專利名稱：對于腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體受體選擇性的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠特異性地結(jié)合一種類型腫瘤壞死因子(在下文稱為“TNF”)相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(在下文稱為“TRAIL”)受體的抗體，更具體地講，涉及在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)表達(dá)所述單一類型受體的細(xì)胞細(xì)胞凋亡的單克隆抗體，還涉及基于其的療法。
背景技術(shù)：
TRAIL是蛋白質(zhì)TNF家族的一員，所述家族也包括TNF-α和Fas配體(1)。這些蛋白質(zhì)是有效的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。迄今為止，已經(jīng)鑒定了5種TRAIL受體，其中兩種-DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)(2-7)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號，而其它三種-DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和osteoprotegerun(OPG)不轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(8-12)。所有5種TRAIL受體在其胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中共享顯著同源性。與Fas和TNF受體I(在下文稱為“TNFRI”)相似，DR4和DR5的胞內(nèi)區(qū)段都含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域，通過涉及Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(在下文稱為“FADD”)和caspase 8的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(6，7)。除轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號外，DR4和DR5受體也可以激活涉及NFκb的途徑(6，7)。
已經(jīng)證明的TRAIL的生物學(xué)功能包括TRAIL能夠選擇性地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡，而正常細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有相對抗性(13-15)。這種選擇性提示，通過在動物模型中系統(tǒng)給予TRAIL沒有誘導(dǎo)顯著毒性證明，與Fas配體相反，TRAIL的給予與非常低水平的毒性相關(guān)(13)。因此，已經(jīng)提出TRAIL為一種有效的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，它可能是用于治療癌癥和與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的其它疾病的合適的治療藥。也提出了TRAIL是一種可能適用于治療自身免疫病和炎性疾病的有效的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。已經(jīng)證明，TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與活化誘導(dǎo)的T細(xì)胞的細(xì)胞死亡，從而用作Fas配體的一種替代機(jī)制(16，17)。TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也可能在誘導(dǎo)T細(xì)胞和其它炎性細(xì)胞細(xì)胞凋亡方面起作用(18)，以及在NK細(xì)胞的殺傷活性(19-21)和樹突細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能(22，23)方面起作用。因此，TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也可能在免疫特權(quán)和免疫監(jiān)視方面起作用。
TRAIL受體系統(tǒng)是復(fù)雜的，包括至少兩種死亡受體(DR4和DR5)和至少兩種非細(xì)胞凋亡受體(DcR1和DcR2)。所有這些受體不僅享有高氨基酸序列同源性，而且表現(xiàn)出與TRAIL相似的結(jié)合親和性(2-12)。DcR1和DcR2受體競爭與TRAIL結(jié)合而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力提示，它們可能用作阻斷或調(diào)節(jié)TRAIL配體活性的誘餌受體。此外，已經(jīng)報(bào)道，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)的誘餌受體水平高于轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的水平。因此提出了，所述死亡受體和誘餌受體的表達(dá)的差別調(diào)節(jié)可能代表決定細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，但卻因?yàn)槿狈κ荏w特異性抗體(2)。盡管已經(jīng)廣泛研究了DR4和DR5的表達(dá)和功能，但由于缺乏受體特異性單克隆抗體而阻礙了進(jìn)展。DR5的細(xì)胞表面表達(dá)尚未有記載。已有報(bào)道，已經(jīng)產(chǎn)生了一組抗TRAIL受體抗體，所述抗體能夠在體外誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡，但僅在所述抗體被固定化以促進(jìn)交聯(lián)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在某些情況下，所述細(xì)胞需要用放線菌素D培養(yǎng)(24)。已經(jīng)產(chǎn)生了幾種抗DR5抗體(24)。然而，這些先前產(chǎn)生的抗DR5單克隆抗體在體外甚至在交聯(lián)條件下，其細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性也很低。沒有報(bào)道體內(nèi)活性。這些抗體已經(jīng)用來檢查TRAIL受體的細(xì)胞表面表達(dá)(24)。因此，需要不僅能夠與細(xì)胞表面受體結(jié)合、而且在體內(nèi)和體外都強(qiáng)烈誘導(dǎo)各種類型異常細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)細(xì)胞凋亡而無需交聯(lián)或固定化的對每種具體TRAIL受體選擇性的單克隆抗體。這種抗體可能不僅提供潛在的治療藥，而且也為TRAIL受體的功能分析提供一種診斷工具。特別需要對于死亡誘導(dǎo)受體DR4和DR5中每種特異性的抗體。
在許多疾病的發(fā)生或發(fā)展中，通常的情況是所述細(xì)胞未被清除。在許多自身免疫病和炎性病癥中，存活的活化細(xì)胞攻擊正常組織或細(xì)胞。此外，腫瘤發(fā)生的進(jìn)展和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的增生性淋巴結(jié)炎形成的特征為未加抑制的細(xì)胞增殖。因此，不足的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致發(fā)病，應(yīng)用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體或激動性單克隆抗體增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是一種消除那些不想要的細(xì)胞的可能的治療策略。
例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(在下文稱為“RA”)是一種常見的人類自身免疫病。目前對RA病理生理學(xué)的了解是，自身免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞起始所述關(guān)節(jié)中的炎性應(yīng)答，這驅(qū)使滑膜細(xì)胞增殖過多。由于滑膜細(xì)胞增殖過多，金屬蛋白酶(在下文稱為“MMP”)過量產(chǎn)生，這進(jìn)一步導(dǎo)致RA特征性的軟骨和骨的侵蝕性破壞(25)。因此，控制炎性滑膜細(xì)胞增殖過多是治療RA中的關(guān)鍵一步。導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增殖過多的分子機(jī)制尚不了解。盡管增殖過多的滑膜細(xì)胞是非惡性的且非轉(zhuǎn)化的，但許多研究提示，它們與轉(zhuǎn)化細(xì)胞享有某些共同的特征(46)。所謂“看來已轉(zhuǎn)化的滑膜細(xì)胞”的這些細(xì)胞的特征是致密粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、大量的不規(guī)則細(xì)胞核和正常的紡錘形細(xì)胞骨架改變。已經(jīng)提出，癌基因和病毒來源的基因的摻入可能是RA滑膜細(xì)胞已轉(zhuǎn)化外觀的主要觸發(fā)物(46)。
RA的至少兩個(gè)方面提示，調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞凋亡可能是引起疾病進(jìn)程的主要原因，并且細(xì)胞凋亡的治療誘發(fā)可能是一種有效的療法活化T細(xì)胞未能耗竭提示，這些T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡存在缺陷，這種活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種涉及Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的過程，RA滑膜細(xì)胞的增殖過多性質(zhì)是在RA病理生理學(xué)晚期起作用的因素。實(shí)際上，已經(jīng)表明，將抗Fas抗體給予炎性關(guān)節(jié)，在人類RA動物模型tax轉(zhuǎn)基因小鼠中抑制慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生(26)。此外，用fas配體基因通過腺病毒載體局部轉(zhuǎn)導(dǎo)有效預(yù)防膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(27)。在兩種情況下都觀察到通過增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對炎性滑膜細(xì)胞增殖的抑制。盡管Fas配體在RA滑膜細(xì)胞中是一種強(qiáng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，但應(yīng)用Fas配體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作為人類療法由于其致死性肝毒性而受到限制。因此，TRAIL受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡代表了一種在治療RA方面比Fas配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更安全更有效的療法。
TRAIL受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也代表一種在治療癌癥方面比Fas配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更安全更有效的療法。已知TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡特異性地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，而不影響正常細(xì)胞。已經(jīng)證明，系統(tǒng)給予三聚體化可溶性TRAIL在實(shí)驗(yàn)動物中并不引起毒性，但能夠誘導(dǎo)移植腫瘤的消退(13，28)。其作為傳統(tǒng)療法的輔佐療法的潛力被最近的發(fā)現(xiàn)所強(qiáng)調(diào)，所述發(fā)現(xiàn)為，DR5的表達(dá)和乳癌細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性通過放射得以加強(qiáng)，提示結(jié)合放射，TRAIL的功效在癌癥治療中得以增加(29)。
另外，編碼TRAIL受體DR5的基因已經(jīng)作圖至染色體8p21-22，這在某些癌細(xì)胞中是一種高頻突變的基因座(30)。已經(jīng)報(bào)道，至少兩種腫瘤細(xì)胞-小細(xì)胞肺癌(31)以及頭頸部癌(32)表現(xiàn)出DR5基因死亡結(jié)構(gòu)域中有突變。因此，在癌癥研究中需要抗DR5抗體，以測定受體表位變異對癌癥發(fā)生和發(fā)展的影響。此外，當(dāng)與癌癥早期檢測的其它生物標(biāo)記結(jié)合使用并且用作腫瘤侵襲預(yù)報(bào)器時(shí)，TRAIL受體突變的功能性將證明是一種有用的臨床診斷工具。
發(fā)明概述公開了一種識別TRAIL受體DR5并且在體內(nèi)誘導(dǎo)DR5表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗體。還公開了識別DR5、但不識別DR4、DcR1或DcR2的抗體。具體詳細(xì)地描述了用雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體。
本發(fā)明提供的方法使得可以通過將細(xì)胞暴露于治療量的能夠與DR5結(jié)合的抗體，抑制細(xì)胞增殖。也公開了一種藥用組合物，所述藥用組合物包括治療量的有效抗DR5單克隆抗體、一種藥學(xué)上可接受的載體和裝有所述抗體和所述載體的容器。本發(fā)明還提供識別DR5的抗體在制備使異常細(xì)胞或調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞選擇性細(xì)胞凋亡的治療藥的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗體與腫瘤壞死因子配體受體(例如DR4、DR5、DcR1、DcR2和OPG)相互作用，誘導(dǎo)表達(dá)這種受體的細(xì)胞凋亡。公開了一種本發(fā)明的抗體，所述抗體能夠選擇性結(jié)合激動性或拮抗性腫瘤壞死因子配體受體表位。
本發(fā)明提供用于細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的療法，所述療法采用這樣一種方法，所述方法包括將患有細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的靶組織暴露于治療量的本發(fā)明抗體。
還描述了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括一個(gè)至少具有10個(gè)堿基、與免疫球蛋白或其片段偶聯(lián)、能夠在受治療者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的抗原性TRAIL受體氨基酸序列。
本發(fā)明提供一種基因治療方法，其中用表達(dá)載體中的TRAIL受體核酸序列轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，使得所述TRAIL受體表達(dá)在所述靶細(xì)胞上。然后將所述靶細(xì)胞暴露于選擇性結(jié)合所述TRAIL受體的抗體。
提供了編碼DR5選擇性抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核酸序列和氨基酸序列。也詳細(xì)描述了包括本發(fā)明核酸序列的載體以及用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)人源化TRA-8的宿主細(xì)胞。
描述了一種生產(chǎn)人源化DR5抗體的方法，其中用編碼人源化免疫球蛋白輕鏈和人源化免疫球蛋白重鏈的核酸序列轉(zhuǎn)化宿主，然后將轉(zhuǎn)化宿主孵育預(yù)定的時(shí)間。
也描述了一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使靶細(xì)胞與藥用有效量的人源化DR5抗體接觸。
提供了用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的商業(yè)試劑盒，所述試劑盒包括一種對DR5具有選擇性的人源化TRA-8抗體；所述抗體包裝在合適的容器內(nèi)且附有使用說明。
附圖簡述

圖1.TRA-8的表征。(a)TRA-8的結(jié)合特異性蛋白質(zhì)印跡分析(上圖)用TRA-8或抗人IgG探測的TNFR家族的重組融合蛋白。第1泳道DR5/hIgG1融合蛋白(免疫原)；第2泳道DR4/hIgG1(TRAIL-R1)；第3泳道DR5/hIgG1；第4泳道TRAIL-R3(DcR-1)/hIgG1；第5泳道TRAIL-R4(DcR-2)/hIgG1；第6泳道CD95/hIgG1；第7泳道可溶性TNFRI。ELISA分析(下圖)所述孔的數(shù)目匹配蛋白質(zhì)印跡的孔數(shù)，孔8除外，孔8是鼠DR5/hIgG1融合蛋白。(b)可溶性TRAIL和TRA-8與DR5和DR4的結(jié)合活性ELISA板用DR5/hIgG1(左圖)或DR4/hIgG1(中間圖)包被，然后與TRAIL或TRA-8一起保溫。(c)DR5表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。用含有全長DR5 cDNA(實(shí)心直方圖)、DR4 cDNA(空心直方圖，實(shí)線)或空載體(空心直方圖，虛線)的pcDNA3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞用TRA-8染色，然后用PE綴合的抗小鼠IgG1染色。(d)DR5的原位免疫組織化學(xué)反應(yīng)性用DR5表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的Cytospin玻片在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用TRA-8染色，(e)TRA-8的殺傷活性將Jurkat細(xì)胞與指定濃度的TRA-8一起孵育。在過夜培養(yǎng)后，通過ATPLite、MTT和PI排除測定測量細(xì)胞生存力。ATPLite和MTT測定的結(jié)果以培養(yǎng)基對照的百分比表示，PI測定的結(jié)果以PI陰性細(xì)胞的百分比表示。(f)caspase活化的蛋白質(zhì)印跡分析將Jurkat細(xì)胞與500ng/ml TRA-8一起孵育指定的時(shí)間。細(xì)胞裂解液通過15％SDS-PAGE分離，將其制成印跡，用抗caspase抗體探測。箭頭表示每種caspase的經(jīng)切割的亞單位。(g)caspase抑制測定將Jurkat細(xì)胞在存在各種濃度的指定caspase抑制劑的情況下與50ng/ml TRA-8一起孵育過夜。通過ATPLite測定測量細(xì)胞生存力。
圖2.DR5的細(xì)胞表面表達(dá)和對DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。將從外周血新鮮分離的正常T細(xì)胞和B細(xì)胞、T細(xì)胞(a和a’)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(b和b’)、前列腺癌細(xì)胞(c)和B細(xì)胞(d)細(xì)胞系與TRA-8或鼠IgG1同種型對照抗體一起孵育，然后與PE綴合的山羊抗小鼠IgG1一起孵育?？招闹狈綀D代表所述同種型抗體對照，而實(shí)心直方圖代表TRA-8染色。在與可溶性TRAIL(空心圓)或TRA-8(實(shí)心圓)一起孵育過夜后，通過ATPLite測定測量細(xì)胞凋亡，如a、b’和d中所示。
圖3a’.T細(xì)胞系U937與TRA-8或鼠IgG1同種型對照抗體一起孵育。在與可溶性TRAIL(空心圓)或TRA-8(實(shí)心圓)一起孵育過夜后，通過ATPLite測定測量細(xì)胞凋亡。
圖3.神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(b)和前列腺癌細(xì)胞系(c)與TRA-8或鼠IgG1同種型對照抗體一起孵育。在與可溶性TRAIL(空心圓)或TRA-8(實(shí)心圓)一起孵育過夜后，通過ATPLite測定測量細(xì)胞凋亡。
圖4是一系列曲線圖，顯示人Jurkat細(xì)胞在暴露于指定濃度的(A)抗體種類TRA-1、TRA-8和TRA-10和(B)在固定濃度的圖4A所示本發(fā)明抗體種類存在下暴露于TRAIL后的細(xì)胞生存力；圖5.DR5在正常組織和癌組織中的表達(dá)正常組織勻漿和癌組織勻漿用TRA-8探測，然后通過化學(xué)發(fā)光顯示。(a)正常組織中DR5蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析第1泳道肝，第2泳道腦，第3泳道肺，第4泳道腎，第5泳道脾，第6泳道睪丸。第7泳道卵巢，第8泳道心臟，第9泳道胰腺。b.癌組織中DR5蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。探測包含得自以下癌的癌組織印跡卵巢(第1泳道)、肺(第2泳道)、肝(第3泳道)、直腸(第4泳道)、宮頸(第5泳道)、皮膚(第6泳道)、睪丸(第7泳道)、甲狀腺(第8泳道)、子宮(第10泳道)、胃(第11泳道)、喉咽(第12泳道)和胰腺(第13泳道)。正常人組織(c)和癌組織(d)的原位免疫組織化學(xué)。冷凍切片用TRA-8免疫染色。
圖6.TRA-8的殺腫瘤活性。給SCID小鼠皮下接種1321N1細(xì)胞。給小鼠靜脈在腫瘤接種后第2天注射一劑100μg TRA-8(a)或在腫瘤接種后開始7天注射三劑100μg TRA-8(b)。腫瘤生長通過重量測定，并且用H&E染色進(jìn)行組織學(xué)檢查。照片顯示了對照小鼠中的有活力的腫瘤生長，而在TRA-8治療的小鼠中沒有所述腫瘤生長(c，上圖)，還顯示了腫瘤的H&E染色(c，下圖)。給SCID小鼠靜脈注射106Jurkat細(xì)胞，然后注射后第2天用一劑TRA-8治療。7天后，收獲脾細(xì)胞，用抗人CD3抗體染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)(d)或通過免疫組織化學(xué)(e)分析。
圖7顯示了RA(A)和OA(B)滑膜細(xì)胞中細(xì)胞表面DR5的表達(dá)。1×106原代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞用親和純化的TRA-8染色，然后用PE綴合的山羊抗小鼠IgG1抗體染色。通過FACSvantage分析10,000個(gè)活細(xì)胞。
圖8是一系列曲線圖，顯示了用各種濃度的重組可溶性TRAIL(空心圓)或親和純化的TRA-8(實(shí)心圓)誘導(dǎo)RA(A)和OA(B)滑膜細(xì)胞的代表株系細(xì)胞凋亡的隨TRAIL和TRA-8濃度而變的細(xì)胞生存力。細(xì)胞生存力以經(jīng)治療細(xì)胞的cpm相對于未經(jīng)治療細(xì)胞的cpm的百分比表示。
圖9是一系列曲線圖，顯示了RA滑膜細(xì)胞DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的caspase依賴性。將RA滑膜細(xì)胞(RA512)在存在各種濃度的caspase抑制劑的情況下與50ng/ml可溶性Fas配體(空心方形)、抗Fas抗體(CH-11)(實(shí)心方形)、可溶性TRAIL(空心圓)或抗DR5抗體(TRA-8)(實(shí)心圓)一起孵育。在培養(yǎng)過夜后，通過ATPLite測定細(xì)胞生存力。
圖10A是顯示NFκb激活的電泳凝膠變動分析。RA1016細(xì)胞與20ng/ml TNF-α、50ng/ml可溶性TRAIL或50ng/ml TRA-8一起孵育指定的時(shí)間，然后進(jìn)行電泳。圖10B和10C是顯示MMP-1和MMP-3產(chǎn)生的曲線圖。1×106/ml指定的RA滑膜細(xì)胞與指定濃度的TNF-α(空心圓)、TRAIL(空心三角)或TRA-8(實(shí)心圓)一起孵育。培養(yǎng)過夜后，收集培養(yǎng)上清液。通過ELISA測定培養(yǎng)上清液中MMP的水平。
圖11.TRA-8不誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性。(a)正常肝組織不表達(dá)DR5。制備兩種正常肝組織、一種肝細(xì)胞癌組織和HepG2細(xì)胞的cytospin制備物的石蠟切片，以供H&E染色，相應(yīng)的冷凍切片用TRA-8染色。(b)DR5細(xì)胞表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。從兩種正常肝組織和一例肝細(xì)胞癌組織分離的肝細(xì)胞、以及HepG2細(xì)胞用TRA-8、抗Fas抗體(DX2)或同種型對照抗體染色。實(shí)心直方圖表示TRA-8或DX2染色，而空心直方圖是相應(yīng)的同種型對照。
圖12.是TRAIL而非TRA-8誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性。將新鮮的正常人肝細(xì)胞保持在肝細(xì)胞培養(yǎng)基(Hepatocyte Culture Medium)中。(a)在指定的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)用1μg/ml可溶性TRAIL加上交聯(lián)劑或TRA-8誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡。細(xì)胞生存力通過ATPLite測定。結(jié)果以與培養(yǎng)基對照相比的活細(xì)胞百分比表示。陰影條帶指示TRAIL，而深色條帶代表TRA-8。(b)肝細(xì)胞的固縮核(condensed nuclei)用Hoechst 33352染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。(c)放線菌酮對肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。肝細(xì)胞在對照培養(yǎng)基中或加有1μg/ml TRAIL或TRA-8的培養(yǎng)基中在存在(實(shí)心條帶)或不存在(空心條帶)1μg/ml放線菌酮的情況下培養(yǎng)8小時(shí)。細(xì)胞生存力通過ATPLite測定。結(jié)果以兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值±SEM表示。(d)正常肝細(xì)胞對DR5和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性的比較。新鮮分離的肝細(xì)胞與指定濃度的可溶性TRAIL、TRA-8、可溶性FasL或抗Fas mAb CH11一起孵育6小時(shí)。細(xì)胞生存力通過ATPLite測定來測量。結(jié)果以與培養(yǎng)基對照相比的活細(xì)胞百分比表示。對于正常肝細(xì)胞，代表4個(gè)正常個(gè)體的平均值±SEM。得自一位患者的肝細(xì)胞癌細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值表示。
