專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起抵抗炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽，涉及生產(chǎn)這些多肽的方法、可用于所述方法的重組大腸桿菌(Escherischia coli)細(xì)胞以及采用的核酸和轉(zhuǎn)化載體。
用于表達(dá)供疫苗系統(tǒng)用的PA的本發(fā)明系統(tǒng)，用蛋白酶缺陷型枯草桿菌(Bacillus subtilis)作為表達(dá)宿主。盡管這類(lèi)系統(tǒng)就產(chǎn)物的量和純度而論是可接受的，但仍有顯著缺陷。首先，管理機(jī)構(gòu)一般不熟悉這種宿主，批準(zhǔn)決定可能因此而延遲。更重要的是，目前使用的枯草桿菌菌株產(chǎn)生熱穩(wěn)定孢子，因而需要使用專(zhuān)用的生產(chǎn)工廠。
WO00/02522具體描述了表達(dá)PA或某些免疫原性片段的VEE病毒復(fù)制子。
眾所周知大腸桿菌是多種人用疫苗的表達(dá)系統(tǒng)。雖然容易使大腸桿菌發(fā)酵至非常高的細(xì)胞密度的能力，使得這種細(xì)菌成為表達(dá)許多蛋白質(zhì)的理想宿主，但先前為用表達(dá)和從大腸桿菌細(xì)胞溶膠中純化重組PA所作的嘗試由于蛋白質(zhì)收率低和蛋白酶降解而受到阻礙(Singh等，J.Biol.Chem.(1989)264；11099-11102，Vodkin等，Cell(1993)34；693-697以及Sharma等，Protein Expr.Purif(1996)，7，33-38)。
在大腸桿菌細(xì)胞溶膠中過(guò)量表達(dá)作為穩(wěn)定的可溶性蛋白的PA的策略最近已有描述(Willhite等，Protein and Peptide Letters，(1998)，5；273-278)。所用的策略是將親和標(biāo)志序列加至PA的N末端的一種策略，這提供了一種簡(jiǎn)單的純化系統(tǒng)。
這種系統(tǒng)的一個(gè)問(wèn)題是需要另一個(gè)下游的加工步驟，以便在可以使用PA之前除去所述標(biāo)志。
密碼子優(yōu)化是現(xiàn)在眾所周知并且用于合成基因設(shè)計(jì)的一種技術(shù)。遺傳密碼有一定程度的豐余性，因此大多數(shù)氨基酸由不止一個(gè)密碼子序列編碼。不同的生物優(yōu)先利用這些不同密碼子中的某一個(gè)。一般可預(yù)期，通過(guò)優(yōu)化密碼子，將提高特定蛋白的表達(dá)水平。
這一般是理想的，但PA除外，就PA而論，較高的表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致蛋白酶降解和/或細(xì)胞毒性。在這種情況下，提高表達(dá)水平可能是逆生產(chǎn)性的(counter-productive)，并且引起顯著的細(xì)胞毒性。
然而意外的是，本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中情況不是這樣，在該系統(tǒng)中，無(wú)論在該菌株中是否存在蛋白酶，密碼子優(yōu)化均導(dǎo)致意想不到的高水平重組PA的表達(dá)。
此外，似乎PA保護(hù)性結(jié)構(gòu)域的表達(dá)并不抑制大腸桿菌中的表達(dá)。
天然PA的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明(Petosa C.等Nature 385833-838，1997)，表明PA由4個(gè)不同的功能獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成結(jié)構(gòu)域1，分為1a(1-167號(hào)氨基酸)和1b(168-258號(hào)氨基酸)；結(jié)構(gòu)域2，259-487號(hào)氨基酸；結(jié)構(gòu)域3，488-595號(hào)氨基酸；和結(jié)構(gòu)域4，596-735號(hào)氨基酸。
本申請(qǐng)人已經(jīng)確定，某些結(jié)構(gòu)域當(dāng)以分離形式、融合蛋白形式或者相互組合形式使用時(shí)，看來(lái)產(chǎn)生意想不到的良好保護(hù)性效應(yīng)。
按照本發(fā)明，提供一種引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性試劑，所述試劑包含結(jié)合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長(zhǎng)保護(hù)性抗原(PA)的至多3個(gè)結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)包含PA的結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4或其變異體。
具體地說(shuō)，所述試劑將包含多肽的混合物或融合肽，其中所述各個(gè)多肽包含PA多個(gè)個(gè)別結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)。
具體地說(shuō)，所述試劑包括非全長(zhǎng)PA形式的包含PA結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4或其變異體的多肽。當(dāng)存在時(shí)，結(jié)構(gòu)域適為完整的，特別是結(jié)構(gòu)域1全部存在。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”包括蛋白質(zhì)和肽。
用于本文時(shí)，表述“變異體”是指由于基礎(chǔ)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或取代為其它氨基酸而不同于所述序列、但仍引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的氨基酸序列。當(dāng)一種氨基酸被一種不同的、其性質(zhì)大致相似的氨基酸取代時(shí)，所述氨基酸取代可以被稱(chēng)為“保守的”。當(dāng)氨基酸被不同類(lèi)型的氨基酸取代時(shí)，為非保守取代。廣義上講，較少的非保守取代在不影響所述多肽的生物活性的情況下是可行的。合適的變異體與所述PA序列將有至少60％相同，優(yōu)選至少75％相同，更優(yōu)選至少90％相同。
