專利名稱：酵母重組株及IFNα-la干擾素的純化方法
專利說明酵母重組株及IFNα-1a干擾素的純化方法 本發(fā)明涉及分泌表達α-1a干擾素的工程菌株及利用它來生產(chǎn)α-1a干擾素的純化方法。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的α-1a干擾素，多為大腸桿菌表達產(chǎn)物，主要工藝缺陷是大腸桿菌的表達系統(tǒng)為包含體型，生產(chǎn)過程中需要復(fù)性，復(fù)性率低，最高為40％，因而比活性低，只有1.0×108單位/毫克蛋白，有較大的副作用；并且，分離純化中要用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95％以上；而目前國產(chǎn)的單抗柱，無論在產(chǎn)量和質(zhì)量上，都不能夠滿足廠家需要，需要花大量經(jīng)費進口，生產(chǎn)成本很高。為了克服上述缺陷，本發(fā)明采用酵母分泌表達系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體表達系統(tǒng)，目標蛋白α-1a干擾素不需要復(fù)性，其生物比活性可達到6.0×108單位/毫克蛋白，毒副作用低；在純化過程中，不需要價值昂貴的單抗柱，即可從發(fā)酵液中提取獲得純度達95％以上的目標蛋白α-1a干擾素，降低了生產(chǎn)成本。
α-1a干擾素酵母重組株的構(gòu)建方法為將克隆修飾的α-1a干擾素基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構(gòu)建成α-1a干擾素基因分泌型表達載體；利用澳大利亞Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法作改進，將α-1a干擾素基因分泌型表達載體轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，構(gòu)建成分泌型表達α-1a干擾素的酵母工程菌株--IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115；通過抗生素篩選、SDS-PAGE分析及生物比活性測定，獲得目標酵母重組株。
上述的酵母重組株目標蛋白α-1a干擾素的表達量為目標蛋白占分泌總蛋白的50-60％，比活性為1.08×109單位/毫克蛋白；目標蛋白α-1a干擾素具有與天然α-1a干擾素相同的免疫原性。本工程菌株接受外源基因是以整合于基因組形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨立染色體組外質(zhì)粒表達體系有顯著差別，故本工程菌株較大腸桿菌、釀酒酵母穩(wěn)定，不易發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象，一旦以工程菌作為樣品模板，通過PCR、分子雜交等技術(shù)鑒定選擇出來的陽性菌株一定是真實可靠的，且其目標表達產(chǎn)物α-1a直接表達分泌在培養(yǎng)液中，因此檢測其蛋白表達量及目標產(chǎn)物的生物活性非常簡易，這較大腸桿菌表達體系—表達產(chǎn)物需復(fù)性—優(yōu)越得多；另外，酵母是一種簡單的真核生物，因此其表達后加工模式類似高等真核生物，故用它表達的基因產(chǎn)物不僅具有天然產(chǎn)物相同的生物活性，而且低毒副作用，產(chǎn)品加工成本低，適用性更廣。
α-1a干擾素的純化方法為利用獲得的高產(chǎn)物表達量、高產(chǎn)物活性的酵母重組株進行發(fā)酵，離心收集上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH，過陽離子層析柱，收集目標洗脫峰，加硫酸銨至稍混濁，離心取上清液，過疏水層析柱，收集目標洗脫峰，過陰離子層析柱，收集目標洗脫峰，過Sephacryl分子篩層析柱，收集目標峰，得到α-1a干擾素。
本發(fā)明提供的α-1a干擾素的純化方法，縮短了純化時間，不需要價格昂貴的單抗柱就可以得到純度大于95％的α-1a干擾素原液，降低了成本，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用將良好的經(jīng)濟效益。附圖
為α-1a干擾素表達載體構(gòu)建圖。
pGAPZα-A/IFNα-1a表達載體分子大小為3.6kbpGAPZα-A載體結(jié)構(gòu)為磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動子區(qū)域第1-483bp磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動子引物位點第455-476bpα-交配因子分泌信號肽序列第493-759bpα-交配因子分泌信號肽引物位點第696-716bp載體多克隆位點第760-828bpmyc抗原決定簇包第827-856bp多聚組氨酸包第872-889bp3’-乙醇氧化酶1基因引物位點第974-994bp乙醇氧化酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第893-1233bp轉(zhuǎn)錄延伸因子1啟動子區(qū)域第1234-1644bp合成原核啟動子第1645-1712bp
鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1713-2087bp細胞色素合成酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第2088-2405bp大腸桿菌復(fù)制子1(來源于pUC載體)第2416-3089bp[具體實施方式
]下面結(jié)合實施例詳細介紹本發(fā)明在α-1a干擾素重組酵母工程菌株的構(gòu)建和α-1a干擾素純化工藝中的具體應(yīng)用。
實施例1一、IFNα-1a干擾素酵母工程菌的構(gòu)建(一)材料1.IFNα-1a基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)購自澳大利亞Invitrogen公司。
(二)方法1.基因PCR擴增(1)引物設(shè)計在5’端引物中刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG。
