.4CFR2035CFR2034的AA202-251被替代FQMVTIDQLKPKIALLKFVK無4389-Y1.2CFR2036CFR2025的AA28-42被替代NQWDGTQHGVELRQQ無4389-Y1.3CFR2037CFR2025的AA45-60被替代IYIMGTQERNEKLFYR無4389-Y1.4CFR2038CFR2025的AA138-147被替代EENETTCYMG無4389-Y2.3CFR2039CFR2026的AA45-60被替代IYIMGTQERNEKLFYR無4389-Y2.4CFR2040CFR2026的AA138-147被替代EENETTCYMG無4389-Y2.3.4CFR2041CFR2039的AA138-147被替代EENETTCYMG無4389-Y1.2.3.4CFR2042CFR2041的AA153-203被替代FQMVTIDQLKPKIALLKFVK無CB-Y1KCFR2143CFR1905的AA131-137被替代ISLENKWGKLFQMVTIDQLKPKIALLKFVK無SB-Y1KCFR2144CFR1904的AA152-158被替代ISLENKWGKLFQMVTIDQLKPKIALLKFVK無3825-Y1KCFR2145CFR2019的C末端添加AADEL無4389-Y1KCFR2146CFR2025的C末端添加AADEL無6rB-CB-Y1KCFR2247CFR2143連接粒酶BG4S接頭人源粒酶BGrB-SB-Y1KCFR2248CFR2144連接粒酶BG4S接頭人源粒酶BGrB-3825-Y1KCFR2249CFR2145連接粒酶BG4S接頭人源粒酶BGrB-4389-Y1KCFR2250CFR2146連接粒酶BG4S接頭人源粒酶BBax-CB-Y1KCFR2351CFR2143連接Bax-Alpha045接頭人Bax(全長(zhǎng))Bax-SB-Y1KCFR2352CFR2144連接Bax-Alpha045接頭人Bax(全長(zhǎng))Bax-3825-Y1KCFR2353CFR2145連接Bax-Alpha045接頭人Bax(全長(zhǎng))Bax-4389-Y1KCFR2354CFR2146連接Bax-Alpha045接頭人Bax(全長(zhǎng))Bax(3..6)-CB-Y1KCFR2455CFR2143連接Bax(片段)045接頭人Bax(3，4，5，6區(qū))Bax(3..6)-SB-Y1KCFR2456CFR2144連接Bax(片段)045接頭人Bax(3，4，5，6區(qū))Bax(3..6)-3825-Y1KCFR2457CFR2145連接Bax(片段)045接頭人Bax(Bax(3..6)-4389-Y1KCFR2458CFR2146連接Bax(片段)045接頭人Bax(實(shí)施例2線性肽抗原區(qū)繪圖rGel分子的抗原區(qū)再以前的文獻(xiàn)中沒有被描述過。rGel分子的抗原區(qū)取決于分子的碳水化合物或肽序列。細(xì)菌中制備的重組rGel沒有糖基化，因此針對(duì)rGel的抗體應(yīng)該識(shí)別分子上的肽區(qū)。為了確定rGel分子的抗原區(qū)，首先從接觸重組gelonin的實(shí)驗(yàn)室工作人員的血清中分離人多克隆抗體。然后將血清加入到用rGel包被的96孔ELISA板中，加入抗人抗體以確定人抗gelonin抗體的存在。結(jié)果表明三個(gè)工作人員中有兩個(gè)人的血清中抗體滴度明顯高于對(duì)照人血清(圖1)。然后抽取20ml這兩個(gè)人的血清用含rGel的Affi-gel親和樹脂進(jìn)行親和層析就可以得到多克隆人抗gelonin抗體?？缭饺L(zhǎng)rGel分子的10個(gè)肽合成出來后包被96孔板。將人抗gelonin抗體加入到96孔板中，反應(yīng)一段時(shí)間后用ELISA檢測(cè)吸附到肽包被孔中的結(jié)合人抗體。如圖2所示，與23-53(區(qū)1)、72-89(區(qū)2)、181-198(區(qū)3)和223-252(區(qū)4)肽反應(yīng)的多克隆抗體被得到。去掉這些可被人多克隆抗體特異性識(shí)別的抗原區(qū)就可以設(shè)計(jì)出人工毒素CFR-1001-2024。實(shí)施例3以人源序列替代抗原區(qū)序列利用有關(guān)抗原區(qū)的信息設(shè)計(jì)人/植物嵌合分子，這些抗原區(qū)是用上述的人抗gelonin抗體而確定出的四個(gè)gelonin分子上的特異性抗原區(qū)(氨基酸205-257、23-42、71-88和189-204)。用GenQuest/BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析這些序列確定與已知人源蛋白的同源性。本試驗(yàn)中還需要考慮的不僅是確定“人”同源序列，而且要確定這個(gè)序列再人工毒素分子上的排列位置以使所得到的雜交分子保持其酶解(n-糖苷)功能。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果確定插入到人工毒素中的4個(gè)候選序列，這是進(jìn)行氨基酸改變的基礎(chǔ)(表8)。區(qū)1的人同源序列與人KELL蛋白的同源性高達(dá)40％，KELL蛋白是一種具有鋅指結(jié)合區(qū)的血型蛋白。令人感興趣的是，天然gelonin的早期研究結(jié)果表明gelonin分子可以與鋅指區(qū)結(jié)合(Sperti等，1986)，但是本試驗(yàn)卻無法證實(shí)這一點(diǎn)。對(duì)區(qū)4(氨基酸189-204)的分析結(jié)果表明該區(qū)與人CFAH蛋白的同源性達(dá)到40％。區(qū)2(氨基酸23-42)的同源性檢索結(jié)果表明該區(qū)與人UTRO蛋白的同源性達(dá)到44％，UTRO蛋白在細(xì)胞骨架錨定到細(xì)胞漿膜的過程中發(fā)揮作用。表8人同種替代Y1(205-257)(源序列)GKLSFQIRTSGANGMFSEAVELERANGKKYYVTAVDQVKPKIALLKFLEKDPE(人源化序列)GKL-FQMVT-------------------------IDQLKPKIALLKFVK----Y2(23-42)(源序列)ELRVKLKPEGNSHGIPLLRKK(人源化序列)ELRVKNQWDGTQHGVEL-RQQV3(71-S8)(源序列)SVYVVGYQVRNRSYFFKD(人源化序列)SIYIMGIQERNEKLFYR-Y4(lS9-204)(源序列)QRIRPANNTISLENKW(人源化序列)QRIREENETTCYMGKW抗原位點(diǎn)被修飾和缺失的人工毒素被進(jìn)一步在區(qū)3修飾以使之與人KELL蛋白的同源性達(dá)到100％。人工毒素分子上KELL序列兩側(cè)的氨基酸也要作調(diào)整以便更接近全長(zhǎng)KELL蛋白的序列排列順序。替代區(qū)3的最終序列見表8。表9所顯示的是含有人同源序列的全長(zhǎng)蛋白的GenBank序列同源性檢索結(jié)果。我們的試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明用重組gelonin作為初始模板可以設(shè)計(jì)、構(gòu)建和檢測(cè)獨(dú)特的缺失突變。表9潛在替代肽分析以鑒定gelonin抗原性序列Y-1，Y-2，Y-3和Y-4實(shí)施例4人工gelonin毒素下面的部分描述了用上述實(shí)施例的方法構(gòu)建的gelonin毒素。缺失毒素CFR1888從原始重組gelonin模板開始，原始的KDPE的C末端經(jīng)修飾后成為KDEL以促進(jìn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)核糖體區(qū)。CFR1901-1905(見表7和圖3A)以CFR1888為模板，在其N末端和/或C末端進(jìn)行一系列缺失突變以確定分子上的哪些區(qū)被刪除后不會(huì)影響分子的生物學(xué)活性。如圖3A所示，單個(gè)缺失突變1901，1902和1903都沒有活性，但是當(dāng)單個(gè)突變結(jié)合時(shí)(CFR1904和CFR1905)其生物學(xué)活性得以恢復(fù)(圖3A)。CFR2018以CFR1888為模板，如表7所示對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步修飾制備稍微小一些的分子并且在其C末端加上丙氨酸以增加其在細(xì)菌宿受試者內(nèi)制備時(shí)的穩(wěn)定性。毒素的抗原性研究利用gelonin分子上排列的線性肽繪出分子上的抗原區(qū)圖譜。如圖1所示，通過人多克隆抗gelonin抗血清可以在分子上找到4個(gè)不同的抗原區(qū)。區(qū)1位于氨基酸2055-257，區(qū)2由氨基酸23-42組成，區(qū)3含有氨基酸71-88，區(qū)4含有氨基酸89-204。CFR2001-2024如圖3B所示，基于已發(fā)現(xiàn)的抗原區(qū)制備了6個(gè)缺失突變子。其中三個(gè)蛋白有生物學(xué)活性，另外三個(gè)無活性。CFR2019-2042通過替代試驗(yàn)獲得了人/植物嵌合分子。4個(gè)抗原區(qū)提交到GenBank進(jìn)行序列分析。通過Swissprot蛋白序列搜索尋找與上述4個(gè)抗原區(qū)有同源性的人源序列。