具體地說(shuō)，特定變異體序列與所述PA序列的同一性可以采用Lipman和Pearson描述的多重比對(duì)法(Lipman D.J.和Pearson，W.R.(1985)Rapid and Sensitive Protein Similiarity Searches，Science，vol 227，pp1435-1441)來(lái)評(píng)價(jià)?！皟?yōu)化”百分比分值可以用Lipman-Pearson算法的以下參數(shù)來(lái)計(jì)算ktup＝1，gap penalty(空位罰分)＝4，和gap penaltylength(空位罰分長(zhǎng)度)＝12。待評(píng)價(jià)相似性的序列應(yīng)該用作“試驗(yàn)序列”，這意指用于比較的堿基序列(SEQ ID NO1)應(yīng)該首先進(jìn)入該算法。
最好是，本發(fā)明的試劑包括具有野生型PA的結(jié)構(gòu)域1序列和/或結(jié)構(gòu)域4序列的多肽。
本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括炭疽芽孢桿菌PA的結(jié)構(gòu)域4。
這些結(jié)構(gòu)域包含以下表1中所示的以下序列。
表1結(jié)構(gòu)域 全長(zhǎng)PA的氨基酸*4596-73511-258這些氨基酸編號(hào)是指在Welkos等Gene69(1988)287-300中所示的序列，在下文中分別描述為SEQ ID NO15(圖4)和SEQ ID NO3(圖3)。
結(jié)構(gòu)域1包括兩個(gè)區(qū)，名為1a和1b。區(qū)1a包括氨基酸1-167，而區(qū)1b從氨基酸168至氨基酸258?？磥?lái)區(qū)1a對(duì)于良好的保護(hù)性應(yīng)答的產(chǎn)生是重要的，可能最好是全長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域4或其保護(hù)性區(qū)的組合作為免疫原性試劑，該試劑引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。這種組合例如可作為融合肽，可以用下文概述的本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)。
當(dāng)使用結(jié)構(gòu)域1時(shí)，適宜將其與所述PA序列的結(jié)構(gòu)域2融合，可能最好將其與結(jié)構(gòu)域2和結(jié)構(gòu)域3融合。
這類(lèi)組合及其在預(yù)防或治療中的應(yīng)用，構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
上述結(jié)構(gòu)域適宜作為融合蛋白的部分，最好具有N末端谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶蛋白(GST)。GST不僅有助于所述蛋白的純化，它也可以提供佐劑效應(yīng)，可能是由于大小增加了。
本發(fā)明的多肽適宜用常規(guī)方法制備。例如，可以合成它們，或者可以用重組DNA技術(shù)制備它們。特別是，將編碼所述結(jié)構(gòu)域的核酸包括在表達(dá)載體中，用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。然后可以采用常規(guī)方法進(jìn)行宿主細(xì)胞的培養(yǎng)以及隨后所需多肽的分離。這些方法中所用的核酸、載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明的再一方面。
一般而言，所用的宿主細(xì)胞是常規(guī)用來(lái)制備PA的宿主細(xì)胞，例如枯草桿菌。
本申請(qǐng)人意外的發(fā)現(xiàn)，或者分離的或者組合的所述結(jié)構(gòu)域可以在一定條件下在大腸桿菌中成功地表達(dá)。
因此，本發(fā)明還提供一種用于生產(chǎn)引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性多肽的方法，所述方法包括用或者(a)編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，或者(b)編碼如上所述的炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的至少一個(gè)保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化宿主，并且從中回收所述多肽，前提是當(dāng)所述多肽是炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體時(shí)，所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
應(yīng)用這些選項(xiàng)，可以用優(yōu)選的表達(dá)宿主獲得高收率的產(chǎn)物。
在

圖1中顯示了一個(gè)表，該表顯示了在大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌基因組中出現(xiàn)的密碼子及其頻率。顯然，胍和胞嘧啶在大腸桿菌中出現(xiàn)的頻率比在炭疽芽孢桿菌中出現(xiàn)的頻率高得多。密碼子選擇含量的分析顯示出以下結(jié)果
因此，看來(lái)大腸桿菌偏好的密碼子是可能時(shí)包括胍或胞嘧啶的那些密碼子。
通過(guò)在用來(lái)編碼所述免疫原性蛋白的序列中將胍和胞嘧啶核苷酸的百分比提高至野生型炭疽芽孢桿菌基因中正常存在的百分比，密碼子選擇將使得在大腸桿菌中的表達(dá)得以改善。
在本發(fā)明中使用的編碼核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比至少在所述多肽為炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體時(shí)，適宜超過(guò)40％，優(yōu)選超過(guò)45％，最優(yōu)選為50-52％。
保護(hù)性結(jié)構(gòu)域的高水平表達(dá)可以采用編碼這些單位的野生型炭疽芽孢桿菌序列來(lái)達(dá)到。然而，如上所述，通過(guò)提高所述核酸的GC％可以進(jìn)一步提高收率。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包括表達(dá)炭疽芽孢桿菌的PA。