圖13.TRAIL誘導(dǎo)肝炎。給B6小鼠靜脈內(nèi)接種109pfu腺病毒載體，所述載體編碼“Tet-on”轉(zhuǎn)錄元件控制下的全長人TRAIL。TRAIL表達(dá)通過指定劑量的四環(huán)素來誘導(dǎo)。(a)肝中人TRAIL表達(dá)的RNA印跡分析。接種載體并用四環(huán)素誘導(dǎo)后24小時(shí)，從肝中分離出總RNA，并且用人TRAIL cDNA或β-肌動蛋白探測。(b)AST的血清水平。TRAIL轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)，測量AST血清水平。(c)TRAIL介導(dǎo)的腺病毒載體感染的肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡給B6小鼠靜脈內(nèi)接種四環(huán)素誘導(dǎo)型腺病毒載體。接種后48小時(shí)，分離得自接種小鼠和未接種對照小鼠的肝細(xì)胞，將其與指定濃度的TRAIL一起孵育8小時(shí)(左圖)。肝細(xì)胞的細(xì)胞生存力通過ATPLite測定來測量。48小時(shí)后，給接種上述腺病毒載體的小鼠靜脈注射10μg可溶性人TRAIL。在注射TRAIL后24小時(shí)，測量AST血清水平(右圖)。(d和e)TRAIL誘導(dǎo)的肝損傷的組織學(xué)分析。用TRAIL轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)(d)或7天(e)時(shí)收集肝臟。對石蠟切片進(jìn)行H&E染色，以100X(上圖)和400X(下圖)拍照。
圖14是一系列曲線圖，顯示了通過靜息細(xì)胞(空心)和活化細(xì)胞(陰影)的流式細(xì)胞術(shù)測定，從人PBMC純化的活化T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)增加水平的DR5。
圖15是圖14中所示的已經(jīng)用抗CD3或抗μ刺激48小時(shí)的純化T細(xì)胞和B細(xì)胞以及通過不同密度的Ficoll-Paque收集的活化細(xì)胞和母細(xì)胞的隨TRA-8濃度而變的生存力曲線圖。生存力通過ATPLite測定來測量。
圖16是直方圖和流式細(xì)胞術(shù)曲線圖，顯示了注射了人PBMC和TRA-8或IgG(對照)的NK細(xì)胞耗竭的NOD/SCID小鼠的門控淋巴細(xì)胞群體中的CD3表達(dá)。
圖17顯示了實(shí)施例13中詳述的小鼠脾組織的CD3和TUNEL染色的細(xì)胞顯微照片。
圖18顯示了慢性溶淋巴細(xì)胞性白血病(CCL)和正常人B細(xì)胞在TRA-8、BISVIII及其組合存在下的細(xì)胞毒性曲線圖。
發(fā)明詳述不能清除細(xì)胞是因?yàn)樵诩?xì)胞凋亡誘導(dǎo)系統(tǒng)中有與作為說明包括所述配體、受體或者胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子和效應(yīng)分子的表達(dá)或功能在內(nèi)的缺陷相關(guān)的缺陷。本發(fā)明提供了一種矯正缺陷型細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)系統(tǒng)以及闡述給定缺陷型細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)系統(tǒng)中具體缺陷的方法。
本發(fā)明涉及一類新的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有針對具體TRAIL受體(包括DR5、DR4、DcR1和DcR2)體內(nèi)和體外選擇性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。本發(fā)明可用作供細(xì)胞凋亡信號研究用的試劑以及有效針對表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞(作為說明包括廣泛類別的癌細(xì)胞、將所述細(xì)胞凋亡系統(tǒng)去調(diào)節(jié)以及自身免疫病的異常增殖滑膜細(xì)胞)的治療藥。按照本發(fā)明的抗體在結(jié)合特定類型TRAIL受體方面有特異性，盡管在它們之間有同源性。本發(fā)明抗體提供了僅表達(dá)靶TRAIL受體的細(xì)胞的靶向細(xì)胞凋亡，或者阻斷表達(dá)靶受體的細(xì)胞的TRAIL細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的抗DR5單克隆抗體可用作表達(dá)DR5的細(xì)胞凋亡的體外有效誘導(dǎo)物和細(xì)胞凋亡的體內(nèi)有效誘導(dǎo)物。移植到人源化抗體骨架的人源化片段CDR序列和本發(fā)明的融合蛋白抗DR5抗體表現(xiàn)出相似的細(xì)胞凋亡特性。
迄今為止，尚未得到與細(xì)胞表面DR5結(jié)合并且在體外和體外在缺乏交聯(lián)劑的情況下都誘導(dǎo)表達(dá)DR5的細(xì)胞凋亡的單克隆抗體。本發(fā)明包括在疾病的動物模型(例如異種移植動物)中或在體內(nèi)有效用作治療藥的抗DR5抗體。盡管已經(jīng)表明可溶性TRAIL在體內(nèi)有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但殺傷活性看來非常低，并且常常需要大劑量并且重復(fù)給藥(13)。按照本發(fā)明的一系列抗DR5抗體之一-TRA-8在攜帶人DR5轉(zhuǎn)基因的動物是藥用有效的，并且也可應(yīng)用于建立可供研究DR5和TRAIL作用的模型。
按照本發(fā)明，從實(shí)驗(yàn)動物收獲針對TRAIL受體產(chǎn)生的按照本發(fā)明的抗體。通過按照本發(fā)明將所述抗體人源化，以保持受體結(jié)合活性，而在人類受治療者體內(nèi)誘發(fā)減弱的且治療耐受的免疫應(yīng)答，本發(fā)明的人源化抗TRAIL受體抗體可用作給定TRAIL受體的治療性激動劑或拮抗劑。本發(fā)明作為體內(nèi)治療藥是有效的，因?yàn)椴恍枰獙⑺隹筎RAIL受體抗體進(jìn)行二次交聯(lián)。
本發(fā)明可延伸至具有激動性或拮抗性細(xì)胞凋亡效應(yīng)的單一抗TRAIL受體抗體之外。而是，使兩種或更多種抗TRAIL受體抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物在體外接觸或與受治療者機(jī)體組織在體內(nèi)接觸，以產(chǎn)生協(xié)同治療。例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和造血細(xì)胞系U937和Molt-4對協(xié)同暴露于激動性抗DR4抗體和抗DR5抗體有反應(yīng)，而僅暴露于激動性抗DR5抗體在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面僅表現(xiàn)出有限的成功。
另外，當(dāng)抗體特異性地結(jié)合誘餌受體之一-DcR1、DcR2或OPG時(shí)，拮抗性抗TRAIL受體抗體尤其可應(yīng)用于本發(fā)明中。用按照本發(fā)明抗體選擇性地封閉誘餌受體在表達(dá)誘餌受體的細(xì)胞類型中有使所述TRAIL結(jié)合平衡向能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號的TRAIL受體改變的效應(yīng)。因此，在按照本發(fā)明的另一種聯(lián)合治療中，誘餌受體結(jié)合抗體使表達(dá)細(xì)胞向轉(zhuǎn)導(dǎo)TRAIL受體結(jié)合的激動性細(xì)胞凋亡信號方向致敏。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種闡明給定TRAIL受體的激動性表位和拮抗性表位的方法。此外，按照本發(fā)明，通過利用一組分別具有不同可變區(qū)或CDR區(qū)的單克隆抗體，闡明個(gè)體之間與給定TRAIL受體相關(guān)的多態(tài)性。一組已表征的單克隆抗體提供了限定激動性和拮抗性表位和多態(tài)性的能力。因此，一組按照本發(fā)明的單克隆抗體可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和/或疾病傾向的受治療者篩選中。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案涉及包括與免疫球蛋白、多肽或其片段偶聯(lián)的TRAIL受體的抗原性片段的融合蛋白。TRAIL受體片段定義為含有足夠數(shù)目的堿基以誘發(fā)針對受治療者細(xì)胞表面上表達(dá)的天然TRAIL受體的免疫原性應(yīng)答。TRAIL受體融合片段包括至少10個(gè)氨基酸。免疫球蛋白融合蛋白或其片段在本文中被定義為包括具有足夠數(shù)目的氨基酸堿基以激活受治療者體內(nèi)的免疫原性級聯(lián)應(yīng)答的天然或合成蛋白或多肽區(qū)段。包括TRAIL受體片段與免疫球蛋白片段偶聯(lián)的融合體的本發(fā)明免疫原，可用作在受治療者體內(nèi)原位誘發(fā)抗TRAIL受體抗體的體內(nèi)治療藥。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明可有效作為基因治療。在本發(fā)明的一個(gè)基因治療方面，靶細(xì)胞用攜帶對應(yīng)于TRAIL受體的可表達(dá)序列的載體轉(zhuǎn)染。所述載體是常規(guī)的，并且根據(jù)靶細(xì)胞對所述載體的敏感性來選擇?；蛑委熭d體作為說明包括腺病毒載體pAdCMV5。當(dāng)靶細(xì)胞或靶組織表達(dá)所述轉(zhuǎn)染的TRAIL受體時(shí)，使所述細(xì)胞或組織暴露于按照本發(fā)明的特異性結(jié)合所述轉(zhuǎn)染的TRAIL受體的抗體。人們會認(rèn)識到，所述抗TRAIL受體抗體根據(jù)所需治療結(jié)果，或者是激動性抗體或者是拮抗性抗體。
本發(fā)明的抗體與致敏劑結(jié)合也有效。本文所用的致敏劑定義為包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的任何刺激，包括紫外光、具體包括雙吲哚馬來酰亞胺的有機(jī)分子、重金屬和自由基種類。
在惡性腫瘤治療方面，TRA-8在缺乏二次交聯(lián)時(shí)能夠以caspase依賴性方式誘導(dǎo)大多數(shù)TRAIL敏感型腫瘤細(xì)胞凋亡。TRA-8表現(xiàn)出強(qiáng)體內(nèi)殺腫瘤活性。TRA-8誘導(dǎo)大多數(shù)TRAIL敏感性細(xì)胞凋亡的能力，證實(shí)了單獨(dú)的DR5足以觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本文詳述的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面DR5，并且其對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性與其對TRAIL的敏感性相當(dāng)，表示DR5是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的主要死亡受體。因此，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞對DR5的差別表達(dá)在TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的選擇性方面起作用。TRA-8繞過所述誘餌受體，而誘導(dǎo)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而，僅少數(shù)TRAIL抗性腫瘤細(xì)胞對TRA-8敏感，表明所述誘餌受體看來在腫瘤細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抗性方面不起重要作用。
雖然先前的研究已經(jīng)表明在動物體內(nèi)系統(tǒng)給予可溶形式的TRAIL誘導(dǎo)腫瘤消退而不引起毒性3，4，22，但如本文所表明的，膜結(jié)合形式的人TRAIL在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)肝損傷。然而，正常肝細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的損傷的敏感性小于對Fas配體的敏感性，并且TRAIL在體內(nèi)沒有致死性，證明了TRAIL的肝毒性比Fas配體要小得多。因此，逐漸增量給予TRAIL可應(yīng)用于癌癥治療中。
如本文詳述的，表明正常肝細(xì)胞沒有顯著水平的DR5蛋白表達(dá)，并且與肝細(xì)胞抗TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。DR5與單克隆抗體交聯(lián)不足以構(gòu)建能夠觸發(fā)細(xì)胞凋亡的同源聚合形式的死亡受體。狨實(shí)驗(yàn)沒有顯示出TRA-8給予的肝毒性。因此，激動性單克隆抗DR5抗體作為治療藥有可能比可溶性TRAIL更具選擇性且更安全。
作為篩選測定，本發(fā)明非常適用于檢測仍表現(xiàn)出正常細(xì)胞形態(tài)的小的惡性腫瘤細(xì)胞簇。用標(biāo)記的按照本發(fā)明的抗體將包括肺癌、前列腺癌和肝癌在內(nèi)的人癌細(xì)胞的原位細(xì)胞切片染色，容易鑒定出癌細(xì)胞。觀測到與同一類型的正常細(xì)胞相比，這些癌細(xì)胞表達(dá)非常高水平的DR5。因此，本發(fā)明可用作至少包括肺、前列腺和肝的組織內(nèi)早期惡性腫瘤的靈敏的篩選方法。本文詳細(xì)描述了一種用于抑制與例如惡性癌和淋巴細(xì)胞性白血病的疾病相關(guān)的異常細(xì)胞增殖的治療方法。
本文詳細(xì)描述了本發(fā)明，尤其是命名為TRA-8的抗人DR5單克隆抗體，其ATCC保藏號為PTA-1428。人們會認(rèn)識到，關(guān)于激動性抗人DR5單克隆抗體TRA-8的詳細(xì)技術(shù)和結(jié)果是完全可延伸的，適用于拮抗性DR5抗體以及以激動性和拮抗性方式作用的針對DR4、DcR1和DcR2產(chǎn)生的抗體。
細(xì)胞凋亡受體(例如Fas)的表達(dá)水平不一定與所述細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性相關(guān)。對于TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，已提示TRAIL的誘餌受體的表達(dá)影響所述細(xì)胞的敏感性。此外，已提示在通過FADD和caspase 8途徑有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號方面，DR5一定與DR4相關(guān)。激動性抗DR5單克隆抗體的可得性，使得可以闡明DR5信號的調(diào)節(jié)及其在TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的相對作用。所述細(xì)胞對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性與其對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性的比較，提供了關(guān)于DR5在TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用以及可能影響敏感性的機(jī)制的深入了解。
這一優(yōu)點(diǎn)一般可延伸至本發(fā)明的人源化抗DR5抗體。通過在以下實(shí)施例中詳述的已知技術(shù)，制備抗DR-5抗體的一個(gè)分子克隆。重組DNA方法(33)在此中可有效地用來構(gòu)建編碼單克隆抗體分子或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸序列。
本發(fā)明使得可以構(gòu)建人源化抗TRAIL受體抗體，其中所述人源化抗體不太可能誘導(dǎo)人抗小鼠抗體(在下文稱為“HAMA”)應(yīng)答(34)，而仍具有有效的抗體效應(yīng)子功能。本文在抗體方面所用的術(shù)語“人”和“人源化”涉及預(yù)期在人類受治療者體內(nèi)誘發(fā)治療耐受性弱免疫原性應(yīng)答的任何抗體。
本發(fā)明提供一種抗DR5抗體、人源化抗DR5抗體、TRA-8重鏈和輕鏈免疫球蛋白和人源化重鏈和輕鏈免疫球蛋白。這些蛋白或基因的某些截短物可執(zhí)行所述全序列蛋白或基因的調(diào)節(jié)功能或酶功能。例如，編碼蛋白的核酸序列可以通過取代、添加、缺失或多聚表達(dá)加以改變，以提供功能等同的蛋白或基因。由于核酸編碼序列的簡并性，編碼與天然存在的蛋白基本相同的氨基酸序列的其它序列可以用于實(shí)施本發(fā)明。這些包括但不限于包括編碼上述多肽的完整核酸序列或其部分、通過編碼所述序列內(nèi)功能等同氨基酸殘基的不同密碼子的取代從而產(chǎn)生沉默變化而被改變的核酸序列。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(“CurrentMethods in Sequence Comparison and Analysis，”MacromoleculeSequencing and Synthesis，selected Methods and Applications，pp.127-149，1998，Alan R.Liss，Inc.)計(jì)算，預(yù)期按照本發(fā)明的免疫球蛋白的核苷酸序列可耐受至多25％的序列同源性變異，只要這種變異體構(gòu)成識別TRAIL受體DR5的有效抗體。例如，多肽序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被具有相似極性、用作功能等同物產(chǎn)生沉默改變的另一種氨基酸所取代。所述序列內(nèi)的氨基酸取代可以從所述氨基酸所屬類別的其它成員中進(jìn)行選擇。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的有在翻譯期間或之后差別修飾(例如通過糖基化、蛋白酶切、與抗體分子或其它細(xì)胞配體連接等)的蛋白質(zhì)或其片段或衍生物。另外，可以對編碼本發(fā)明抗DR5抗體的核酸序列的重組載體進(jìn)行工程改造，以修改載體的加工或表達(dá)。
另外，編碼抑制劑的核酸序列可以在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯序列、起始序列和/或終止序列，或在編碼區(qū)產(chǎn)生變異和/或形成新的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或破壞現(xiàn)有的所述位點(diǎn)，以進(jìn)一步促進(jìn)體外修飾?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于體外定點(diǎn)誘變，J.Biol.Chem.2536551、應(yīng)用Tab接頭(Pharmacia)等等。
X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)表明，抗體免疫球蛋白折疊一般形成一種長的圓柱形結(jié)構(gòu)，含有兩層分別由3條或4條b-鏈組成的反向平行的b-折疊片。在可變區(qū)中，來自H鏈和L鏈的各個(gè)V區(qū)的三個(gè)環(huán)聚集在一起，形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些環(huán)中的每個(gè)環(huán)稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。CDR的變異性在所述抗體的氨基酸序列中是最高的。并非CDR部分的可變區(qū)部分稱為“構(gòu)架區(qū)”(“FR”區(qū))，一般在維持CDR結(jié)構(gòu)方面起作用。最好將得自給定抗體的所有CDR都移植到受體抗體中，以便保留對于TRAIL受體表位區(qū)的結(jié)合區(qū)。預(yù)期將全部CDR中的一部分移植到供體中在此中是有效的。人們理解，移植一般需要將一個(gè)氨基酸或一個(gè)區(qū)的殘基用另一種氨基酸殘基取代。然而，有時(shí)尤其是轉(zhuǎn)移一個(gè)區(qū)時(shí)，可以根據(jù)需要添加或刪除或取代一個(gè)或多個(gè)殘基，這樣的缺失和插入以及合適的取代和倒位在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。
例如通過將抗TRAIL受體單克隆抗體的L鏈和H鏈亞基的每個(gè)CDR移植到人抗體的相應(yīng)CDR區(qū)中，從而將有效針對TRAIL受體的小鼠單克隆抗體人源化，獲得本發(fā)明的抗體。
采用已知的技術(shù)，構(gòu)建了含有所述分子獨(dú)特型的抗體片段，所述片段在此中也是有效的。例如，這類片段作為說明包括可以通過用胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生的抗TRAIL受體(AB’)2片段、通過還原所述TRAIL受體(AB’)2片段的二硫橋產(chǎn)生的TRAIL受體抗體AB’片段、以及通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理所述抗體分子產(chǎn)生的抗體片段。
具體地說，通過用人DR5免疫小鼠，隨后將得自所述小鼠的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合可以獲得雜交瘤，培養(yǎng)所述雜交瘤，可以獲得抗DR5單克隆抗體TRA-8。
單克隆抗體的制備作為說明包括下述步驟a)純化生物大分子，用作抗原；b)在采用注射所述抗原初次免疫動物，給所述動物放血，并且分析抗體效價(jià)以便確定何時(shí)取出脾臟之后，制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞；c)制備骨髓瘤細(xì)胞；d)將抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；e)選擇生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤；f)制備單細(xì)胞克隆(克隆)；g)任選地，培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞，或讓已經(jīng)移植有雜交瘤細(xì)胞的動物生長，以大規(guī)模地制備所述單克隆抗體；和h)測試如此制備的單克隆抗體的生物活性和特異性、或者分析標(biāo)記因子特性。
下面參考上述步驟詳細(xì)描述用于抗DR5單克隆抗體制備的方法。制備本發(fā)明抗體的方法僅僅是說明制備方法，并非是限制性的?？梢圆捎闷渌阎姆椒?，或者采用修改的方法，例如利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞，而不利用脾細(xì)胞和骨髓瘤。
(a)抗原的制備可有效作為所述抗原的重組蛋白(在下文稱為“重組人DR5”)通過以下步驟獲得通過利用ADENO-Quest試劑盒(QuantumBiotechnologies Inc.，Canada)，用包含人DR5胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1抗體(在下文稱為“IgG”)的Fc區(qū)的融合蛋白(參看PTA-1428)的表達(dá)載體pAdDR5-IgG轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞使其表達(dá)所述融合蛋白，收集并部分純化表達(dá)產(chǎn)物。質(zhì)粒pAdDR5-IgG通過將編碼人DR5和人IgG的融合蛋白的DNA插入pAdCMV5中構(gòu)建而成，該質(zhì)粒是一種用于動物細(xì)胞的表達(dá)載體。其它材料例如編碼DR5的DNA、所述載體和所述宿主在此中是有效的。
在用載體pAdDR5-IgG轉(zhuǎn)染的QBI-293A細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)的人DR5和IgG融合蛋白，通過A蛋白-Sepharose親和色譜或G蛋白-Sepharose親和色譜或采用Resource Q柱(商標(biāo)；Pharmacia)的離子交換色譜來部分純化。
或者，將得自人細(xì)胞系的細(xì)胞膜的純化DR5用作抗原。此外，由于DR5的一級結(jié)構(gòu)是已知的(參看PTA-1428)，所以可以通過已知方法，例如Sanger法化學(xué)合成包含SEQ ID No.1氨基酸序列的肽，并將其用作抗原。
(b)抗體生產(chǎn)細(xì)胞的制備用與佐劑(例如弗氏完全或不完全佐劑或氧化鋁)混合的步驟(a)中生產(chǎn)的免疫原免疫小鼠。其它合適的實(shí)驗(yàn)動物作為說明包括大鼠、豚鼠、兔、狗、雞、馬、豬、牛和羊。
免疫實(shí)驗(yàn)動物的合適給藥途徑包括皮下注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射和肌內(nèi)注射途徑，優(yōu)選皮下注射和腹膜內(nèi)注射。
免疫任選地通過一劑或以適當(dāng)間隔(最好1-5周)的數(shù)次重復(fù)劑量進(jìn)行。監(jiān)測經(jīng)免疫的動物的血清抗體效價(jià)，具有足夠高抗體效價(jià)的動物選擇作為抗體生產(chǎn)細(xì)胞源。選擇具有高效價(jià)的動物使得后續(xù)程序的效率更高。用于隨后融合的細(xì)胞一般從最后一次免疫后3-5天的動物中收獲。
分析抗體效價(jià)的方法包括各種眾所周知的技術(shù)，例如放射免疫測定(在下文稱為“RIA”)、固相酶免疫測定(在下文稱為“ELISA”)、熒光抗體測定和被動血凝測定，由于檢測靈敏度、快速、精確和自動化的潛力，優(yōu)選RIA和ELISA。
抗體效價(jià)的測定可以例如通過如下的ELISA進(jìn)行。首先，將經(jīng)純化或部分純化的DR5吸附至固相(例如96孔ELISA板)表面，然后用與抗原無關(guān)的蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)封閉尚未結(jié)合DR5的任何殘留表面。洗滌后，使孔表面與連續(xù)稀釋的小鼠血清樣品接觸，使得樣品中的抗DR5抗體能夠與所述抗原結(jié)合。加入作為第二抗體的酶標(biāo)抗小鼠抗體，以與小鼠抗體結(jié)合。洗滌后，加入酶底物，通過測定由于底物變化等引起的顯色所致的吸光度的變化，估計(jì)抗體效價(jià)。
(c)骨髓瘤細(xì)胞的制備得自已建立小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞用作骨髓瘤細(xì)胞來源，包括例如得自BALB/c的8-氮鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤株系P3X63Ag8U.1(P3-U1)(35)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(36)、Sp2/0-Ag14(SP-2)(37)、P3X63Ag8.653(653)(38)和P3X63Ag8(X63)(39)。將所選的細(xì)胞系順序轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基例如8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基中。8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基包括Iscove氏改進(jìn)的Dulbecco氏培養(yǎng)基(在下文稱為“IMDM”)或Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(在下文稱為“DMEM”)。在RPMI-1640培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、胎牛血清(在下文稱為“FCS”)和8-氮鳥嘌呤。然后，在融合前3-4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基例如含有10％FCS的ASF104培養(yǎng)基(Ajinomoto，K.K.)中，以確保在融合當(dāng)天可得到至少2×107細(xì)胞。
(d)細(xì)胞融合得自所述動物任何合適部分的淋巴細(xì)胞和血漿細(xì)胞是生產(chǎn)所述抗體的祖細(xì)胞。淋巴細(xì)胞或血漿細(xì)胞來源作為說明包括脾、淋巴結(jié)、外周血或任何其合適的組合，脾細(xì)胞是最常用的來源。