人同源序列區(qū)1(氨基酸205-257)與人血型蛋白KELL(P23276)序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)與此蛋白上的一個(gè)序列具有40％的一致性和65％的陽(yáng)性率。區(qū)2(氨基酸23-42)與人UTRO蛋白(P46939)的序列一致性為44％。區(qū)3(氨基酸71-88)與人MAOM蛋白(P23368)的序列一致性為37％，陽(yáng)性率為68％。區(qū)4(氨基酸189-204)與人CFAH蛋白(P08063)的序列一致性為40％。根據(jù)這些數(shù)據(jù)(表8)制備出4個(gè)抗原區(qū)相應(yīng)的人嵌合序列。這些序列代表了以人非抗原性序列代替植物蛋白的抗原區(qū)。CFR2019-2024以CFR2019和CFR2024為模板開始，合成一系列新設(shè)計(jì)的蛋白，命名為CFR2019-2042(表7)。用人嵌合同源序列替代這些蛋白上的區(qū)1，2，3，或4。在含50Kda標(biāo)記物的細(xì)菌中表達(dá)這些人工設(shè)計(jì)的毒素(CFR2018，2019，2024和2025)，然后純化。利用標(biāo)記物的多克隆抗血清進(jìn)行Western分析。2019，2024和2025分子與起始模板2018蛋白相比其分子變小。Western分析結(jié)果也顯示每個(gè)毒素分子在SDS-PAGE上的平均遷移率都是相同的，說明這些分子與抗標(biāo)記物抗體的反應(yīng)活性大致相同。利用抗天然CFR1888分子的抗體為探針從新進(jìn)行Western雜交，結(jié)果顯示這種抗體與2018蛋白具有較好的反應(yīng)性，而與2019和2025人工毒素基本不反應(yīng)，與2024人工毒素只有較弱的反應(yīng)。這些結(jié)果說明通過特異性的缺失(CFR2024)、抗原區(qū)替代(CFR2019)或抗原區(qū)的缺失與替代相結(jié)合(CFR2025)可以設(shè)計(jì)出新的毒素分子，這些分子基本不被親本分子的抗體所識(shí)別，因此其抗原性減弱。CFR2143-2146這一系列的雜交分子被設(shè)計(jì)成具有蛋白CFR1888和CFR2018的最佳功能活性。CFR2247-2458設(shè)計(jì)出一系列既有I型毒素的n糖苷功能又有人選擇性前調(diào)亡分子如BAX和粒酶B活性的分子。分析這些分子的gelonin組分功能活性及BAX和粒酶B活性。也可以檢測(cè)其抑制無細(xì)胞蛋白合成的能力。對(duì)這一系列分子的評(píng)價(jià)首先是檢測(cè)BAX在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況?？梢杂肂AX抗體如通用抗Bax6A7抗體通過免疫分析如免疫沉淀或Western雜交進(jìn)行。確定了Bax的表達(dá)情況后檢測(cè)細(xì)胞的存活能力。存活能力的測(cè)定方法有很多，其中包括利用螢火蟲熒光素酶構(gòu)建物。螢火蟲熒光素酶構(gòu)建物是一種攜帶螢火蟲熒光素酶(Luc)結(jié)構(gòu)基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pGL3)，將該載體與編碼BAX和BAX融合蛋白的質(zhì)粒一起導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。利用20ml細(xì)胞提取物通過液閃計(jì)數(shù)測(cè)定熒光素酶的活性。通過比較試驗(yàn)組構(gòu)建物與特異對(duì)照質(zhì)粒的熒光素酶相對(duì)活性就可以知道細(xì)胞的存活能力。粒酶B可以將L-谷?；?2-萘胺(Bachem，Philadelphia，PA)水解成2-萘胺，因此通過測(cè)定2-萘胺的熒光強(qiáng)度就可以知道含有全部或部分粒酶B多肽的雜交分子的熒光素酶活性。酰胺酶的活性測(cè)定方法如下將1.00mM的L-谷?；?2-萘胺溶解到緩沖液A(0.3MNaCl0.1MHEPES，用1MNaOH，lmmNa2EDTA0.05M(v/v)Tritonx-100將pH調(diào)整到7.0)中，21℃條件下用Perkin-Elmer650-10M熒光分光光度計(jì)測(cè)量340nm激發(fā)熒光強(qiáng)度和415nm的發(fā)射熒光強(qiáng)度(各有5nm的帶寬變化)。將一小管酶溶液加入到底物溶液中，測(cè)定10-40分鐘內(nèi)發(fā)射熒光強(qiáng)度的變化。另外，也可以BAADT(N-a-t-butoxycarbonyl-L-alanyl-L-alanylL-aspartyl-thiobenzylester)為底物通過連續(xù)比色測(cè)定粒酶B的活性。為了檢測(cè)每一組分，將1-50μl加入到緩沖液A中，緩沖液A含有1M(v/v)10mMBAADT/(CH3)250和1M(v/v)11nMdithiobis(2-硝基苯酸)(Sigma)，在21℃條件下用Thermomaxplatereader(MolecularDevicesInc.，PaloAlto，CA)測(cè)定405nm處的吸光度增加值。吸光度增加值可以轉(zhuǎn)換成酶活性。實(shí)施例4實(shí)施例5的材料和方法材料從表達(dá)鼠抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取雜交瘤RNA，用Novagen(Madison，WI)和InvitrogenCorp.(C.arlsbad，CA)的試劑盒從RNA中擴(kuò)增編碼抗體ZME-018的cDNA。PCR試劑來自于FisherScientific(Pittsburgh，PA)，分子生物學(xué)酶購(gòu)自BoehringerMannhehn(Indianapolis，IN)或NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)。細(xì)菌菌株和pEt細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒來自于Novagen(lVladison，WI)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基購(gòu)自DifcoLaboratories(Detroit，MI)。其他所有化合物和試劑購(gòu)自FisherScientific或SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)。金屬親和樹脂(Talon)來自于ClontechLaboratories(PaloAlto，CA)。其他色譜樹脂和材料購(gòu)自PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)。組織培養(yǎng)試劑來自于GIBCOBRL(Gaithersburg，MD)?？贵wZME-018VH區(qū)和VL區(qū)的克隆表達(dá)ZME-018(IgG2A)抗體的鼠雜交瘤FMT112P2的mRNA用InvitrogenFastTrackkit提取，然后用在特定條件下InvitrogenCopyKit轉(zhuǎn)錄成cDNA?？贵w輕鏈和重鏈可變區(qū)的擴(kuò)增是用NovagenIg-Primekit進(jìn)行，所用引物為鼠Ig引物對(duì)。輕鏈PCR擴(kuò)增條件如下30個(gè)循環(huán)，94℃×1分鐘、60℃×1分鐘、72℃×1分鐘，最后72℃孵育5分鐘。重鏈的反應(yīng)條件與輕鏈相似，除了其退火溫度為50℃而不是60℃。用這種方法擴(kuò)增的DNA克隆到InvitrogenT/A克隆載體pCRII中，不需進(jìn)一步純化就可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，然后通過藍(lán)-白斑篩選。陽(yáng)性克隆(分別從重鏈和輕鏈文庫(kù)中挑選5個(gè)克隆)用T7和SP6啟動(dòng)子引物測(cè)序，然后比較抗體區(qū)與其他免疫球蛋白的同源性。構(gòu)建編碼單鏈抗體scfvMEL和免疫毒素scfvMEL/rGel的基因一種兩步的剪接-重疊延伸PCR方法用于構(gòu)建單鏈抗體ZME-018，以輕鏈和腫瘤DNA克隆為模板。輕鏈的擴(kuò)增引物為A(5’-GCTGCCCAACCAGCCATGGCGGACATTGTGATG-3’)和C(5’-GCCGGAGCCTGGCTTGC(A/C)GCTOCCGCTGGTGGAGCCTITGATC(A/T)CCAG-3’)，重鏈的擴(kuò)增引物為B(5’-AAGCCAGGCTCCGGCGAAGGCAGCACCAAAGGCGAAGTGAAGGTT-3’)和D(5’-GCCACCGCCACCACTAGTTGAGGAGACTGT-3’)。每組PCR的條件為30個(gè)循環(huán)，94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后72℃孵育5分鐘。從每一反應(yīng)液中取1/10體積混和直接用在第二步PCR中，引物只有引物A和Y引物D，反應(yīng)條件同上。終產(chǎn)物用GenecleanII(Bio101，Vista，CA)純化后以限制性內(nèi)切酶NcoI和SpeI消化，然后克隆到T7來源的質(zhì)粒pET-22b中。