專利名稱：產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens) β -毒素的脫毒 的免疫原性衍生物，編碼所述衍生物的DNA，含有編碼所述衍生物的DNA的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽 孢桿菌，含有編碼所述衍生物的DNA的革蘭氏陽性細(xì)菌表達系統(tǒng)，表達野生型β-毒素的基 于非產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的革蘭氏陽性細(xì)菌表達系統(tǒng)，基于此制備的用于抵抗產(chǎn)氣莢膜 梭狀芽孢桿菌的疫苗，用于制備天然的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的方法，用于制備 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的脫毒的免疫原性衍生物的方法，和用于制備抵抗產(chǎn)氣莢 膜梭狀芽孢桿菌的疫苗的方法。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(也稱為魏氏梭狀芽孢桿菌)是大 屬梭狀芽孢桿菌的一個種。所有屬于該屬的細(xì)菌是形成孢子的厭氧革蘭氏陽性芽孢桿菌。 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌種被劃分為亞種。已經(jīng)有人描述了五個亞種。通常將這些亞種稱作 “型”Α-Ε。所有的亞種產(chǎn)生幾種毒素，包括主要的和次要的毒素。四種主要的毒素是α，β，
ε和τ毒素。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的所有的型產(chǎn)生α-毒素。毒素是由B和C型 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的。另外，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的所有的型產(chǎn)生各種各樣的 次要毒素。這主要是由于在這5種產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的型中存在一種或多種這些不同 的毒素，所有的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌種是致病的。
背景技術(shù)：
已知A型是人和豬的致病菌。B型主要是羔羊，綿羊和山羊的致病菌，并且引起“羔 羊痢疾”和出血性腸炎。C型是人，綿羊，小牛，羔羊，豬和鳥的致病菌。它是“羊腸毒血病”， 出血性腸炎，壞死性腸炎和腸性毒血癥的致病因子。如上文提到的，已知B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生β-毒素。已知β-毒 素在人和動物的壞死性腸炎的發(fā)病機理中起著主要的作用。對于人，已經(jīng)將該疾病稱作為 pigbel (Johnson等人，Lancetii =496-500, (1987))。對于動物，已經(jīng)描述了小牛，羔羊和豬 的壞死性腸炎(HauschiId, A. H. W. in S. Kadis, Τ. C. Montie, (ed.)微生物毒素，p. 159-188。 Academic press, Inc. New York (1971)和Willis，T.A.厭氧細(xì)菌學(xué)臨床和實驗室實踐，第 3 版，Butterworths，倫敦(1977))。已經(jīng)從產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離到純化形式的β _毒素(Sakurai等人，感染和 免疫學(xué) 18 741-745(1977), Sakurai 等人，Toxicon25 1301-1310 (1987))。對于該毒素的 生物物理特性仍有許多是未知的，由此對于其作用模式也是未知的。但是，由于能夠獲得純 化形式的該毒素，在動物中清楚地證明了 β-毒素的毒性。由Sakurai等人證明了純化的 β -毒素對例如小鼠和豚鼠的致死毒性(感染和免疫學(xué)21 678-680 (1978)，Sakurai等人， Toxicon 25:1301-1310(1987))。近來，已經(jīng)由Hunter等人闡明了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的核酸序列(感 染和免疫學(xué)61 :3958-3965(1993))。核酸序列顯示β _毒素蛋白質(zhì)的大小是約35千道爾頓。
由于在發(fā)病機理中來自于B和C型的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的作用是首 要的重要，在研制抗該毒素的免疫方面已經(jīng)有許多的嘗試?？苟舅氐拿庖咦阋员Ｗo免 受B和C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的感染。誘導(dǎo)抗毒素的免疫力的唯一的途徑是以該 毒素給待保護的動物給藥。但是顯然必須供給脫毒形式的所述毒素，因為否則的話給藥會 導(dǎo)致待免疫接種動物的嚴(yán)重的疾病或死亡。大約在1960年已經(jīng)獲得了基于脫毒形式的β-毒素，也稱作為β-類毒素的疫苗 (例如英國專利No. 901，433和美國專利No. 3，288，680)。但是目前可獲得的基于失活的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的所有疫苗已經(jīng) 有幾方面的明顯的缺點。在第一方面，所有基于β-毒素的疫苗包括化學(xué)脫毒的，主要是福爾馬林脫毒的 β-毒素，多年的實踐證明使這些化學(xué)脫毒過程標(biāo)準(zhǔn)化是非常困難的。用于蛋白質(zhì)脫毒的 經(jīng)典的化學(xué)方法具有缺點他們以相當(dāng)隨機的方式改變了該蛋白質(zhì)的總的結(jié)構(gòu)。因此，在化 學(xué)脫毒過程中，β-毒素的免疫原性特性也快速地降低。例如從

圖1和2可以看到這一點在圖2中，顯示了在標(biāo)準(zhǔn)條件下，至少的福 爾馬林，一種非常普遍使用的失活化合物，對于β-毒素的脫毒是必須的。但是，從圖1和 圖2可以看到，隨著福爾馬林的量的增加，抗原性效價顯著地下降了。不管怎樣不可能得到 全部效價，因為即使是脫毒必需的福爾馬林的最低量(圖2)也已經(jīng)使效價下降。這意味著 只存在很窄的帶，其中可以得到脫毒和合理的效價和由此獲得的免疫原性。給出這一非常 窄的帶，和至少存在三種變化脫毒的時間，溫度和精確的福爾馬林濃度的事實，再現(xiàn)性地 生產(chǎn)脫毒的毒素是非常困難的就很顯然了。所以非常需要對毒素脫毒的另一條途 徑。由于下面的原因至今還沒有發(fā)現(xiàn)可接受的選擇途徑足夠水平的脫毒性和殘留的免疫 原性之間的精細(xì)的平衡意味著在一方面是該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和另一方面是該蛋白質(zhì)的生物 學(xué)特性之間的緊密聯(lián)系。所以還不可能期望存在這樣的可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而使該 蛋白質(zhì)脫毒，同時沒有明顯損害該蛋白質(zhì)的免疫原特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個優(yōu)點是第一次公開了避免上面提到的問題的方法利用遺傳操作技 術(shù)，驚人地發(fā)現(xiàn)了可以突變的特異的和較大氨基酸區(qū)域以便提供需要的毒素的非毒性 的衍生物而沒有明顯地?fù)p害它的必須的免疫原特性。