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一種病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:563971閱讀:711來源:國知局

專利名稱::一種病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及一種病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)及其應(yīng)用。特別是一種以煙草花葉病毒TMV為載體的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)。
背景技術(shù)
:植物分子生物學基本上依賴正向遺傳學;即通過突變和克隆突變基因從而找到控制該表型的野生型基因序列。在過去的幾年中,隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測序的完成以及其它物種序列信息數(shù)據(jù)庫的相繼產(chǎn)生,意味著較傳統(tǒng)正向遺傳學更優(yōu)越的研究基因功能的技術(shù)正應(yīng)運而生。其中之一就是反向遺傳學,它是通過改變某個基因或者序列的表達對其突變表型進行功能研究。T-DNA和轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)在產(chǎn)生突變體方面非常有效,但是不能研究存多基因家族的功能,很難達到基因組的飽和度,和由于插入的多樣性常常造成對多個基因的共同失活。利用組織特異性啟動子的反義RNA(antisenseRNA,asRNA)和共抑制技術(shù)可以防止發(fā)育早期的抑制,但這都需要繁重的工作量、耗時,且存在結(jié)果的不可預測性。1995年,人們發(fā)現(xiàn)了利用煙草花葉病毒(乃k/ccomos^cv/n^,TMV)攜帶與內(nèi)源基因相同的序列會導致內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Kumagaiets丄,1995)。這種載體是用番茄花葉病毒(rowafowora,:cv/nw,ToMV)的(coatprotein,CP)替代TMV-U1株系的CP。在TMV-U1的CP亞基因組啟動子下游,表達需要沉默的基因的部分片段。重組TMV通過降解轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,定向下調(diào)特定的基因,因此人們很快認識到可以利用病毒誘導的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)系統(tǒng)作為研究基因功能的工具(Baulcombe,1999)。VIGS系統(tǒng)對研究植物基因功能非常有效,特別是針對某些突變后可能造成胚死亡的基因和不易于轉(zhuǎn)化的植物品種。VIGS作為功能基因組研究手段的另一個顯著優(yōu)勢,是它可以在植物的一個世代時間范圍內(nèi)誘導特定基因的沉默表型,非??旖荨IGS避免了對植株的轉(zhuǎn)化,不依賴于轉(zhuǎn)基因植物,而轉(zhuǎn)基因?qū)芏嘀参锲贩N而言是非常困難的。通過VIGS載體攜帶基因家族的保守序列即可以達到沉默該家族全部或者主要成員的目的。相反,通過基因特異序列可以定向沉默基因家族中的特定成員。目前利用煙草花葉病毒TMV作為載體建立的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),通常是將目標基因片段插入到TMV外殼蛋白(coatprotein,CP)或運動蛋白亞基因組啟動子下游。目的基因與這些蛋白亞基因組轉(zhuǎn)錄物的拷貝數(shù)是一致的,都是單拷貝。目標基因片段在這些蛋白亞基因組轉(zhuǎn)錄時,被隨之轉(zhuǎn)錄、翻譯。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被宿主植物的核酸內(nèi)切酶所識別,并誘導序列特異性的對同源基因mRNA的降解,誘導基因沉默的產(chǎn)生。隨著TMV粒子在葉片組織內(nèi)的不斷繁殖、浸染,被基因沉默的區(qū)域也隨之擴大。不過使用該策略在誘導基因沉默的同時,還會在蛋白質(zhì)水平上產(chǎn)生目的片段所編碼的多肽,是否對后續(xù)TMV的包裝、繁殖、繼續(xù)浸染造成影響,繼而影響沉默效果還值得商榷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種以煙草花葉病毒為載體的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)。本發(fā)明的目的之二在于提供該病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)在目標基因沉默中的應(yīng)用為達到上述目的,本發(fā)明的構(gòu)思是病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)是一種由RNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,這種沉默的產(chǎn)生并不需要病毒攜帶的目標基因在蛋白水平的表達,它只需要s標基因在轉(zhuǎn)錄水平上作為-種外源核酸片段被宿主植物的核酸內(nèi)切酶所識別,并誘導序列特異性的對同源基因mRNA的降解。另外,經(jīng)典的病毒學研究表明,TMV在合成自身亞基因組的過程中會形成RNA的雙鏈階段,而這些亞基因組都包含了病毒基因組的3'非翻譯區(qū)(unt.raslatedregion,UTR)。因此,利用以上原理,將目標基因片段插入TMVcDNA的CP終止密碼子與3'UTR之間,除了不會在蛋白質(zhì)水平上產(chǎn)生新的多肽外,目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不再是單拷貝,而是遠遠高于現(xiàn)有TMVVIGS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的拷貝數(shù),基因沉默效率也就更高。