通過重疊接合延伸PCR將編碼scfvMEL和重組gelonin的基因融合在一起，以抗體DNA和geloninDNA為模板，引物為NbsphZME(5’-GGGCGGTGGCTCCGTCATGACGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATrC-3’)，NTXOM(5’-GGTGGCGGTGGCTCCGGTCTAGACACCGTGACG-3’，和XOMBAC(5’-AAGGCTCGTGTCGACCTCGAGTCATTAAGCTTTAGGATCTTTATC-3’)(圖4)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過如上述的純化和消化后克隆到載體pET-32a中。經(jīng)過測(cè)序證明正確的克隆轉(zhuǎn)化購(gòu)自Novogen的大腸桿菌細(xì)胞株AD494(DE3)pLysS中表達(dá)融合毒素。蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)為表達(dá)免疫毒素，將細(xì)菌接種到含有高強(qiáng)度抗生素選擇性(200μg/ml氨芐青霉素，70μg/ml氯霉素和15μg/ml卡那霉素)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，直到細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(A600＝0.4-0.8)。然后將培養(yǎng)物用含同樣濃度抗生素的新鮮2xYT培養(yǎng)基稀釋1倍，然后加入0.1mMIPTG在23℃孵育16-23小時(shí)使靶蛋白表達(dá)。所得到的細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心后儲(chǔ)存在-80℃以便進(jìn)行下一步的純化。免疫毒素/蛋白質(zhì)純化從表達(dá)免疫毒素scFvZME-Gel的培養(yǎng)物中離心得到的冷凍細(xì)菌沉淀物在室溫下解凍后加入pH8.0的10mMTris-HCl在4℃裂解30分鐘。然后將細(xì)菌裂解物用細(xì)胞裂解儀超聲破碎三次，每次10秒，再用14,000rpm于4℃離心30分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移出來置于冰上，細(xì)胞沉淀重復(fù)進(jìn)行超聲破碎。然后將兩次破碎后離心的上清液混和，用SS-34轉(zhuǎn)子在4℃超速離心40,000rpm45分鐘。含有可溶性蛋白的樣品過濾(0.22μm孔徑的濾膜)，用1MTris-HCl(pH8.0)將Tris-HCl的濃度調(diào)整到40mM，然后在室溫下加入到用同樣緩沖液預(yù)平衡的Talon金屬親和層析柱中。上樣以后用3倍柱體積的上樣緩沖液洗脫，再用5倍柱體積的40mMTris-HCl(pH8.0)、500mMNaCl和5mM咪唑洗脫，然后用5倍柱體積的40mMTris-HCl(pH8.0)、500mMNaCl和100-200mM咪唑?qū)⒔Y(jié)合到柱子上的蛋白洗脫下來。混和含有免疫毒素的組分，定量后根據(jù)Novagen(Madison，WI)建立的方法用腸激酶將6xHis切掉，然后透析到20mMTris-HCl(pH7.2)，50mMNaCl溶液中。ELISA和Western分析ELISA的所有孵育步驟都是在室溫下孵育1小時(shí)，除非特殊說明，在兩次孵育期間用ELISA洗滌緩沖液(10mMTris-HCl(pH8.0)，150mMNaCl，0.2％Tween-20)。96孔板的孔用50,000個(gè)gp240抗原陽(yáng)性A375M黑色素瘤細(xì)胞包被并干燥。然后從新水化并用溶于洗滌緩沖液中的3％BSA封閉。96孔板中加入純化的免疫毒素樣品、兔抗gelonin多克隆抗體(濃度為100ng/ml，溶于稀釋緩沖液含1mg/mlBSA的ELISA洗滌緩沖液中)和過氧化物酶連接的羊抗兔IgG抗體(Sigma，用稀釋緩沖液稀釋到1∶5,000)孵育。用洗滌緩沖液洗滌每一孔，然后用溶于0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.2)中的ABTS(2，2’-azino-bis[3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonicacid])染色30分鐘，在405nm處測(cè)吸光度。除非特殊說明，Western雜交的所有孵育步驟都是在室溫下孵育1小時(shí)。主要步驟為蛋白通過SDS-PAGE分離，然后在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mMTris-HCl(pH7.5)，190mM甘油，20％(v/v)HPLC級(jí)甲醇)中4℃過夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，所用電壓為40v。濾膜用溶于Western封閉緩沖液(50mMTris-HCI(pH7.5)，150mMNaCl)中的5％BSA封閉，然后與兔抗gelonin多克隆抗體(濃度為100ng/mL，溶于Western洗滌緩沖液TBS，pH7.6，0.5％Tween-20中)和過氧化物酶連接的羊抗兔IgG抗體(Sigma，用洗滌緩沖液稀釋到1∶10,000)連續(xù)反應(yīng)。用AmershamECL檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)所產(chǎn)生的信號(hào)。網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解體外翻譯分析給予各種劑量的免疫毒素后，gelonin可以誘導(dǎo)抑制放射性標(biāo)記(3H)的亮氨酸摻入蛋白質(zhì)中，根據(jù)廠家(Promega)的說明書和文獻(xiàn)的描述(Press等，1986)利用無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)測(cè)定亮氨酸摻入的抑制率。免疫熒光染色分析抗原陽(yáng)性細(xì)胞(A375黑色素瘤細(xì)胞)加入到多聚賴氨酸包被的16孔槽狀載波片(Nunc)上，每個(gè)槽加入104個(gè)細(xì)胞，5％CO2中37℃孵育過夜。在不同時(shí)間點(diǎn)上用50μg/ml的scfvMEL/rGel融合構(gòu)建物處理。然后細(xì)胞用PBS洗滌，結(jié)合到細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)通過在甘氨酸緩沖液(500mMNaCl，0.1M甘氨酸，pH2.5)中孵育10分鐘被剝離，用0.5MTris，pH7.4中和5分鐘，用PBS簡(jiǎn)單洗滌，然后用3.7％的甲醛(Sigma)在室溫下固定15分鐘，再用PBS簡(jiǎn)單漂洗。然后將細(xì)胞放入到含有0.2％TritonX-100m的PBS中滲透10分鐘，用PBS洗滌三次，再用含3％BSA的PBS在室溫下孵育1小時(shí)。用PBS簡(jiǎn)單洗滌后，細(xì)胞與兔抗scfvMEL抗體或兔抗rGel多克隆抗體孵育，抗體用含0.1％Tween-20和0.2％BSA的PBS稀釋到1∶500，室溫下孵育1小時(shí)。然后用含0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗滌三次，每次10分鐘，用含3％BSA的PBS在室溫下封閉1小時(shí)，再加入1∶100稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗兔IgG抗體(Sigma)。對(duì)照組細(xì)胞只與(FITC)標(biāo)記的抗兔二抗(1∶100)孵育。用PBST洗滌三次后再用PBS洗滌10分鐘，然后在計(jì)數(shù)液中計(jì)數(shù)。載波片放到熒光顯微鏡下觀察，每一照片至少含有10個(gè)視野，放大倍數(shù)為400倍。體外細(xì)胞毒試驗(yàn)樣品的分析采用標(biāo)準(zhǔn)72小時(shí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)，所用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的抗原陽(yáng)性A375M和抗原陰性Me-180或SK-OV-3單層細(xì)胞(5,000/孔)，染色方法為以前文獻(xiàn)所描述的結(jié)晶紫染色方法(Oqishikawa等，1992)。體內(nèi)細(xì)胞毒試驗(yàn)4-6周齡的去胸腺小鼠(裸鼠)分組，每組5只放在一個(gè)籠子內(nèi)。在其右腹部皮下注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑色素瘤細(xì)胞A-375(5×106個(gè)細(xì)胞/小鼠)，使腫瘤在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。腫瘤長(zhǎng)到可測(cè)量的大小(～30-50mm2)時(shí)，用生理鹽水(對(duì)照組)或各種濃度的scfvMel/rGel融合毒素處理(尾靜脈注射)，連續(xù)注射4天。再觀察動(dòng)物并測(cè)量腫瘤30天。實(shí)施例5單鏈重組抗黑色素瘤抗體融合到gelonin上設(shè)計(jì)seFvMEL/rGel融合蛋白以ZME-018抗體的可變區(qū)基因和gelonin基因(Rosenblum等，1999)為模板構(gòu)建抗黑色素瘤免疫毒素基因。