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及了在野生型β-毒素中不存在的在它的氨 基酸序列中至少攜帶一個突變的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的脫毒的免疫原性衍生 物或其免疫原片段。其免疫原片段可理解為，雖然不包括β-毒素的衍生物的全部長度的氨基酸序 列，但仍然含有能夠在宿主動物中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的衍生物的那些區(qū)域的片段。突變可理解為與野生型β _毒素的氨基酸序列相比衍生的β _毒素的氨基酸序列 的變化。突變是替代，缺失，插入或倒位，或它們的組合。突變可以是例如毒素的一個 或更多的氨基酸被具有不同特性的其它氨基酸替代。適當(dāng)?shù)奶娲抢鐜д姷陌被崽?代了帶負(fù)電的氨基酸，如賴氨酸替代了天冬氨酸。另一個適當(dāng)?shù)奶娲侵咀宓陌被崽?代芳香族氨基酸例如色氨酸=>甘氨酸。同時還有親水氨基酸替代疏水氨基酸，例如天冬
4氨酸替代異亮氨酸是合適的。因此，本發(fā)明的優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的毒素的衍生物，其中至少一個突變是 替代突變。顯然，在替代之外，仍然能夠誘導(dǎo)免疫學(xué)應(yīng)答，但含有提供毒素的非毒性衍 生物的一個或多個氨基酸的插入和/或缺失的突變也是本發(fā)明的一部分。所以同樣優(yōu)選的 形式，本發(fā)明涉及本發(fā)明的毒素的衍生物，其中至少一個突變是缺失或插入。當(dāng)存在兩 個或更多突變，替代和缺失/插入突變的組合同樣是可能的。如果在小鼠中毒素的衍 生物的LD50 (在實驗中殺死所有動物的50%的致死劑量)至少比天然β -毒素的LD50高 10倍，那么認(rèn)為該β-毒素衍生物是非毒性的。天然β-毒素的LD50約為0. 15微克/小 鼠。如前面提到，本發(fā)明的一個優(yōu)點是，與本領(lǐng)域設(shè)想的相反，發(fā)現(xiàn)可以從遺傳上改變 β_毒素的氨基酸序列以致得到非毒性的但仍然具有免疫原性的類毒素。然而，不是所有突 變導(dǎo)致需要的非毒性和仍具有免疫原性的毒素衍生物。所以，已經(jīng)開發(fā)了快速篩選和 選擇產(chǎn)生仍然具有免疫原性的毒素非毒性衍生物的試驗。這一試驗允許篩選大量的產(chǎn) 生非毒性但仍然具有免疫原性的毒素的衍生物的突變體。下面將公開這一試驗。還發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地將在毒素的中性和親水部分之間形成轉(zhuǎn)換區(qū)域的那些區(qū)域作 為導(dǎo)入得到具有需要的特性的毒素的非毒性衍生物的突變的靶區(qū)是恰當(dāng)?shù)?。通過將 Hoop-Woods算法應(yīng)用到β-毒素的序列，可以容易地跟蹤這些區(qū)域(Hopp 和Woods ； Proc. Natl. Acad. Sci. 78 =38248-3828 (1981)) 所以，在這一實施方案的更優(yōu)選的形式中， 本發(fā)明涉及具有定位于β-毒素的中性和親水部分之間的轉(zhuǎn)換區(qū)的突變的β-毒素的衍生 物。非常適于作為突變的靶區(qū)的區(qū)域定位于位置62，位置182，位置197，與肽前導(dǎo)甲 硫氨酸相關(guān)的氨基酸編號80-103，145-147，281-291，295-299之間和氨基酸位置292的 唯一的半胱氨酸的下游區(qū)。所以，甚至以一個更優(yōu)選的形式，本發(fā)明涉及具有一個突變的 β -毒素的衍生物，該突變至少定位于下列區(qū)域之一在位置62，182，197和氨基酸編號 80-103，145-147，281-291，295-299之間和/或與肽前導(dǎo)甲硫氨酸相關(guān)的氨基酸位置292 下游的區(qū)域。以甚至更為優(yōu)選的形式，該突變定位于位置62，位置80-82，位置95-97，位置 101-103，位置 145-147，位置 182，位置 197，位置 287-291，位置 295-299。通過化學(xué)地替代或修飾蛋白質(zhì)中的氨基酸可以產(chǎn)生本發(fā)明的毒素的非毒性 免疫原性衍生物。它們也可以通過在編碼毒素的基因中導(dǎo)入突變產(chǎn)生。下面將敘述在 DNA片段中導(dǎo)入突變的方法。然后突變的DNA片段可以例如克隆進核苷酸序列如適當(dāng)?shù)谋?達質(zhì)粒并隨后表達。所以，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有具有作為特性的編碼從遺傳上脫毒 的本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的免疫原性衍生物或其免疫原性片段的突變 DNA片段的核苷酸序列。如前面提到，在這一實施方案的優(yōu)選形式中，本發(fā)明涉及具有定位于毒素的 中性和親水部分之間的轉(zhuǎn)換區(qū)的突變的毒素的衍生物。通過表達編碼這一的毒 素的衍生物的DNA片段可以制造這樣的β-毒素的衍生物。所以，在優(yōu)選的形式中，編碼 β -毒素的衍生物的突變的DNA片段具有在至少一個編碼β -毒素的衍生物的中性和親水 部分之間的轉(zhuǎn)換區(qū)域的DNA區(qū)域中的突變。
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本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的脫毒的免疫原性衍生物例如可以通 過將編碼毒素的基因隨機誘變得到。本領(lǐng)域誘導(dǎo)隨機誘變的許多方法是已知的，例如 利用化學(xué)誘變試劑的化學(xué)誘導(dǎo)誘變，通過紫外輻射或Y “輻射的誘變或利用重組DNA技術(shù) 的隨機誘變。DNA水平的突變也可以在特異位點產(chǎn)生定點誘變。這是在已知的遺傳工程技術(shù) 的幫助下進行的。例如可以使用限制性酶切出在或包含靶區(qū)的DNA片段，和用具有突變序 列的合成片段替代這些片段。定點誘變也是在靶區(qū)中導(dǎo)入突變的非常方便的技術(shù)。如果該 突變有關(guān)替代突變，閱讀框架當(dāng)然將保持不變。缺失和/或插入突變和替代突變的組合也 是可能的。上面敘述的DNA突變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并已經(jīng)在Maniatis，分子克隆，冷泉港 實驗室出版，ISBN 0-87969-309-6(1989)中有敘述。表達本發(fā)明的毒素的衍生物的適當(dāng)?shù)募?xì)菌表達系統(tǒng)是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿 菌細(xì)菌本身。利用同源重組法，編碼本發(fā)明的毒素的衍生物的突變的DNA片段可以容 易地替代天然的毒素基因。同源重組是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。然后，這樣得到的重組產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌細(xì)菌生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽 孢桿菌毒素的遺傳上脫毒的免疫原性衍生物。