在最后一次加強(qiáng)注射后，從具有預(yù)定抗體效價(jià)的小鼠中取出存在抗體生產(chǎn)細(xì)胞的組織。目前用于脾細(xì)胞與在步驟c)中制備的骨髓瘤細(xì)胞融合的合適技術(shù)利用聚乙二醇。
所述融合技術(shù)包括用無血清培養(yǎng)基(例如RPMI 1640)或磷酸緩沖鹽溶液(在下文稱為“PBS”)洗滌脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，使得脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)目比率約為5∶1至10∶1，然后離心。在棄去上清液并使沉淀細(xì)胞充分松散后，滴加1ml含有50％(w/v)聚乙二醇(m.w.1,000-4,000)的無血清培養(yǎng)基并且混合。隨后，緩慢加入10ml無血清培養(yǎng)基，然后離心。再次棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞懸浮于適量的含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的溶液和小鼠白介素-2(在下文稱為“IL-2”)的HAT培養(yǎng)基(在下文稱為“HAT”)中。然后將懸浮液加入到培養(yǎng)板(在下文也簡稱為“板”)的各孔中，在5％v/v CO2存在下、于37℃培養(yǎng)約2周，可適當(dāng)?shù)貙AT培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充添加。
(e)雜交瘤的選擇當(dāng)采用的骨髓瘤株系抗8-氮鳥嘌呤，即它的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)有缺陷時(shí)，任何非融合的骨髓瘤細(xì)胞和任何骨髓瘤-骨髓瘤融合體都不能在HAT培養(yǎng)基中存活。另一方面，抗體生產(chǎn)細(xì)胞相互之間的融合體以及抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤可以存活，前者僅有有限的壽命。因此，在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致僅選擇所需的雜交瘤。
將所得的雜交瘤培養(yǎng)為集落，然后將其轉(zhuǎn)移到缺乏氨基蝶呤的HAT培養(yǎng)基(HT培養(yǎng)基中)。此后，取出等份的培養(yǎng)上清液，以通過例如ELISA測定抗Fas抗體效價(jià)。當(dāng)將上述融合蛋白用作ELISA抗原時(shí)，也必需消除生產(chǎn)與人IgG1的Fc區(qū)特異性結(jié)合的抗體的克隆。這種克隆的存在與否可以例如采用Fas-IgG1或IgG1作為抗原通過ELISA加以證實(shí)。
(f)克隆然后，將采用與步驟(b)中測定抗體效價(jià)的方法相似的方法表明生產(chǎn)特異性抗體的雜交瘤，轉(zhuǎn)移到另一板中以供克隆。合適的克隆方法包括有限稀釋法，其中將雜交瘤稀釋，使得板的各孔含有一個(gè)細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)；軟瓊脂法，其中在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)后回收集落；采用顯微操作器來分離單細(xì)胞以供培養(yǎng)的方法；和“分選-克隆(sort-a-clone)”，其中通過細(xì)胞分選器分離單細(xì)胞。
對于顯示出一定抗體效價(jià)的每個(gè)孔，將按照例如有限稀釋法的克隆程序重復(fù)2-4次，選擇具有穩(wěn)定抗體效價(jià)的克隆作為抗DR5單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤。生產(chǎn)抗小鼠DR5抗體的雜交瘤通過與獲得抗DR5單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的相似方法來選擇。
作為本發(fā)明抗體基礎(chǔ)的小鼠-小鼠雜交瘤TRA-8于2000年3月1日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)，保藏號為PTA-1428。因此，當(dāng)利用小鼠-小鼠雜交瘤TRA-8或任何其它已建立的雜交瘤制備抗體時(shí)，可以采用省去步驟(a)-(f)、從以下步驟(g)開始的程序來進(jìn)行制備。
(g)培養(yǎng)雜交瘤以制備單克隆抗體然后將通過克隆獲得的雜交瘤培養(yǎng)在正常培養(yǎng)基中，而非培養(yǎng)在HT培養(yǎng)基中。用大培養(yǎng)瓶通過滾瓶培養(yǎng)，或者通過旋動培養(yǎng)，進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。然后收獲得自大規(guī)模培養(yǎng)的上清液，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適方法例如凝膠過濾進(jìn)行純化，以獲得作為本發(fā)明抗體基礎(chǔ)的抗DR5單克隆抗體。雜交瘤也可以在同源小鼠(例如BALB/c小鼠或nu/nu小鼠)腹膜內(nèi)生長，以獲得含大量抗DR5單克隆抗體的腹水?？梢苑奖愕赜檬惺蹎慰寺】贵w純化試劑盒(例如，MAbTrap GII Kit；Pharmacia)來純化所收獲的抗體。
如上制備的單克隆抗體對人DR5具有高度特異性。
(h)單克隆抗體的測定所述單克隆抗體的同種型和亞類的合適鑒定方法包括Ouchterlony法、ELISA和RIA。最好使用市售試劑盒進(jìn)行鑒定，例如使用Mouse Typer Kit(商標(biāo)；BioRad)。
可以通過Folin-Lowry法或通過基于280nm吸光度的計(jì)算(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)，進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
所述單克隆抗體所識別的表位的鑒定如下進(jìn)行。首先，制備單克隆抗體所識別的分子的各個(gè)部分結(jié)構(gòu)。所述部分結(jié)構(gòu)通過其中用已知的寡肽合成技術(shù)合成制備所述分子的各個(gè)部分肽的方法、或者其中將編碼所需部分多肽的DNA插入合適的表達(dá)質(zhì)粒中、然后在合適宿主(例如大腸桿菌)中表達(dá)以生產(chǎn)所述肽的方法來制備。一般而言，為達(dá)到上述目標(biāo)，這兩種方法常常結(jié)合使用。例如，通過已建立的遺傳工程技術(shù)，可以制備從所述抗原蛋白的C末端或N末端開始適當(dāng)減小長度的一系列多肽。通過確定所述片段與所述抗體反應(yīng)，獲得近于理想的所述表位部位。
通過用已建立的寡肽合成技術(shù)合成各種各樣的對應(yīng)于所述肽的較小的寡肽或其突變體，以測定所肽對作為制備本發(fā)明抗體基礎(chǔ)的抗DR5單克隆抗體的結(jié)合特性以及所述肽與所述單克隆抗體對抗原結(jié)合的競爭性抑制，可以更加精細(xì)地鑒定出所述表位。可以方便地用市售試劑盒例如SPOTs Kit(Genosys Biotechnologies，Inc.)和基于multipin合成法的一系列multipin肽合成試劑盒(Chiron Corp.)，獲得種類繁多的寡肽。
本發(fā)明的抗體具有下述各種功能特性a)-f)，每種特性通過例如下文所述方法得以證實(shí)。
a)TRA-8與表達(dá)人DR5的細(xì)胞的特異性結(jié)合本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)特特征是結(jié)合細(xì)胞表面DR5的能力。這通過表達(dá)DR5的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析來證明。首先，采用用編碼人DR5的全長cDNA轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，證明DR5的特異性細(xì)胞表面結(jié)合。具體地說，TRA-8僅識別用DR5轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，而不識別用空對照載體或編碼DR4的載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞。其次，測試三種不同來源-造血譜系、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和前列腺癌的人類惡性腫瘤細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞中的大多數(shù)表達(dá)顯著水平的細(xì)胞表面DR5，雖然表達(dá)水平變異很大。第三，檢查得自RA患者和OA患者的兩組人原代滑膜成纖維細(xì)胞。與OA細(xì)胞相比，所有RA滑膜細(xì)胞均表達(dá)顯著更高水平的DR5。
b)在缺乏交聯(lián)時(shí)人惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的體外誘導(dǎo)在細(xì)胞體外培養(yǎng)期間，用各種濃度的抗體，尤其是TRA-8，通過細(xì)胞生存力測定(ATPLite)，測定按照本發(fā)明產(chǎn)生的抗體識別TRAIL受體并且直接誘導(dǎo)人惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。對于某些細(xì)胞，TRA-8顯示出強(qiáng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，例如TRA-8能夠在pg/ml水平內(nèi)誘導(dǎo)人Jurkat細(xì)胞凋亡。重要的是，TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不需要交聯(lián)，在大多數(shù)細(xì)胞中，TRA-8表現(xiàn)出在存在增強(qiáng)劑時(shí)比重組可溶性TRAIL更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
c)TRA-8的體內(nèi)殺腫瘤活性在兩種SCID/人腫瘤細(xì)胞模型中評估TRA-8殺腫瘤活性。首先，給SCID小鼠靜脈內(nèi)接種人白血病Jurkat細(xì)胞，用一劑(100μg)TRA-8治療。結(jié)果表明，經(jīng)Jurkat細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析和原位免疫組織化學(xué)染色測定，通過用TRA-8治療，大多數(shù)移植的Jurkat細(xì)胞從外周血和脾中消除。其次，在SCID小鼠中皮下接種人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞1321N1，用一劑TRA-8治療帶有腫瘤的小鼠。根據(jù)腫瘤大小和組織學(xué)分析確定，在TRA-8治療的小鼠中移植的1321N1細(xì)胞的生長受到顯著抑制。
d)用TRA-8鑒定RA滑膜細(xì)胞測試了從8位RA患者和4位OA患者分離的原代滑膜細(xì)胞的DR5細(xì)胞表面表達(dá)。TRA-8能夠使所有RA細(xì)胞染色陽性，但對于所有OA細(xì)胞染色為陰性。因此，通過用TRA-8檢測DR5的表面表達(dá)，可以區(qū)別RA與OA。
e)TRA-8對RA滑膜成纖維細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)在存在各種濃度TRA-8的情況下體外培養(yǎng)期間，通過細(xì)胞生存力測定，測定TRA-8誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡的能力。所有RA細(xì)胞都表現(xiàn)出對100ng/ml TRA-8高水平至中等水平的敏感性。相反，所有OA細(xì)胞基本上都對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抗性。重要的是，TRA-8表現(xiàn)出比可溶性TRAIL加增強(qiáng)劑更好的對RA滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。此外，與抗Fas抗體(CH-11)相比，TRA-8表現(xiàn)出對RA滑膜細(xì)胞更強(qiáng)的選擇性。
f)TRA-8在RA滑膜細(xì)胞中不誘導(dǎo)MMP的產(chǎn)生由于TRA-8與TNF-α一樣，能夠在RA滑膜細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-kb激活，所以測定了TRA-8對滑膜細(xì)胞產(chǎn)生MMP1和MMP3的影響。雖然TNF-α誘導(dǎo)MMP的劑量依賴性增加，但TRA-8不能誘導(dǎo)任何MMP產(chǎn)生，在某些濃度下，TRA-8略微減少RA滑膜細(xì)胞中MMP的產(chǎn)生。
g)TRA-8誘導(dǎo)多種caspase活化由于caspase在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，所以在人Jurkat細(xì)胞中測定TRA-8誘導(dǎo)caspase活化的能力。當(dāng)將Jurkat細(xì)胞與低劑量(50ng/ml)TRA-8一起孵育時(shí)，通過蛋白質(zhì)印跡分析和caspase切割分析確定，在早至孵育后15分鐘，觀測到caspase 8、caspase 9和caspase 3的活化。就caspase活化的時(shí)間、數(shù)量和強(qiáng)度而論，本發(fā)明的抗體包括說明性抗體TRA-8表現(xiàn)出比任何其它已知的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)抗體(例如抗人Fas抗體(CH-11))好得多的活性。
因此，本發(fā)明的抗體是具有如效應(yīng)(a)和(g)中所示的選擇性誘導(dǎo)致病細(xì)胞凋亡特性的物質(zhì)。因此，它可用作用于與細(xì)胞不當(dāng)存活或細(xì)胞不當(dāng)增殖相關(guān)疾病的預(yù)防藥和治療藥，所述疾病例如可歸因于細(xì)胞凋亡系統(tǒng)包括Fas/Fas配體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常的那些疾病。
通過在添加試驗(yàn)樣品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞例如人白血病細(xì)胞系Jurkat(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號TIB-152(American TypeCulture No.TIB-152))和星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系1321N1，并且通過例如ATPLite測定測量生存力，證實(shí)本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。
本發(fā)明的抗體，尤其是對人類的免疫原性與人抗體幾乎相同的抗DR5抗體，可用作與細(xì)胞不當(dāng)存活或不當(dāng)增殖相關(guān)疾病的預(yù)防藥或治療藥，所述疾病包括可歸因于自身免疫病中細(xì)胞凋亡系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常的那些疾病，所述疾病作為說明包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本病(Hashimoto’s disease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、斯耶格倫綜合征、惡性貧血、艾迪生病(Addison disease)、硬皮病、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture’s syndrome)、局限性回腸炎、自身免疫性溶血性貧血、不育癥、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、巴塞多病(Basedow’s disease)、血小板減少性紫癜、胰島素依賴性糖尿病、變態(tài)反應(yīng)、特發(fā)性疾病、動脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球性腎炎、再生不良性貧血、器官移植后的排斥以及肺、前列腺、肝、卵巢、淋巴組織和乳房組織的許多惡性腫瘤。
這種預(yù)防藥或治療藥可以以各種形式給予。合適的給藥模式包括口服給藥，例如通過片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑和糖漿劑給予，或者通過胃腸外給藥，例如通過注射、滴注和栓劑給藥。
所述抗體或治療藥可以經(jīng)口服、直腸、腦池內(nèi)、腦室內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、陰道內(nèi)、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)、局部(散劑、軟膏劑或滴劑)、通過腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、通過吸入或作為頰或鼻噴霧劑給予。所述抗體或治療藥的實(shí)際所需用量將根據(jù)受治療者而變化，取決于受治療者的年齡、體重、一般健康狀況、待治療疾病的嚴(yán)重程度、腫瘤的位置和大小、所用的具體化合物、給藥模式等。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅用本文給出的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以確定合適的量?？贵w典型的單劑量范圍為0.1-10,000微克，最好是1-100微克。載體中典型的抗體濃度的范圍為給予的每毫升0.2-2000納克。
根據(jù)計(jì)劃的給藥模式，所述抗體或治療藥可以在固體、半固體或液體劑型的藥用組合物中，所述劑型例如片劑、栓劑、丸劑、膠囊劑、散劑、液體或懸浮劑，最好為適用于一次給予精確劑量的單位劑型。所述組合物將包括有效量的所選基質(zhì)(substrate)以及藥學(xué)上可接受的載體，另外可以包括其它藥物、藥用試劑、載體或稀釋劑。所謂“藥學(xué)上可接受的”是指不是生物學(xué)希望有的或者在其它方面不希望有的物質(zhì)，所述物質(zhì)可以與所選基質(zhì)一起給予個(gè)體，而不引起顯著的不希望有的生物學(xué)效應(yīng)或以有害方式與所述藥用組合物中所含有的任何其它成分相互作用。
適用于胃腸外注射的組合物可以包含生理上可接受的無菌水性或非水溶液、分散體、懸浮液或乳液以及適用于重建為無菌注射用溶液或分散體的無菌粉末。合適的水性或非水載體、稀釋劑、溶劑或溶媒的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇類(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機(jī)酯，例如油酸乙酯?？梢岳缋冒吕缏蚜字⑼ㄟ^在分散體的情況下保持所需的粒徑以及利用表面活性劑，可以維持合適的流動性。
這些組合物也可以含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。用各種抗細(xì)菌藥和抗真菌藥例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，確保防止微生物的作用。也可能需要包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。注射用藥物形式的延長吸收可以利用延遲吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠來達(dá)到。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這類固體劑型中，活性化合物與至少一種惰性常規(guī)賦形劑(或載體)例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣或以下物質(zhì)混合(a)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠，(c)濕潤劑，例如甘油，(d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽和碳酸鈉，(e)溶液阻滯劑(retarder)，例如石蠟，(f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物，(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和甘油一硬脂酸酯，(h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土，和(i)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或其混合物。就膠囊劑、片劑和丸劑而論，所述劑型也可以包含緩沖劑。
相似類型的固體組合物也可以用作利用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等的賦形劑的軟和硬填充明膠膠囊中的填充劑。
諸如片劑、糖錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑的固體劑型可以用包衣和殼體制備，例如腸溶衣和本領(lǐng)域已知的其它包衣劑。它們可以含有遮光劑，也可以是這樣的組合物，使得它們在腸道的某一部分以延遲方式釋放一種或多種所述活性化合物?？梢允褂玫陌窠M合物的實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟。如果合適，所述活性化合物也可以為具有一種或多種上述賦形劑的微囊形式。
用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除所述活性化合物外，所述液體劑型可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油，特別是棉子油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯或這些物質(zhì)的混合物等。
除這類惰性稀釋劑外，所述組合物還可以包括輔料，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。
混懸劑除含有所述活性化合物外，還可以含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、氫氧化鋁(aluminium metahydroxide)、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠或這些物質(zhì)的混合物等。
用于直腸給藥的組合物最好是栓劑，所述栓劑可以通過將本發(fā)明的化合物與合適的非刺激性賦形劑或載體(例如可可脂、聚乙二醇或栓劑用蠟)混合，所述賦形劑或載體在常溫下為固體，但在體溫下為液態(tài)，因此溶于直腸或陰道腔中并釋放所述活性化合物。
用于局部給予本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、噴霧劑和吸入劑。根據(jù)需要，所述活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體和任何防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。眼用制劑、眼用軟膏劑、散劑和溶液劑也被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺和前體藥物”是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的本發(fā)明化合物的那些羧酸鹽、氨基酸加成鹽、酯、酰胺和前體藥物，它們適用于與患者組織接觸，而沒有過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)等，與合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比率相稱，對于其計(jì)劃的用途是有效的，合適時(shí)也是指本發(fā)明化合物的兩性離子形式。術(shù)語“鹽”是指本發(fā)明化合物的相對無毒的無機(jī)和有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可以在所述化合物的最后分離純化期間就地制備，或者通過單獨(dú)將游離堿形式的純化化合物與合適的有機(jī)酸或無機(jī)酸反應(yīng)，然后分離由此生成的鹽。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘甲酸鹽、甲磺酸鹽、葡糖庚酸鹽、乳糖酸鹽、甲磺酸鹽和十二烷基磺酸鹽等。這些可以包括基于堿金屬和堿土金屬例如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等的陽離子、以及無毒銨、季銨和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。(參見例如S.M.Barge等，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.，1977，661-19，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。)術(shù)語“前體藥物”是指在體內(nèi)血液中例如通過水解容易被迅速轉(zhuǎn)化產(chǎn)生上式母體化合物的化合物。在T.Higuchi和V.Stella，“Pro-drugsas Novel Delivery Systems，”A.C.S.Symposium Series Vol.14和Bioreversible Carriers in Drug Design，Edward B.Roche編著，AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中提供了全面的論述。
靶細(xì)胞是一種動物細(xì)胞，所述動物作為說明包括人類、非人類靈長類、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、牛、馬、雞、豬、狨和雪貂。
另外，本發(fā)明的抗體或治療藥可以以非溶劑化以及溶劑化形式與藥學(xué)上可接受的溶劑(例如水、乙醇等)一起存在。一般而言，對于本發(fā)明目的而言，溶劑化形式被認(rèn)為與非溶劑化形式等同。
通過已知的技術(shù)純化抗體分子，所述技術(shù)作為說明包括氨基吸收或氨基親和色譜、色譜技術(shù)例如高壓液相色譜或其組合。
本發(fā)明的另一方面包括用于將生物活性抗TRAIL受體抗體或人源化抗TRAIL受體抗體傳遞至脊椎動物的藥物制品。藥物制品包括藥用有效量的抗TRAIL受體抗體或其片段、一種藥學(xué)上可接受的載體和一個(gè)以無菌方式裝有所述載體和所述抗體的容器。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，藥用有效量的抗DR5抗體通過與靶細(xì)胞接觸，抑制細(xì)胞增殖。識別DR5的抗體或識別DR5的人源化抗體的藥用有效量是給予個(gè)體的足以引起所需效應(yīng)的量。給予藥用有效量的DR5識別抗體的所需效應(yīng)包括靶細(xì)胞死亡、對靶細(xì)胞的生長抑制、刺激DR5、與DR5結(jié)合以及提高靶細(xì)胞中NFκB水平或活性。靶細(xì)胞是表達(dá)DR5的細(xì)胞，作為說明包括異常生長的細(xì)胞和腫瘤，例如乳頭瘤和疣；乳癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞瘤、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、子宮癌和腦部腫瘤例如星形細(xì)胞瘤。在體內(nèi)，所述靶細(xì)胞是患有病理病癥的個(gè)體的細(xì)胞，所述病癥包括其中細(xì)胞增殖異?；蛘{(diào)節(jié)異常的那些病癥，例如惡性腫瘤或良性腫瘤以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶細(xì)胞也接觸治療藥。