此外，按照本發(fā)明，提供一種已經(jīng)用編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
如上所述，所述編碼核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比適宜超過(guò)40％，優(yōu)選超過(guò)45％，最優(yōu)選為50-52％。
本發(fā)明的用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的核酸適宜為合成基因。特別是，所述核酸為圖2中所示的SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式。
表述“修飾形式”是指編碼PA或引起保護(hù)性免疫應(yīng)答但利用某些不同密碼子的片段或其變異體的其它核酸序列，條件是符合對(duì)按照本發(fā)明的GC百分含量的要求。合適的修飾形式是與SEQ ID NO1至少80％相似，優(yōu)選90％相似，最優(yōu)選至少95％相似。特別是，所述核酸包含SEQ ID NO1。
在一個(gè)替代實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種已經(jīng)用編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌細(xì)胞。
所述核酸最好編碼炭疽芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4。
按照本發(fā)明，再提供一種生產(chǎn)免疫原性多肽的方法，所述多肽引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答，所述方法包括培養(yǎng)如上所述的細(xì)胞，并且從培養(yǎng)物中回收所需的多肽。這類(lèi)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
在再一方面，本發(fā)明提供一種大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，其中所述核酸中的胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
本發(fā)明的又一方面包括一種大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸。
可供用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化的合適載體是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，T7表達(dá)系統(tǒng)提供良好的表達(dá)水平。然而，一種特別優(yōu)選的載體包括可得自Avecia(UK)的pAG163。
SEQ ID NO1的核酸或者編碼PA并且GC含量為35％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少45％、最優(yōu)選為50-52％的其變異體，構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
如有必要，所述變異體的PA或結(jié)構(gòu)域可以作為與另一蛋白的融合體表達(dá)，所述另一蛋白例如為提供一種不同免疫的蛋白、有助于所述產(chǎn)物純化的蛋白或者用以確保翻譯的良好起始的高表達(dá)蛋白(例如硫氧還蛋白，GST)。
可任選地加入其它系統(tǒng)例如T7溶菌酶至所述表達(dá)系統(tǒng)中，以改善對(duì)所述系統(tǒng)的阻抑，盡管就本發(fā)明而論，尚未記錄到與細(xì)胞毒性相關(guān)的問(wèn)題。
任何合適的大腸桿菌菌株都可以用于本發(fā)明的方法中?？傻玫皆S多蛋白酶缺陷型的菌株(例如Ion-、ompT-)，預(yù)期所述菌株會(huì)將蛋白水解減少至最低。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不需要應(yīng)用這類(lèi)菌株來(lái)達(dá)到產(chǎn)物的良好收率，其它已知菌株例如K12可產(chǎn)生意想不到的高產(chǎn)物收率。
所述菌株的發(fā)酵一般在本領(lǐng)域知道的常規(guī)條件下進(jìn)行。例如，發(fā)酵可以作為分批培養(yǎng)物進(jìn)行，優(yōu)選在大搖瓶中進(jìn)行，使用含有抗生素以保持質(zhì)粒并添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的復(fù)合培養(yǎng)基。
適當(dāng)?shù)厥斋@培養(yǎng)物，將細(xì)胞貯存于-20℃直至需要用于純化。
對(duì)于大腸桿菌PA(或變異體或結(jié)構(gòu)域)表達(dá)的合適的純化方案可以根據(jù)在枯草桿菌表達(dá)中所用的方法進(jìn)行改進(jìn)。待使用的各個(gè)純化步驟將取決于重組PA的物理特性。通常，在允許最大差別結(jié)合于所述離子交換柱條件下進(jìn)行離子交換色譜分離，然后從窄梯度收集流分。在某些情況下，單個(gè)色譜分離步驟可能足以獲得所需規(guī)格的產(chǎn)物。
可以根據(jù)需要用SDS PAGE或蛋白質(zhì)印跡，分析流分中所述產(chǎn)物的存在。
正如下文說(shuō)明的，已經(jīng)達(dá)到了代表rPA的完整結(jié)構(gòu)域或部分結(jié)構(gòu)域的一組融合蛋白的成功克隆和表達(dá)。在A/J小鼠模型中評(píng)價(jià)了這些融合蛋白的免疫原性和抗STI孢子攻擊的保護(hù)性功效。