所以在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及 含有帶有如上所述的突變DNA片段的核苷酸序列的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌細(xì)菌。但是在從產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌中分離毒性的和遺傳性改變的非毒性產(chǎn)氣莢膜 梭狀芽孢桿菌毒素的過程中遇到幾個其它問題。首先，從操作人員的健康觀點出發(fā)梭 狀芽孢桿菌是生長危險的細(xì)菌。用于生產(chǎn)毒素的梭狀芽孢桿菌菌種的生長必須在高度 安全的條件下進行，而該條件使大規(guī)模生產(chǎn)變得困難。第二，如上所述，與毒素一起產(chǎn) 生了幾個其它主要的/次要的毒素。正如對疫苗生產(chǎn)是必須的，在這些毒素中，毒素的 分離和純化是困難的和耗時的。第三，梭狀芽孢桿菌菌種是形成孢子的細(xì)菌。從毒素 制劑中去除所有孢子并同時保留毒素的免疫原特性是必須的但也是困難的，因為這些 孢子對熱和化學(xué)試劑是高度抗性的。所以，顯然需要提供無其它梭狀芽孢桿菌毒素和無梭 狀芽孢桿菌孢子的毒素的方法。前面已經(jīng)敘述了用于芽孢桿菌毒素的表達的基于革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌 的非梭狀芽孢桿菌表達系統(tǒng)。Hunter等(感染和免疫61 :3958_3965 (1993))已經(jīng)將大腸 桿菌系統(tǒng)用于毒素基因的表達。只發(fā)現(xiàn)了對應(yīng)于期望的34千道爾頓的蛋白質(zhì)的較小 的帶，而發(fā)現(xiàn)最大部分的β-毒素蛋白質(zhì)是大的IlSkD的多體形式。Steinporsdottir等 (FEMS微生物學(xué)通訊130 273-278(1995))試圖在大腸桿菌中將β-毒素基因作為與谷胱 甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合的融合蛋白表達。它們也象Hunter—樣，只發(fā)現(xiàn)高分子量的非天然的 β-毒素。在這篇文章中得出的結(jié)論是大腸桿菌中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然毒素具有不同 的構(gòu)型。所以似乎是在構(gòu)型的折疊和天然毒素的分泌中其它梭狀芽孢桿菌編碼蛋白質(zhì) 起著附加的作用。已知這是許多其它分泌細(xì)菌蛋白質(zhì)的情況。為了這一原因，由于如上所 述，在結(jié)構(gòu)和免疫原性之間存在精細(xì)的平衡，不能期望從除了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌以外 的其它來源得到并因此是非天然形式的毒素成為疫苗的有效基礎(chǔ)，不管使用的表達系 統(tǒng)如何?，F(xiàn)在驚人地發(fā)現(xiàn)，在除了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的革蘭氏陽性細(xì)菌中表達天然 β“毒素基因提供具有如在產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌中產(chǎn)生的天然β“毒素的所有生物學(xué)和生物物理特性和活性的天然毒素，但比產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌或大腸桿菌中產(chǎn)生的 毒素具有幾個非常如人所愿的優(yōu)點a)它沒有被產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌孢子污染，b) 它的產(chǎn)生是無污染的脂多糖，C)它的產(chǎn)生是無其它主要/次要的芽孢桿菌毒素和d)它呈它 的天然構(gòu)象。這樣得到的毒素可以用福爾馬林失活，比從梭狀芽孢桿菌得到的毒 素更具有優(yōu)點，因為在失活過程中唯一有待考慮的生物學(xué)材料是毒素本身孢子，脂多 糖和其它主要/次要的梭狀芽孢桿菌毒素不需要考慮，因為它們并不存在。所以，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及革蘭氏陽性細(xì)菌表達系統(tǒng)，其中革蘭氏陽 性細(xì)菌不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，所述的表達系統(tǒng)含有編碼野生型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿 菌β-毒素的基因。毒素基因可以在天然啟動子的控制下。它也可以置于異源啟動子的控制下。 這樣一個啟動子例如可以是Lac-啟動子(Chang等，自然學(xué)275 :615 (1978))或Trp-啟動 子(Goeddel等，N. A. R. 8 :4057 (1980))。這樣一個啟動子可以是強啟動子，導(dǎo)致β-毒素的 過度表達，或它可以是誘導(dǎo)型啟動子。兩類啟動子在本領(lǐng)域是已知的。已經(jīng)敘述了幾個革蘭氏陽性細(xì)菌的表達系統(tǒng)，并且用于幾個革蘭氏陽性細(xì)菌科中 的多用途的表達質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的。作為例子有Simon和Chopin敘述的基于ρΑΜβ 1的 腸球菌廣譜革蘭氏陽性宿主范圍的復(fù)制子的表達系統(tǒng)(BioChimie70 :559-567(1988))。 這一質(zhì)粒的衍生物可以用于在例如鏈球菌，乳桿菌，和芽孢桿菌種中表達外源基因。在非梭 狀芽孢桿菌革蘭氏陽性細(xì)菌的組中，基因組中具有較高的AT-含量的那些細(xì)菌是最適用于 從梭狀芽孢桿菌屬中克隆和表達基因。所以，以更優(yōu)選的形式，用于制備天然毒素或本 發(fā)明的毒素衍生物的革蘭氏陽性細(xì)菌選自乳球菌，乳桿菌，明串珠菌，片球菌，鏈球菌， 腸球菌，葡萄球菌，芽孢桿菌，八疊球菌，瘤胃球菌或利斯特氏菌屬的組。在除了梭狀芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性細(xì)菌中表達本發(fā)明的突變毒素基因當(dāng) 然具有更大的優(yōu)點在這種情況下可以完全省略用福爾馬林脫毒處理。這樣得到的毒 素的非毒性衍生物，幾乎是無孢子，無脂多糖，無其它主要/次要的芽孢桿菌毒素，是天然 形式，其它優(yōu)點是本身無毒性。所以，以更優(yōu)選的形式，本發(fā)明涉及革蘭氏陽性細(xì)菌表達系統(tǒng)，所述的革蘭氏陽性 細(xì)菌不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌，含有編碼本發(fā)明的衍生的毒素基因或其免疫原片段 的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個實施方案涉及基于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的遺傳脫毒 的免疫原性衍生物的，抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗。這樣的疫苗例如可以通過 混合免疫學(xué)足夠量的本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β“毒素的脫毒免疫原性衍生物和 生理學(xué)可接受載體。免疫學(xué)足夠量可理解為能夠在宿主動物中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的脫毒 的免疫原性產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的量。所以，本發(fā)明的另一個實施方案涉及含有本發(fā)明產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌類毒 素的衍生物或其免疫原片段，和生理可接受載體的抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫
田ο生理可接受載體例如是，水或生理鹽溶液。通常，疫苗另外和穩(wěn)定劑混合，例如，防 止易于降解的多肽的降解，從而增強疫苗的擱置壽命，或提高冷凍干燥的效力。有用的穩(wěn)定 劑特別是SPGA (Bovarnik等；細(xì)菌學(xué)雜志59 :509 (1950))，碳水化合物，如山梨醇，甘露醇，海藻糖，淀粉，蔗糖，葡聚糖或葡萄糖，蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白或它們的降解產(chǎn)物，和緩 沖液，如堿金屬磷酸鹽。無需說明，通過添加化合物穩(wěn)定疫苗的其它方法也是本發(fā)明的實施 方案。可選擇地，一個或更多具有佐劑活性的化合物可以加入到疫苗中。佐劑是免疫系 統(tǒng)的非特異刺激劑。它們增強宿主對給藥的免疫原的免疫應(yīng)答。所以，以更優(yōu)選的形式， 本發(fā)明的疫苗含有佐劑。本領(lǐng)域已知的佐劑的例子有弗氏完全和不完全佐劑，維生素E，非 離子嵌段聚合物，胞壁酰肽，ISCOMs (免疫刺激復(fù)合物，參見例如歐洲專利EP109942)，皂角 苷，礦物油，植物油，和Carbopol (均聚物)。特定地適于粘膜應(yīng)用的佐劑例如是大腸桿菌熱易變毒素(LT)或霍亂毒素(CT)。其它適當(dāng)?shù)淖魟├缡菤溲趸X，磷酸鋁和氧化鋁，油乳液(例如，Bayol F 或 Marcol52 ，皂角苷或維生素-E可溶物。利用本領(lǐng)域已知的儲藏活疫苗的方法可以儲藏本發(fā)明的疫苗。儲藏可以例如在零 下溫度進行。冷凍干燥也是已知和適當(dāng)?shù)谋４嬉呙绲姆椒?。冷凍干燥具有的?yōu)點是它能穩(wěn)定疫 苗以致它能儲藏在一定的溫度下保持良好，該溫度剛好高于保持非冷凍干燥儲藏物所必須 的溫度。這些疫苗可以非常有效地冷凍干燥，特別是當(dāng)本發(fā)明的疫苗與穩(wěn)定劑如上面提到 的那些在冷凍干燥之前混合。該疫苗可以對對B或C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染敏感的所有宿主如人，羔羊， 綿羊，山羊，豬，鳥和小牛給藥。疫苗可以早在出生時給藥，但也可以在以后的任何時期給藥。部分地根據(jù)動物的大小，優(yōu)選的疫苗劑量為每個動物在1和100微克的衍生物。例 如豬的最適的劑量范圍為20和80微克之間。雖然原則上所有常規(guī)的給藥途徑都可以使用，優(yōu)選地疫苗是通過腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，肌 內(nèi)，皮下，口或皮內(nèi)給藥。本發(fā)明的另一個實施方案涉及制造抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗的可 選擇的另一條途徑?？梢岳镁哂袑ψ鳛樗拗鞯娜嘶騽游锩舾械腂或C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽 孢桿菌的減毒或非致病活細(xì)菌和病毒作為如上所述的本發(fā)明的突變的毒素基因的載 體。這些所謂的活重組載體疫苗可以安全地與生理可接受載體一起對宿主動物給藥它們 是非致病的并且它們表達β-毒素的非毒性衍生物?；诨畹闹亟M載體的疫苗具有的優(yōu)點 是它們在宿主中直接生產(chǎn)和或呈現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β“毒素的衍生物。用這樣的重組細(xì)菌或病毒接種的動物將生產(chǎn)不僅抗載體的免疫原，而且抗多肽的 免疫原部分的免疫原性應(yīng)答，為此另外將遺傳密碼克隆進重組載體。這具有的優(yōu)點是通過 以這樣的重組載體給藥，可以保護其抵抗兩種或更多疾病。目前，本領(lǐng)域已知有許多活重組載體病毒和細(xì)菌。適當(dāng)?shù)幕钪亟M載體細(xì)菌例如是 沙門氏菌種類和大腸桿菌種類。經(jīng)常用于本領(lǐng)域作為活重組載體的病毒是腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄 病毒，牛痘病毒和皰疹病毒。同時適于作為特異的口服應(yīng)用載體病毒是豬細(xì)小病毒。另一個 用作攜帶編碼類毒素的基因的活重組載體病毒的病毒是皰疹病毒偽狂犬病病毒(PRV) (例如在歐洲專利號606，437中敘述)。這樣的攜帶β -類毒素基因的PRV將保護豬不受
8PRV和C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的感染。所以，含有攜帶本發(fā)明的突變毒素基因的活 重組載體生物體的抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗也是本發(fā)明的一部分。很顯然，即使不是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌中的最重要的毒力因子，天然毒素 也是重要的。所以，梭狀芽孢桿菌菌株已經(jīng)失去重要的毒力因子，該菌株中由本發(fā)明的突變 β _毒素基因替代了天然β _毒素基因。這樣的菌株可以用作活的減毒疫苗，因為該β _毒 素不是以它的毒性形式而是非毒性衍生物形式制備的。這樣一個活減毒疫苗的優(yōu)點是它產(chǎn) 生β “毒素的非毒性但仍然是免疫原性形式，而另外它還具有天然產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌 菌株的所有其它免疫原性抗原。所以，含有活減毒產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株的疫苗也是包括在本發(fā)明內(nèi)，該菌 株中本發(fā)明的突變的毒素基因代替了天然毒素基因。也是本發(fā)明的實施方案中的是除了含有本發(fā)明的毒素衍生物外，還含有來自 其它致病原的免疫原的疫苗。這允許在一個接種給藥步驟中進行抗不同疾病的接種。在這 一實施方案的更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的疫苗含有選自包括大葉性肺炎放線桿菌，偽狂犬 病病毒，豬流行性感冒病毒，豬細(xì)小病毒，可傳播的胃腸炎病毒，輪狀病毒，大腸桿菌，豬丹 毒桿菌，出血敗血性巴斯德氏菌，支氣管炎博德特氏菌，沙門氏菌種類，豬肺炎支原體，副豬 嗜血菌和類螺旋桿菌的細(xì)菌的組的其它免疫原。本發(fā)明還涉及制備天然產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的方法，該方法的基礎(chǔ)是 在除了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌以外的革蘭氏陽性細(xì)菌中表達含有編碼所述的毒素的 DNA片段的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提出了用于制備本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的非毒性 衍生物的方法。這些方法的基礎(chǔ)是在革蘭氏陽性細(xì)菌中表達含有編碼毒素的衍生物的 DNA片段的核苷酸序列。同時，本發(fā)明提供用于制備抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗的方法。這些 方法例如包括將本發(fā)明的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的衍生物和生理學(xué)可接受載體