治療藥是有效緩解病理病癥的化合物或組合物。治療藥的一個(gè)說明性實(shí)例包括抗腫瘤化合物。
抗腫瘤化合物是有效抑制異常生長細(xì)胞的生長或使生長停滯的化合物或組合物?？鼓[瘤化合物的藥用有效量是給予個(gè)體的足以使得異常生長細(xì)胞的生長受到抑制或阻滯的量?？鼓[瘤化合物的說明性實(shí)例包括博來霉素、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、放線菌素D、己烯雌酚多柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法侖、氨甲蝶呤、絲裂霉素、6-巰基嘌呤、替尼泊苷、6-硫代鳥嘌呤、長春新堿和長春堿?？鼓[瘤化合物和治療藥的其它實(shí)例可在下述文獻(xiàn)中找到The Merck Manua of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等編著，1987，Rahway，N.J.和Sladek等Metabolism andAction of Anti-Cancer Drugs，1987，Powis等編著，Taylor and Francis，New York，N.Y.。
本發(fā)明的抗體可以進(jìn)一步與其它療法例如化學(xué)療法和放射療法聯(lián)合治療惡性腫瘤，治療功效可以用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)化合物例如雙吲哚基馬來酰亞胺VIII來增強(qiáng)。
與先前公布的抗DR5抗體(24)相比，本發(fā)明的說明性TRA-8抗體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性非常強(qiáng)，并且在體外能夠以pg/ml水平誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，且在體內(nèi)證明殺腫瘤活性優(yōu)于先前報(bào)道的可溶性TRAIL。靜脈給予一劑TRA-8足以抑制實(shí)體瘤和造血腫瘤細(xì)胞的生長，而用可溶性TRAIL誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤消退則需要相當(dāng)高的劑量(每天500ug，給予10天)。本發(fā)明的抗TRAIL受體抗體看來與可溶性TRAIL一樣安全，因?yàn)槭纠钥贵wTRA-8并不誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的載體包括一段與調(diào)控元件(例如啟動子或增強(qiáng)子)有效連接的編碼抗DR5抗體免疫球蛋白重鏈或輕鏈的核酸序列?！坝行нB接”是指所構(gòu)成的核酸序列的布置使得可執(zhí)行其正常功能。因此，與編碼多肽的核苷酸序列有效連接的調(diào)控元件能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和/或所述多肽的翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，單一載體任選地包括抗DR5抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈兩者的編碼序列。
下文敘述以下實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的方法和結(jié)果。這些實(shí)施例并非包括本發(fā)明的所有方面，而是說明代表性的方法和結(jié)果。這些實(shí)施例并不排除對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的本發(fā)明的等同方案和變化。實(shí)施例1.DR5抗原的制備1.1DR5 cDNA的克隆通過以下RT-PCR法，采用以下物質(zhì)和反應(yīng)，克隆編碼人DR5蛋白的DNAa)模板通過采用TRIzol試劑(GIBCO BRL)提取HeLa細(xì)胞的總RNA。用于PCR反應(yīng)的模板使用通過用第一鏈cDNA合成試劑盒(the First-Strand cDNA synthesis kit)(Amersham Pharmacia Biotech)按照試劑盒中提供的說明手冊獲得的cDNA。
b)PCR引物合成用于PCR的下述寡核苷酸引物5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’(DR5p1SEQ ID No.1)；5’-ccactgggtgatgttggatggg-3’(DR5p2SEQ ID No.2)；
除非另有說明，否則在這些實(shí)施例中的所有寡核苷酸都由Lifetechnologies合成。所有的寡核苷酸在溶于蒸餾水后都貯存于-20℃。
c)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)溶液的組成模板cDNA，總共33μl反應(yīng)物中的5μl引物DR5p1，10pmol；引物DR5p2，10pmol；10×濃縮PCR緩沖液(試劑盒中提供的)，10μl；dNTPs(各2.5mM)，4μl；和Taq聚合酶(Promega)，5單位。
將無菌蒸餾水加入到所述溶液中，至總體積為100μl。除非另有說明，否則dNTPs為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩爾混合物(每種2.5mM)。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱2分鐘，此后將加熱至94℃30秒、52℃1分鐘和72℃3分鐘的循環(huán)重復(fù)40次。完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱10分鐘。
如此獲得的擴(kuò)增DNA片段在含有0.25μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分離。用剃刀刀片將確定含有所需DNA片段的條帶切下，用Gene Clean試劑盒(BIO101)從中回收所述DNA。用TA克隆試劑盒(TACloning Kit)(Invitrogen，CA)克隆所述DNA片段。這一步如下進(jìn)行。
將從PCR反應(yīng)溶液中回收的DNA片段同TA克隆試劑盒中提供的50ng pCR2.1載體一起與其中加有4單位T4 DNA連接酶(1μl)的1μl 10×連接酶反應(yīng)緩沖液(6mM Tris-HCl(pH 7.5)、6mM氯化鎂、5mM氯化鈉、7mM β-巰基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亞精胺和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合。用無菌去離子水將混合物的總體積調(diào)至10μl，將所得的連接酶溶液于14℃保溫15小時(shí)。此后，將2μl連接酶反應(yīng)溶液加入到其中加入2μl 0.5M β-巰基乙醇的50μl感受態(tài)大腸桿菌菌株TOP10F’中，該菌株由TA克隆試劑盒提供，并且按照說明手冊使其成為感受態(tài)，將所得混合物在冰上保持30分鐘，然后于42℃保持30秒，再于冰上保持5分鐘。接著，將500μl含有2％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖的培養(yǎng)基(在下文稱為“SOC”培養(yǎng)基)加入到培養(yǎng)物中，將混合物于37℃振蕩孵育1小時(shí)。此后，將培養(yǎng)物涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素的L-肉湯瓊脂平板(1％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.5％w/v氯化鈉、0.1％w/v葡萄糖和0.6％w/v細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Difco))上。選擇在平板上出現(xiàn)的氨芐青霉素抗性菌落，用鉑接種環(huán)將其刮下，在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-肉湯培養(yǎng)基中于37℃下以200r.p.m.振蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，通過離心收獲細(xì)胞，用堿法從中制備質(zhì)粒DNA。將得自如此獲得的質(zhì)粒的EcoRI-EcoRIDR5cDNA片段亞克隆到pcDNA3質(zhì)粒(Invitrogen，CA)中。對pcDNA3中的全長DR5基因測序，該基因匹配已公布的序列。將如此獲得的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pcDNA3-DR5。
1.2DR5-IgG表達(dá)載體的構(gòu)建為了獲得可溶性形式的缺乏跨膜域的人DR5，構(gòu)建一種表達(dá)質(zhì)粒載體。這種載體被設(shè)計(jì)為編碼包含與人IgG1 Fc DNA融合的人DR5胞外域的融合蛋白(41)。編碼缺乏跨膜域的人DR5的DNA通過以下PCR反應(yīng)獲得。
a)模板用于該P(yáng)CR反應(yīng)的模板利用pcDNA3-DR5。
b)PCR引物合成用于PCR的下述寡核苷酸引物5’-gacgatgcccgatctactttaaggg-3’(DR5p1SEQ ID No.1)；5’-ggatccgtggacacattcgatgtc-3’(DR5p3SEQ ID No.3)；除非另有說明，否則在這些實(shí)施例中的所有寡核苷酸都由Lifetechnologies合成。所有的寡核苷酸在溶于蒸餾水后都貯存于-20℃。
c)PCR反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照實(shí)施例1.1(c)分離擴(kuò)增的DNA。
如此獲得的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pCR-ΔDR5。將從pmFas-hIgG1Fc中回收的編碼人Fc片段的BamHI-EcoRI片段亞克隆到pcDNA3的BamHI和EcoRI多克隆位點(diǎn)中。如此獲得的質(zhì)粒命名為pcDNAFc。此外，將從pCR-ΔDR5中回收的編碼可溶性人DR5區(qū)的BamHI-BamHI片段亞克隆到pcDNAFc質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)中。如此獲得的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pcDNAΔDR5-Fc。利用DNA聚合酶克列諾片段(GIBCO BRL)，將從pcDNAΔDR5-Fc質(zhì)粒中回收的編碼可溶性人DR5-人IgG Fc區(qū)的EcoRI片段平端化，然后亞克隆到用BamHI切割后平端化的穿梭載體pAdCMV5(Quantum Biotechnologies Inc.，Canada)中。如此獲得的質(zhì)粒命名為pAdΔDR5-Fc。
1.3人DR5-IgG1融合蛋白的表達(dá)和純化用ADENO-Quest試劑盒(Quantum Biotechnologies Inc.，Canada)，按照說明手冊，用pAdΔDR5-Fc和QBI-病毒DNA(由ADENO-Quest試劑盒提供)共轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞(由ADENO-Quest試劑盒提供)。培養(yǎng)重組病毒噬斑，并且通過上清液的ELISA分析，根據(jù)DR5-IgG融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行篩選。陽性噬斑在QBI-293A細(xì)胞中擴(kuò)增，并作為病毒儲備液貯存于-80℃。50個(gè)平皿(150mm)的QBI-293A細(xì)胞用pAdADR5-Fc重組病毒以10m.o.i.(感染復(fù)數(shù))轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲培養(yǎng)基。
通過在500ml含有10％v/v FCS的DMEM(GIBCO)培養(yǎng)基中于37℃、5％v/v CO2環(huán)境下培養(yǎng)2天，讓具有DR5-IgG基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長至1×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。然后將培養(yǎng)物離心(1,000r.p.m.，5分鐘)，并收集上清液。用A蛋白-Sepharose CL-4B親和色譜(Pharmacia)在以下條件下達(dá)到從上清液中純化DR5-IgG
柱子A蛋白-Sepharose CL-4B柱(柱大小2ml；Pharmacia)；洗脫緩沖液0.1M甘氨酸(pH2.4)，0.15M NaCl；中和緩沖液1M Tris-HCl(pH8.5)。
在將所有上清液上樣至柱子后，用20ml PBS洗滌3次，然后加入10次1ml洗脫緩沖液。測量每個(gè)洗脫流分(1ml)的光密度。收集第二流分至第五流分(OD280≥0.1)，加入100μl中和緩沖液后，將流出液分別置于在透析管中，將流出液對1升PBS(pH7.5)于4℃透析。更換透析緩沖液兩次。
然后，通過ELISA分析流出液中DR5-IgG基因產(chǎn)物的表達(dá)。首先，將100μl每個(gè)流分分別置于96孔微量培養(yǎng)板(Costar)的各孔中，于37℃保溫1小時(shí)。此后，除去各孔中的溶液，平板用100μl/孔含有0.1％v/v Tween 20的PBS(在下文稱為“PBS-Tween”)洗滌3次。洗滌后，以100μl/孔的量加入含有2％w/v牛血清白蛋白(在下文稱為“BSA”)的PBS之后，將平板于37℃保溫1小時(shí)。此后，各孔用100μl/孔PBS-Tween再洗滌3次，此后向各孔中加入100μl/孔用PBS-Tween稀釋1000倍的抗人IgG1單克隆抗體溶液，將平板再次于37℃保溫1小時(shí)。然后各孔用100μl/孔PBS-Tween洗滌3次。然后以100μl/孔的量加入3，3’，5，5’-四甲基-聯(lián)苯胺(在下文稱為“TMB”)液體底物系統(tǒng)(Sigma)，讓平板于室溫靜置5分鐘，然后加入100μl/孔0.2N H2SO4終止反應(yīng)。讀出各孔450nm的吸光度，用650nm的吸光度作為對照讀數(shù)，估計(jì)結(jié)合抗體的濃度。用微量培養(yǎng)板讀出儀(Molecular Devices)測量吸光度。采用這種ELISA法證實(shí)DR5-IgG1的產(chǎn)生。用蛋白質(zhì)印跡分析，其中用抗人IgG1 mAb(Sigma)檢測凝膠上的抗體，測量已表達(dá)DR5-IgG1融合蛋白的分子量。已表達(dá)DR5-IgG1融合蛋白的分子量約為50kDa。通過該蛋白的SDS-PAGE分析和通過考馬斯藍(lán)染色測定評估，達(dá)到的純度高于90％。實(shí)施例2.抗人DR5的單克隆抗體的產(chǎn)生2.1免疫用親和純化的人DR5/hIgG1融合蛋白免疫6-8周齡雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。對于初次爪墊免疫，將融合蛋白(50μg)在弗氏完全佐劑(Difco，Detroit，MI)中乳化。然后小鼠通過4次每隔一天注射無佐劑給予的50μg融合蛋白進(jìn)行加強(qiáng)。最后一次注射后3天，將得自局部淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合，將雜交瘤培養(yǎng)在補(bǔ)充10％胎牛血清的F104培養(yǎng)基中。通過ELISA選擇陽性雜交瘤，其中所述板用或者1μg/ml DR5/hIgG1或者等量的作為對照的Fas/hIgG1包被。用一組小鼠Ig同種型特異性山羊抗體(SouthernBiotechnology，Birmingham，AL)，通過ELISA測定雜交瘤的同種型。用固定化抗小鼠IgG1或G蛋白(Sigma)，通過親和色譜純化單克隆抗體。
2.2細(xì)胞融合在加強(qiáng)注射后第3天，從小鼠取出局部淋巴結(jié)，置于10ml含有50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和300μg/ml L-谷氨酸的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中，然后用刮刀使器官通過篩網(wǎng)(CellStrainer；Falcon)將破碎。離心所得的細(xì)胞懸浮液，以沉淀局部淋巴結(jié)細(xì)胞，然后用無血清RPMI培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次。然后將經(jīng)洗滌的細(xì)胞重懸于無血清RPMI培養(yǎng)基中并計(jì)數(shù)。
同時(shí)，讓骨髓瘤NS1細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心TIB-18)在含有10％v/v FCS(Gibco BRL)的ASF104培養(yǎng)基(Ajinomoto，K.K.)(“含血清ASF培養(yǎng)基”)中于37℃、5％v/v CO2下生長不至超過1×108細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度，將其同樣破碎、洗滌、重懸浮并計(jì)數(shù)。
將計(jì)算含有3×107細(xì)胞的量的NS1細(xì)胞懸浮液與計(jì)算含有3×108細(xì)胞的量的脾細(xì)胞懸浮液混合。離心所得的混合物，并棄去上清液。進(jìn)行細(xì)胞融合的以下步驟，而在所有時(shí)間都將含有所述沉淀的塑料管置于37℃溫水的燒杯中。
將1ml 50％(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)緩慢加入所述管中，同時(shí)用移液管管尖攪拌沉淀。隨后，將預(yù)溫?zé)嶂?7℃的1ml無血清RPMI培養(yǎng)基分兩份緩慢加入，然后再加入7ml無血清RPMI培養(yǎng)基。然后將所得的混合物離心，棄去上清液，加入10ml含有10％v/v FCS的HAT培養(yǎng)基，同時(shí)用移液管管尖溫和攪拌。再加入20ml含有10％v/v FCS的HAT培養(yǎng)基后，將懸浮液以100μl/孔分配到96孔細(xì)胞培養(yǎng)微量培養(yǎng)板中，在5％v/v CO2環(huán)境下于37℃培養(yǎng)。7天或8天后，用100μl/孔新鮮HAT培養(yǎng)基替代表現(xiàn)出黃色的任何孔中的培養(yǎng)基。通過如下所述的有限稀釋，克隆得自這些孔的融合細(xì)胞。
2.3通過有限稀釋克隆取出4-10周齡雌性BALB/c小鼠(得自Japan SLC，Inc.)的胸腺，如上所述在篩網(wǎng)(Cell Strainer；Falcon)上破碎，破碎的細(xì)胞用含有10％v/vFCS的HT培養(yǎng)基洗滌2次。將相當(dāng)于得自一只小鼠的量的胸腺細(xì)胞懸浮于30ml含有10％v/v FCS的HT培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液。上述在實(shí)施例2.2中獲得的融合細(xì)胞制備物用這種飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液稀釋10-100倍，用飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液進(jìn)一步連續(xù)稀釋，以制備融合細(xì)胞密度為5細(xì)胞/ml、1細(xì)胞/ml和0.5細(xì)胞/ml的懸浮液。將如此制備的樣品以100μl/孔分配到96孔細(xì)胞培養(yǎng)微量培養(yǎng)板的各孔中，于37℃、5％v/v CO2下孵育5天。
2.4篩選用包有1μg/ml DR5/hIgG1或者作為對照的等量Fas/hIgG1(41)的板，通過ELISA篩選得自生長中雜交瘤的培養(yǎng)上清液。用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗小鼠免疫球蛋白(Southern Biotechnology.Birmingham，AL)與作為底物的TMB(Sigma，St Louis，MI)，檢測結(jié)合抗體。將濃度為1μg/ml的純化DR5-IgG1或等量Fas-hIgG1加入到96孔ELISA/RIA STRIP PLATE(Costar，NY)的各孔中。將板于4℃靜置過夜，讓所述蛋白質(zhì)吸附至孔表面。此后，棄去各孔中的溶液，用PBS-Tween洗滌各孔3次。然后向各孔中加入100μl含有1％(w/v)牛血清白蛋白(A3803；Sigma Chemicals Co.)的PBS，將板于37℃孵育1小時(shí)。然后用PBS-Tween將各孔再洗滌3次，向各孔中加入50μl得自每種生長中雜交瘤的培養(yǎng)上清液。然后將板于37℃孵育1小時(shí)，再次用PBS-Tween洗滌各孔4次。洗滌后，各孔加入50μl用PBS稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(SouthernBiotechnology.Birmingham，AL)，再次將板于37℃孵育1小時(shí)，此后用PBS-Tween洗滌各孔4次。以100μl/ml的量加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液體底物系統(tǒng)(Sigma)，讓該板于室溫靜置5分鐘，然后通過加入100μl/孔0.2N H2SO4終止反應(yīng)。用微量培養(yǎng)板讀出儀(MolecularDevices)測量各孔450nm的吸光度(對照為650nm)，從樣品中選擇吸光度(450nm-650nm，OD值；＞0.5)明顯高于未加融合細(xì)胞上清液的吸光度(OD數(shù)值；≈0.03)的融合細(xì)胞。此外，也通過用Jurkat細(xì)胞測量細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，對得自生長中雜交瘤的培養(yǎng)上清液進(jìn)行功能篩選。在96孔板中，在50μl得自生長中雜交瘤的培養(yǎng)上清液存在下加入50μl含有Jurkat細(xì)胞(1000細(xì)胞/孔)和5μM雙吲哚基馬來酰亞胺VIII(BisVIII，Alexis，San Diego，CA)的RPMI培養(yǎng)基。將細(xì)胞在潮濕培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)過夜。用ATPLite試劑盒，按照生產(chǎn)商(PackardInstruments)的說明，根據(jù)細(xì)胞生存力測量細(xì)胞凋亡，用TopCounter(Packard Instruments)對樣品計(jì)數(shù)。
2.5TRAIL和TRA-8與所述受體的ELISA結(jié)合ELISA板用2μg/ml DR4-Ig或DR5-Ig融合蛋白包被過夜。用3％BSA封閉后，加入指定濃度的可溶性TRAIL-FLAG或TRA-8，于37℃保溫1小時(shí)。分別用HRP綴合抗Flag抗體(Alexis)或HRP綴合抗鼠IgG1(Southern Biotechnology)檢測TRAIL或TRA-8的結(jié)合。反應(yīng)物用TMB底物緩沖液顯色，并用Benchmark Microplate Reader(BioRad)測量。通過用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software，San Diego，CA)，通過非線性回歸的單位點(diǎn)結(jié)合模型估計(jì)Kd值。對于競爭性ELISA，加入100ng/ml TRAIL-FLAG，在各種濃度的TRA-8存在下保溫。如上測定TRAIL的結(jié)合。
2.6克隆對于在以上實(shí)施例2.4中選擇的細(xì)胞，重復(fù)在以上實(shí)施例2.3和2.4的步驟5次，從而使得能夠選擇幾個(gè)分別產(chǎn)生結(jié)合DR5-IgG而不結(jié)合Fas-IgG的單一抗體雜交瘤克隆。作為這種選擇程序的結(jié)果，獲得命名為TRA-8并且產(chǎn)生與DR5-IgG結(jié)合而不與Fas-IgG結(jié)合的抗體的小鼠-小鼠雜交瘤。這種雜交瘤TRA-8于2000年3月1日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為PTA-1428。
在用單克隆抗體同種型試劑盒(Pierce)測試后，表明小鼠-小鼠雜交瘤TRA-8(在下文簡稱為“TRA-8”)產(chǎn)生的抗體亞類為IgG1，κ。
用我們的人DR5-IgG1融合蛋白作為免疫原，通過初步ELISA篩選獲得了7個(gè)雜交瘤克隆，每個(gè)克隆都是DR5-IgG強(qiáng)陽性，而非Fas-IgG融合蛋白陽性克隆，表明所獲得的雜交瘤產(chǎn)生識別DR5胞外部分、而不識別IgG1的Fc部分的抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。
2.7蛋白質(zhì)印跡分析用于正常人組織和癌組織勻漿的蛋白質(zhì)印跡分析的濾膜購自Geno Technology(St Louis，MO)。在每個(gè)泳道中加入通過抗β-肌動蛋白抗體測量的等量蛋白質(zhì)。印跡用1μg/ml TRA-8探測過夜，然后用HRP綴合山羊抗小鼠IgG1(Southern Biotechnology)于室溫探測1小時(shí)，然后通過化學(xué)發(fā)光顯示。
2.8原位免疫組織化學(xué)人組織得自the Tissue Procurement Center of UAB。將冷凍切片在70％乙醇中固定，用10％馬血清的PBS溶液封閉，然后與10μg/ml親和純化TRA-8一起于室溫孵育60分鐘。用帶有作為比色底物的二氨基聯(lián)苯胺的抗小鼠IgG ABC試劑盒(Vector，Burlingame，CA)來顯現(xiàn)反應(yīng)性。
2.9caspase活化的分析將Jurkat細(xì)胞(1×106/ml)與500ng/ml TRA-8一起孵育。等份(30μg蛋白質(zhì))細(xì)胞裂解液在15％SDS-PAGE上分離，吸印到尼龍膜上，印跡用抗caspase 8、9和3抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)探測，然后通過HRP綴合第二抗體探測，并通過化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)經(jīng)切割的產(chǎn)物。設(shè)立的caspase抑制劑購自R&D Systems(Minneapolis，MN)。將每種caspase抑制劑以指定濃度加入到培養(yǎng)物中。實(shí)施例3.TRA-8單克隆抗體的純化讓小鼠-小鼠雜交瘤TRA-8在500ml含有10％v/v FCS的ASF培養(yǎng)基中于37℃、5％v/v CO2下培養(yǎng)5天，生長至1×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。然后將培養(yǎng)物離心(1,000r.p.m.，5分鐘)，并收集上清液。用G蛋白-Sepharose CL-4B親和色譜(Pharmacia)在以下條件下達(dá)到從上清液中純化TRA-8柱子G蛋白-Sepharose CL-4B柱(柱大小2ml；Pharmacia)；洗脫緩沖液0.1M甘氨酸(pH2.4)，0.15M NaCl；中和緩沖液1M Tris-HCl(pH8.5)。
在將所有上清液上樣至柱子后，用20ml PBS洗滌3次，然后加入10次1ml體積洗脫緩沖液。測量每個(gè)洗脫流分(1ml)的光密度。分別收集第2-5流分(＞OD280＝0.1)。