第一步，在一個(gè)方向上裝配免疫毒素，然后檢測(cè)其對(duì)抗原陽(yáng)性黑色素瘤細(xì)胞A375M的結(jié)合能力和細(xì)胞毒性。利用PCR方法將編碼抗體和gelonin片段的基因連接起來構(gòu)建一個(gè)按抗體-毒素順序排列的融合體。免疫毒素基因也可以在C末端添加一個(gè)六聚組氨酸標(biāo)記，利用NovagenT-7來源的表達(dá)載體pET-32b在大腸桿菌AD494(DE3)中表達(dá)。圖4顯示的是表達(dá)的免疫毒素的方向和蛋白質(zhì)連接區(qū)氨基酸接頭的序列?？贵w的構(gòu)建是將輕鏈可變區(qū)(VL)的N末端通過一個(gè)18氨基酸的易彎曲肽接頭(Alfthan等，1995)連接到重鏈可變區(qū)(VH)的C末端。Gelonin(CYR2015)(在本實(shí)施例中指rGel)放置在VH的下游通過另一個(gè)接頭相連。我們選擇這種結(jié)構(gòu)的理由在于該結(jié)構(gòu)不會(huì)影響抗體結(jié)合位點(diǎn)的彎曲性。位于融合蛋白N末端的毒素需要一個(gè)較長(zhǎng)的肽來為兩個(gè)蛋白區(qū)提供最佳的空間定向，這種變體正在構(gòu)建中。最終融合基因的DNA序列分析確定了終產(chǎn)物的序列，并且表明利用PCR方法不會(huì)引入錯(cuò)誤的堿基。另外，序列分析結(jié)果也表明靶基因正確地插入到pET-32b載體的閱讀框架中。在無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中重組融合毒素具有與不含抗體的重組gelonin相同的蛋白合成抑制活性，說明gelonin活性位點(diǎn)裂隙中沒有明顯的硬脂酸堆積，這在于我們所設(shè)計(jì)的分子中抗體片段的近似性。另外，在這個(gè)融合構(gòu)建物中沒有蛋白裂解位點(diǎn)，文獻(xiàn)資料也表明gelonin不需要從構(gòu)建物上裂解下來就可以維持其生物學(xué)活性。這與蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)形成強(qiáng)烈對(duì)比，RTA需要從蛋白質(zhì)載體上裂解下來才能恢復(fù)其生物活性(Kim等，1988；O’Hare等，1990)。這是一個(gè)意外的驚喜，因?yàn)間elonin和RTA具有相同的作用機(jī)制(Stirpe等，1992)，并且具有30％的序列同源性(Rosenblum等，1999)。融合蛋白的表達(dá)和純化含有融合基因的質(zhì)粒載體pET-32b轉(zhuǎn)導(dǎo)到大腸桿菌AD494(DE3)pLysS中，通過加入IPTG誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)。如考馬斯染色凝膠所顯示的預(yù)期分子量(68kDa)的蛋白被誘導(dǎo)出來。這個(gè)蛋白用IMAC樹脂純化，用重組腸激酶(EK)剪切而洗脫下來得到最終的融合蛋白，其在凝膠上的條帶大小為56kDa。融合體也可以用抗gelonin抗體和抗單鏈抗體通過Western雜交分析。遷移到56kDa處的sfvMEL/rGel融合構(gòu)建物與兩個(gè)抗體都可以結(jié)合，因此說明融合構(gòu)建物中存在免疫反應(yīng)性抗體和毒素成分。從誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物中分離的可溶性sfvMEL/rGel免疫毒素的估計(jì)產(chǎn)率大約為700μg/L；但是最終純化出的融合毒素的產(chǎn)率大約為200μg/L。產(chǎn)率降低的主要原因在于IMAC無法完全捕獲上樣液中所有的可溶性靶蛋白。更換結(jié)合緩沖液和條件以及其他品牌的IMAC捕獲樹脂也無法改善這些結(jié)果。免疫毒素的ELISA結(jié)合為了確定純化的融合蛋白是否保留了抗原結(jié)合活性，我們用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA結(jié)合分析比較純化的融合蛋白和完整的IgGZME-018-gelonin化學(xué)結(jié)合物及IgGZME-018與抗原的結(jié)合能力，以抗原陽(yáng)性的人黑色素瘤細(xì)胞為抗原來源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)scfvMEL/rGel融合構(gòu)建物具有與化學(xué)結(jié)合物相同的結(jié)合活性。結(jié)果表明融合蛋白與靶細(xì)胞黑色素瘤細(xì)胞A375M具有特異而顯著的ELISA結(jié)合活性，而與SK-OV-3或ME-180細(xì)胞的結(jié)合活性只是背景水平。SfvMEL融合毒素的無細(xì)胞蛋白合成抑制活性毒素插入到融合構(gòu)建物中后其生物學(xué)活性被嚴(yán)重compromised。為了檢測(cè)融合構(gòu)建物中rGel組分的n-糖苷酶活性，將融合構(gòu)建物加入到體外蛋白反應(yīng)系統(tǒng)中，所用的方法是3H-亮氨酸摻入到分離的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)。融合構(gòu)建物和原始rGel的抑制曲線是相同的，兩個(gè)分子的IC50也基本相同(分別為100pM和104pM)。免疫熒光染色檢測(cè)scfvMEL/rGel的結(jié)合與內(nèi)化作用經(jīng)scFvMEL/rGel處理的A375-M在處理后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行免疫熒光染色。被細(xì)胞內(nèi)化的構(gòu)建物用兔抗-rGel或兔抗-scFvMEL抗體及隨后的FITC標(biāo)記的抗兔IgG抗體檢測(cè)。經(jīng)融合蛋白處理后可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到scFvMEL/rGel融合蛋白上的rGel區(qū)，并且rGel的量隨時(shí)間而增加。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也可以觀察到scFvMEL區(qū)。這說明融合構(gòu)建物與細(xì)胞接觸后能與細(xì)胞有效結(jié)合并且rGel毒素可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。免疫毒素的體外細(xì)胞毒活性檢測(cè)純化的sfvMEL/rGel融合蛋白和原始的ZME/rGel化學(xué)構(gòu)建物對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞系(A375M)及抗原陰性細(xì)胞系(SK-OV-3)的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)。如圖7所示，兩個(gè)分子的IC50都是約為10nM，而rGel毒素的IC50要高出約200倍(約為2000nM)。免疫毒素對(duì)抗原陰性細(xì)胞系(SK-OV-3)的細(xì)胞毒效應(yīng)與單獨(dú)的gelonin相同。如預(yù)期的一樣，聯(lián)合給予ZME抗體和sfvMEL/rGel免疫毒素(圖8)后劑量-效應(yīng)曲線出現(xiàn)適度的偏移，說明融合構(gòu)建物細(xì)胞毒性的發(fā)揮依賴表面抗原的識(shí)別。異種移植模型中sfvMEL/rGel的抗腫瘤活性攜帶已生長(zhǎng)良好的A-375黑色素瘤異種移植物的小鼠用鹽水(對(duì)照組)、2mg/kg或20mg/kg的sfvMEL/rGel處理4天。如圖9所示，在28天的試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照組腫瘤從30mm2增長(zhǎng)到150mm2(500％增長(zhǎng)率)。與此相對(duì)應(yīng)的是，2mg/kgsfvMEL/rGel處理的小鼠腫瘤只有輕微的增長(zhǎng)，大約增加到60mm2(100％增長(zhǎng)率)。20mg/kg融合毒素處理組小鼠的腫瘤在處理后大小下降了50％，然后緩慢恢復(fù)，到28天時(shí)恢復(fù)到原來的大小(腫瘤總體沒有增長(zhǎng))。這兩種劑量的免疫毒素對(duì)小鼠沒有明顯的毒副作用，說明本試驗(yàn)中還沒有達(dá)到最大耐受劑量(MTD)。實(shí)施例6體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)方法人黑色素瘤細(xì)胞A375M的培養(yǎng)介質(zhì)為最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10％熱滅活胎牛血清、100μM非必須氨基酸、2mML-谷胺酰胺、1mM丙酮酸鹽、維生素和抗生素。培養(yǎng)細(xì)胞通過常規(guī)篩選發(fā)現(xiàn)無支原體感染。細(xì)胞增殖試驗(yàn)細(xì)胞系接種到完全培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2的濕潤(rùn)空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了評(píng)價(jià)重組毒素和免疫毒素對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響，將培養(yǎng)的細(xì)胞洗滌、用依地酸分離、重懸于完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為25×103個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，然后使細(xì)胞黏附到孔壁上，得到稀疏接種細(xì)胞群。