根據(jù)上述構(gòu)思,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案-種病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),以煙草花葉病毒TMV為載體,其特征在于該系統(tǒng)是將目標基因DNA片段插入到煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3'非翻譯區(qū)之間,并在煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3'非翻譯區(qū)之間引入了多克隆限制性內(nèi)切酶切位點,用于目標基因麗A片段的插入;所述的目標基因DNA片段不大于lkb。上述的多克隆限制性內(nèi)切酶切位點與3'非翻譯區(qū)之間,引入一小段CP3'末端的堿基序列,可以增強基因沉默載體的穩(wěn)定性。該CP3'末端堿基序列的長度小于100bP。上述的目標基囚片段的長度范圍為100-500bp。上述的目標基因片段的長度為加0bp。一種上述病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)在通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種的方式完成宿主植物目標基因的沉默中應(yīng)用。本發(fā)明將要沉默的目標基因片段插入TMVcDh'A的CP終止密碼子下游的3'非翻譯區(qū)內(nèi)。即通過PCR的方法,在CP終止密碼子與3'UTR之間,引入多克隆限制性內(nèi)切酶切位點和CP3'末端堿基序列,構(gòu)建得到VIGS載體。目標基因片段可插入到多克隆位點后,可以穩(wěn)定存在,由于TMV每個亞基因組都包含了病毒基因組的3'UTR,通過重組TMV體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種植物,該系統(tǒng)就可以方便、高效地對目標基因進行沉默。圖l為本發(fā)明實施例中的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)pT醇-rCPc61-VIGS載體構(gòu)建示意圖。其中Mi表示TMV外殼蛋白的3'UTR非翻譯區(qū),表示TMV外殼蛋白3'末端的61bp的堿基序列,MCS表示引入的多克隆位點區(qū),是外源序列插入處。圖2為TMV-rCPc61-PDS409感染本生煙草后PDS沉默的表型。煙草褪綠表型處,即為基因沉默部位。圖3為TMV-rCPc61-PDS117感染本生煙草21天后PDS沉默的表型。煙草褪綠表型處,即為基因沉默部位。圖4為TMV-rCPc61-PDS292感染本生煙草14天后出現(xiàn)的PDS基因沉默表型。煙草褪綠表型處,即為基因沉默部位。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明該發(fā)明,而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例一TMV沉默載體pTMV-rCPc61-VIGS的構(gòu)建1)多克隆位點的引入TMVcDM克隆載體pTMV20的構(gòu)建參照參見Wu,L.G.,Jiang'L.B.,Zhou,Z.A"Fan,」.H.,Zhang,Q.Q.,Zhu,H.H.,Han,Q.andXu,Z.K.(2003)Expressionoffoot-and-mouthdiseasevirusepitopesintobaccobyatobaccomosaicv丄ns-ba"seclvector.Vaccine21,4390-4398。將多克隆位點區(qū)KpnI/XhoI/EcoRV/NotI序列合成引物KXEN5(+)/KXEN3(-),通過二次PCR的方法將多克隆位點區(qū)KpnI/XhoI/EcoRV/NotI序列引入到pTMV20載體中CP終止密碼子后,得到質(zhì)粒pTMV-VIGS。應(yīng)理解,本發(fā)明多克隆位點在整個VIGS系統(tǒng)中的使用,只是為了引入插入片段,可以根據(jù)自身實驗需要引進相應(yīng)位點。應(yīng)31H該TMV沉默載體^iTMV20j]基礎(chǔ)上構(gòu)律,原dTMV20質(zhì)粒上現(xiàn)有的酶切位點,應(yīng)避免引入。2)CP3'末端堿基序列的引入為了避免重組病毒的插入片段發(fā)生丟失,提高該TMV沉默載體的沉默效率,根據(jù)CP3'末端61bp堿基序列合成引物KXEN-rCPc61(+)/KXEN-rCPc61(+),通過二次PCR的方法,將該序列反向克隆到pTMV-VIGS的多克隆位點區(qū)Kpnl/XhoI/EcoRV/Notl序列的下游,得到TMV沉默載體pTMV-rCPc61-VIGS。構(gòu)建模式參見圖1。應(yīng)理解,本發(fā)明在3'UTR前連接了CP3'末端序列,是為了保持3'非編碼區(qū)和CP之間原有的結(jié)構(gòu),避免插入片段的丟失,提高該TMV沉默載體的沉默效率。該段堿基序列位于3'UTR區(qū),不會被編碼成有義蛋白??梢愿鶕?jù)自身實驗需要,引進合適長度的CP3'末端堿基序列,較佳范圍為〈100bp。3)重組TMV克隆的構(gòu)建根據(jù)Genbank上登錄的本生煙草的PDS基因的cDNA序列(AJ616742),合成引物PDS--Xho15(+)/PDS-Xho13(-),通過RT-PCR的方法從三生煙草(Samsunmm)中克隆到該基因的409bp長的部分序列。將409bp長度的PDS序列通過PCR及Notl酶切的方法克隆到pTMV-rCPc61載體中,得到pTMV-rCPc61-PDS409。將PDS的PCR片段通過RcoRV酶切得到長度分別為292bp和117bp的片段,并將它們分別克隆到pTMV-rCPc61載體的Notl/EcoRV酶切位點之間,得到pTMV-rCPc61-PDS292和pTMV-rCPc61-PDS117。共得到三種含不同長度PDS基因片段的重組TMV克隆。應(yīng)理解,選取目的基因的相應(yīng)片段時,應(yīng)規(guī)避該TMV沉默載體上的限制性內(nèi)切酶酶切位點。