所有所述rPA結(jié)構(gòu)域蛋白在A/J小鼠中都有免疫原性，并且與GST對(duì)照免疫小鼠相比，至少賦予抗攻擊的部分保護(hù)。連接于所述結(jié)構(gòu)域蛋白N末端的載體蛋白GST，通過(guò)在免疫動(dòng)物體內(nèi)所激發(fā)的抗體應(yīng)答表明，并不損害所述融合蛋白的體內(nèi)免疫原性，或者不損害所述融合蛋白的體外免疫原性，因?yàn)橛每箁PA抗血清在蛋白質(zhì)印跡后可以檢測(cè)到所述融合蛋白，這表明GST標(biāo)志并不干擾rPA表位的識(shí)別。用較大的融合蛋白免疫，產(chǎn)生最高效價(jià)。具體地說(shuō)，用全長(zhǎng)GST1-4融合蛋白免疫的小鼠，產(chǎn)生的平均血清抗rPA濃度大約是rPA免疫組的8倍(圖5)。用切除所述GST的rPA結(jié)構(gòu)域1-4免疫小鼠，產(chǎn)生的效價(jià)大約是用所述融合蛋白免疫所產(chǎn)生的效價(jià)的一半。這種融合蛋白的免疫原性高得多的原因尚不清楚。有可能這種蛋白大小的增加可能對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞有佐劑效應(yīng)。它并未刺激這種應(yīng)答達(dá)到在所述其它融合蛋白中的同一程度，并且GST標(biāo)志的任何佐劑效應(yīng)并不增強(qiáng)抗攻擊的保護(hù)，因?yàn)榻?jīng)切割的蛋白的保護(hù)性與其融合蛋白對(duì)應(yīng)物相似。
盡管用GST1、經(jīng)切割的1、GST1b-2、GST1b-3和GST1-3免疫的組的抗rPA效價(jià)高，但在這些組中在102MLD的較低攻擊水平下發(fā)生保護(hù)有一些被突破，并且與GST對(duì)照免疫小鼠相比，用這些蛋白質(zhì)免疫并未延長(zhǎng)那些小鼠的存活時(shí)間，這些小鼠的確死于攻擊。這提示這些蛋白尚未恰當(dāng)?shù)匾l(fā)所述免疫應(yīng)答，以達(dá)到完全抗所述感染。正如小鼠和豚鼠的其它研究(Little S.F.等1986.Infect.Immun.52509-512，Turnbull P.C.B.等，1986.Infect.Immun.52356-363)所表明的，在抗PA的抗體效價(jià)與抗攻擊的保護(hù)之間沒(méi)有明確的關(guān)聯(lián)。然而，保護(hù)需要一定閾值的抗體(Cohen S等，2000 Infect.Immun.684549-4558)，提示也需要免疫應(yīng)答的細(xì)胞介導(dǎo)組分受刺激以提供保護(hù)(Williamson 1989)。
SDS Page和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，GST1、GST1b-2和GST1-2是所產(chǎn)生的穩(wěn)定性最低的融合蛋白，可能是由于所述蛋白在無(wú)結(jié)構(gòu)域3的情況下對(duì)降解更為敏感，這種不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致了保護(hù)性表位的喪失。
所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象對(duì)于刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答也可能是重要的。與其完整的對(duì)應(yīng)物GST1-2和GST1-3相比時(shí)，從所述融合蛋白去除結(jié)構(gòu)域1a，導(dǎo)致抗體效價(jià)降低和抵抗攻擊的保護(hù)減弱。同樣，僅用GST 1免疫的小鼠受到抵抗攻擊的部分保護(hù)，但與結(jié)構(gòu)域2聯(lián)合時(shí)，如GST1-2融合蛋白，在102MLD攻擊水平下觀測(cè)到完全的保護(hù)。然而，通過(guò)用GST1-2融合蛋白免疫激發(fā)的免疫應(yīng)答不足以提供抗較高的103MLD攻擊水平的完全保護(hù)，這又可能是由于該蛋白降解所致的保護(hù)性表位損失引起的。
用含結(jié)構(gòu)域4的截短物免疫的所有組都受到完全的保護(hù)，抵抗103MLD的STI孢子的攻擊(表1)，所述含結(jié)構(gòu)域4的截短物包括單獨(dú)的GST4、單獨(dú)的經(jīng)切割的4、以及兩種單獨(dú)表達(dá)的結(jié)構(gòu)域GST1和GST4的混合物。Brossier等指出，用表達(dá)無(wú)結(jié)構(gòu)域4的PA的炭疽芽孢桿菌突變型菌株免疫的小鼠的保護(hù)減弱(Brossier F.等2000.Infect.Immun.681781-1786)，并且這一點(diǎn)在該項(xiàng)研究中得以證實(shí)，在該項(xiàng)研究中，用GST1-3免疫導(dǎo)致保護(hù)被突破，盡管有良好的抗體效價(jià)。這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)構(gòu)域4是PA的免疫顯性亞單位。結(jié)構(gòu)域4代表所述PA多肽羧基末端的139個(gè)氨基酸。它含有宿主細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)(Little S.F.等，1996 Microbiology 142707-715)，被鑒定為在位于氨基酸殘基679-693之間的小環(huán)中或小環(huán)附近(Varughese M.等1999 Infect.Immun.671860-1865)。因此，它對(duì)于宿主細(xì)胞中毒是必不可少的，因?yàn)橐呀?jīng)證明，已表達(dá)的在結(jié)構(gòu)域4區(qū)中含突變(Varughese 1999出處同上)或缺失(Brossier 1999出處同上)的PA形式是無(wú)毒的。PA的晶體結(jié)構(gòu)表明，結(jié)構(gòu)域4、特別是該結(jié)構(gòu)域的19個(gè)氨基酸的環(huán)(703-722)比相互之間緊密連接的其它3個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)楸┞?Petosa 1997出處同上)。這一結(jié)構(gòu)安排可能使得結(jié)構(gòu)域4是對(duì)于免疫效應(yīng)細(xì)胞的識(shí)別最為突出的表位，因此含結(jié)構(gòu)域4的融合蛋白能夠引發(fā)保護(hù)性最強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
這一研究進(jìn)一步闡明了PA在保護(hù)性免疫應(yīng)答激發(fā)中的作用，證明抗炭疽感染的保護(hù)作用可能歸因于PA的單個(gè)結(jié)構(gòu)域。