24小時(shí)后，用含不同濃度免疫毒素或gelonin的培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后通過結(jié)晶紫染色分析細(xì)胞的相對(duì)增殖率。結(jié)晶紫染色細(xì)胞用含鈣和鎂的PBS洗滌三次后用含0.5％(w/v)結(jié)晶紫的20％甲醇固定和染色。結(jié)合的染料在室溫下用150μlSrensen’s檸檬酸緩沖液(0.1M檸檬酸鈉，pH4.2-50％(v/v)乙醇)洗脫1小時(shí)。用Bio-Tekmicroplatereader測(cè)量600nm吸光度值。相對(duì)細(xì)胞增值率(RCP)計(jì)算公式如下公式1純化的scfvMEL-CFR2018、scfvMEL-CFR2025和CFR2018對(duì)細(xì)胞增殖的影響用標(biāo)準(zhǔn)72小時(shí)細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析，所用的細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期抗原陽(yáng)性單層細(xì)胞A375M(5000/孔)，染色用結(jié)晶紫，方法如上所述。結(jié)果圖10所顯示的是每一種重組分子對(duì)上述經(jīng)72小時(shí)培養(yǎng)的A-375人黑色素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。如圖所示，融合構(gòu)建物scfvMEL-CFR2018和scfvMEL-CFR2025都能抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。達(dá)到對(duì)照組抑制率50％所需要的每一種藥物的濃度(I.C.50)都是100nM。而單純毒素(CFR2018)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度超過800nM，與抗體融合構(gòu)建物相比幾乎高出8倍。融合到scfvMEL抗體上使CFR2018毒素具有了腫瘤細(xì)胞靶向性，這種靶向作用可以使毒素的細(xì)胞毒性增加8倍。另外，與CFR2018毒素相比，人工毒素CFR2025和CFR2018與抗體載體一起轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞內(nèi)時(shí)具有相同的細(xì)胞毒性。本文所描述的所有組合物和方法按照本說明書都可以適度實(shí)施。在本發(fā)明的組合物和方法以實(shí)施方式的形式被描述時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的概念和范圍的情況下可以對(duì)這些組合物和方法、方法的步驟及步驟的順序進(jìn)行適當(dāng)修改。特別要說明的是，可以用那些化學(xué)和生理相近的試劑代替本發(fā)明的試劑，也可以得到同樣的結(jié)果。在本發(fā)明權(quán)利要求所定義的精神、范圍和概念內(nèi)，所有的這些代替和修改都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參考文獻(xiàn)下面的參考文獻(xiàn)在一定程度上為本發(fā)明提供了可模仿的試驗(yàn)過程或作為本說明書的詳細(xì)補(bǔ)充，已特地納入本文作為參考。EPANo.320308EPANo.329822EPO0273085GBApplicationNo.2,202,328GBApplicationNo.2193095PCT/US85/01161PCT/US87/00880PCT/US89/01025PCT/US89/05040U.S.Patent3,817,837U.S.Patent3,850,752U.S.Patent3,939,350U.S.Patent3,996,345U.S.Patent4,162,282U.S.Patent4,196,265U.S.Patent4,275,149U.S.Patent4,277,437U.S.Patent4,310,505U.S.Patent4,366,241U.S.Patent4,472,509U.S.Patent4,472,509U.S.Patent4,533,254U.S.Patent4,554,101U.S.Patent4,683,195U.S.Patent4,683,202U.S.Patent4,684,611U.S.Patent4,690,915U.S.Patent4,728,575U.S.Patent4,728,578U.S.Patent4,737,323U.S.Patent4,800,159U.S.Patent4,879,236U.S.Patent4,883,750U.S.Patent4,921,706U.S.Patent4,938,948U.S.Patent4,938,948U.S.Patent4,946,773U.S.Patent4,952,500U.S.Patent5,021,236U.S.Patent5,196,066U.S.Patent5,199,942U.S.Patent5,279,721U.S.Patent5,302,523U.S.Patent5,322,783U.S.Patent5,359,046U.S.Patent5,384,253U.S.Patent5,401,511U.S.Patent5,401,511U.S.Patent5,432,260U.S.Patent5,464,765U.S.Patent5,538,877U.S.Patent5,538,880U.S.Patent5,550,318U.S.Patent5,563,055U.S.Patent5,580,859U.S.Patent5,589,466U.S.Patent5,591,616U.S.Patent5,603,872U.S.Patent5,603,872U.S.Patent5,610,042U.S.Patent5,656,610U.S.Patent5,693,762U.S.Patent5,702,932U.S.Patent5,736,524U.S.Patent5,780,448U.S.Patent5,786,214U.S.Patent5,789,215U.S.Patent5,801,005U.S.Patent5,824,311U.S.Patent5,830,880U.S.Patent5,840,873U.S.Patent5,843,640U.S.Patent5,843,650U.S.Patent5,843,651U.S.Patent5,843,663U.S.Patent5,846,708U.S.Patent5,846,709U.S.Patent5,846,717U.S.Patent5,846,726U.S.Patent5,846,729U.S.Patent5,846,783U.S.Patent5,846,945U.S.Patent5,849,481U.S.Patent5,849,483U.S.Patent5,849,486U.S.Patent5,849,487U.S.Patent5,849,497U.S.Patent5,849,546U.S.Patent5,849,547U.S.Patent5,849,718U.S.Patent5,851,770U.S.Patent5,851,772U.S.Patent5,853,990U.S.Patent5,853,992U.S.Patent5,853,993U.S.Patent5,856,092U.S.Patent5,858,652U.S.Patent5,861,155U.S.Patent5,861,244U.S.Patent5,863,732U.S.Patent5,863,753U.S.Patent5,866,331U.S.Patent5,866,337U.S.Patent5,866,366U.S.Patent5,871,727U.S.Patent5,871,986U.S.Patent5,879,703U.S.Patent5,882,864U.S.Patent5,889,155U.S.Patent5,900,481U.S.Patent5,905,024U.S.Patent5,910,407U.S.Patent5,912,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yrPheCysGlnGlnTyrAsnSerTyr859095cctctgacgttcggtggaggcaccaagctggagatcaaaggctccacc336ProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysGlySerThr100105110agcggcagcggtaagccaggctccggcgaaggcagcaccaaaggcgaa384SerGlySerGlyLysProGlySerGlyGluGlySerThrLysGlyGlu115120125gtgaaggttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatcc432ValLysValGluGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySer130135140atgaaactctcctgtgttgtctctggattcactttcggtaattactgg480MetLysLeuSerCysValValSerGlyPheThrPheGlyAsnTyrTrp145150155160atgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtggattgca528MetAsnTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrpIleAla165170175gaaattagattgaaatccaataattttgcaagatattatgcggagtct576GluIleArgLeuLysSerAsnAsnPheAlaArgTyrTyrAlaGluSer180185190gtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtc624ValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSerSerVal195200205tacctgcaaatgatcaacctaagagctgaagatactggcatttattac672TyrLeuGlnMetIleAsnLeuArgAlaGluAspThrGlyIleTyrTyr210215220tgtaccagttatggtaactacgttgggcactattttgaccactggggc720CysThrSerTyrGLyAsnTyrValGlyHisTyrPheAspHisTrpGly225230235240caaggcaccactctcaccgtctcctcagctagcggtggcggtggctcc768GlnGlyThrThrLeuThrValSerSerAlaSerGlyGlyGlyGlySer245250255ggtctagacaccgtgagctttagcactaaaggtgccacttatattacc816GlyLeuAspThrValSerPheSerThrLysGlyAlaThrTyrIleThr260265270tacgtgaatttcttgaatgagctacgagttaaattgaaacccgaaggt864TyrValAsnPheLeuAsnGluLeuArgValLysLeuLysProGluGly275280285aacagccatggaatcccattgctgcgcaaaaaatgtgatgatcctgga912AsnSerHisGLyIleProLeuLeuArgLysLysCysAspAspProGly290295300aagtgtttcgttttggtagcgctttcaaatgacaatggacagttggcg960LysCysPheValLeuValAlaLeuSerAsnAspAsnGlyGlnLeuAla305310315320gaaatagctatagatgttacaagtgtttatgtggtgggctatcaagta1008GluIleAlaIleAspValThrSerValTyrValValGlyTyrGlnVal325330335agaaacagatcttacttctttaaagatgctccagatgctgcttacgaa1056ArgAsnArgSerTyrPhePheLysAspAlaProAspAlaAlaTyrGlu340345350ggcctcttcaaaaacacaattaaaacaagacttcattttggcggcagc1104GlyLeuPheLysAsnThrIleLysThrArgLeuHisPheGlyGlySer355360365tatccctcgctggaaggtgagaaggcatatagagagacaacagacttg1152TyrProSerLeuGluGlyGluLysAlaTyrArgGluThrThrAspLeu370375380ggcattgaaccattaaggattggcatcaagaaacttgatgaaaatgcg1200GlyIleGluProLeuArgIleGlyIleLysLysLeuAspGluAsnAla385390395400atagacaattataaaccaacggagatagctagttctctattggttgtt1248IleAspAsnTyrLysProThrGluIleAlaSerSerLeuLeuValVal405410415attcaaatggtgtctgaagcagctcgattcacctttattgagaaccaa1296IleGlnMetValSerGluAlaAlaArgPheThrPheIleGluAsnGln420425430attagaaataactttcaacagagaattcgcccggcgaataatacaatc1344IleArgAsnAsnPheGlnGlnArgIleArgProAlaAsnAsnThrIle435440445agccttgagaataaatggggtaaactctcgttccagatccggacatca1392SerLeuGluAsnLysTrpGlyLysLeuSerPheGlnIleArgThrSer450455460ggtgcaaatggaatgttttcggaggcagttgaattggaacgtgcaaat1440GlyAlaAsnGlyMetPheSerGluAlaValGluLeuGluArgAlaAsn465470475480ggcaaaaaatactatgtcaccgcagttgatcaagtaaaacccaaaata1488GlyLysLysTyrTyrValThrAlaValAspGlnValLysProLysIle485490495gcactcttgaagttcgtcgataaagatcctaaataatga1527AlaLeuLeuLysPheValAspLysAspProLys500505<210>11<211>507<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述合成的<400>11MetThrAspIleValMetThrGlnSerGlnLysPheMetSerThrSer151015ValGlyAspArgValSerValThrCysLysAlaSerGlnAsnValAsp202530ThrAsnValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProGluPro354045LeuLeuPheSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPhe505560ThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnVal65707580GlnSerGluAspLeuAlaGluTyrPheCysGlnGlnTyrAsnSerTyr859095ProLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysGlySerThr100105110SerGlySerGlyLysProGlySerGlyGluGlySerThrLysGlyGlu115120125ValLysValGluGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySer130135140MetLysLeuSerCysValValSerGlyPheThrPheGlyAsnTyrTrp145150155160MetAsnTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrpIleAla165170175GluIleArgLeuLysSerAsnAsnPheAlaArgTyrTyrAlaGluSer180185190ValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSerSerVal195200205TyrLeuGlnMetIleAsnLeuArgAlaGluAspThrGlyIleTyrTyr210215220CysThrSerTyrGlyAsnTyrValGlyHisTyrPheAspHisTrpGly225230235240GlnGlyThrThrLeuThrValSerSerAlaSerGlyGlyGlyGlySer245250255GlyLeuAspThrValSerPheSerThrLysGlyAlaThrTyrIleThr260265270TyrValAsnPheLeuAsnGluLeuArgValLysLeuLysProGluGly275280285AsnSerHisGlyIleProLeuLeuArgLysLysCysAspAspProGly290295300LysCysPheValLeuValAlaLeuSerAsnAspAsnGlyGlnLeuAla305310315320GluIleAlaIleAspValThrSerValTyrValValGlyTyrGlnVal325330335ArgAsnArgSerTyrPhePheLysAspAlaProAspAlaAlaTyrGlu340345350GlyLeuPheLysAsnThrIleLysThrArgLeuHisPheGlyGlySer355360365TyrProSerLeuGluGlyGluLysAlaTyrArgGluThrThrAspLeu370375380GlyIleGluProLeuArgIleGlyIleLysLysLeuAspGluAsnAla385390395400IleAspAsnTyrLysProThrGluIleAlaSerSerLeuLeuValVal405410415IleGlnMetValSerGluAlaAlaArgPheThrPheIleGluAsnGln420425430IleArgAsnAsnPheGlnGlnArgIleArgProAlaAsnAsnThrIle435440445SerLeuGluAsnLysTrpGlyLysLeuSerPheGlnIleArgThrSer450455460GlyAlaAsnGlyMetPheSerGluAlaValGluLeuGluArgAlaAsn465470475480GlyLysLysTyrTyrValThrAlaValAspGlnValLysProLysIle485490495AlaLeuLeuLysPheValAspLysAspProLys50050權(quán)利要求1.