本發(fā)明VIGS系統(tǒng)適合沉默基因片段大小在lkb以內(nèi),較佳范圍為100-500bp,最仕長度為300bp左右。所選用的引物的序列表參見表1。實施例二基因沉默載體的效率測試以本生煙草(Nicotianabenthamiana)的八氫番茄紅素脫氫酶(phytoenedesaturase,PDS)為例,說明該沉默載體的效果。PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的一個關(guān)鍵酶,當該基因被沉默時,植株會產(chǎn)生白化效應(yīng),植物的葉片變成白色,這是由于PDSm脂A水平顯著降低引起的。l.克隆體外轉(zhuǎn)錄將實施例一中的重組TMVcDNA克隆經(jīng)PstI酶切線性化;加入T4DM聚合酶至終濃度0.llVu1,dNTP至終濃度0.lmM/u1,16oC反應(yīng)30min,用以填平酶切后的3'末端;苯酚氯仿抽提,2.5倍體積冰乙醇沉淀質(zhì)粒,75%乙醇洗兩遍;以2ug線性化質(zhì)粒為模板,由T7RNA聚合酶催化進行加帽體外轉(zhuǎn)錄,參見Xu、Z.K.,A,1—a、.T.V.,andNuss,D丄(1989).AssignmentofwoundtumorvirusnonstructuralpolypeptidestocognatedsRNAgenomesegmentsbyinvitroexpressionoftailoredfull-lengthcDNAclones.K/rW057168,73-78。反應(yīng)體系20ul,包括40mMTris-HCl,pH8.0,6mMMgC12,10mMdithiothreitol,2mMspermidine,ATP、CTP、UTP各IraM,GTP0.lraM,0.25mMra7GpppG,20URNasin,20UT7RNA聚合酶;37oC反應(yīng)l小時后,加入O.2MEDTA(pH8.0)2iU終止反應(yīng)。2、接種本生煙草獲得了含特定目的基因片段的重組TMVcDNA克隆后,經(jīng)PstI酶切線性化;再按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行體外轉(zhuǎn)錄,可用于直接感染煙草,參見Xu,Z.K.,Anzola,J.V.,andNuss,D丄(1989).AssignmentofwoundtumorvirusnonstructuralpolypeptidestocognatedsRNAgenomesegmentsbyinvitroexpressionoftailoredfull-lengthcDNAclones.Kz>oJog.K168'73-78。三種重組TMV在本生煙草上,均引起不同程度的PDS的基因沉默,參見圖2,3,4。其中TMV-rCPc61-PDS292在感染煙草后,兩周后開始引起植株葉片的褪綠,感染后一個月在非接種葉片、莖、萼片上都產(chǎn)生了非常明顯的褪綠表型,參見圖4。比pTMV-rCPc61-PDS409和pTMV-rCPc61-PDS117在本生煙草上的褪綠白化表型明顯。說明該基因沉默系統(tǒng)對300bp左右的目的片段的沉默效率最好。表l引物虛列表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),以煙草花葉病毒TMV為載體,其特征在于該系統(tǒng)是將目標基因DNA片段插入到煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3’非翻譯區(qū)之間,并在煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3’非翻譯區(qū)之間引入了多克隆限制性內(nèi)切酶切位點,用于目標基因DNA片段的插入;所述的目標基因DNA片段不大于1kb。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),其特征在于在所述的多克隆限制性內(nèi)切酶切位點與3'非翻譯區(qū)之間引入CP3'末端的堿基序列,以增強沉默載體的穩(wěn)定性;該CP3'末端堿基序列的長度小于100bp。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),其特征在于所述的目標基因片段的長度范圍為100-500bp。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng),其特征在于所述的目標基因片段的長度為300bp。5.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)在通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種的方式完成宿主植物目標基因的沉默中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種特別是一種以煙草花葉病毒TMV為載體的病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)。該系統(tǒng)是將目標基因DNA片段插入到煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3’非翻譯區(qū)之間,并在煙草花葉病毒TMV外殼蛋白CP的終止密碼子與3’非翻譯區(qū)之間引入了多克隆限制性內(nèi)切酶切位點,用于目標基因DNA片段的插入;在3’非翻譯區(qū)前引入一段CP3’末端的堿基序列,以增強沉默載體的穩(wěn)定性。所述的目標基因DNA片段不大于1kb。利用本發(fā)明的基因沉默系統(tǒng)對目標基因進行沉默將更為經(jīng)濟可行、方便、有效。文檔編號C12N15/83GK101418313SQ20081004143公開日2009年4月29日申請日期2008年8月7日優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日發(fā)明者宋任濤,平李,李茫茫,許政暟,賀燕云,菲金申請人:上海大學
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