加入100μl中和緩沖液后，將流出液分別置于在透析管中，將流出液對1升PBS(pH7.5)于4℃透析。更換透析緩沖液兩次。然后采用用上述技術(shù)制備的人DR5-IgG融合蛋白，通過ELISA分析該樣品的抗DR5抗體活性。實(shí)施例4.DR4抗原、DR4-IgG表達(dá)載體和抗DR4單克隆抗體的制備重復(fù)實(shí)施例1-3的程序，用DR4模板cDNA和引物取代實(shí)施例1中詳述的模板和引物，獲得DR4抗原，將其按照實(shí)施例1.2-3使用，獲得對DR4特異性的單克隆抗體。實(shí)施例5.抗DcR1和DcR2的單克隆抗體按照實(shí)施例1，通過取代相應(yīng)的cDNA和引物以產(chǎn)生相應(yīng)的抗原，產(chǎn)生針對誘餌受體DcR1和DcR2的單克隆抗體。按照實(shí)施例2和實(shí)施例3，產(chǎn)生了具有免疫球蛋白G的DcR1或DcR2的表達(dá)載體以及所得的純化單克隆抗體。實(shí)施例6.單克隆抗體的特異性由于所有TRAIL受體和TNFR家族其它蛋白享有顯著的同源性，所以采用兩種不同的人DR5-IgG融合蛋白和可溶性重組形式的其它相關(guān)蛋白，通過蛋白質(zhì)印跡分析，測定了示例性抗體TRA-8對DR5的特異性。通過將得自DR5胞外部分的殘基1-180的cDNA與編碼人IgG1恒定區(qū)的cDNA融合，構(gòu)建了第一種DR5-Ig融合蛋白。將融合的cDNA克隆到重組腺病毒載體(Quantum Biotechnogies，Inc.，Montreal，Canada)中。相對分子量為50kDa的已表達(dá)DR5/hIgG1融合蛋白用抗人IgG親和柱(Sigma，St Louis，MO)純化。對于特異性的蛋白質(zhì)印跡分析，第二種重組人DR5/IgG1融合蛋白(aa 52-212)以及TRAIL-R1、R3和R4融合蛋白購自Alexis?？扇苄孕问降娜薋as和TNFR1由Amgen，Inc.(Thousands Oaks，CA，USA)的Carl Edwards博士友好提供。所用的可溶性重組人DR4、DcR1、DcR2和TNFR1、R4和Fas分子是人IgG1融合蛋白。0.5μg每種蛋白質(zhì)通過10％SDS-PAGE分離，并吸印到硝化纖維素膜上。印跡用5％奶粉的PBS溶液于室溫封閉1小時(shí)，用1μg/ml純化抗DR5單克隆抗體(克隆TRA-8)或0.1μg/ml HRP綴合山羊抗人IgG于4℃探測過夜。辣根過氧化物酶(HRP)綴合山羊抗小鼠IgG用作第二抗體，以檢測結(jié)合TRA-8。通過化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)印跡。
使用用含有全長DR5或DR4的pcDNA3載體(Clontech，Palo Alto，CA)或空載體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。將編碼人TRAIL或鼠Fas配體的全長cDNA克隆到pTRE載體中四環(huán)素控制型啟動子下游(Clontech)。將pTRE-hTRAIL或pTRE-mFasL的XhoI-HindIII片段進(jìn)一步克隆到腺病毒穿梭載體pAdBN(Quantum Biotechnologies，Inc.)中。所述293宿主細(xì)胞用線性化pAd-TRE-hTRAIL或pAd-TRE-mFasL和腺病毒的大片段DNA共轉(zhuǎn)染。來自重組病毒噬斑的功能性人TRAIL或鼠Fas配體的表達(dá)用51Cr-釋放測定和作為靶的Jurkat篩選。
TRA-8與圖1a中所示用于免疫的DR5-IgG融合蛋白(～50kDa)-DR5，#1強(qiáng)反應(yīng)，與圖1a中所示的第二種DR5-IgG融合蛋白(～60kD)-DR5，#2弱反應(yīng)。TRA-8與DR4、DcR1、DcR2、Fas(CD95)或TNFRI沒有顯著結(jié)合。這些結(jié)果表明，TRA-8識別并非該家族其它成員共享的、而是DR5所特有的表位。
TRA-8與TNF受體超家族的其它成員例如Fas(CD95)和TNF受體I不反應(yīng)，根據(jù)450nm和650nm的吸光度比率表明(其中下圖編號為1-7(圖1a，下圖的第8欄)，TRA-8與DR5的鼠類同源物也沒有交叉反應(yīng)。可溶性TRAIL和TRA-8與固定化DR5的結(jié)合相當(dāng)(圖1b，左圖)。相反，TRAIL與DR4結(jié)合，而TRA-8沒有表現(xiàn)出與DR4的任何結(jié)合活性(圖1b，中圖)。TRAIL和TRA-8與DR5結(jié)合的Kd值估計(jì)分別為59nM和3nM。重要的是，TRA-8有效地與TRAIL競爭與DR5的結(jié)合，而不競爭與DR4的結(jié)合，如競爭性ELISA所示(圖1b，右圖)。這些結(jié)果確立了TRA-8對人DR5的特異性。
TRA-8能夠檢測DR5的細(xì)胞表面表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析表明與用全長人DR5轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的細(xì)胞表面特異性結(jié)合，但不與用DR4或空載體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合(圖1c)。同樣，用TRA-8的原位免疫組織化學(xué)顯示出與用全長DR5 DNA轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的反應(yīng)性，但沒有與用對照載體轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的反應(yīng)性(圖1d)。TRA-8不誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，采用編碼人DR5的成對引物從Cos-7細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT-PCR表明沒有特異性PCR產(chǎn)物。用人Jurkat細(xì)胞作為靶的進(jìn)一步功能分析表明，在缺乏交聯(lián)時(shí)，TRA-8強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，這通過細(xì)胞生存力的三種不同的測定包括ATPLite、MTT和PI排除得到證實(shí)(圖1e)。通過ATPLite測定顯示，納克水平的TRA-8殺傷超過50％的Jurkat細(xì)胞。TRA-8的殺傷活性對于DR5是特異性的，因?yàn)樗梢员籇R5-Ig所阻斷，而不被DR4-Ig融合蛋白阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。caspase 8、3、9和10的切割可以通過蛋白質(zhì)印跡分析在早至TRA-8處理Jurkat細(xì)胞后30分鐘檢測到(圖1f，Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞死亡被通用caspase抑制劑(Z-VAD)完全抑制(圖1g)。caspase 8、9和3的各種caspase抑制劑部分抑制細(xì)胞死亡，進(jìn)一步表明TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要通過caspase依賴性細(xì)胞凋亡機(jī)制。實(shí)施例7.細(xì)胞表面DR5表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析許多腫瘤細(xì)胞上的主要死亡受體，而非正常細(xì)胞上的主要死亡受體然后，用含有全長人DR5 cDNA或DR4 cDNA的表達(dá)載體或作為對照的空載體轉(zhuǎn)染的COS-7(美國典型培養(yǎng)物保藏中心No.CRL-1651)細(xì)胞，評價(jià)TRA-8結(jié)合細(xì)胞表面上表達(dá)的DR5的能力以及該反應(yīng)的特異性。藻紅蛋白(PE)綴合抗小鼠IgG1(Pharmingen)用作第二抗體，檢測結(jié)合TRA-8。用流式細(xì)胞儀(FACSVantage)在下述條件下測量1×104細(xì)胞的熒光激發(fā)波長488nm；檢測波長600nm。
流式細(xì)胞術(shù)分析表明，TRA-8使以DR5載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的大約30％染色，如圖1c的實(shí)心直方圖所示。這一百分比與采用綠色熒光蛋白(GFP)分析轉(zhuǎn)染所測定的轉(zhuǎn)染效率(數(shù)據(jù)未顯示)類似。TRA-8沒有顯著地使用DR4載體(空心直方圖)或?qū)φ蛰d體(虛線直方圖)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色，表明TRA-8對于細(xì)胞表面DR5是特異性的。
盡管已經(jīng)在mRNA水平上廣泛研究了腫瘤細(xì)胞中的DR5表達(dá)(Rieger J.等1FEBS Lett 1998 May 1；427(1)124-8)，但對于DR5的表面表達(dá)尚不甚了解。Gibson S.B.等1Mol Cell Biol 2000 Jan；20(1)205-12；Kim K.等1Clin Cancer Res 2000 Feb；6(2)335-46。因此，抗DR5單克隆抗體的可得性使得我們可以檢查DR5的表面水平以及將所述表達(dá)與細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性相關(guān)聯(lián)。將下一組細(xì)胞(1×106)與10μg/ml親和純化TRA-8一起于室溫下孵育30分鐘，然后用PE綴合抗小鼠IgG1(Pharmingen)再染色30分鐘。用FACSvantage流式細(xì)胞儀在下述條件下分析10,000個(gè)活細(xì)胞激發(fā)波長488nm；檢測波長600nm。
所測試的5個(gè)造血細(xì)胞系是Jurkat、CEM-6、Molt-4、H-9和U937細(xì)胞。在Jurkat、CEM-6、H-9和U937細(xì)胞表面可檢測到DR5表達(dá)，而在Molt-4細(xì)胞上幾乎檢測不到，如圖2a和2a’中所示。盡管先前已經(jīng)描述了高水平的DR5 RNA表達(dá)(43)，但FACs分析表明，這些細(xì)胞不表達(dá)高水平的表面DR5。這些結(jié)果表明，DR5的細(xì)胞表面表達(dá)與DR5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不相關(guān)，這對于這種受體而言并非是意料之外的。DR5的細(xì)胞表面表達(dá)水平可以是細(xì)胞譜系特異性的，因?yàn)樵煅獊碓吹拇蠖鄶?shù)細(xì)胞表達(dá)低水平的DR5，而大多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺細(xì)胞表達(dá)高水平的DR5。
用TRA-8單克隆抗體，通過檢查在一組不同類型的人腫瘤細(xì)胞中DR5的細(xì)胞表面表達(dá)以及這些細(xì)胞對TRAIL和TRA-8兩者介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，來確定DR5在誘導(dǎo)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面的作用。原代外周血T細(xì)胞不表達(dá)顯著水平的細(xì)胞表面DR5，并且對TRAIL和TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有抗性(圖2a、2a’和3a’)。盡管所測試的所有5個(gè)人T白血病細(xì)胞系都表達(dá)可檢測到的、盡管相對低水平的細(xì)胞表面DR5，但其中兩個(gè)細(xì)胞系(Jurkat和CEM-6)卻對TRAIL和TRA-8兩者介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡高度敏感，表明單獨(dú)的DR5足以誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡。Molt-4和U937細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡部分敏感，而對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有相對抗性，提示其它TRAIL受體可能參與細(xì)胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。H-9細(xì)胞對TRAIL和TRA-8兩者介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有抗性，暗示有胞內(nèi)抗細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)的阻斷。
一組細(xì)胞包括人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Hs683、U251MG、D37MG、D54MG、U373MG、CH235MG、U87和正常人星形細(xì)胞，這些細(xì)胞由the Neurosurgery Department of the University of Alabama atBirmingham的Yancey Gillespie博士提供。人前列腺癌細(xì)胞系Du154、PC3和LnCap由the Pathology Department of the University of Alabama atBirmingham的William Grizzle博士提供，William Grizzle博士從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得所述細(xì)胞系。人白血病T細(xì)胞系、B細(xì)胞淋巴瘤、HepG2 Jurkat(美國典型培養(yǎng)物保藏中心TIB-152)和CCRF-CEMCEM-6(美國典型培養(yǎng)物保藏中心CCL-119)；單核細(xì)胞細(xì)胞系U937(美國典型培養(yǎng)物保藏中心CRL-2367)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。所有上述細(xì)胞系均在補(bǔ)充10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)。人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系1321N1由Psychiatry Department of the University of Alabamaat Birmingham的Richard Jope博士友好提供，在補(bǔ)充5％FCS的DMEM中培養(yǎng)。
購自Alexis Corporation(San Diego，CA)的可溶性重組人TRAIL是一種融合蛋白，由在N末端與FLAG標(biāo)志和一個(gè)8個(gè)氨基酸的接頭肽融合的人TRAIL胞外域(氨基酸殘基95-281)組成。與先前報(bào)道的His標(biāo)志的TRAIL不同，這種單獨(dú)的TRAIL制備物在Jurkat細(xì)胞中不誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞凋亡應(yīng)答，并且需要抗FLAG抗體作為交聯(lián)劑，以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。這種抗FLAG抗體也購自Alexis。
所測試的所有10種人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)可檢測水平的DR5。大多數(shù)表達(dá)中等至高水平的DR5，如圖2b中所示。D-54MG、U373MG和CH-235MG三個(gè)系表達(dá)高水平的DR5，而Hs-683、U251-MG、D37-MG、U87、SMK1和1321N1六個(gè)系表達(dá)中等水平的DR5。僅H-465一個(gè)細(xì)胞系表達(dá)低水平的DR5。所有三個(gè)前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)高水平的DR5，如圖2c中所示。
同正常原代T細(xì)胞一樣，原代B細(xì)胞不表達(dá)顯著水平的DR5，并且在用TRAIL或TRA-8處理后不經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(圖2d)。所測試的4個(gè)B淋巴瘤細(xì)胞系中的3個(gè)(SKW64、EB-3和Raji)表達(dá)相對高水平的DR5，對TRAIL和TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都非常敏感。第4個(gè)細(xì)胞系Daudi表達(dá)非常低水平的DR5，對TRAIL或者TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性低得多。盡管原代星形細(xì)胞并不表達(dá)可檢測水平的細(xì)胞表面DR5(圖2b’)，但所測試的所有4個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系卻表達(dá)高水平的DR5。DR5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤上的表達(dá)水平高于在T細(xì)胞和B細(xì)胞上的表達(dá)水平，這并不伴隨著對TRAIL和DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性顯著更高，提示DR5的細(xì)胞表面表達(dá)水平不一定與腫瘤細(xì)胞凋亡的水平相關(guān)。為測定DR4、DR5和DcR2信使水平而進(jìn)行的RT-PCR在所測試的所有細(xì)胞中都檢測到信使(表1)。然而，一般而言，與轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞相比，原代正常細(xì)胞表達(dá)相對低水平的DR5。表1TRAIL受體表達(dá)的RT-PCR分析*
*從細(xì)胞中分離總RNA，如方法中所述進(jìn)行RT-PCR。PCR產(chǎn)物在3％瓊脂糖凝膠上分離，并通過Fluor-S MAX MultiImager System(BioRad)分析。數(shù)值以相對于β-肌動蛋白的比率表示。實(shí)施例8.在體外在惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為了確定TRA-8是否在體外在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，檢查了所有DR5陽性腫瘤細(xì)胞對TRA-8或者TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。
靶細(xì)胞(1×103/孔)在指定濃度的可溶性TRAIL加上交聯(lián)劑(Alexis)或TRA-8存在下，在96孔板中于37℃培養(yǎng)過夜。細(xì)胞生存力的測定利用(1)ATPLite試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明(Packard Instruments，Meriden，CT)；(2)MTT細(xì)胞增殖/生存力試劑盒(Sigma)；或(3)用PI將死細(xì)胞染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用10μg/ml PI染色，PI陰性細(xì)胞作為活細(xì)胞門控。對于肝細(xì)胞的固縮核的分析，細(xì)胞用10ng/ml Hoechst 33352(Molecular Probes)染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
TRA-8抗體能夠在大多數(shù)人惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(9/10)、3個(gè)前列腺癌細(xì)胞系中的2個(gè)細(xì)胞系和4個(gè)DR5陽性造血細(xì)胞系中的2個(gè)細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它在Molt-4細(xì)胞系中不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞系表達(dá)幾乎不可檢測的細(xì)胞表面水平的DR5。然而，所述細(xì)胞對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性水平在所述細(xì)胞系中變化相當(dāng)大。
所述細(xì)胞對TRA-8抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的變異性和敏感性提示，盡管需要最低水平的DR5的細(xì)胞表面表達(dá)，但DR5的細(xì)胞表面表達(dá)的水平不一定是敏感性的主要決定因素，其它因素影響該過程。盡管所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞一般都表達(dá)的表面DR5的水平顯著高于造血細(xì)胞，但與所述造血細(xì)胞相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性卻不成比例增加。所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的5個(gè)細(xì)胞系D-37MG、D54-MG、U373-MG、CH235-MG和1321N1對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性高，與它們對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性相當(dāng)，如圖3b中所示。所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的2個(gè)細(xì)胞系-H-456和SMK1對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性低得多。就H-456細(xì)胞而論，DR5的表面表達(dá)低；然而，DR5在SMK1上的表面表達(dá)與更敏感的細(xì)胞系相似，提示其它機(jī)制可能在決定對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性方面起作用。盡管所有三個(gè)前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)高水平的DR5，但Du145細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最為敏感，PC3細(xì)胞部分敏感，而LnCAP細(xì)胞完全具有抗性，如圖3c中所示。在所述造血細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Jurkat和CEM-6對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡非常敏感，如圖2a中所示，盡管發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)細(xì)胞系表達(dá)低水平的DR5。盡管在U937細(xì)胞可檢測到DR5，但這些細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性。同樣，雖然H-9細(xì)胞表達(dá)可檢測水平的DR5，但H-9細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性。這些結(jié)果暗示，存在影響DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。
按照實(shí)施例1-3的程序，產(chǎn)生了其它表面結(jié)合抗DR5抗體。將命名為TRA-1和TRA-10的兩個(gè)其它抗DR5抗體與TRA-8一起研究，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相對能力，因而可用作激動劑，或相反阻斷TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因而可用作拮抗劑。人Jurkat細(xì)胞用作靶，以測定命名為TRA-1、TRA-8和TRA-10三種抗DR5抗體的激動劑活性和/或拮抗劑活性。如圖4中所示，與2.5μg/ml TRA-10、TRA-1和TRA-8一起孵育過夜時(shí)，細(xì)胞生存力分別為約90％、70％和20％。TRA-8以劑量依賴性方式誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞凋亡應(yīng)答，而TRA-1僅誘導(dǎo)中等的細(xì)胞凋亡應(yīng)答，TRA-10僅誘導(dǎo)弱應(yīng)答。因此TRA-8被鑒定為激動性抗DR5抗體。在圖4中，顯示人Jurkat細(xì)胞的生存力隨TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以劑量依賴性而變。對在低劑量TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究中，TRA-10顯著阻斷人Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。因此，TRA-10被鑒定為拮抗性抗DR5抗體。TRA-1保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為PTA-1741。TRA-10同樣保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為PTA-1742。
所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的5個(gè)細(xì)胞系-D-37MG、D54-MG、U373-MG、CH235-MG和1321N1對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性等同于它們對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，如圖3b中所示，表明在這些細(xì)胞中TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要通過DR5介導(dǎo)。此外，所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的2個(gè)細(xì)胞系-Hs683和U251-MG對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性，而對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡部分敏感，表明所述誘餌受體在這些細(xì)胞中起作用，以及應(yīng)用TRA-8抗體繞過了這種調(diào)控機(jī)制。在所述前列腺癌細(xì)胞系中，盡管對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性不同，但這卻與所述細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性相當(dāng)，再次提示DR5在前列腺癌細(xì)胞的TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起主要作用。在所述造血細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Jurkat和CEM-6對TRA-8和TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都非常敏感。TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的水平與TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相當(dāng)，如圖2a和3a’中所示。僅所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的一個(gè)細(xì)胞系U87和兩個(gè)造血細(xì)胞系U937和Molt-4顯示出對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，而對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性較低或具抗性。一個(gè)細(xì)胞系H-9細(xì)胞系表達(dá)可檢測水平的DR5，但對TRA-8或TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性。TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡需要最低水平的DR5表達(dá)，DR5表達(dá)的水平不一定預(yù)示著所述細(xì)胞對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性；在某些細(xì)胞中誘餌受體在調(diào)節(jié)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起作用，而看來在迄今所測試的大多數(shù)細(xì)胞中并不起重要作用；正如所預(yù)期的，TRA-8抗體繞過所述誘餌受體的效應(yīng)；在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可能發(fā)生DR5受體的功能突變；以及最后，在限定所述細(xì)胞對TRAIL和DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性方面，胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制可能與所述誘餌受體一樣重要或者更為重要。