一種除SEQIDNO1毒素之外的重組gelonin毒素，該毒素含有核心毒素區(qū)，該核心毒素區(qū)被定義為SEQIDNO1的氨基酸殘基110-210。2.如權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)外，該重組毒素含有至少10個(gè)SEQIDNO1的連續(xù)氨基酸殘基。3.如權(quán)利要求2所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)外，該重組毒素含有至少20個(gè)SEQIDNO1的連續(xù)氨基酸殘基。4.如權(quán)利要求3所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)外，該重組毒素含有至少30個(gè)SEQIDNO1的連續(xù)氨基酸殘基。5.如權(quán)利要求4所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)外，該重組毒素含有至少50個(gè)SEQIDNO1的連續(xù)氨基酸殘基。。6.如權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素，其中，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有10個(gè)SEQIDNO1的氨基酸缺失。7.如權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有20個(gè)SEQIDNO1的氨基酸缺失。8.如權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有30個(gè)SEQIDNO1的氨基酸缺失。9.如權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有5個(gè)SEQIDNO1的氨基酸被替代。10.如權(quán)利要求9所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有10個(gè)SEQIDNO1的氨基酸被替代。11.如權(quán)利要求10所述的重組gelonin毒素，除核心毒素區(qū)的氨基酸外，至少有20個(gè)SEQIDNO1的氨基酸被替代。12.一種蛋白化合物，其特征在于，所述化合物由權(quán)利要求1所述的重組gelonin毒素和第二多肽組成。13.如權(quán)利要求12所述的蛋白化合物，其中，第二多肽連接到重組gelonin毒素上。14.如權(quán)利要求13所述的蛋白化合物，其中，第二多肽通過一個(gè)接頭連接到重組gelonin毒素上。15.如權(quán)利要求12所述的蛋白化合物，其中，第二多肽和重組gelonin毒素形成融合蛋白。16.如權(quán)利要求12所述的蛋白化合物，其中，第二多肽是抗體。17.如權(quán)利要求16所述的蛋白化合物，其中，抗體含有一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)。18.如權(quán)利要求16所述的蛋白化合物，其中，抗體是直接針對(duì)腫瘤抗原的。19.如權(quán)利要求12所述的蛋白化合物，其中，第二多肽具有酶活性。20.一種用以下過程制備的經(jīng)過修飾的酶a)用抗體確定酶上的一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)；b)從酶上去除一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)以形成經(jīng)過修飾的酶；以及c)確定經(jīng)過修飾的酶具有酶活性。21.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，確定方法包括分析經(jīng)過修飾的酶的酶活性。22.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，它還包括用抗原性小于一個(gè)或多個(gè)被取代區(qū)域的氨基酸區(qū)域取代一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)域。23.如權(quán)利要求22所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，一個(gè)或多個(gè)較低抗原性區(qū)域通過在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源區(qū)來確定。24.如權(quán)利要求23所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，數(shù)據(jù)庫(kù)是人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。25.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，抗原區(qū)對(duì)人具有抗原性。26.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，抗體是多克隆抗體。27.如權(quán)利要求26所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，多克隆抗體來源于人。28.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，酶是植物毒素。29.如權(quán)利要求28所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，植物毒素是gelonin。30.如權(quán)利要求20所述的經(jīng)過修飾的酶，它還含有附著在經(jīng)過修飾的酶上第二多肽。31.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽連接到經(jīng)過修飾的酶上。32.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽與經(jīng)過修飾的酶形成融合蛋白。33.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽是抗體。34.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽是毒素。35.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽是第二種酶。36.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)過修飾的酶，其中，第二多肽可以促進(jìn)調(diào)亡。37.一種制備具有減弱的抗原性的修飾蛋白的方法，所述方法包括a)選擇一個(gè)想要施用于第一受試者的蛋白質(zhì)；b)利用來自于第一受試者或與第一受試者同種的第二受試者的抗血清確定第一受試者中抗原性的蛋白質(zhì)區(qū)域；c)制備確定區(qū)缺失的修飾蛋白；以及d)確定修飾蛋白具有減弱的抗原性。38.如權(quán)利要求37所述的方法，所述方法還包括d)搜索人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)以確定低抗原性區(qū)域與蛋白質(zhì)抗原區(qū)域的同源性；e)用所確定的低抗原性區(qū)域的全部或部分替代抗原區(qū)以形成修飾蛋白。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，替代步驟是利用編碼修飾蛋白的核酸分子通過重組技術(shù)完成的。40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，修飾蛋白是通過去除確定區(qū)域來制備的。41.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，缺失區(qū)域至少含有5個(gè)氨基酸殘基。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，缺失區(qū)域至少含有10個(gè)氨基酸殘基。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，缺失區(qū)域至少含有15個(gè)氨基酸殘基。