現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例并參考附圖，具體描述本發(fā)明，在附圖中圖1是在大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的密碼子頻率的表；圖2顯示了按照本發(fā)明的核酸的序列，該核酸編碼枯草桿菌的PA，如Welkos等(出處同上)所發(fā)表的；和圖3顯示了SEQ ID NO3-14，它們是用來(lái)編碼PA的各個(gè)結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域組合的氨基酸序列和DNA序列，如下文詳述；圖4顯示了SEQ ID NO15-16，它們分別是PA結(jié)構(gòu)域4的氨基酸序列和DNA序列；和圖5是一個(gè)表，顯示了在初次免疫后37天，得自在第1天和第28天用10μg包含PA片段的融合蛋白肌內(nèi)免疫的A/J小鼠的抗rPA IgG濃度；所示結(jié)果為取自每個(gè)治療組5只小鼠的樣品的平均數(shù)±sem。
實(shí)施例1在大腸桿菌中表達(dá)的研究已經(jīng)對(duì)rPA表達(dá)質(zhì)粒pAG163∷rPA進(jìn)行了修飾，以用KmR標(biāo)記取代原始的TcR基因。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌BLR(DE3)中，并且評(píng)價(jià)了表達(dá)水平和溶解性。該菌株的胞內(nèi)蛋白酶La(Ion基因產(chǎn)物)和外膜蛋白酶OmpT有缺陷。
然而，表達(dá)研究并未表明與Ion+K12宿主菌株相比在該菌株內(nèi)可溶性蛋白的積累有任何改善(即由于過(guò)度的蛋白水解，積累受到阻礙)。因此推斷，rPA的任何胞內(nèi)蛋白水解都不是La蛋白酶的作用所致。實(shí)施例2發(fā)酵分析使用K12菌株UT5600(DE3)pAG163∷rPA進(jìn)行的發(fā)酵的進(jìn)一步分析。
發(fā)現(xiàn)在該培養(yǎng)物中的rPA被分為可溶性部分不可溶性部分(估計(jì)有350mg/L不溶性部分，650mg/L全長(zhǎng)可溶性部分)。所用的條件(37℃，1mM IPTG用于誘導(dǎo))在搖瓶培養(yǎng)物中未產(chǎn)生任何可檢測(cè)的可溶性rPA，也未得到以上實(shí)施例1中所述的結(jié)果，而存在大量的可溶性rPA是出乎意料的。然而，看來(lái)發(fā)酵的操作、誘導(dǎo)和收獲點(diǎn)可能提供在大腸桿菌K12表達(dá)菌株中rPA的穩(wěn)定積累。實(shí)施例3用最初作為不溶性內(nèi)含體從UT5600(DE3)pAG163∷rPA發(fā)酵分離出的物質(zhì)，制備rPA樣品。內(nèi)含體用25mM Tris-HCl pH8洗滌2次，用同一緩沖液+2M尿素洗滌1次。然后將它們?nèi)苡诰彌_液+8M尿素中，沉淀出碎片。通過(guò)在25mM Tris-HCl pH8中稀釋并于4℃靜置溫育過(guò)夜，而去除尿素。將經(jīng)稀釋的樣品上樣至Q sepharose柱，用NaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。合并含有最高純度rPA的流分，將其分為等分樣品并凍存于-70℃。用4-12％MES-SDS NuPAGE凝膠，與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比測(cè)試該樣品，表明其純度高，并且內(nèi)毒素污染少。實(shí)施例4所述產(chǎn)物的進(jìn)一步表征該產(chǎn)物的N末端測(cè)序表明，N末端序列的組成為MEVKQENRLL(SEQ ID NO2)這證明該產(chǎn)物正如所預(yù)期的，且留有起始密碼子甲硫氨酸。
發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在蛋白質(zhì)印跡中有反應(yīng)；該樣品的MALDI-MS表明，質(zhì)量大約為82700(與預(yù)期的質(zhì)量為82915相似)。已知分子量高并且與所用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(66KDa)有一定的距離，則認(rèn)為這表明該物質(zhì)沒(méi)有顯著地截短，而并未消除該樣品內(nèi)的微不均一性。實(shí)施例5PA各個(gè)結(jié)構(gòu)域的測(cè)試使用Pharmacia pGEX-6P-3表達(dá)系統(tǒng)，以與載體蛋白谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白在大腸桿菌中產(chǎn)生作為重組蛋白的PA的各個(gè)結(jié)構(gòu)域。各個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列以及用來(lái)編碼所述結(jié)構(gòu)域的DNA序列如圖3進(jìn)行連接。相應(yīng)的氨基酸序列和DNA序列在以下表2中提供。
用這些融合蛋白，以總共100μl體積、吸附于20％v/v鋁膠的10μg相應(yīng)融合蛋白，肌內(nèi)免疫A/J小鼠(Harlan Olac)。
動(dòng)物經(jīng)兩次免疫，通過(guò)用指定劑量水平的炭疽芽孢桿菌(STI菌株)孢子攻擊，測(cè)定其保護(hù)性免疫的產(chǎn)生。下表顯示了攻擊后14天的存活者。
孢子的攻擊水平/小鼠
所述數(shù)據(jù)表明，PA所有4個(gè)結(jié)構(gòu)域的組合無(wú)論是否以與GST的融合蛋白存在，在直至高攻擊水平下都是保護(hù)性的。去除結(jié)構(gòu)域4，留下1+2+3，導(dǎo)致在所測(cè)試的最高攻擊水平9×105下被突破。在9×104孢子下，結(jié)構(gòu)域1+2的保護(hù)性與結(jié)構(gòu)域1+2+3的組合一樣。然而，去除結(jié)構(gòu)域1a而留下GST與結(jié)構(gòu)域1b+2的融合體，導(dǎo)致在所測(cè)試最高攻擊水平(9×104)下保護(hù)被突破，加入結(jié)構(gòu)域3僅有略微改善。
該數(shù)據(jù)表明，PA誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫可以歸因于單個(gè)結(jié)構(gòu)域(完整的結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域4)或者得自所有4個(gè)結(jié)構(gòu)域作為全變物(permutation)的結(jié)構(gòu)域組合。