P1-5’GCTCGAGAAAAGAATGTGTGATCTGCCTCAAACC3’(“ATG”被刪除)Xho I Lys-Arg(Kex2位點)P2-5’GTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACT3’XbaI(2)熱循環(huán)95℃，5’；95℃，30”→49℃，30”→72℃，60”72℃，10’擴增30個循環(huán)。
2.PCR擴增產(chǎn)物回收與克隆(1)IFNα-1a基因經(jīng)擴增電泳后獲得約521bp的DNA帶；(2)用德國寶靈曼公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物高純度試劑盒回收目標片段并進行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美國PE公司生產(chǎn)的ABI 377A DNA自動測序儀進行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表達載體構(gòu)建采用基因克隆技術(shù)將α-1a干擾素基因通過XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游的Xho I/Xba I位點，構(gòu)建成含α-factor信號肽的分泌型酵母表達載體；表達載體轉(zhuǎn)化GS115(his4)利用澳大利亞Invitrogen公司生產(chǎn)的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)經(jīng)稍作改進的方法進行。具體操作如下(1)挑取畢赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115單菌落，在30℃，300轉(zhuǎn)/分鐘條件下以YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同樣培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600＝6-8，在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心5分鐘，去上清液，用10毫升溶液I重懸，制成感受態(tài)細胞；(2)取100微升感受態(tài)，加入5-10微升線性化的α-1a干擾素重組表達載體，再加400毫升溶液II，混勻后28℃培養(yǎng)1小時，加1毫升YPD，30℃培養(yǎng)1小時；(3)將培養(yǎng)物在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心15分鐘，去上清，用200毫升溶液III重懸，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培養(yǎng)24-36小時，產(chǎn)生單菌落。
5.高表達酵母工程菌株的篩選用Zeocin抗生素篩選獲得陽性菌株后，提取工程菌基因組DNA，進一步以引物P1/P2作PCR分析和以德國寶靈公司生產(chǎn)的DiG Labelling and Detection Kit標記α-1a干擾素基因之520bp DNA片段為探針，進行Southern blotting等技術(shù)鑒定篩選出陽性菌株，再用SDS-PAGE篩選高表達目標蛋白的IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115工程菌株。
實施例2α-1a干擾素的純化方法構(gòu)建α-1a干擾素酵母工程菌(IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115)后，-80℃保存菌種。發(fā)酵前，接種平板，使菌種活化，在YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基中，接種單菌落發(fā)酵72小時，離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH4.0-5.0，過CM Sepharose柱層析，收集0.4摩爾/升氯化鈉洗脫峰，加硫酸銨至30％，離心取上清液，過PhenylSepharose柱層析，收集10％硫酸銨洗脫峰，過DEAE Sepharose柱層析，收集0.1摩爾/升氯化鈉洗脫峰，過Sephacryl S-200柱層析，收集蛋白峰，得到純度大于95％的α-1a干擾素原液。
權(quán)利要求
1.一種酵母重組株，其特征在于將克隆修飾的α-1a干擾素基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構(gòu)建成α-1a干擾素基因分泌型表達載體IFNα-1a/pGAPZα-A，轉(zhuǎn)入畢赤氏酵母(Pichiapastoris)的菌株GS115，構(gòu)建成分泌型α-1a干擾素的酵母重組株IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115。
2.一種α-1a干擾素的純化方法，其特征在于直接從分泌型α-1a干擾素酵母工程菌株(IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115)的發(fā)酵液中分離純化α-1a干擾素離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH，過陽離子交換層析柱，收集目標洗脫峰，加硫酸銨至稍混濁，離心取上清液，過疏水層析柱，收集目標洗脫峰，過陰離子層析柱，收集目標洗脫峰，過Sephacryl分子篩層析柱，收集目標峰，得到α-1a干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及分泌表達α－1a干擾素的酵母工程菌株IFN α－1a/pGAPZ α－A/GS115構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用它來生產(chǎn)α－1a干擾素的純化方法。本發(fā)明采用酵母分泌表達系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體表達系統(tǒng)，目標蛋白α－1a干擾素不需要復(fù)性，其生物比活性可達到1.0×10
文檔編號C07K14/435GK1548525SQ0210897
公開日2004年11月24日 申請日期2002年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月16日
發(fā)明者梁國棟, 周鵬, 夏中寧 申請人:海南海梁生物高科技有限公司