先前研究已經(jīng)表明，DR5 mRNA廣泛分布于正常組織中7。為了評估DR5在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，在蛋白質(zhì)印跡分析中，用TRA-8抗體探測一組正常人組織勻漿(Geno Technology，St Louis，MO)。在9種正常人組織中，腦組織為弱陽性(圖5a，第2泳道)。通過TRA-8反應(yīng)性，在肝(第1泳道)、肺(第3泳道)、腎(第4泳道)、脾(第5泳道)、睪丸(第6泳道)、卵巢(第7泳道)、心臟(第8泳道)或胰腺(第9泳道)中沒有檢測到DR5蛋白。相反，所有13種人癌組織都用TRA-8染色陽性(圖5b)，所述癌組織包括卵巢癌(第1泳道)、肺癌(第2泳道)、肝癌(第3泳道)、直腸癌(第4泳道)、宮頸癌(第5泳道)、皮膚癌(第6泳道)、睪丸癌(第7泳道)、甲狀腺癌(第8泳道)、子宮癌(第10泳道)、胃癌(第11泳道)、喉咽癌(第12泳道)和胰腺癌(第13泳道)。此外，采用TRA-8進(jìn)行的正常組織和癌組織的原位免疫組織化學(xué)證實(shí)，除少數(shù)脾中散布的陽性細(xì)胞外，DR5在正常乳房組織、肺組織和脾組織中的表達(dá)不可檢測(圖5c)。包括乳房浸潤性導(dǎo)管癌、小細(xì)胞性肺癌和淋巴瘤在內(nèi)的對應(yīng)癌組織與TRA-8陽性反應(yīng)(圖5d)。在所檢查的總共22種癌組織中，6種乳癌中的5種、2種宮頸癌中的2種、5種肝癌中的4種、8種淋巴瘤中的5種、2種肺癌中的2種和2種前列腺癌中的2種與TRA-8反應(yīng)陽性。這些結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果一致，表明癌組織比正常組織表達(dá)更高水平的DR5蛋白。實(shí)施例9.TRA-8的體內(nèi)殺腫瘤活性由于各種原因，在體外研究中顯示出有前景的許多藥物在體內(nèi)并不顯示出功效。因此，重要的是測試TRA-8在體內(nèi)動物模型中的功效。為了完成這一點(diǎn)，將TRA-8抗人DR5抗體給予帶有表達(dá)人DR5分子的人類異種移植物的小鼠。采用的小鼠為6-8周齡NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratory)，給所述小鼠皮下接種人星形細(xì)胞瘤1321N1細(xì)胞(1×107)，或靜脈內(nèi)接種人白血病Jurkat細(xì)胞(1×106)。在腫瘤接種后第2天，給小鼠靜脈內(nèi)接種TRA-8(100μg)。用TRA-8治療后5天，根據(jù)腫瘤塊的大小和重量測定1321N1腫瘤生長。根據(jù)脾重量和人CD3陽性Jurkat細(xì)胞在接種動物的脾中的百分比，測定Jurkat細(xì)胞的生長。取腫瘤組織的活檢組織，進(jìn)行組織學(xué)檢查。
在腫瘤接種后1天用一次靜脈內(nèi)給予100μg TRA-8進(jìn)行早期治療，完全抑制1321N1細(xì)胞形成實(shí)體瘤(圖6a)。在腫瘤接種后1周，用三劑100μg TRA-8進(jìn)行晚期治療，將腫瘤重量降低至四分之一或更低(圖6b)。在早期時(shí)間點(diǎn)用TRA-8治療的動物中腫瘤形成不可見(圖6c，上圖)。組織學(xué)分析揭示，用TRA-8治療的動物中腫瘤組織顯著消退(圖6c，下圖)。同樣，TRA-8治療抑制Jurkat細(xì)胞在脾中定居，如在脾中CD3陽性Jurakt細(xì)胞稀少所證明的(圖6d、6e)。所植入腫瘤的組織學(xué)分析顯示，在TRA-8治療的動物的軟組織中有少數(shù)腫瘤細(xì)胞散布，而對照顯示出形成實(shí)體瘤，如圖6c中所示。通過圖6a中所示的流式細(xì)胞術(shù)分析和圖6c的原位CD3染色證明，在Jurkat細(xì)胞模型中，與對照動物脾中Jurkat細(xì)胞數(shù)目接近10％相比，在TRA-8治療動物的脾中Jurkat細(xì)胞數(shù)目低于2％。
這些結(jié)果證實(shí)了最近的實(shí)證系統(tǒng)給予交聯(lián)重組TRAIL抑制腫瘤在體內(nèi)生長(13)。這些結(jié)果表明，一劑TRA-8在消除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞方面非常有效。
由于在鼠類模型中使用抗人抗體，所以不可能評價(jià)TRA-8治療的毒性。然而，體內(nèi)給予TRAIL的研究表明，沒有與該治療相關(guān)的顯著毒性(13)。實(shí)施例10.RA滑膜細(xì)胞對TRAIL和TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的研究集中于惡性細(xì)胞。按照本發(fā)明的TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也可治療自身免疫病和炎性病癥例如RA。
10.1RA滑膜細(xì)胞中細(xì)胞表面DR5表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析將一組得自RA患者的8種原代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞上DR5的表達(dá)與得自骨關(guān)節(jié)炎(下文稱為“OA”)患者的8種原代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞上DR5的表達(dá)比較。所述8種人原代RA滑膜細(xì)胞培養(yǎng)物RA-1014、RA-1016、RA-1021、RA-512、RA-707、RA-811、RA-716和RA-929由M.Ohtsuki博士(Sankyo Co.Ltd.，Tokyo，Japan)友好提供，并培養(yǎng)在補(bǔ)充10％FCS、青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺的DMEM中。所述7種OA滑膜細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)物通過標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白酶法從OA患者的滑膜組織中分離，并且在相同條件下培養(yǎng)。所有原代細(xì)胞的傳代數(shù)都低于10。如實(shí)施例5中所述，通過FACs分析測定DR5的表達(dá)。
所有RA細(xì)胞的原代培養(yǎng)物都表達(dá)高水平的表面DR5，在從不同患者分離出的這些滑膜細(xì)胞中表達(dá)水平變異小，如圖7a中所示。相反，在從OA患者分離出的滑膜細(xì)胞表面上表面DR5的表達(dá)非常低或不可檢測，如圖7b中所示。發(fā)現(xiàn)與所述RA細(xì)胞的表現(xiàn)相比，SV40轉(zhuǎn)化的滑膜細(xì)胞表達(dá)高水平的DR5。相反，在圖7b中，與所述OA細(xì)胞的表現(xiàn)相比，未轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞表達(dá)低水平的DR5。
10.2RA滑膜細(xì)胞對TRA-8或TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性一般而言，從RA患者中分離出的所有滑膜細(xì)胞都對TRAIL和抗DR5抗體兩者誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，而所有OA細(xì)胞對TRAIL和抗DR5抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性，如圖8a、8b所示。這些研究表明，TRA-8抗體優(yōu)選靶向改變的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞。此外，對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性或抗性的模式與抗DR5抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，表明所述滑膜細(xì)胞主要利用DR5觸發(fā)TRAIL細(xì)胞凋亡。
正如關(guān)于所述惡性細(xì)胞所述的，在所述RA滑膜細(xì)胞中對TRAIL或抗DR5抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性有不同，盡管它們表達(dá)相似水平的DR5。RA-512和RA-707最為敏感，因?yàn)槌^80％的細(xì)胞被低于20ng/ml濃度的TRAIL或TRA-8殺死。其中RA-1014、RA-811、RA-716和RA929對TRAIL或TRA-8中等敏感，在存在高濃度(＞50ng/ml)的TRAIL或TRA-8時(shí)發(fā)生近100％的細(xì)胞死亡。在RA-1016和RA1021細(xì)胞中，盡管大多數(shù)(超過60％)細(xì)胞被低劑量的TRAIL或TRA-8殺死，但在存在高濃度TRAIL或TRA-8時(shí)一部分細(xì)胞卻存活下來，表明有一個(gè)細(xì)胞亞群對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具抗性。相反，所有OA細(xì)胞對TRAIL和TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性卻低得多。在OA52F和OA69F中，甚至在存在高濃度TRAIL或TRA-8時(shí)，不超過60％的細(xì)胞被殺死。OA72M細(xì)胞完全抵抗TRAIL或TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。SV40轉(zhuǎn)化的滑膜細(xì)胞也對TRAIL和TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，未轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞看來對TRAIL和TRA-8具抗性。
先前已經(jīng)表明，DR5利用FADD/caspase 8依賴性途徑來觸發(fā)細(xì)胞凋亡(44)。為了確定RA滑膜細(xì)胞的caspase依賴性DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在存在特異性caspase抑制劑的情況下將RA細(xì)胞與TRAIL或抗DR5抗體一起培養(yǎng)。在所測試的8種caspase抑制劑中，caspase 6、8和10抑制劑能夠抑制TRAIL和DR5兩者誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞凋亡，如圖9中所示，表明這三種caspase參與DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
10.3TRA-8或TRAIL誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞中NF-κb激活，而不增加MMP的釋放有相當(dāng)多的證據(jù)支持這樣一種概念在細(xì)胞凋亡信號和增殖信號之間有密切聯(lián)系(45)。已經(jīng)確定，除細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之外，DR5還能夠激活NF-κb途徑，并且NF-κb激活可能能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡信號。因此進(jìn)行了凝膠變動測定。細(xì)胞用50ng/ml重組可溶性TRAIL、在1mg/ml增強(qiáng)劑存在下的Fas配體或50ng/ml TRA-8刺激指定時(shí)間。制備核提取物，與雙重染色的[32P]標(biāo)記的oligo-DNA探針一起保溫。結(jié)果用旋風(fēng)分離式(cyclone)磷光成像儀(TopCount NXT，PackardInstrument Company，CT)分析。在RA滑膜細(xì)胞與TNF-α或TRAIL一起孵育后，NF-κb以時(shí)間依賴方式被激活。TRA-8抗體能夠強(qiáng)激活NF-κb。相反，F(xiàn)as配體不能誘導(dǎo)NF-κb激活，如圖10a所示。
因此，盡管TRAIL和TRA-8抗體在RA滑膜細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞凋亡應(yīng)答，但它們也激活NF-κb，而NF-κb的激活被認(rèn)為在RA中引起TNF-α的促炎作用。因此，有可能TRAIL同TNF-α一樣，可以充當(dāng)促炎細(xì)胞因子。為了確定TRAIL和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κb激活是否有相似的生物學(xué)結(jié)果，通過ELISA測定MMP的產(chǎn)生。將滑膜細(xì)胞在單獨(dú)的培養(yǎng)基中或加有50ng/ml白介素1b、10ng/ml TNF-α、50ng/ml TRAIL或50ng/ml TRA-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中MMP-1和MMP-3的水平。
當(dāng)RA滑膜細(xì)胞與促炎細(xì)胞因子TNF-α或IL-1b一起孵育時(shí)，與培養(yǎng)基對照相比，MMP-1、MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生增加，如圖10b、10c所示。相反，用TRAIL或抗DR5抗體處理，與這些MMP的釋放增加無關(guān)。實(shí)施例11A.不能誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性對于24小時(shí)細(xì)胞生存力測定，從In Vitro Technology(Baltimore，MD)購買96孔板中的新鮮正常人肝細(xì)胞。將所述肝細(xì)胞培養(yǎng)在含有1μg/ml或者可溶性TRAIL或者TRA-8的肝細(xì)胞培養(yǎng)基(HepatocyteCulture Medium)中。對于6小時(shí)生存力測定，從收集于UAB TissueProcurement Center的新鮮手術(shù)樣本中分離正常肝細(xì)胞或肝細(xì)胞癌細(xì)胞。用于分離人類肝細(xì)胞的所有試劑包括肝細(xì)胞灌注緩沖液、消化培養(yǎng)基、洗滌培養(yǎng)基和貼壁培養(yǎng)基購自Gibco。組織玻片在肝細(xì)胞消化培養(yǎng)基(Hepatocyte Digest Medium)中于37℃振蕩(50rpm)消化1小時(shí)。通過低速離心(50g，3min)收獲經(jīng)分離的肝細(xì)胞，用肝細(xì)胞洗滌培養(yǎng)基(Hepatocyte Washing Medium)洗滌6次。將肝細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液在96孔Matrigel板(BD)中含有10％FCS的貼壁培養(yǎng)基(Attachment Medium)中培養(yǎng)6小時(shí)。通過用預(yù)溫?zé)岬馁N壁培養(yǎng)基洗滌2次，除去非貼壁肝細(xì)胞。貼壁肝細(xì)胞進(jìn)一步與各種濃度的可溶性TRAIL或FasL在交聯(lián)劑存在下、或者TRA-8或CH11一起孵育6小時(shí)。
TRAIL有至少兩種能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的受體(DR4和DR5)。用TRA-8測定僅DR5的交聯(lián)是否足以誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞凋亡。最初采用TRA-8，通過原位免疫組織化學(xué)，在5種正常人肝組織和5種肝癌組織中在蛋白質(zhì)水平上檢查DR5的表達(dá)。得自正常肝組織的切片在H&E染色時(shí)(圖11a，左上圖)，在TRA-8對DR5無陽性反應(yīng)性的情況下(圖11a，左下圖)，顯示出正常結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。相反，人肝細(xì)胞癌組織與TRA-8反應(yīng)陽性，其反應(yīng)模式與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞質(zhì)都存在DR5一致。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2也是DR5陽性。這些結(jié)果在所述5種正常肝組織中是一致的，5種肝癌組織中僅一種組織(肝腺瘤)為DR5陰性。這些結(jié)果與圖5a中所示的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)一致，在圖5a中，關(guān)于其它正常組織，正常人肝組織不表達(dá)顯著水平的DR5蛋白。此外，用TRA-8探測的經(jīng)分離的正常人肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析沒有顯示出可檢測水平的DR5。
通過流式細(xì)胞術(shù)分析檢測的人肝細(xì)胞上DR5的細(xì)胞表面表達(dá)證明，新鮮制備的正常肝細(xì)胞不表達(dá)可檢測水平的細(xì)胞表面DR5(圖11b，左上圖)。在凍藏或置于短期培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞上也沒有檢測到細(xì)胞表面DR5。相反，新鮮分離的肝細(xì)胞癌細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面DR5。用Fas作為比較，所述正常肝細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞和HepG2細(xì)胞都表達(dá)相同水平的Fas(圖11b，下圖)。這些結(jié)果與用原位免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡獲得的結(jié)果一致，表明細(xì)胞表面DR5在癌性肝細(xì)胞中高度表達(dá)，而不在正常肝細(xì)胞中表達(dá)。通過RT-PCR證明23，在人肝細(xì)胞中存在DR4、DR5、DcR1和DcR2的mRNA水平，提示人肝細(xì)胞可能表達(dá)非常低水平的DR5蛋白，其表達(dá)水平低于通過TRA-8檢測的閾值。
為了確定TRA-8是否誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性，檢查了正常人肝細(xì)胞對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及對可溶性TRAIL加交聯(lián)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。當(dāng)將正常肝細(xì)胞在存在高濃度TRAIL的情況下培養(yǎng)時(shí)，通過ATPLite測定(圖12a)和MTT測定，觀測到細(xì)胞生存力的時(shí)間依賴性降低。TRAIL介導(dǎo)的正常肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡可以在早至加入TRAIL后4小時(shí)觀察到。在24小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，超過80％的肝細(xì)胞被TRAIL殺死。相反，在同樣的培養(yǎng)期中，TRA-8在正常肝細(xì)胞中不誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞死亡。被Hoechst染色的固縮核(細(xì)胞凋亡的特征)在TRAIL處理的肝細(xì)胞中增加，而在TRA-8處理的肝細(xì)胞中不增加(圖12b)。凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目與通過ATPLite測定測量的細(xì)胞生存力降低很好地相關(guān)，提示TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡是通過細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的。Z-VAD能夠抑制TRAIL介導(dǎo)的對肝細(xì)胞的毒性證實(shí)了這一點(diǎn)。因?yàn)榉啪€菌酮是一種有效的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)劑，所以研究了這種化合物對TRAIL和TRA-8處理的肝細(xì)胞的效應(yīng)。在4小時(shí)培養(yǎng)期間，放線菌酮顯著增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡，超過70％的肝細(xì)胞在放線菌酮存在下被TRAIL殺死(圖12c)。然而，放線菌酮處理不能增強(qiáng)肝細(xì)胞中TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。為了比較肝細(xì)胞中TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與用TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的特征，將正常肝細(xì)胞以及癌細(xì)胞與可變濃度的可溶性TRAIL加交聯(lián)劑或者TRA-8一起孵育。在6小時(shí)培養(yǎng)期間，TRAIL在正常肝細(xì)胞中誘導(dǎo)中等的細(xì)胞凋亡應(yīng)答。在500ng/ml TRAIL存在下，超過20％的肝細(xì)胞被殺死(圖12d，左上圖)。用TRA-8處理正常肝細(xì)胞在同樣培養(yǎng)期并不誘發(fā)任何顯著的細(xì)胞死亡。與正常肝細(xì)胞相反，原代肝細(xì)胞癌細(xì)胞(圖12d，上部中間圖)和HepG2細(xì)胞(圖12d，右上圖)對TRAIL或TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡高度敏感。超過80％的肝細(xì)胞癌細(xì)胞和接近100％的HepG2細(xì)胞在8小時(shí)培養(yǎng)期期間被殺死。這些結(jié)果表明，正常肝細(xì)胞完全抗TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性比肝癌細(xì)胞低得多。用Fas配體和抗Fas抗體(CH-11)，在正常肝細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中，對Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性沒有顯著差異(圖12d，下圖)。比較實(shí)施例11B.人膜結(jié)合TRAIL在體內(nèi)誘導(dǎo)肝炎給8-10周齡雌性B6小鼠靜脈注射109pfu的Ad/hTRAIL與等量的Ad/Tet-on。在接種腺病毒載體后，立即給小鼠在其飲用水中飼喂不同濃度的四環(huán)素。肝損傷采用AST診斷試劑盒(Sigma)通過AST血清水平來測定。TRAIL的表達(dá)通過RNA印跡分析來測定。
