專利名稱：一種中華甲蟲蒲螨毒素蛋白及其基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物技術領域，特別是涉及一種中華甲蟲蒲螨毒素蛋白及其基 因。
背景技術：
小蠹蟲、長蠹、吉丁蟲(鞘翅目)；紅鈴蟲、米蛾(鱗翅目)；紅蟻(膜翅目)等是一 類隱蔽在樹皮下危害樹木的害蟲，化學防治很難奏效。以小蠹蟲為例，小蠹蟲被稱為森林的 “頭號殺手”，蟲害嚴重的地區(qū)每年用于小蠹蟲的防治費用是230元/畝，常規(guī)防治也要40 元/畝，但仍然不能遏止每年數(shù)百萬立方米林木材積的損失，據(jù)專家估計，其造成的經(jīng)濟損 失約占全部蟲害損失的一半。郁郁蔥蔥的森林在冥冥中變成了毫無生機的死地。因此多 年 來國內(nèi)外許多學者孜孜不倦地尋找高效的生物作用物，以控制此類害蟲。蒲螨(Pyemotes)為昆蟲外寄生螨，體長僅200 μ m左右，其寄主主要是上述隱蔽性 害蟲，蒲螨控制寄主的能力極強，含有對寄主昆蟲高毒而對哺乳動物安全的神經(jīng)毒素，1只 蒲螨可制服比其體重大166000倍的寄主。由此可見，這是一類有廣闊應用前景的天敵資 源。國外有關研究起步較早，1850年Newport在谷物、棉花上發(fā)現(xiàn)了一種球腹蒲螨，50 年代末以后，發(fā)達國家對有關資源做了持續(xù)、系統(tǒng)的調(diào)查，發(fā)表18種蒲螨，至今方興未艾。 80年代年美國學者TomalskLBruce等開始系統(tǒng)研究美國重要蒲螨麥蒲螨(P. tritici)，得 到了該蒲螨的毒素基因Tox34和Τοχ21，1991年將Τοχ34轉移到苜蓿銀紋夜蛾核多角體病 毒中，得到表達。但麥蒲螨則主要以鱗翅目和膜翅目為主要寄主，例如，麥蒲螨人工釋放用 于防治印度谷螟(Plodia interpunctella(HUbner))，至今未見到釋放麥蒲螨控制鞘翅目 害蟲的報道。1990年本發(fā)明人在小蠹蟲體上發(fā)現(xiàn)了我國第一種蒲螨，此后對我國的蒲螨資源做 了較系統(tǒng)的調(diào)查，在多種鉆蛀性甲蟲上發(fā)現(xiàn)了 1種高寄生率的蒲螨，經(jīng)系統(tǒng)研究，明確其為 我國特有的優(yōu)勢蒲螨種，定名為中華甲蟲蒲螨(Pyemotes zhonghuajia)，它含有對昆蟲高 毒的蒲螨毒素，特別的，它是鞘翅目害蟲的強力控制因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種中華甲蟲蒲螨毒素蛋白及其編碼基因，或與 SEQ ID NO :1所示核苷酸編碼相同蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的第二個目的在于提供制備上述蒲螨毒素蛋白的方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供上述蒲螨毒素蛋白及其編碼基因的應用。本發(fā)明從中華甲蟲蒲螨中分離純化得到中華甲蟲蒲螨毒素蛋白，其N-氨基酸序 列為N-Asp-Asn-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Val-Arg-Ala-。為便于表述，現(xiàn)將該蛋白命名為 Ptgl-I0PTGl-I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該基因全長649bp。
應當理解，在不影響PTGl-I蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本領域技 術人員可對SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨 基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件 下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。 因 此，本發(fā)明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核 苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正 義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述 載體的宿主細胞，利用所述宿主細胞制備蒲螨毒素蛋白的方法等等。本發(fā)明所述的中華甲蟲蒲螨毒素蛋白可用于殺滅害蟲，制備生物殺蟲劑；所述基 因可用于提高植物抗蟲活性、制備轉基因植物。本發(fā)明的中華甲蟲蒲螨毒素蛋白的提取、濃縮和純化過程如下1、預處理將進入產(chǎn)后代高峰期時的中華甲蟲蒲螨進行液氮速凍，-40°C保存?zhèn)?用，取適量冷凍樣品加入醋酸緩沖液研磨，離心分離，收集上清液；2、粗分離將上清液用沉淀法或冷凍干燥法濃縮；3、純化采用常規(guī)的層析法進行，所述層析法包括離子交換層析、凝膠過濾、吸附 層析以及親和層析等的離子交換層析；4、測序電泳分離具有生物活性的毒素蛋白，應用電轉移方法將膠中的蛋白轉到 PVDF膜上，應用Edman降解法測定毒素蛋白N-末端的10個氨基酸的序列。其中，所述濃縮可采用硫酸銨或有機溶劑沉淀濃縮，或冷凍干燥濃縮，實驗證明， 硫酸銨沉淀、有機溶劑沉淀和冷凍干燥濃縮得到的毒素，活性沒有顯著差異，由于硫酸銨沉 淀濃縮相對容易、費用較低，因此，提取液的濃縮優(yōu)選硫酸銨沉淀。