結(jié)構(gòu)域4的氨基酸序列和DNA編碼序列示于圖4，分別為SEQ IDNO15和SEQ ID NO 16。實(shí)施例6結(jié)構(gòu)域作為疫苗的進(jìn)一步測(cè)試從炭疽芽孢桿菌Sterne DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼所述PA結(jié)構(gòu)域-氨基酸1-259、168-488、1-488、168-596、1-596、260-735、489-735、597-735和1-735(分別為截短物GST1、GST1b-2、GST1-2、GST1b-3、GST1-3、GST2-4、GST3-4、GST4和GST1-4)的DNA，將其克隆到表達(dá)載體pGEX-6-P3(Amersham-Pharmacia)的XhoI/BamHI位點(diǎn)中，置于lac啟動(dòng)子下游并且與所述啟動(dòng)子符合讀框。使用該系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白以具有N末端谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶蛋白(GST)的融合蛋白表示。然后，將帶有編碼所述PA結(jié)構(gòu)域的DNA的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，以供蛋白質(zhì)表達(dá)研究用。
在含有50μg/ml氨芐青霉素、30μg/ml氯霉素和1％w/v葡萄糖的L-肉湯中，培養(yǎng)帶有重組pGEX-6-P3質(zhì)粒的大腸桿菌BL21。將培養(yǎng)物于30℃振蕩(170rev/min)培養(yǎng)至A600nm為0.4，然后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)。將培養(yǎng)物再孵育4小時(shí)，然后通過(guò)以10000rpm離心15分鐘收獲培養(yǎng)物。
所述PA截短物-融合蛋白的初步提取表明，它們以內(nèi)含體產(chǎn)生。將細(xì)胞沉淀重懸于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，在冰水浴中超聲處理4×20秒。將懸浮液以15000rpm離心15分鐘，然后通過(guò)懸浮于8M尿素中于室溫?cái)嚢?小時(shí)，用尿素提取細(xì)胞沉淀。將懸浮液以15000rpm離心15分鐘，上清液對(duì)含有400mM L-精氨酸和0.1mM EDTA的100mMTris pH8透析，然后在PBS中透析。
所述PA截短物-融合蛋白的成功重折疊，使其可以在谷胱甘肽Sepharose CL-4B親和柱上純化。將所有提取物(截短物GST1b-2-氨基酸殘基168-487除外)上樣到先前用PBS平衡的15ml谷胱甘肽Sepharose CL-4B柱(Amersham-Parmacia)，于4℃旋轉(zhuǎn)溫育過(guò)夜。柱子用PBS洗滌，用含150mM NaCl、1mM EDTA和20mM還原型谷胱甘肽的50mM Tris pH7洗脫所述融合蛋白。合并通過(guò)SDS-PAGE分析鑒定的含PA截短物的流分，然后對(duì)PBS透析。用BCA(Perbio)測(cè)定蛋白濃度。
然而，用還原型谷胱甘肽未能從谷胱甘肽sepharose CL-4B親和柱洗脫下截短物GST1b-2，因此用離子交換色譜純化。具體地說(shuō)，將截短物GST1b-2對(duì)20mM Tris pH8透析，然后上樣至用同一緩沖液平衡的HiTrap Q柱(Amersham-Parmacia)。用20mM Tris pH8中的0-1M增加的NaCl梯度洗脫融合蛋白。合并含GST-蛋白的流分，濃縮，然后上樣至先前用PBS平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200凝膠過(guò)濾柱(Amersham-Parmacia)。合并含融合蛋白的流分，通過(guò)BCA(Perbio)測(cè)定蛋白濃度。產(chǎn)量在每升培養(yǎng)物1mg和43mg之間。
所述片段的分子量及其被抗PA抗體的識(shí)別用SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡法來(lái)證實(shí)。通過(guò)SDS Page和蛋白質(zhì)印跡法分析所述rPA截短物，顯示出預(yù)期大小的蛋白條帶。在所調(diào)查的所有所述rPA截短物中顯然有一些降解，顯示出與在枯草桿菌中表達(dá)的重組PA有相似性。rPA截短物GST1、GST1b-2和GST1-2在無(wú)結(jié)構(gòu)域3的情況下對(duì)降解特別敏感。同樣報(bào)道了結(jié)構(gòu)域3中含有突變的rPA構(gòu)建體不能從炭疽芽孢桿菌培養(yǎng)上清液中純化(Brossier 1999)，表明結(jié)構(gòu)域3可能使結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2穩(wěn)定化。
在該項(xiàng)研究中使用雌性無(wú)特定病原體的A/J小鼠(Harlan UK)，因?yàn)樗鼈兪翘烤腋腥镜姆€(wěn)定模型(Wellkos 1986)。小鼠在年齡上相當(dāng)，在該項(xiàng)研究開(kāi)始時(shí)為7周齡。
在該項(xiàng)研究的第1天和第28天，用100μl總體積PBS中吸附于20％1.3％v/v鋁膠(HCI Biosector，Denmark)的10μg融合蛋白為A/J小鼠免疫。也包括用得自枯草桿菌的rPA(Miller 1998)、重組GST對(duì)照蛋白或去除了GST標(biāo)志的編碼結(jié)構(gòu)域1、4以及1-4的融合蛋白免疫的組。在后腿兩個(gè)部位肌內(nèi)給予免疫劑量。初次免疫后37天，取小鼠的血樣，以供通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行血清抗體分析。