為了確定膜結(jié)合形式的TRAIL是否在體內(nèi)誘導(dǎo)肝損傷，構(gòu)建了編碼全長人TRAIL的重組腺病毒載體(Ad/hTRAIL)，全長人TRAIL的表達(dá)在四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子的控制之下。給B6小鼠靜脈接種Ad/hTRAIL后24小時(shí)，通過RNA印跡分析證明，在肝中觀測到劑量依賴形式的四環(huán)素誘導(dǎo)的人TRAIL表達(dá)(圖13a)。通過再次劑量依賴方式的轉(zhuǎn)氨酶血清水平的四環(huán)素依賴性增加表明，TRAIL的表達(dá)水平與肝損傷很好地相關(guān)(圖13b)。由于接種腺病毒載體本身可能增加肝細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，所以分離出得自接種Ad/TRAIL小鼠的肝細(xì)胞，測試TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。與得自對照小鼠的肝細(xì)胞相比，Ad/TRAIL感染的肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡沒有顯著增加(圖13c，左圖)。此外，Ad/TRAIL接種小鼠在靜脈注射可溶性人TRAIL后沒有表現(xiàn)出肝損傷增加。因此，得出的結(jié)論是，Ad/TRAIL誘導(dǎo)的肝炎是高水平膜形式的TRAIL表達(dá)介導(dǎo)的。肝切片的組織學(xué)分析表明，肝細(xì)胞的損傷在早至接種載體后24小時(shí)出現(xiàn)(圖13d)，并且持續(xù)至少7天(圖13e)。肝中的這些病理學(xué)改變也是四環(huán)素依賴性的，并且以劑量依賴方式發(fā)生。在TRAIL誘導(dǎo)的肝損傷的治療早期即24小時(shí)之內(nèi)的特征為壞死病灶。在這一時(shí)期沒有觀察到炎性細(xì)胞的浸潤，但發(fā)生了出血。到接種后第7天時(shí)，彌散的肝損傷清晰可見，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂、肝細(xì)胞嚴(yán)重變性，出現(xiàn)不規(guī)則凝聚的胞質(zhì)和大的透明空間，并且有顯著的細(xì)胞凋亡和壞死。單核細(xì)胞的廣泛浸潤是這一時(shí)期的特征性特征。這些結(jié)果表明，膜結(jié)合形式的人TRAIL能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)肝損傷。盡管人TRAIL在小鼠中傾向于引起嚴(yán)重的肝炎，但并不誘導(dǎo)致死性反應(yīng)。相反，接種編碼Fas配體的相似的四環(huán)素控制型載體的小鼠發(fā)生暴發(fā)性肝炎，肝細(xì)胞大量凋亡和壞死，并伴有嚴(yán)重出血并且死亡率在接種72小時(shí)內(nèi)以四環(huán)素劑量依賴性地發(fā)生。在接受3mg/ml或更高劑量的四環(huán)素的那些亞組中，在48小時(shí)內(nèi)死亡率達(dá)到100％。相反，所有接受Ad/hTRAIL的小鼠無論接受何種劑量的四環(huán)素，在接種后4周仍存活。因此，由此得出，膜結(jié)合形式的TRAIL在體內(nèi)是一種效力低于Fas配體的肝細(xì)胞損傷誘導(dǎo)劑。它們還提示，TRAIL可能通過與作為Fas配體毒性基礎(chǔ)的機(jī)制不同的機(jī)制誘導(dǎo)肝損傷。實(shí)施例12.活化人T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)水平增加的DR5為了確定DR5是否在TRAIL介導(dǎo)的活化T細(xì)胞和B細(xì)胞凋亡中起作用，用TRA-8檢查靜息和活化T細(xì)胞和B細(xì)胞上DR5的表面表達(dá)。PBMC中未經(jīng)刺激的人T細(xì)胞不表達(dá)顯著水平的DR5(圖14)。用抗CD3或Con-A刺激后48小時(shí)，細(xì)胞表面DR5表達(dá)顯著增加。同樣，未經(jīng)刺激的B細(xì)胞表達(dá)非常低水平的DR5。用抗μ刺激而不用LPS刺激，導(dǎo)致DR5的細(xì)胞表面表達(dá)增加。這些結(jié)果表明，活化T細(xì)胞和B細(xì)胞都表達(dá)較高水平的細(xì)胞表面DR5。細(xì)胞用20μg/ml TRA-8和PE抗小鼠IgG1染色。實(shí)施例13.活化T細(xì)胞和B細(xì)胞變得對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感為了確定活化T細(xì)胞和B細(xì)胞是否對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，人PBMC的T細(xì)胞和B細(xì)胞分別用抗CD3或抗μ在體外刺激48小時(shí)。通過梯度離心收集活細(xì)胞和正增殖的母細(xì)胞，將其與各種濃度的TRA-8一起孵育。未經(jīng)刺激的T細(xì)胞和B細(xì)胞對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不敏感(圖15)。經(jīng)完全刺激的T細(xì)胞和B細(xì)胞顯示出對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性中度增加，培養(yǎng)過夜后，20％細(xì)胞被TRA-8殺死。高度增殖的T母細(xì)胞甚至對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感。超過70％的T母細(xì)胞可能被TRA-8殺死。相比之下，B母細(xì)胞也對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感。這些結(jié)果表明，活化T細(xì)胞和B細(xì)胞對DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。實(shí)施例14.TRA-8使人/SCID小鼠中的活化T細(xì)胞耗竭為了確定TRA-8的體內(nèi)抗T細(xì)胞功效，給NOD/SCID小鼠靜脈注射1×108人PBMC。通常，SCID小鼠體內(nèi)的人T細(xì)胞對異種刺激應(yīng)答而被快速活化。從轉(zhuǎn)移當(dāng)天開始，給所述人PBMC/SCID小鼠腹膜內(nèi)注射100μg TRA-8或?qū)φ誌gG1，重復(fù)每日注射，注射3天。轉(zhuǎn)移后5天，從脾中分離出單核細(xì)胞，用抗人CD3抗體染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析，門控所述淋巴細(xì)胞群體，并且分析CD3陽性人T細(xì)胞。用抗人CD3染色在對照治療的小鼠中測定，大約30％的脾淋巴細(xì)胞是人T細(xì)胞。然而，在TRA-8治療的小鼠的脾淋巴細(xì)胞中，僅觀測到少數(shù)人細(xì)胞(低于3％)(圖16)。原位組織學(xué)研究表明，在對照小鼠的脾中，人T細(xì)胞在脾中重新建群，通過TUNEL染色證明，僅觀察到少數(shù)凋亡的細(xì)胞。相反，在TRA-8治療的小鼠脾中，沒有觀察到活的人T細(xì)胞重新建群，而是觀察到許多凋亡的細(xì)胞(圖17)。這些結(jié)果證明，TRA-8在體內(nèi)具有抗T細(xì)胞活性，并且表明可應(yīng)用本發(fā)明的抗體治療GVH疾病。實(shí)施例15.TRA-8的抗腫瘤治療活性15.1DR5在人癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)和功能i)通過用TRA-8原位染色測定的人癌組織中DR5的表達(dá)。為了確定癌細(xì)胞和癌組織是否差別表達(dá)較高水平的DR5，用TRA-8將一組人癌組織染色以供免疫組織化學(xué)分析，所述組的癌組織包括超過20種乳癌、6種卵巢癌、5種結(jié)腸癌和5種前列腺癌。這些癌組織中的大多數(shù)表達(dá)可檢測的DR5。這些癌組織中的DR5表達(dá)水平不等。一般而言，癌組織比非相關(guān)組織表達(dá)更高水平的DR5。另外，DR5表達(dá)顯然與p53突變無關(guān)。
ii)DR5在人癌細(xì)胞系中的表達(dá)和功能(表2)。檢查了9種人乳癌細(xì)胞系、3種卵巢癌系、3種結(jié)腸癌系和3種前列腺癌系的DR5細(xì)胞表面表達(dá)以及在體外對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。9種乳癌系中的7種、3種卵巢癌系中的3種、3種結(jié)腸癌系中的3種和3種前列腺癌系中的3種表達(dá)可變水平的細(xì)胞表面DR5。在9種乳癌系中，3種對TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡非常敏感，3種中度敏感，3種抗TRA-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。所有3種卵巢癌系都非常敏感。3種結(jié)腸癌系中的1種非常敏感，而2種具有中度敏感性。3種前列腺癌系中的2種具有中度敏感性，而1種為抗性。
表2.DR5在人癌細(xì)胞中的表達(dá)和功能
注釋1通過流式細(xì)胞術(shù)測定，細(xì)胞用20μg/ml TRA-8染色，與對照抗體進(jìn)行比較。2通過ATPLite測定來測量。++++超過80％被殺死，+++60-80％被殺死，++40-60％被殺死，+20-40％被殺死，-無殺傷。
iii)TRA-8和阿霉素的聯(lián)合細(xì)胞毒性。在幾個(gè)乳癌系中，檢查阿霉素對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。高劑量的阿霉素表現(xiàn)出相加效應(yīng)。然而，在某些TRA-8抗性系中，低劑量的阿霉素協(xié)同增強(qiáng)TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
iv)TRA-8對人癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)結(jié)合活性。使用放射性同位素標(biāo)記的TRA-8。在體外以及在植入腫瘤的SCID小鼠體內(nèi)檢查了TRA-8對乳癌系的結(jié)合活性。對癌細(xì)胞體外結(jié)合活性估計(jì)為Kd數(shù)值為3nM，這與我們先前用ELISA進(jìn)行的估計(jì)一致，所述活性至少是可溶性TRAIL的50倍。在體內(nèi)，TRA-8局限于植入的腫瘤組織。
15.2用TRA-8治療NOD/SCID小鼠的慢性溶淋巴細(xì)胞性白血病慢性溶淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)是一種常見形式的B細(xì)胞惡性腫瘤。CLL中的大多數(shù)惡性B細(xì)胞具有成熟表型，并且抗許多細(xì)胞凋亡刺激。檢查5位CLL患者的B細(xì)胞中DR5的表達(dá)和功能。所有患者的外周B細(xì)胞計(jì)數(shù)都高，正如在PBMC中有超過95％的CD19+B細(xì)胞所示的。與正常原代B細(xì)胞相比，所有患者的CLL B細(xì)胞的細(xì)胞表面DR5水平都較高，并且在體外對TRA-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感。有趣的是，CLL B細(xì)胞也對雙吲哚馬來酰亞胺VIII(BisVIII)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感。在用TRA-8和BisVIII聯(lián)合治療后，接近50％的CLL B細(xì)胞被殺死，而正常B細(xì)胞保持無反應(yīng)(圖18)。將CLL B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)移后5天約25-30％CD19+B細(xì)胞在受體小鼠的脾中重新建群。然而，三劑100μg TRA-8治療完全消除了受體SCID小鼠脾中5位患者中的4位患者的CLL B細(xì)胞。因此，單獨(dú)的TRA-8或者TRA-8與其它物質(zhì)聯(lián)合作為用于慢性溶淋巴細(xì)胞性白血病的治療藥是有效的。實(shí)施例16.cDNA克隆(1)TRA-8重鏈和輕鏈N末端氨基酸序列的測定為了獲得TRA-8重鏈和輕鏈的cDNA，用已知技術(shù)測定TRA-8的重鏈和輕鏈的N末端氨基酸序列以及克隆化TRA-8基因的N末端氨基酸序列。
將10μg含有抗人DR5抗體TRA-8的溶液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS-PAGE”)，所用的凝膠濃度為12％w/v，100V恒定電壓，電泳120分鐘。電泳后，將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液25mM Tris-HCl(pH9.5)、20％甲醇、0.02％v/v SDS中達(dá)5分鐘。此后，用印跡裝置(KS-8451；Marysol)，在10V恒定電壓、4℃條件下，將凝膠的蛋白質(zhì)內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至在轉(zhuǎn)移緩沖液中預(yù)浸泡的聚偏二氟乙烯膜(“PVDF膜”；孔徑0.45μm；Millipore，Japan)上達(dá)14小時(shí)。
此后，PVDF膜用洗滌緩沖液25mM NaCl、10mM硼酸鈉緩沖液(pH8.0)洗滌，然后在染色液(50％v/v甲醇、20％v/v乙酸和0.05％w/v考馬斯亮藍(lán))中染色5分鐘，以定位蛋白質(zhì)條帶。然后PVDF膜用90％v/v甲醇水溶液脫色，將先前位于PVDF膜上對應(yīng)于重鏈的條帶即遷移率較低的條帶、和對應(yīng)于輕鏈的條帶即遷移率較高的條帶切下，用去離子水洗滌。
用氣相蛋白質(zhì)測序儀(PPSQ-10；Shimadzu Seisakusyo，K.K.)，通過Edman自動化法(Edman，P.等，(1967)，Eur.J.Biochem.，1，80)，測定重鏈和輕鏈的N末端氨基酸序列。
對應(yīng)于重鏈的條帶的N末端氨基酸序列測定為Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu(序列表中的SEQ ID No.4)；而對應(yīng)于輕鏈的條帶的N末端氨基酸序列測定為Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-See-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser(序列表中的SEQ ID No.5)。
將這些氨基酸序列與Kabat等產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(Kabat E.A.等，(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological InterestVol.II，”U.S.Department of Health and Human Services)的比較揭示，TRA-8的重鏈(γ1鏈)和輕鏈(κ鏈)分別屬于亞型3d和亞型1。
(2)cDNA克隆根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，合成寡核苷酸引物，所述寡核苷酸預(yù)期與屬于這些小鼠亞型的基因的5’非翻譯區(qū)和3’翻譯區(qū)的真正末端(very ends)的部分雜交。然后，通過以下逆轉(zhuǎn)錄和PCR的組合(RT-PCR)，克隆編碼TRA-8重鏈和輕鏈的cDNAa)模板用TRIzol試劑(GIBCO BRL)提取TRA-8雜交瘤(ATCC No.PTA-1428)的總RNA。用于PCR反應(yīng)的模板利用通過采用第一鏈cDNA合成試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)按照試劑盒中提供的說明手冊獲得的cDNA。b)PCR引物合成以下PCR寡核苷酸引物5’-cagcactgaa cacggacccc-3’(H5NCS1序列表中的SEQ ID No.6)；5’-aaaggtaatt tattgagaag-3’(H5NCS2序列表中的SEQ ID No.7)；5’-cctcaccatg aacttcgggc-3’(H5SS1序列表中的SEQ ID No.8)；5’-ctgttgtatg cacatgagac-3’(H5SS2序列表中的SEQ ID No.9)；5’-gaagtgatgc tggtggagtc-3’(H5CS1序列表中的SEQ ID No.10)；5’-agtgtgaagt gatgctggtg-3’(H5CS2序列表中的SEQ ID No.11)；5’-tttaccagga gagtgggaga g-3’(H3CR序列表中的SEQ ID No.12)；5’-tgcagagaca gtgaccagag-3’(H3VR序列表中的SEQ ID No.13)；5’-tgttcaggac cagcatgggc-3’(L5NCS1序列表中的SEQ ID No.14)；5’-aagacatttt ggattctaac-3’(L5NCS2序列表中的SEQ ID No.15)；5’-tatcatgaag tctttgtatg-3’(L5SS1序列表中的SEQ ID No.16)；5’-gatggagaca cattctcagg-3’(L5SS2序列表中的SEQ ID No.17)；5’-gacattgtga tgacccagtc-3’(L5CS序列表中的SEQ ID No.18)；5’-ttaacactca ttcctgttga-3’(L3CR序列表中的SEQ ID No.19)；5’-gactgggtca tcacaatgtc-3’(LCSR序列表中的SEQ ID No.20)。
除非另有說明，否則這些實(shí)施例中的所有寡核苷酸都由PharmaciaBiotech合成。所有寡核苷酸在溶于蒸餾水后貯存于-20℃。c)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)溶液的組成模板cDNA，總共33μl反應(yīng)物中的5μl引物1，10pmol；引物2，10pmol；10×濃縮PCR緩沖液(試劑盒中提供的)，10μl；dNTPs(各2.5mM)，4μl；和Taq聚合酶(promega)，5單位。
將無菌蒸餾水加入到溶液中至100μl的總體積。除非另有說明，否則dNTPs為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩爾混合物(每種2.5mM)。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱2分鐘，此后將加熱至94℃30秒、52℃1分鐘和72℃3分鐘的循環(huán)重復(fù)40次。完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱10分鐘。
如此獲得的擴(kuò)增DNA片段在含有0.25μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分離。用剃刀刀片將確定含有所需DNA片段的條帶切下，用Gene Clean試劑盒(BIO101)從中回收所述DNA。用pGEM-T Easy載體(Promega)克隆所述DNA片段。這一步如下進(jìn)行。
將從PCR反應(yīng)溶液中回收的DNA片段同50ng pGEM-T Easy載體(試劑盒中提供的)一起，與其中加有4單位T4 DNA連接酶(1μl)的1μl10×連接酶反應(yīng)緩沖液(6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM氯化鎂、5mM氯化鈉、7mM β-巰基乙醇、0.1mM ATP、2mM DTT、1mM亞精胺和0.1mg/ml牛血清白蛋白)混合。用無菌去離子水將混合物的總體積調(diào)至10μl，將所得的連接酶溶液于14℃保溫15小時(shí)。此后，將2μl連接酶反應(yīng)溶液加入到其中加入2μl 0.5M β-巰基乙醇的50μl感受態(tài)大腸桿菌菌株JM109(由所述試劑盒提供，并且按照說明手冊使其成為感受態(tài))，將所得混合物在冰上保持30分鐘，然后于42℃保持30秒，再于冰上保持5分鐘。接著，將500μl含有2％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化鈉、2.5mM氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖的培養(yǎng)基(在下文稱為“SOC”培養(yǎng)基)加入到培養(yǎng)物中，將混合物于37℃振蕩孵育1小時(shí)。此后，將培養(yǎng)物涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素的L-肉湯瓊脂平板(1％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.5％w/v氯化鈉、0.1％w/v葡萄糖和0.6％w/v細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Difco))上。選擇在平板上出現(xiàn)的氨芐青霉素抗性菌落，用鉑接種環(huán)將其刮下，在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-肉湯培養(yǎng)基中于37℃下以200r.p.m.振蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，通過離心收獲細(xì)胞，用堿法從中制備質(zhì)粒DNA。將所得的質(zhì)粒對于TRA-8重鏈命名為質(zhì)粒pH62，或者對于TRA-8輕鏈命名為pL28。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌(E.coli)JM109/pH62和大腸桿菌JM109/pL28，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號分別為FERMBP-7560和FERM BP-7561。通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，用3700 DNA分析儀(ABI PRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，證實(shí)了編碼TRA-8重鏈和輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
TRA-8重鏈和輕鏈的核苷酸序列分別以序列表中的SEQ ID No.21和SEQ ID No.22給出。TRA-8重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別以序列表中的SEQ ID No.23和SEQ ID No.24給出。以上確立的TRA-8重鏈和輕鏈的N末端氨基酸序列完全匹配。此外，當(dāng)將所述重鏈和輕鏈的氨基酸序列與抗體的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較時(shí)，確定對于重鏈，SEQ ID No.21中的核苷酸編號58-414構(gòu)成可變區(qū)，而SEQ ID No.21中的核苷酸編號415-1392構(gòu)成恒定區(qū)。對于輕鏈，SEQ ID No.22中的核苷酸編號64-387構(gòu)成可變區(qū)，而SEQ ID No.22中的核苷酸編號388-702構(gòu)成恒定區(qū)。CDR的位置和序列通過比較與數(shù)據(jù)庫的同源性也得以闡明。TRA-8重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別示于SEQ ID No.25、SEQ ID No.26和SEQ ID No.27中。TRA-8輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別示于SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30中。實(shí)施例17.設(shè)計(jì)TRA-8抗體人源化形式(1)TRA-8可變區(qū)的分子建模采用一般稱為同源性建模的方法(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))，進(jìn)行TRA-8可變區(qū)的分子建模。將登錄于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)人免疫球蛋白可變區(qū)的一級序列(Nuc.Acid Res.28，235-242(2000))(可得到根據(jù)X射線晶體學(xué)得出的三維結(jié)構(gòu))與以上確定的TRA-8構(gòu)架區(qū)進(jìn)行比較。結(jié)果，1NCD和1HIL被選擇為分別與TRA-8的輕鏈和重鏈的構(gòu)架區(qū)具有最高序列同源性。通過將對應(yīng)于TRA-8輕鏈和重鏈的1NCD和1HIL的坐標(biāo)組合，產(chǎn)生構(gòu)架區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，以獲得“構(gòu)架模型”。采用Chothia等確定的分類法，TRA-8的CDR的類別確定如下CDRL1、CDRL2、CDRH1和CDRH2分別屬于典型的類別2、1、1、3，而CDRL3不屬于任何具體的典型類別。將CDRL1、CDRL2、CDRH1和CDRH2的CDR環(huán)固定為其相應(yīng)典型類別固有的構(gòu)象，并整合到所述構(gòu)架模型中。按照Thornton等的分類法(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))，CDRL3被賦予簇8A構(gòu)象；采用H3規(guī)則(H3 rule)(FEBS letter 455，188-197(1999))，CDRH3被分類為k(8)C。然后將CDRL3和CDRH3的相應(yīng)構(gòu)象整合到所述構(gòu)架模型中。
最后，進(jìn)行能量計(jì)算，以消除不利的原子間接觸，以便獲得就能量而論可能的TRA-8可變區(qū)的分子模型。用市售的常用分子建模系統(tǒng)ABM(Oxford Molecular Limited，Inc.)進(jìn)行上述程序。對于所獲得的分子模型，用軟件PROCHECK(J.Appl.Cryst.(1993)，26，283-291)進(jìn)一步評價(jià)所述結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。
(2)設(shè)計(jì)人源化TRA-8的氨基酸序列通過一般稱為CDR移植的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))進(jìn)行人源化TRA-8抗體的構(gòu)建。受體抗體的選擇基于構(gòu)架區(qū)的氨基酸同源性。將TRA-8中構(gòu)架區(qū)的序列與抗體氨基酸序列的Kabat數(shù)據(jù)庫(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))中的所有人構(gòu)架序列進(jìn)行比較。結(jié)果，mAB58’CL抗體被選擇為受體，因?yàn)闃?gòu)架區(qū)的序列同源性最高，為80％。將mAb58’CL構(gòu)架區(qū)的氨基酸殘基與TRA-8構(gòu)架區(qū)的氨基酸殘基進(jìn)行比對，鑒定出其中使用不同氨基酸的位置。用以上構(gòu)建的TRA-8的三維模型分析那些殘基的位置，根據(jù)Queen等給出的標(biāo)準(zhǔn)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))，選擇應(yīng)該移植到受體上的供體殘基。如以下實(shí)施例中所述，通過將若干供體殘基轉(zhuǎn)移到受體抗體mAb8’CL中，構(gòu)建人源化TRA-8序列。實(shí)施例18.所述人源化抗體重鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建(1)攜帶人源化TRA-8重鏈可變區(qū)DNA的質(zhì)粒的構(gòu)建為了測定人源化TRA-8的活性，如下構(gòu)建攜帶人源化TRA-8重鏈的質(zhì)粒。然而，應(yīng)該認(rèn)識到TRA-8的人源化不限于這些實(shí)施例。
如序列表的SEQ ID No.31中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8重鏈氨基酸序列的人源化，需要分別用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代第13號氨基酸(賴氨酸)、第19號氨基酸(賴氨酸)、第40號氨基酸(蘇氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酸)、第44號氨基酸(精氨酸)、第84號氨基酸(絲氨酸)、第88號氨基酸(絲氨酸)、第93號氨基酸(甲硫氨酸)、第114號氨基酸(蘇氨酸)、第115號氨基酸(亮氨酸)。
如下構(gòu)建攜帶編碼人源化TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA(序列表的SEQ ID No.31)的質(zhì)粒。
用PCR構(gòu)建以下DNA序列，每種序列的構(gòu)成描述如上合成以下12種寡核苷酸5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtagcaacagctac aggtgtccac-3’(A；SEQ ID No.32)；5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgagactctcctgtg cagcctctgg-3’(B；SEQ ID No.33)；5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctggagtgggttgca accattagta-3’(C；SEQ ID No.34)；5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagagacaatgccaa gaacaccctg-3’(D；SEQ ID No.35)；5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaaggggtgactcta tgattacgac-3’(E；SEQ ID No.36)；5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccatcggtc-3’(F；SEQ ID No.37)；5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3’(G；SEQ ID No.38)；5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcagagtggacacct gtagctgttg-3’(H；SEQ ID No.39)；
5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaatccagaggctg cacaggagag-3’(I；SEQ ID No.40)；5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccactactaatggt tgcaacccac-3’(J；SEQ ID No.41)；5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagatacagggtgttc ttggcattgt-3’(K；SEQ ID No.42)；and5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagtagtccgtcgta atcatagagt cacc-3’(L；SEQ ID No.43).