本發(fā)明的所述純化依次采用離子交換層析、葡聚糖凝膠(S^hadex G200)過濾層 析、以及核酸蛋白純化儀純化蛋白毒素，逐步提純毒素蛋白的活性成分；分離純化的毒素蛋白的生物活性是將毒素施用于諸如棉鈴蟲的寄主，考察寄主是 否因此死亡來進行的，本發(fā)明利用金龜子幼蟲(蠐螬)、小蠹蟲幼蟲、大蠟螟幼蟲和棉鈴蟲 幼蟲作為寄主，測試純化的毒素蛋白的生物活性，實驗證明，大蠟螟幼蟲和棉鈴蟲幼蟲是較 為合適的實驗對象。本發(fā)明的中華甲蟲蒲螨毒素蛋白相應基因的分離和克隆如下1、供試蒲螨準備將單頭保種的、進入產(chǎn)后代高峰期時的蒲螨進行液氮速凍，然 后-40°C保存?zhèn)溆茫?、用“蛋白酶K消化裂解法”提取基因組；3、PCR擴增根據(jù)毒素蛋白N-末段氨基酸序列及已發(fā)表的毒素基因序列設計合成 了引物，進行PCR擴增；4、PCR擴增片段的回收、連接、轉化和鑒定將所有PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 后，EB染色，在紫外燈下分別切下PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)回收、連接、轉化，并克隆到pGEMT-easy vector，獲得陽性克??；5、測序進行DNA序列。本申請涉及的中華甲蟲蒲螨毒素蛋白Ptgl-I是對小蠹蟲等鉆蛀性鞘翅目害蟲高毒的因子，一方面可將Ptgi-I基因轉入樹木培育新的抗蟲樹木，另一方面可轉入微生物生 產(chǎn)微生物農(nóng)藥(殺蟲劑)，僅抗蟲樹木的應用所能挽回的由小蠹蟲等鉆蛀性害蟲為害所造 成的經(jīng)濟損失和生態(tài)損失就十分可觀，因此，該毒素未來的經(jīng)濟和社會效益將十分巨大。與 國外對蒲螨的應用相比，中華甲蟲蒲螨具有與麥蒲螨不同的寄主范圍，中華甲蟲蒲螨以鞘 翅目昆蟲為主要寄主，而中華甲蟲蒲螨對印度谷螟無效；而中華甲蟲蒲螨則是鞘翅目害蟲 的強力控制因子。因此麥蒲螨與中華甲蟲蒲螨具有不同的殺蟲譜。


圖1是提取液經(jīng)離子交換層析純化的譜圖。圖2是離子交換層析后的活性組分經(jīng)Si^phadex G200樹脂凝膠過濾層析純化的譜 圖。圖3是凝膠過濾層析后的活性組分經(jīng)AKTApHCIO型核酸蛋白純化儀純化的譜圖。圖4是中華甲蟲蒲螨毒素蛋白活性成分的電泳結果。圖5是PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電泳的結果。圖6是PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳的結果。 圖7是Ptgl-I原核表達細胞裂解上清液活性測定結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1靶標昆蟲及其齡期的選擇分別用微量注射器吸取蒲螨毒素提取液待測組分5ul對靶標昆蟲進行血腔注射， 每組分注射10頭，重復3次。對照處理方法，用微量注射器吸取5ul醋酸緩沖液對供試昆 蟲進行血腔注射，重復3次，每重復10頭。觀察死蟲數(shù)，和對照相比，供試昆蟲死亡的處理 就是含有毒素的組分。供試靶標昆蟲有，金龜子幼蟲(蠐螬)、小蠹蟲幼蟲、大蠟螟幼蟲、棉 鈴蟲幼蟲。實驗結果見表1 表1靶標昆蟲對5ul注射液的反應
權利要求
一種中華甲蟲蒲螨的毒素基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO1所示核苷酸編碼相同蛋白的核苷酸序列。
2.一種由權利要求1所述基因編碼的毒素蛋白，其氨基酸序列包括N-Asp-Asn-Gly-As
3.含有權利要求1所述基因的載體。
4.含有權利要求3所述載體的宿主。
5.權利要求1所述基因在制備轉基因植物中的應用。
6.權利要求1所述基因在提高植物抗蟲活性中的應用。
7.權利要求2所述毒素蛋白在制備生物殺蟲劑中的應用。
8.權利要求2所述的蛋白在殺滅植物害蟲中的應用。
9.一種制備權利要求1所述蛋白的方法，包括如下步驟1)預處理將進入產(chǎn)后代高峰期時的膚小蠹蒲螨進行液氮速凍，-40°C保存?zhèn)溆?，取適 量冷凍樣品加入醋酸緩沖液研磨，離心分離，收集上清液；2)粗分離將上清液用沉淀法或冷凍干燥法濃縮；3)純化采用常規(guī)的層析法進行，所述層析法為離子交換層析、凝膠過濾、吸附層析或 親和層析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中華甲蟲蒲螨的毒素蛋白Ptg1-1，其N-端氨基酸序列，包括N-Asp-Asn-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Val-Arg-Ala-，其核苷酸序列見SEQ ID NO1。本發(fā)明基于我國特有的中華甲蟲蒲螨，提取、濃縮和純化毒素蛋白，并對得到的毒素蛋白進行了測序，提取、克隆了該毒素蛋白對應的基因，為我國開發(fā)新型生物殺蟲劑和抗蟲植物提供了基因源，將對害蟲控制作出重要貢獻。
文檔編號C12N1/19GK101935662SQ20101019481
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權日2009年6月8日
發(fā)明者于麗辰, 焦蕊, 許長新, 賀麗敏, 郝寶鋒, 韓繼成 申請人:河北省農(nóng)林科學院昌黎果樹研究所