混合ο附圖的說明圖1表示福爾馬林與效價之間的關(guān)系。圖2表示福爾馬林與動物死亡％之間的關(guān)系。圖1. a.質(zhì)粒pTREXlANEW的結(jié)構(gòu)。陰影盒表示了 MLS抗生素抗性標(biāo)記的編碼序 列。OripAMBl 質(zhì)粒pAMBl的復(fù)制起點，MLS 大環(huán)內(nèi)酯，lincosamindes，鏈陽性菌素B抗生 素抗性基因。下面顯示了 PIL253的EcoRI和平齊的SacI位點之間克隆的表達盒的結(jié)構(gòu)。 如影線盒顯示了盒的不同功能區(qū)。指出了唯一的限制位點。SD:與乳酸乳球菌16S rRNA互 補的Shine Dalgarno序列，ATG =SD作用的翻譯起始密碼。圖1. b 完整的pTREXIA序列，包括限制酶位點。圖1. c 高度相似的pTREXl表達盒的特征。圖l.d:用于產(chǎn)生用于pTREX7，-14和-IA (顯示5’ -3’)的PCR起源的啟動子片 段的寡核苷酸。圖2. a =TIR偶聯(lián)載體pKS90，圖解表示pKS90表達盒。
圖2. b 完整的pKS90序列，包括限制酶位點。圖2. c 用于產(chǎn)生形成pKS90的TIR區(qū)的人工DNA序列的寡核苷酸圖3. a 用于構(gòu)建Cp β -突變體的引物。 圖3. b 如用于Cp β Ml的構(gòu)建過程的實施例。
1.以[cpbF2]和[ml-反式]引物和pJF2000cpb模板進行PCR產(chǎn)生ml_5，半PCR產(chǎn) 物。[ml-反式]引物含有所需的位點特異性突變。
2.以[ml-順式]和[cpbR]和pJF2000cpb模板進行的PCR產(chǎn)生ml-3’半PCR產(chǎn)物。
3.將1.和2.的PCR產(chǎn)物連接，產(chǎn)生代表完整的ml基因的模板。然后利用[cpbF2]和 [cpbR]引物擴增這個完整基因，產(chǎn)生具有BamHI末端的產(chǎn)物。
4.將該PCR產(chǎn)物克隆到BamHI消化的表達質(zhì)粒pKS90_l并轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌 pep5acmA0
圖4 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β -毒素的氨基酸序列。
具體實施例方式實施例1構(gòu)建表達質(zhì)粒pKS90，pTREXIA, pTREX7 和 pTREX14pKS90質(zhì)粒是高拷貝數(shù)(40-80/細(xì)胞)的pTREXl質(zhì)粒基礎(chǔ)上的θ -復(fù)制革蘭氏陽 性質(zhì)粒，PTREXl質(zhì)粒本身是以前公開的PIL253質(zhì)粒的衍生物。pIL253摻入了 pAMbl的廣譜 革蘭氏陽性宿主范圍的復(fù)制子(Simon，D.，和A. Chopin. 1988.載體質(zhì)粒家族的構(gòu)建和它在 乳鏈球菌中的分子克隆中的應(yīng)用.Biochimie. 70 :59_567)并且由于乳酸乳球菌(Llactis) 性因子它是非可動的。PIL253也缺乏tra功能，該功能是以pIL501為例的接合親本質(zhì)粒 轉(zhuǎn)移或有效地移動所必須的。前面已經(jīng)將腸球菌PAMbl復(fù)制子轉(zhuǎn)移到各種菌種中，包括 鏈球菌，乳桿菌和芽孢桿菌菌種以及丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Gibson，Ε. Μ.，N. Μ. Chace, S. B. London 禾口 J. London. 1979，細(xì)菌學(xué)雜志 137 :614_619，LeBlanc, D. J.，R. J. Hawley， L. N. Lee 禾口 E. J. St. Martin. 1978，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75 :3484_3487，Oultram, J. D.，和 Μ. Young. 1985，F(xiàn)EMS Micro. Lett. 27 :129-134)的各種菌種，表明了潛在的廣譜宿 主范圍效用。盡管pTREXl (和pTREXIA)代表基本組成型轉(zhuǎn)錄載體，為了提高表達水平，衍 生的PKS90使用了與乳球菌的翻譯起始區(qū)的翻譯偶聯(lián)。下面給出了 pKS90的構(gòu)建詳情和它 的直接親本pTREXl。pTREXl 通過將兩個互補的低聚核苷酸退火并用Tfl DNA聚合酶延伸產(chǎn)生含有推斷的RNA 穩(wěn)定序列，翻譯起始區(qū)(TIR)，用于插入靶基因的多重克隆位點和轉(zhuǎn)錄終止子的人工DNA 片段。該有意義和反義低聚核苷酸在它們的5’末端分別含有Nhel和BamHl識別位點以便 有助于克隆。將這一片段克隆進PUC19NT7中的Xbal和BamHI位點之間，pUC19NT7是含有 來自克隆在EcoRI和HindIII位點之間的pLETl的T7表達盒(Wells, J. Μ.，P. W. Wilson 和 R. W. F. Le Page. 1993，J. App 1. Bact. 74 :629_636)的 pUC19 的衍生物。將得到的構(gòu)建體 命名為pUCLEX。然后在克隆進PIL253的EcoRI和SacI (截短)位點之前通過用HindIII 裂解并接著用EcoRI切割成平齊末端來除去pUCLEX的完全的表達盒以便產(chǎn)生載體pTREX。 推斷的RNA穩(wěn)定序列和TIR是起源于大腸桿菌T7細(xì)菌噬菌體序列并在一個核苷酸位點有 修飾以便增強Shine Dalgarno(SD)序列基元對乳酸乳球菌的核糖體16sRNA的互補性。將命名為Pl的乳酸乳球菌MG1363染色體啟動子克隆進存在于表達盒中的EcoRI和BgIII位 點之間，產(chǎn)生PTREX1。以前利用該啟動子探針載體pSB292已經(jīng)分離了這一啟動子并通過 引物延伸和 DNA 測序分析得到鑒定(Nick. R. ffaterfield, R. W. F. Le Page, P. W. Wilson 和 工1恥118，基因165，1995，9-15)。利用Vent DNA聚合酶通過PCR擴增啟動子片段。PCR 片段包括所有克隆啟動子上游的DNA序列和轉(zhuǎn)錄起始位點的3’端的多達15個堿基。存在 于這一啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的下游的Shine-Dalgarno(SD)序列被故意地從PCR擴增啟 動子片段中排除以便防止在除了表達盒指示的起始密碼以外的位點開始翻譯。利用克隆在 EcoRI和BgIII位點之間的更弱的P7和P14啟動子代替Pl，也已經(jīng)產(chǎn)生了命名為pTREX7和 PTREX14的兩個類似的載體。圖l.d說明了用于產(chǎn)生這些啟動子片段的PCR引物。