微量滴定板(Immulon 2，Dynex Technologies)用PBS中從枯草桿菌表達(dá)的(Miller 1998)5μg/ml rPA于4℃包被過(guò)夜，每塊板的兩列除外，這兩列用5μg/ml抗小鼠Fab(Sigma，Poole，Dorset)包被。用含1％v/vTween 20的PBS(PBS-T)洗滌板，5％w/v脫脂奶粉的PBS溶液(blotto)于37℃封閉2小時(shí)。加入在1％blotto中兩倍稀釋的血清至所述rPA包被孔中，與加入至抗fab包被孔的鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)(Siema)一起，以雙份重復(fù)進(jìn)行分析，于4℃溫育過(guò)夜。洗滌后，向所有孔中加入在PBS以1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(SouthemBiotechnology Associates Inc.)，于37℃溫育1小時(shí)。再次洗滌板，然后加入底物2，2’-Azinobis(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(1.09mM ABTS，Sigma)。于室溫溫育20分鐘后，測(cè)定414nm下各孔的吸光度(TitertekMultiscan，ICN Flow)。用Titersoft version 3.1c軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。效價(jià)以每ml血清μgIgG表示，計(jì)算組平均數(shù)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。結(jié)果示于圖5。
所產(chǎn)生的所有rPA截短物都是免疫原性的，在A/J小鼠體內(nèi)激發(fā)的平均血清抗rPA IgG濃度范圍從GST1b-2截短物免疫組的6μg/ml至GST1-4截短物免疫組的1488μg/ml(圖5)。GST對(duì)照免疫小鼠沒(méi)有可檢測(cè)的抗rPA抗體。
在免疫方案的第70天，用炭疽芽孢桿菌STI孢子攻擊小鼠。從原液取出足夠的STI孢子用于攻擊，在無(wú)菌蒸餾水中洗滌，然后重懸于PBS中至1×107孢子/ml和1×106孢子/ml的濃度。分別以每只小鼠含1×106孢子和1×105孢子的0.1ml體積腹膜內(nèi)攻擊小鼠，在攻擊后監(jiān)測(cè)14天，以確定其保護(hù)狀況。嚴(yán)格觀測(cè)人道終點(diǎn)，使得表現(xiàn)出綜合指示具有致死感染的大量臨床體征的小鼠被剔除。攻擊后存活14天的免疫小鼠數(shù)目示于表3。
表3攻擊水平MLD結(jié)構(gòu)域 存活者/受攻擊的數(shù)目(％)102MLD 103MLDGST1 3/5(60) 1/5(20)GST1b-2 1/5(20) ndGST1-2 5/5(100)3/5(60)GST1b-3 3/5(60) ndGST1-3 4/5(80) ndGST1-4 nd 5/5(100)GST2-4 nd 5/5(100)GST3-4 nd 5/5(100)GST4 5/5(100)5/5(100)GST1+GST4nd 5/5(100)經(jīng)切割的11/5(20) 2/5經(jīng)切割的45/5(100)5/5經(jīng)切割的1-4 nd 5/5rPA nd 4/4(100)對(duì)照 0/5(0) 0/5(0)1MLD＝約1×103STI孢子nd＝未進(jìn)行用103MLD的STI孢子攻擊的組都是完全受保護(hù)的，除了GST1、GST1-2和經(jīng)切割的1免疫的組，在這些組中有一些保護(hù)被突破，僅用GST免疫的對(duì)照組全都死于感染，至死亡時(shí)的平均時(shí)間(MTTD)為2.4±0.2天。在102MLD的較低攻擊水平下，GST1-2、GST4和經(jīng)切割的4免疫的組都受到完全的保護(hù)，但在其它組中有一些保護(hù)被突破。在這些組中死亡小鼠的MTTD為4.5±0.2天，這與GST對(duì)照免疫組沒(méi)有顯著差異，GST對(duì)照免疫組全部死亡，MTTD為4±0.4天。
權(quán)利要求
1.一種引起抗炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性試劑，所述試劑包含結(jié)合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長(zhǎng)保護(hù)性抗原(PA)的至多3個(gè)結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)包含PA的結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4或其變異體。
2.一種權(quán)利要求1的免疫原性試劑，所述試劑包含野生型PA的結(jié)構(gòu)域1和/或結(jié)構(gòu)域4的序列。
3.一種權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的免疫原性試劑，所述試劑包含炭疽芽孢桿菌PA的結(jié)構(gòu)域4。
4.一種任一前述權(quán)利要求的免疫原性試劑，所述試劑包含結(jié)構(gòu)域1和4或其保護(hù)性區(qū)的組合。
5.一種權(quán)利要求4的免疫原性試劑，其中所述結(jié)構(gòu)域以融合多肽的形式存在。
6.一種權(quán)利要求5的免疫原性試劑，所述試劑包含與所述PA序列的結(jié)構(gòu)域2融合的結(jié)構(gòu)域1。
7.一種權(quán)利要求6的免疫原性試劑，所述試劑與所述PA序列的結(jié)構(gòu)域3融合。
8.一種權(quán)利要求4的免疫原性試劑，所述試劑包含多肽的混合物，其中一種多肽包含所述PA序列的結(jié)構(gòu)域1，而其中一種多肽包含所述PA序列的結(jié)構(gòu)域4。
9.一種任一前述權(quán)利要求的免疫原性試劑，其中一種多肽與另一種多肽融合。
10.一種權(quán)利要求9的免疫原性試劑，所述另一種肽是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
11.一種核酸，所述核酸編碼任一前述權(quán)利要求的免疫原性試劑的多肽。
12.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求11的核酸。
13.一種用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
14.一種用于生產(chǎn)引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性多肽的方法，所述方法包括用或者(a)編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，或者(b)編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的一個(gè)保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化宿主，并且從中回收所述多肽，條件是當(dāng)所述多肽是炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體時(shí)，所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