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，缺失區(qū)域至少含有20個(gè)氨基酸殘基。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，缺失區(qū)域至少含有25個(gè)氨基酸殘基。46.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，缺失的抗原區(qū)被與被去除的氨基酸殘基數(shù)目相同的氨基酸替代。47.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述區(qū)域用ELISA方法確定。48.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，受試者是哺乳動(dòng)物。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，哺乳動(dòng)物是人。50.一種人源化的重組gelonin毒素，該毒素中至少有3個(gè)來自于一個(gè)或多個(gè)抗原區(qū)1，2，3或4的氨基酸被在人體內(nèi)抗原性低于被替代的氨基酸的氨基酸替代。51.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于抗原區(qū)1的氨基酸被替代。52.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于抗原區(qū)2的氨基酸被替代。53.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于抗原區(qū)3的氨基酸被替代。54.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于抗原區(qū)4的氨基酸被替代。55.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于至少2個(gè)抗原區(qū)的氨基酸被替代。56.如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素，其中，至少有3個(gè)來自于抗原區(qū)1-4中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸被替代。57.一種用以下過程制備的重組gelonin毒素a)在gelonin毒素中確定至少一個(gè)在哺乳動(dòng)物中具有抗原性的區(qū)域；以及b)用在哺乳動(dòng)物中抗原性較低的區(qū)域替代至少一部分抗原區(qū)。58.如權(quán)利要求57所述的重組gelonin毒素，其中，步驟a)中確定的抗原區(qū)是重組gelonin毒素。59.如權(quán)利要求57所述的重組gelonin毒素，其中，所述過程還包括將確定的抗原區(qū)與哺乳動(dòng)物氨基酸序列比較，從而找到在哺乳動(dòng)物中具有低抗原性的區(qū)域。60.如權(quán)利要求57所述的重組gelonin毒素，其中，所述過程還包括在哺乳動(dòng)物中確定低抗原性的區(qū)域。61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，哺乳動(dòng)物是人。62.一種殺傷腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括給細(xì)胞提供有效量的免疫毒素，所述免疫毒素含有g(shù)elonin的核心毒素區(qū)和能特異性靶向腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體。63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，免疫毒素包括SEQIDNO1。64.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，抗體是靶向腫瘤抗原的。65.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，抗體是鼠抗體。66.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞是黑色素瘤細(xì)胞。67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，抗體包括9.2.27或ZME-018。68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，免疫毒素是scfvMEL-2018或scfvMEL-2025。69.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞存在于病人體內(nèi)。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中，免疫毒素包含在藥學(xué)上可接受的組合物中。71.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，免疫毒素是通過將能夠表達(dá)免疫毒素的表達(dá)構(gòu)建物施用于癌癥細(xì)胞而提供的。72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，表達(dá)構(gòu)建物是病毒載體。73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，病毒載體是腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、肝炎病毒、皰疹病毒、慢性病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒。74.一種治療病人腫瘤的方法，所述方法包括給病人施用有效量的組合物，所述組合物含有攜帶gelonin核心毒素區(qū)的免疫毒素和特異性靶向腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述腫瘤為前列腺癌，肺癌，腦癌，皮膚癌，肝癌，乳腺癌，淋巴瘤，胃癌，腸癌，卵巢癌，胰腺癌，骨癌，骨髓腫瘤，頭頸腫瘤，宮頸癌，食管癌，眼癌，膽囊癌，腎癌，腎上腺癌，心臟腫瘤，結(jié)腸癌，或血液腫瘤。76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，免疫毒素包括SEQIDNO1。77.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，抗體靶向黑色素瘤細(xì)胞。78.如權(quán)利要求77所述的方法，其中，免疫毒素是scfvMEL-2018或scfvMEL-2025。79.一種治療病人腫瘤的方法，所述方法包括給病人施用有效量的組合物，所述組合物含有如權(quán)利要求50所述的人源化重組gelonin毒素。80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中，組合物還含有抗體。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，抗體是人源化的。82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，抗體是單鏈抗體。83.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，抗體與腫瘤細(xì)胞上的抗原結(jié)合。84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞是骨癌細(xì)胞，腦癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞，膠質(zhì)瘤細(xì)胞，牙齦癌細(xì)胞，頭頸腫瘤細(xì)胞，腎癌細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，胃癌細(xì)胞或舌癌細(xì)胞。85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞是黑色素瘤細(xì)胞。86.如權(quán)利要求82所述的方法，其中，單鏈抗體是9.2.27或ZME-018。87.如權(quán)利要求79所述的方法，它還包括對(duì)病人進(jìn)行化療、放療、基因治療或第二免疫治療。88.如權(quán)利要求79所述的方法，它還包括從病人體內(nèi)切除癌前病變組織或癌組織或腫瘤。全文摘要本發(fā)明涉及在保持蛋白化合物生物學(xué)活性的同時(shí)降低其抗原性的方法，本發(fā)明還涉及具有較低抗原性同時(shí)又具有生物學(xué)活性的蛋白組合物。這些方法及組合物有益于需要這種化合物和組合物的個(gè)體。本發(fā)明還涉及經(jīng)剪切的和/或具有較低抗原性的修飾毒素化合物。這種人工毒素具有治療、診斷和預(yù)防作用，特別是可以作為免疫毒素。本發(fā)明還提供了利用這些免疫毒素治療腫瘤的方法。文檔編號(hào)C07K19/00GK1512888SQ02808173公開日2004年7月14日申請(qǐng)日期2002年2月12日優(yōu)先權(quán)日2001年2月12日發(fā)明者M(jìn)·G·羅森布拉姆,L·陳,MG羅森布拉姆申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)