pTREXIA 質(zhì)粒代表了 pTREXl的一種替代品，其中來自pET3A的Xbal-Spel T7-表達盒片段替代了 Xbal結(jié)合的表達盒。所以SD序列對于乳球菌不是最佳的。圖1闡明了完整的pTREXIA序 列和圖示表達盒。pKS90 pKS90質(zhì)粒是pTREXl的衍生物，當(dāng)利用同樣的轉(zhuǎn)錄啟動子Pl時，它具有修飾 的含有SD的TIR和乳球菌染色體起源的解離酶基因Pll的起始20個密碼子(Nick. R. ffaterfield,R. W. F. Le Page，P. W. Wilson 和 J. Μ· Wells.基因，165. 1995. 9-15)。這是通 過在pTREXl的BgIII和BamHI位點之間克隆含有新的TIR的人工DNA序列得到的。圖2 表示了用于這一過程的低聚核苷酸序列。通過仔細(xì)選擇PCR引物序列，PCR起源的靶基因 可以通過翻譯與這一 TIR偶聯(lián)，該TIR當(dāng)與從pTREXl親本質(zhì)粒得到的質(zhì)粒比較時已經(jīng)證明 有提高的表達水平。圖2說明了完整的pKS90序列和圖示說明表達盒。構(gòu)建分泌活性β -毒素的乳酸乳球菌的重組菌株將含有如Hunter等公開的(感染和免疫學(xué)61 =3958-3965(1993))編碼β-毒素的 基因的PJF2000DNA (如J. Frey，獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)院，Berne大學(xué)，CH-3012Berne，瑞士提供的)電 穿孔轉(zhuǎn)入大腸桿菌SURE。將來自六個獨立的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA分離，通過限制消化來檢查 并合并。將這些菌株在_70°C儲藏于15%甘油。用Xbal/BamHI或Smal/BamHI消化從這一合 并的質(zhì)粒DNA制劑中切除含有相關(guān)的翻譯起始區(qū)(和上游RNA穩(wěn)定莖-環(huán))的cpb基因。將 純化的cpb基因片段連接進表達載體pTREXIA，pTREX14和pTREX7的多重克隆位點，它們分 別指導(dǎo)高，中等和低水平的組成型表達。當(dāng)將Smal/BamHI為末端的cpb片段連接進BamHI/ BgIIK平齊末端)的PTREX14和pTREX7DNA時，Xbal/BamHI為末端的cpb片段連接到Xbal/ BamHI消化的pTREXlANEW。將這些構(gòu)建體成功地電穿孔轉(zhuǎn)入特定的無活力的菌株乳酸乳球 菌ρ印5-acmA-，該菌株缺乏染色體編碼的肽酶ρ印5，該酶能讓生物體利用從酪蛋白釋放的 肽。另外，它也缺乏與細(xì)胞壁相關(guān)的自溶素，acmA。但是任何其它乳酸乳球菌菌株適用于這 一目的。利用限制消化分析鑒定了 10個準(zhǔn)確的各種類型的分離物并已經(jīng)儲存于_70°C下的 15%的甘油中。將這些菌株類型命名為乳酸乳球菌ρ印5-acmA-[pTREXlAcpb]，乳酸乳球菌 pep5-acmA-[pTREX14cpb]和乳酸乳球菌？印5-&01^-[ 11 乂70 13]。另外，利用 Vent DNA 聚 合酶和來自質(zhì)粒PJF2000的BamHI為末端的低聚核苷酸，通過PCR擴增cpb基因。將這一 PCR產(chǎn)物克隆進TIR偶聯(lián)的載體pKS90的BamHI位點。在轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜之前利用SDS-PAGE分辨從對數(shù)中期細(xì)胞和上清液提取 的總蛋白質(zhì)。利用MAB(單克隆抗體)純化的β-毒素作為對照，利用抗Cpb的單克隆和多克隆抗體探測這些濾膜。通過Western印跡和SDS-凝膠的考馬斯藍(lán)染色，在來自所有四個 菌株的培養(yǎng)物上清液中檢測準(zhǔn)確大小的單個蛋白質(zhì)產(chǎn)物(大約30千道爾頓)。每個菌株 分泌的毒素的量是與使用的表達載體中啟動子的相對強度一致的。沒有檢測到胞內(nèi)毒 素暗示了梭狀芽孢桿菌輸出序列在乳球菌中有效地起作用。來自PTREX1A表達子，乳酸乳 球菌 MG1363p印5-acmA- [p3_l/5]，和 pKS90 表達子乳酸乳球菌 MG1363p印5_acmA- [p5_123] 的過濾的上清液顯示含有活性毒素，提供了重組β -毒素的陽性對照。cpb突變基因利用從存在于質(zhì)粒PJF2000 (由J. Fery提供)的原始的模板cpb基因(從C型產(chǎn) 氣莢膜梭狀芽孢桿菌克隆)通過Vent DNA聚合酶擴增的PCR片段進行體外基因構(gòu)建產(chǎn)生突 變的cpb基因。圖3給出了在這一構(gòu)建中使用的引物，和使用的構(gòu)建過程的例子。在終端 cpbF2的5’末端和cpbR PCR引物中的BamHI位點允許在pKS90表達質(zhì)粒(參見上面)的 BamHI位點克隆這些突變體。選擇摻入適當(dāng)?shù)亻g隔cpb ATG起始密碼的BamHI位點的PCR 引物允許突變體cpb基因通過翻譯與pKS90中的PllTIR偶聯(lián)。使用這一方法可以產(chǎn)生一 系列突變表達菌株。利用3到4倍的冗余序列自動序列分析確定這些突變基因的準(zhǔn)確序列 (在克隆進PKS90后)，由此證實了基因序列和在表達質(zhì)粒中的定位。在這些載體中克隆突 變基因允許憑借天然cpb N-末端輸出引導(dǎo)物將基因產(chǎn)物分泌進入培養(yǎng)上清液。將培養(yǎng)上 清液過濾滅菌并直接用于動物生物測定。
構(gòu)建體突變pMl-4D80DK — A80AApMl-10D80DK - A80AA Y182 ^ H182pM2T95GF — D95DDpM3-3KioiKE — A101AA T197 — A197pM3-69K101KE — A101AApM4-3P145KN — D145EDpM4-18V62-I62 P145KN - D145EDpM6-l (pM6-5) (pM6-7)Γ — A ^292 λ292pM6-16C292 -A292 A+292NWNGApM7-15E287RER — Q287QQQ表1 突變基因構(gòu)建體。突變表達菌株基于pKS90的類毒素表達質(zhì)粒在特定的無活力的乳球菌宿主菌株乳酸乳球菌 MG1363pep5-acmA-中增殖，但其它乳球菌菌株也可以使用。這一菌株代表了原噬菌體和用 質(zhì)粒處理的菌株，該菌株是高度營養(yǎng)缺陷型的和不能在天然牛奶環(huán)境中生存的。另外它的 生長速度比其它乳球菌菌株慢。表1代表了如上所指的非毒性表達菌株。在這一表中，指出了哪些氨基酸突變了 和突變定位于哪里。類毒素表達菌株可以生長在用0. 5% w/v的葡萄糖和5克/毫升的紅霉素補充的 M17培養(yǎng)基中(Difco cat.號1856-17)。不需要通氣，缺氧條件確實是優(yōu)選的，雖然不是必 要的。最適的生長溫度是30°C。已經(jīng)證明所有這些菌株產(chǎn)生的各種類毒素蛋白質(zhì)在培養(yǎng) 基中積累到小于5克/毫升的水平。利用單克隆和多克隆抗體二者的Western印跡分析證