15.一種權(quán)利要求14的方法，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體。
16.一種權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)45％。
17.一種權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比為50-52％。
18.一種權(quán)利要求14的方法，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的一個(gè)保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體。
19.一種權(quán)利要求18的方法，其中所述結(jié)構(gòu)域是炭疽芽孢桿菌PA的結(jié)構(gòu)域1和/或結(jié)構(gòu)域4。
20.一種重組大腸桿菌(Escherischia coli)細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)用編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
21.一種權(quán)利要求20的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)45％。
22.一種權(quán)利要求21的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比為50-52％。
23.一種權(quán)利要求20的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述核酸是圖2所示的SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式。
24.一種權(quán)利要求23的重組大腸桿菌細(xì)胞，其中所述核酸是SEQID NO1的核酸。
25.一種重組大腸桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)用編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的一個(gè)保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸轉(zhuǎn)化。
26.一種權(quán)利要求25的重組細(xì)胞，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌PA的結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4。
27.一種用于生產(chǎn)引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求20-26中任一項(xiàng)的細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)物中回收所述保護(hù)性多肽。
28.一種大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸，并且其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過(guò)35％。
29.一種大腸桿菌轉(zhuǎn)化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原(PA)的一個(gè)保護(hù)性結(jié)構(gòu)域或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體的核酸。
30.一種SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式，所述核酸或其修飾形式編碼PA或可以引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的其變異體，并且GC含量至少為35％。
31.一種權(quán)利要求30的核酸，所述核酸與SEQ ID NO1至少有90％相同。
32.一種權(quán)利要求31的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO1。
34.一種預(yù)防或治療炭疽芽孢桿菌感染的方法，所述方法包括給予需要預(yù)防或治療的哺乳動(dòng)物足量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的免疫原性試劑。
35.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的免疫原性試劑在預(yù)防或治療炭疽芽孢桿菌感染的藥物制備方面的應(yīng)用。
全文摘要
一種引起抗炭疽芽孢桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性試劑，所述試劑包含結(jié)合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長(zhǎng)保護(hù)性抗原(PA)的至多3個(gè)結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)包含PA的結(jié)構(gòu)域1或結(jié)構(gòu)域4或其變異體。通過(guò)從大腸桿菌表達(dá)，生產(chǎn)所述免疫原性試劑的多肽以及全長(zhǎng)PA。用該方法獲得高產(chǎn)量的多肽。也描述并要求保護(hù)了在該方法中使用的細(xì)胞、載體和核酸。
文檔編號(hào)C07K14/32GK1440459SQ01812409
公開(kāi)日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月8日
發(fā)明者E·D·威廉森, J·米勒, N·J·瓦爾克, L·W·J·拜利, P·T·霍爾登, H·C·弗利克－史密斯, H·L·布利芬特, R·W·蒂特巴爾, A·W·托平 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部