12實準(zhǔn)確大小的蛋白質(zhì)單體是通過所有上面列出的命名表達菌株分泌到上清液中的。作為例 子的突變蛋白質(zhì)，M4(4_3)的N-末端序列分析證實在從乳球菌的細(xì)胞質(zhì)中輸出的過程中準(zhǔn) 確地切除了前導(dǎo)肽。用于cpb基因的隨機誘變的方案如下津立了典型的PCR反應(yīng)混合物IOmM Tris-HCl (pH 8. 7,25°C )50mM KCl，5微克/毫升牛血清白蛋白0·5μΜ的各種PCR引物(cpbg2 5' -ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3')(cpbR :5，_atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag_3，)4mM MgCl20. 5mM MnCl23. 4mM強制dNTP和0. 2mM其它3dNTPs(dNTP濃度的范圍可以是0. 1到IOmM之間)600pM的模板DNA (pJF2000cpb克隆或其它cpb衍生物)2U Taq DNA 聚合酶熱循環(huán)條件如下(940C 30 秒，50°C 60 秒，72°C 180 秒)30 個循環(huán)，接著在 72°C溫育 600 秒。利用4個dNTP的每一個作為強制核苷酸進行反應(yīng)，然后合并。這獲得了替代物的 適當(dāng)?shù)碾S機混合物。然后用BamHI消化合并的PCR片段并連接到BamHI消化的pKS90。將 這一連接混合物轉(zhuǎn)化進乳酸乳球菌MG1363。在液體培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)化體并在實施例3中敘 述的體外毒素測試中測試過濾的上清液。實施例2乳酸乳球菌的培養(yǎng)在用0.5% w/v葡萄糖和5微克/毫升紅霉素補充的Μ17培養(yǎng)基(如，Difco cat. 1856-17)中生長生產(chǎn)基因修飾的β-毒素的乳酸乳球菌。通氣不是必須的，缺氧條件 是優(yōu)選的，雖然不是必須的。最適生長溫度是30°C。在指數(shù)生長過程中添加葡萄糖是必須 的。抗原制備通過離心手段從細(xì)胞中分離培養(yǎng)物上清液。在滅菌過濾上清液后，用硫酸銨沉淀 衍生物(0.3克/克)。將沉淀重懸浮于PBS。作為另一種可選的方案，培養(yǎng)上清液可以在 濾紙< 10，000道爾頓上濃縮。小鼠致死率通過給約20克重的NRMI小鼠腹膜內(nèi)注射無菌過濾的培養(yǎng)上清液0. 5毫升開始測 試乳酸乳球菌中生產(chǎn)的β -毒素的衍生物。衍生物ρΜ6-1，6-5和6-7的致死水平與天然毒 素相類似。在氨基酸位置Cys292 — Ala292中已經(jīng)修飾了 ρΜ6_1，6_5，和6_7衍生物。 表2:小鼠致死率測試在隨后的實驗中，用硫酸銨沉淀含有衍生物的上清液。以IOX更小的體積在PBS 中重懸浮含各個衍生物的沉積物。將各個衍生物腹膜內(nèi)注射進小鼠。衍生物ρΜ1-4，ρΜ1-10， PM3-69和pM7-15在野生型毒素具致死作用的水平時都是非毒性的。它們僅在非常高濃度 20-40微克/毫升時是毒性的。衍生物PM4-18和pM6_16在野生型毒素具致死性的水平上 也是非毒性的。它們在更高的濃度30-50微克/毫升甚至是非毒性的。其余的3個衍生 物pM2，pM3-3和pM4-3是輕微毒性的。(野生型毒素的LD5tl是0. 15微克/小鼠)。也可參 見表2。在豚鼠中的皮膚壞死將300克的自家喂養(yǎng)的白變種豚鼠的兩側(cè)4X8厘米的面積脫毛。在動物的每側(cè) 4個位置皮內(nèi)注射0. 2毫升提取液。在24，48和72小時后檢測動物，對注射位置的損傷進 行評分。在注射位置明顯的壞死(++++)，嚴(yán)重的紅斑(+++)，紅斑(+++)，變紅(+)，沒有反 應(yīng)(0)。pMl-4，1-10，3-3,4-3,6-16和7_15衍生物甚至在非常高的濃度下也沒有皮膚壞死。衍生物PM6-1，6-5和6_7在5微克/毫升的水平皮膚壞死。它們在0. 5微克/毫 升沒有皮膚壞死。濃縮之后，PM3-69衍生物在6微克/毫升的劑量產(chǎn)生皮膚壞死，該劑量 對應(yīng)于比天然毒素的皮膚壞死低至少60倍。衍生物pM 4-18比天然毒素的皮膚壞死的潛 力小15倍。通過分別測試濃度1微克/毫升和2微克/毫升還沒有顯示衍生物pM2具有
14任何皮膚壞死反應(yīng)。所以PM2至少比天然毒素的毒性低20倍。也可參見表3。疫苗制備分別用弗氏不完全佐劑(50 % )或Alhydrogen (20 % )作佐劑制備抗原。 0 沒有反應(yīng)+變紅++ 紅斑+++ 嚴(yán)重紅斑++++ 在注射位置明顯壞死CpC β C型產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β _毒素表3:在豬中的皮膚壞死豬的免疫接種以約40微克/毫升的濃度制備衍生物3-69和加入佐劑到最后濃度20微克/毫 升。以2星期的間歇肌內(nèi)對豬注射2毫升。在第一次接種之前，第二次接種之前和第二次 接種后2星期取血樣。觀察第一次接種后24小時對豬的副作用。沒有觀察到副作用。實施例3用于檢測從隨機誘變的β _毒素基因得到的非毒性β _毒素衍生物的快速篩選測 試BT細(xì)胞測試的過程將在含有5%的小牛血清的伊格爾氏培養(yǎng)基中的1.5Χ105細(xì)胞/毫升的胰蛋白酶 消化的BT (牛陀螺狀細(xì)胞)細(xì)胞的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到96孔的微滴平板，每孔100微升。在37°C 和3%的CO2下溫育平板24小時。在20°C，PBS，pH7. 0在稀釋平板中稀釋待測試的β -毒 素樣品。謹(jǐn)慎地從細(xì)胞中潷棄培養(yǎng)基并在每個孔中加入100微升毒素稀釋液。然后在 37，和3% CO2下溫育細(xì)胞30分鐘。謹(jǐn)慎地潷棄樣品并加入加熱到37°C的含有5%小牛血 清的新鮮伊格爾氏培養(yǎng)基。在如上所述的同樣條件下溫育細(xì)胞3天。然后從微滴平板中潷 棄培養(yǎng)基并加入吉姆薩染色溶液5微升/孔。在10分鐘后，潷棄染色劑，并用水洗滌平板 3次，并允許保持至少20分鐘以便干燥。檢測所有孔中多核細(xì)胞的存在和不均勻的單層。在特定的孔中缺乏這些信號表明 在該孔中非毒性毒素衍生物的存在。在下面所述的半定量的ELISA測試中測試證明為 非毒性的這些毒素衍生物的免疫原性。半定量ELISA 在蛋白質(zhì)A柱上純化兔中抗天然產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的高度特異的抗 體并用約2微克/毫升的這些特異的抗體涂覆ELISA平板。以3倍的稀釋度在平板中加 入含有毒素衍生物的上清液。在溫育1小時后，利用辣根過氧化物酶綴合的多克隆兔 抗-C. ρ. β-毒素抗體檢測。那些比天然β -毒素在ELISA中的反應(yīng)效價低不少于1000倍的β -毒素衍生物 被視為所需的非毒性的和仍然是本發(fā)明的免疫原性β“毒素衍生物。
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實施例4豬中的接種實驗制備疫苗用乳酸乳球菌菌株pMl-4生產(chǎn)衍生物pMl-4。在發(fā)酵后，通過離心(100000Xg， 35分鐘)除去細(xì)胞。然后在每克上清液中加入0.31克硫酸銨。將混合物置于4°C，沉淀3 小時。在IOOOOOXg離心45分鐘后，將沉淀以1/30的原始體積溶解并對PBS透析。通過 與BSA標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的SDS-PAGE定量衍生物pMl-4的最后含量。最后用Diluvac Forte 以 1 1的比例混合衍生物溶液。疫苗中pMl-4的最后濃度為80微克/毫升。接種使用5個5星期大的豬。用2毫升在0天和21天肌內(nèi)接種豬。觀察根據(jù)下面的范圍在接種后開始的3小時的過程中記錄動物總體癥狀0 =沒有癥狀1 =輕度壓抑，粗糙地包裹(少于1小時)2 =壓抑，顫抖(少于1小時)3 =壓抑，顫抖，躺下和進水有限(小于1小時)4 =嘔吐，嚴(yán)重壓抑(小于1小時)5 =壓抑超過1小時并不吃隨后供給的食物血液取樣和確定效價在第一次接種(0天)之前，在第二次接種(21天)之前和第二次接種后2星期(35 天)取血樣并通過競爭ELISA分析抗-β-毒素抗體。簡要地說，在ELISA平板中涂覆抗天 然毒素的單克隆抗體。允許血清的系列稀釋液與固定濃度的毒素在獨立的平板上 反應(yīng)。將含有抗體的血清和毒素的混合物轉(zhuǎn)移到Mab涂覆的平板并確定剩余的天然β-毒 素含量。相對于WHO抗毒素標(biāo)準(zhǔn)1959，以對未抑制的β-毒素有50%抑制計算出效價。結(jié)果觀察豬沒有表現(xiàn)出任何由于接種引起的臨床反應(yīng)。參見表4。血清學(xué)一個豬(編號52)對第一次接種應(yīng)答。在第二次接種后所有四個豬血清轉(zhuǎn)化，在 ELISA中測量平均抗β -毒素效價為66i. u.。單個效價顯示于表4。表4 在豬中的抗β _毒素抗體應(yīng)答在ELISA中以i. U.測量豬中抗β -毒素抗體應(yīng)答并評價試驗中的非特異性毒性。 結(jié)論通過產(chǎn)生抑制β _毒素的抗β _毒素抗體所有豬對用遺傳修飾的β _毒素的接種
產(chǎn)生應(yīng)答。
權(quán)利要求
產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)β 毒素的脫毒免疫原性衍生物，其特征是它攜帶一個插入突變、缺失突變或替代突變，所述突變定位于位置62，182，197或氨基酸編號80 103，145 147，281 291，295 299之間的區(qū)域之一或與肽前導(dǎo)甲硫氨酸相關(guān)的氨基酸位置292下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的脫毒免疫原性衍生物，其特征 是突變定位于氨基酸編號80-82,95-97，101-103或287-291之間的區(qū)域之一。
3.產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的脫毒免疫原性衍生物，其特征是它攜帶定位于 β-毒素的中性和親水部分之間的轉(zhuǎn)換區(qū)中的插入突變、缺失突變或替代突變。
4.含有突變的DNA片段的核苷酸序列，所述的突變的DNA片段編碼權(quán)利要求1_3任一 項所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β“毒素的脫毒免疫原性衍生物。
5.含有權(quán)利要求4所述的核苷酸序列的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌細(xì)菌。
6.基于革蘭氏陽性細(xì)菌的表達系統(tǒng)，所述的革蘭氏陽性細(xì)菌是乳球菌屬的種，該種含 有權(quán)利要求4所述的核苷酸序列。
7.用于抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗，其特征是它含有權(quán)利要求1-3任一項 所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β “毒素的脫毒免疫原性衍生物，和生理學(xué)可接受載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征是它含有佐劑。
9.用于抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗，其特征是它含有活的重組載體生物 體，所述的載體生物體攜帶權(quán)利要求4所述的DNA片段。
10.用于抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗，其特征是它含有活的減毒的產(chǎn)氣莢 膜梭狀芽孢桿菌菌株，其中天然β“毒素基因被權(quán)利要求4所述的核苷酸序列替代。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項所述的疫苗，其特征是它另外含有來自其它病原體的免 疫原。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的疫苗，其特征是所述的來自其它病原體的免疫原 選自含有大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)，偽狂犬病病 毒(Pseudorabies virus),豬流行性感冒病毒(Porcine Influenza virus),豬細(xì)小 病毒(PorcineParvovirus)，可傳播的胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritis virus),輪狀病毒(rotavirus)，大腸桿菌(Escherichia coli),豬丹毒桿菌 (Erysipelothrixrhusiopathiae),出血敗血個生巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida),支氣 管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，沙門氏菌種類(Salmonella species)，豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae),畐Ij豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)和類螺旋桿菌的細(xì)菌(Helicobacter-like bacteria)的組。
13.用于制備天然產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素的方法，其特征是含有編碼所述 β -毒素的DNA片段的核苷酸序列在乳球菌屬的種的細(xì)菌中表達。
14.用于制備權(quán)利要求1-3任一項所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的衍生物的 方法，其特征是權(quán)利要求4所述的含有編碼β -毒素的衍生物的DNA片段的核苷酸序列在 乳球菌屬的種的細(xì)菌中表達。
15.制備用于抵抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的疫苗的方法，其特征是所述的方法包 括混合權(quán)利要求1-3任一項所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β _毒素的脫毒免疫原性衍生物 和生理學(xué)可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的脫毒的免疫原性衍生物或其免疫原片段，它具有的特征是它們攜帶在野生型β-毒素氨基酸序列中不存在的，β-毒素氨基酸序列的突變。本發(fā)明也涉及編碼這樣的β-毒素的基因以及表達這樣的β-毒素的表達系統(tǒng)。另外，本發(fā)明涉及表達天然β-毒素的細(xì)菌表達系統(tǒng)。最后，本發(fā)明涉及基于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌β-毒素的脫毒的免疫原性衍生物的疫苗，和用于制備這樣的疫苗的方法。
文檔編號C12N15/09GK101914145SQ20101019422
公開日2010年12月15日 申請日期1998年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者J·M·韋爾斯, N·R·瓦特非爾德, P·L·弗蘭德森, R·P·A·M·塞格斯 申請人:英特威國際有限公司