The following 2 PCR primers are synthesized as described above5’-ttggataagc ttggcttgac-3’(P1；SEQ ID No.44)；和5’-gaccgatggg cccttggtgg a-3’(P2；SEQ ID No.45).
分別用一種組合的PCR，進(jìn)行編碼多肽鏈的DNA的合成，所述多肽鏈包含一個(gè)分泌信號序列、一個(gè)人源化TRA-8重鏈可變區(qū)和位于IgG-CH1區(qū)N末端的8個(gè)氨基酸殘基。
如下制備所述DNA片段。所述PCR反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸A，10pmol；寡核苷酸B，10pmol；寡核苷酸C，10pmol；寡核苷酸D，10pmol；寡核苷酸E，10pmol；寡核苷酸F，10pmol；寡核苷酸G，10pmol；寡核苷酸H，10pmol；寡核苷酸I，10pmol；寡核苷酸J，10pmol；寡核苷酸K，10pmol；
寡核苷酸L，10pmol；寡核苷酸引物P1，2μM；寡核苷酸引物P2，2μM；10×Pyrobest緩沖液II，10μl；dNTP混合物，8μl；Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和重蒸水至終體積50μl。
PCR反應(yīng)如下進(jìn)行。首先將溶液于94℃加熱5分鐘，然后將加熱至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)7次。在完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱15分鐘。
將等體積的苯酚-氯仿(50％v/v用水飽和的苯酚、48％v/v氯仿、2％v/v異戊醇)加至200μl的每種PCR產(chǎn)物中，劇烈混合1分針。此后，將混合物以10,000×g離心，回收水層，將其與等體積的氯仿-異戊醇(96％v/v氯仿和4％v/v異戊醇)混合，將其再次劇烈混合并以10,000×g離心，回收水層。在本段落中引述的系列步驟稱為“酚抽提”。
然后對回收的水層進(jìn)行乙醇沉淀。本文所用和提及的“乙醇沉淀”包括將十分之一體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的100％乙醇加入到待處理溶液中并將其混合，用干冰冷凍所述混合物。然后所得的混合物以10,000×g離心，以回收作為沉淀的DNA。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，將所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最小量的重蒸水中，并且通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下對應(yīng)于人源化TRA-8 DNA的DNA條帶，用GenecleanSpin試劑盒(BIO 101，CA，USA)從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中。
用pGEM-T Easy載體(Promega)，將所得的每種提取DNA如下克隆從所述PCR反應(yīng)中回收的DNA片段，5μl；10×Taq聚合酶緩沖液，1μl；dNTP混合物，1μl；Taq聚合酶(5單位/ml)，1μl；和重蒸水至終體積10μl。
在上述每種溶液于70℃反應(yīng)30分鐘后，用DNA連接試劑盒(DNALigation Kit)Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd)，使用生產(chǎn)商的方案，連接每種DNA溶液和pGEM-T Easy載體。
在于15℃保溫4小時(shí)后，將2μl經(jīng)保溫的反應(yīng)溶液與細(xì)胞密度為1-2×109細(xì)胞/ml的100μl感受態(tài)大腸桿菌菌株JM109(Takara ShuzoCo.，Ltd.)混合，將混合物在冰上保持30分鐘，然后于42℃保持30秒，再次在冰上保持1分鐘。然后，將500μl SOC培養(yǎng)基(2％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化鈉、2.5mM w/v氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖)加入到混合物中，將其再振蕩孵育1小時(shí)。然后分離轉(zhuǎn)化菌株，如“Molecular Cloning A Laboratory Manual”中所述，從菌株中制備質(zhì)粒DNA。通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，證實(shí)編碼人源化TRA-8重鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得質(zhì)粒命名為pHB14(攜帶編碼人源化TRA-8重鏈的cDNA的質(zhì)粒)。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌JM109/pHB14，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7556。
(2)攜帶人源化TRA-8重鏈可變區(qū)DNA的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建如下通過插入編碼人源化TRA-8重鏈的DNA(在上述克隆的)，構(gòu)建用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體。
1μg用于哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體-攜帶人源化抗Fas單克隆抗體HFE7A重鏈可變區(qū)和人IgG1恒定區(qū)基因組DNA的質(zhì)粒pSRHHH3(歐洲專利申請EP 0-909-816-A1)用限制性酶HindIII和ApaI消化，通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下含有人IgG1恒定區(qū)基因組DNA但無人源化HFE7A重鏈可變區(qū)的載體DNA條帶，用Geneclean Spin試劑盒(BIO 101，CA，USA)從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，將所得的經(jīng)消化的去磷酸化質(zhì)粒(100ng)與1μg也用HindIII和ApaI消化的含有編碼人源化TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA的pHB14 DNA片段連接。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上鋪平板。
將用該方法獲得的轉(zhuǎn)化子在2ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，隨后用堿-SDS法從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。
所提取的質(zhì)粒DNA用HindIII和ApaI消化，經(jīng)過3％w/v瓊脂糖凝膠電泳，以證實(shí)編碼人源化TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA的插入片段存在或不存在。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在所述載體中的插入和方向。所得的攜帶編碼人源化TRA-8重鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pHB14-1。實(shí)施例19.所述人源化抗體輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建(1)用于人源化形式的TRA-8抗體輕鏈的載體的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.46中所示，在使小鼠抗人DR5抗體TRA-8的輕鏈氨基酸序列人源化時(shí)，分別用脯氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和蘇氨酸取代TRA-8輕鏈氨基酸序列N末端的第8號氨基酸(組氨酸)、第9號氨基酸(賴氨酸)、第10號氨基酸(苯丙氨酸)、第11號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(蘇氨酸)、第20號氨基酸(絲氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酰胺)、第43號氨基酸(絲氨酸)、第60號氨基酸(天冬氨酸)、第63號氨基酸(蘇氨酸)、第77號氨基酸(天冬酰胺)、第78號氨基酸(纈氨酸)、第80號氨基酸(絲氨酸)、第83號氨基酸(亮氨酸)、第85號氨基酸(天冬氨酸)、第87號氨基酸(苯丙氨酸)和第99號氨基酸(甘氨酸)、第103號氨基酸(亮氨酸)和第108號氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名為LM2。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列的表達(dá)質(zhì)粒。
1)用于制備人源化TRA-8輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM2多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.46)的DNA，其中每種都是人源化抗DR5抗體TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈(κ鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3’(HKDPR11；SEQ ID No.49)；5’-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc -3’(HKCDF11；SEQ ID No.50)；5’-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg -3’(HKCDR12；SEQ ID No.51)；5’-tgggcatcca cccggcacac tggggtceca agcaggttta gtggcagt -3’(HKCDF22；SEQ ID No.52)；5’-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagatggt -3’(HKCDR22；SEQ ID No.53)；和5’-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggactgtg -3’(HKCF12；SEQ ID No.54).
2)質(zhì)粒pCR3.1/M2-1的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備序列表的SEQ ID No.55中限定的、編碼序列表的SEQ ID No.46中限定的氨基酸序列的LM2-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM2-F1-DNA片段，該片段編碼一個(gè)分泌信號序列和FRL1區(qū)的一部分，并且在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)。模板質(zhì)粒pHSGHM/17和pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0909 816 A1中描述的方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pHSGHM17 DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)，25ng寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物HKSPR11，50pmoldNTPs混合物，5μl
10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼FRL1的一部分、CDRL1、FRL2和CDRL2的LM2-F2-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pL28 DNA，25ng寡核苷酸引物HKCDF11，50pmol寡核苷酸引物HKCDR12，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼CDRL2、FRL3和CDRL3一部分的LM2-F3-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)，25ng寡核苷酸引物HKCDF22，50pmol寡核苷酸引物HKCDR22，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼CDRL3、FRL4和恒定區(qū)且在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的LM2-F4-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA，25ng寡核苷酸引物HKCF12，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀刀片切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM2-F1-DNA、LM2-F2-DNA、LM2-F3-DNA和LM2-F4-DNA片段融合的LM2-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM2-F1-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM2-F2-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM2-F3-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM2-F4-DNA凝膠片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(Invitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM2-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，證實(shí)編碼人源化TRA-8輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/M2-1(攜帶編碼人源化TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM2-DNA的質(zhì)粒pCR3.1/M2-1用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III和EcoR I消化的LM2-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM2-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶人源化LM2 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M2-1-4。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSG/M2-1-4，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7563。
3)質(zhì)粒pSR/M2-1(人源化LM2 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶人源化LM2 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M2-1-4用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0-909-816-A1)用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/M2-1-4中獲得的HindIII-EcoR I DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在pSRPDHH載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼人源化TRA-8輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/M2-1。實(shí)施例20.人源化抗體的生產(chǎn)采用FUGENE6轉(zhuǎn)染試劑法(Boehringer Mannheim Biochemica)，按照試劑盒中提供的說明手冊，用以上獲得的人源化TRA-8重鏈和人源化TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，即得自猴腎的細(xì)胞系。
讓COS-7細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心No.CRL-1651)在含有補(bǔ)充10％胎牛血清(在下文縮寫為“FCS”；Moregate)的Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(在下文稱為“D-MEM”；Gibco BRL)的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)面積57cm2；Sumitomo Bakelite)中生長至半?yún)R合(3×106細(xì)胞/皿)。
同時(shí)，將用堿-SDS法制備的10μg/皿(總共5皿)的人源化DR5重鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA(pHA15-1)和10μg/皿的人源化DR5輕鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA與氯化銫密度梯度離心物混合，然后用乙醇沉淀，接著懸浮于5μl/皿的dH2O中。
在將15μl/皿的FUGENE6轉(zhuǎn)染試劑與180μl/皿無FCS的D-MEM混合后，將該FUGENE溶液(185μl/皿)與5，皿含有10μg/皿人源化DR5重鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA和10μg/皿人源化DR5輕鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA的DNA溶液混合。于室溫孵育15分鐘后，將所得的質(zhì)粒懸浮液(200μl)加入到預(yù)先制備的COS-7平板上。在5％CO2、37℃下孵育24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為無FCS的D-MEM。在5％CO2、37℃下孵育72小時(shí)后，回收培養(yǎng)上清液，以純化上清液中的表達(dá)產(chǎn)物。采用如上所述的方法，用每種以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(A)無質(zhì)粒DNA(B)pHB14-1和pSR/M2-1共轉(zhuǎn)染然后將培養(yǎng)物離心(1,000r.p.m.，5分鐘)，收集上清液。將上清液再次離心(9,800r.p.m.，15分鐘)，并用0.45μm濾膜(ADVANTEC TOYODISMIC-25cs，Cat # 25CS045 AS)過濾。用G蛋白-POROS親和色譜(Applied Biosystems)在以下條件下完成從濾液中純化IgGHpLCBioCAD 700E(Applied Biosystems)柱子G蛋白-ID傳感柱(柱尺寸2.1mmID×30mm LD，床體積0.1ml；Cat # 2-1002-00，Applied Biosystems)洗脫緩沖液0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)中和緩沖液1M Tris-HCl(pH8.5)檢測280nm
流速1ml/min流分大小0.5ml/0.5min流分收集管1.5ml聚丙烯微量試管溫度4℃在所有濾液上柱后，用30ml PBS(Sigma，Cat # 1000-3)洗滌柱子。當(dāng)將洗脫緩沖液上柱后，開動流分收集器。每個(gè)流分收集微量試管預(yù)先含有55μl 1M NaCl、110μl中和緩沖液和74μl 2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma，Cat # A-7030)的PBS溶液。收集第8-10號的流分，用Slide-A-lyzer(Pierce，Cat # 66450)，將其對1升PBS(pH7.5)于4℃透析1天。更換兩次透析緩沖液。
通過ELISA，用針對抗人IgG的抗體，進(jìn)行所制備的培養(yǎng)上清液中所述人源化抗體表達(dá)的證實(shí)以及所述表達(dá)產(chǎn)物的定量測定。
向96孔板(MaxiSorp，Nunc)的各孔中，加入100μl以0.5μg/ml的終濃度溶于吸附緩沖液(0.05M碳酸氫鈉，0.02％疊氮化鈉，pH9.6)的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆抗體(Kappel)，將孔板于37℃保溫2小時(shí)，以使得抗體吸附。然后，所述板用350μl含有0.05％Tween-20(BioRad)的PBS(-)(在下文稱為“PBS-T”)洗滌5次。洗滌后，向各孔加入用含10％FCS的D-MEM稀釋的培養(yǎng)上清液，于37℃保溫2小時(shí)。用PBS-T再次洗滌后，向各孔加入100μl用PBS-T稀釋10,000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆抗體(Jackson Immuno ResearchLab.)，于37℃保溫2小時(shí)。用PBS-T再次洗滌后，按照試劑盒中提供的說明手冊，加入得自堿性磷酸酶底物試劑盒(Alkaline PhosphataseSubstrate kit)(Bio Rad)的對硝基苯磷酸底物溶液。于37℃保溫0.5-1小時(shí)后，測量405nm的吸光度。在所述實(shí)驗(yàn)中，使用以含10％FCS的D-MEM稀釋至一定濃度的人血漿免疫球蛋白G亞類1(IgG1)(BiopureAG)作為所述培養(yǎng)上清液中含有的人源化DR5抗體的濃度參比樣品。
結(jié)果，用所述抗人IgG抗體特異性地檢測培養(yǎng)上清液中的表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物。人IgG抗體的量為8.96μg(800μl)。實(shí)施例21.人源化抗體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性用Jurkat細(xì)胞(ATCC No.TIB-152)檢查純化的人源化TRA-8抗體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
Jurkat細(xì)胞在含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco BRL)中在5％CO2存在下于37℃培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)的所述細(xì)胞以50μl/孔分配到96孔微量培養(yǎng)板(Sumitomo Bakelite)的各孔中。通過按照實(shí)施例20中所述的方法估計(jì)所述培養(yǎng)液中感興趣的終產(chǎn)物的濃度，用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基將實(shí)施例20中制備的人源化TRA-8調(diào)至100ng/ml的感興趣的終產(chǎn)物濃度。用每種如此調(diào)至100ng/ml的表達(dá)產(chǎn)物的溶液，通過用含10％FCS的PRMI1640重復(fù)連續(xù)的2倍稀釋，產(chǎn)生連續(xù)稀釋液。將每種稀釋的人源化TRA-8溶液以50μl/孔加入到各孔中。于37℃反應(yīng)12小時(shí)后，加入50μl含有1mg/ml XTT(2，3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-羧基aniride內(nèi)鹽；Sigma ChemicalCo.)的25μM PMS(吩嗪硫酸甲酯；Sigma Chemical Co.)(XTT的終濃度為250μg/ml，而PMS的終濃度為5μM)。在孵育3小時(shí)后，利用線粒體的還原能力作為指標(biāo)，測量各孔的450nm吸光度以便計(jì)算細(xì)胞生存力。
各孔中細(xì)胞的生存力按照以下公式計(jì)算生存力(％)＝100×(a-b)/(c-b)其中“a”為試驗(yàn)孔的測量結(jié)果，“b”是無細(xì)胞孔的測量結(jié)果，而“c”是未加入抗體孔的測量結(jié)果。
結(jié)果，證明實(shí)施例20中制備的表達(dá)產(chǎn)物(人源化TRA-8)在表達(dá)人DR5抗原的T淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例22.TRA-8對各種DR5分子的反應(yīng)性為了確定TRA-8對各種DR5分子的反應(yīng)性，用活化淋巴細(xì)胞如下檢查TRA-8的反應(yīng)性。
首先，從人(30ml)、狨(3ml)和獼猴(20ml)取外周血樣品。在血樣中加入1ml肝素(Novoheparin；Novo)，然后將樣品緩慢鋪在等體積Ficoll-Paque PLUS溶液((Amersham Pharmacia Biotech.)比重1.077，獼猴除外，其比重為1.072)上，以1,700r.p.m.離心30分鐘，以便獲得外周血單核細(xì)胞部分。這一單核細(xì)胞部分用Hank氏平衡鹽溶液洗滌兩次，然后懸浮于含10％v/v FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，至1×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。將植物凝集素-P(PHA-P，Sigma Chemicals，Co.)加入所得的懸浮液中至5μg/ml的終濃度，樣品在5％v/v CO2、37℃下孵育24小時(shí)。此后，通過離心回收細(xì)胞，用含10％v/v FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌并重懸于該培養(yǎng)基中。然后，為了活化所回收的細(xì)胞，將白介素-2(Amersham Pharmacia Biotech.)加入懸浮液中至終濃度10單位/ml，將其在5％v/v CO2、37℃下孵育72小時(shí)。
將計(jì)算含有1×106活化淋巴細(xì)胞的量的活化制備物置于試管中，或者懸浮于50μl含0.5、1、5、10μg/ml TRA-8的PBS中，或者懸浮于50μl PBS中。讓所得的懸浮液在冰上靜置1小時(shí)，此后細(xì)胞用500μl等份的PBS洗滌3次，然后懸浮于50μl含20μg/ml FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Bioresource)的PBS中。用500μl PBS中懸浮的所述細(xì)胞作為對照，用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur；Becton Dickinson)測量熒光強(qiáng)度。
根據(jù)熒光強(qiáng)度獲得細(xì)胞數(shù)的分布，計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例。進(jìn)而用TRA-8濃度和染色細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比率計(jì)算每種Kd值。與人、狨和獼猴的活化淋巴細(xì)胞的每種反應(yīng)性頻率幾乎是相同的。因此，TRA-8能夠結(jié)合各種各樣的靈長類DR5，包括最初制備的TRA-8所針對人DR5。實(shí)施例23.狨體內(nèi)TRA-8逐步增加劑量的研究用1只雄性和1只雌性狨進(jìn)行一項(xiàng)TRA-8的逐步增加劑量的初步毒性研究。進(jìn)行三組一次靜脈給藥，每次間隔7天的停藥期。TRA-8的劑量設(shè)定為50、250和1250μg/動物體。每次治療后48小時(shí)，從股靜脈收集血液，制備血漿。用分析儀(FUJI DRI-CHEMFuji Film MedicalCo.，Ltd.)測量血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性。所有血液的抽取都不用麻醉。結(jié)果，沒有證據(jù)表明，在每次治療后在血漿生化檢查中注意到有肝損傷。實(shí)施例24.TRA-8對癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)藥理學(xué)研究為了確定TRA-8是否在抗腫瘤治療中有治療功效，用各種癌細(xì)胞系如下檢查了TRA-8的體外殺傷活性。
將得自Gibco BRL、在含有10％FCS(Gibco BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基(用于Jurkat)、DMEM培養(yǎng)基(用于HCT-116)、MEM-R(用于WiDr)或DMEM-F12(用于COL2-Jck)中在5％CO2、37℃下培養(yǎng)的各種癌細(xì)胞(2-8×103細(xì)胞/50μl)分配到96孔微量培養(yǎng)板(SumitomoBakelite)的各孔中。用含10％FCS的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)TRA-8，使得感興趣的終產(chǎn)物的濃度為100ng/ml。用所述TRA-8溶液(100ng/ml)通過用含10％FCS的培養(yǎng)基重復(fù)連續(xù)2倍稀釋，產(chǎn)生連續(xù)稀釋液。將每種稀釋的TRA-8溶液以50μl/孔加入到各孔中，于37℃孵育。于37℃反應(yīng)72小時(shí)后，加入50μl含有1mg/ml XTT的25μM PMS(吩嗪硫酸甲酯；Sigma Chemical Co.)(XTT的終濃度為250μg/ml，而PMS的終濃度為5μM)。在孵育3小時(shí)后，利用線粒體的還原能力作為指標(biāo)，測量各孔的450nm吸光度以計(jì)算細(xì)胞生存力。
各孔中細(xì)胞的生存力按照以下公式計(jì)算生存力(％)＝100×(a-b)/(c-b)其中“a”為試驗(yàn)孔的測量結(jié)果，“b”是無細(xì)胞孔的測量結(jié)果，而“c”是未加入抗體孔的測量結(jié)果。
結(jié)果示于以下表3中。
表3
在體外條件下，TRA-8對各種癌細(xì)胞系強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
此外，測定了TRA-8在移植WiDr細(xì)胞的裸鼠中的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，因?yàn)門RA-8與鼠DR5無交叉反應(yīng)。
將TRA-8抗人DR5抗體給予帶有表達(dá)人DR5分子的人類異種移植物的裸鼠。所用的小鼠是6周齡BALb/c nude/nude小鼠(雌性，得自Clea Japan Inc.)，它們移植有人結(jié)腸癌細(xì)胞系WiDr(5mm3)。在腫瘤移植后1天，這些移植的小鼠每日通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射TRA-8(5μg/動物體)治療14次。根據(jù)腫瘤塊的大小每日測量WiDr腫瘤的生長。結(jié)果示于以下表4中。
表4
在該模型中，通過腫瘤的大小證明，所有未經(jīng)治療的動物表現(xiàn)出可見的腫瘤生長，而在TRA-8治療的動物中腫瘤的生長受到抑制。這一結(jié)果表明，TRA-8在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞消除方面有效。實(shí)施例25.TRA-8的聯(lián)合研究人前列腺癌細(xì)胞系PC-3得自美國組織培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)、1％L-谷氨酰胺-200mM(25030-149，Gibco BRL)和0.5％青霉素鏈霉素溶液(PenicillinStreptomycin Solution)(P-7539，Sigma)的F-12K營養(yǎng)混合物(NutrientMixture)(21127-022，Gibco BRL)中維持。在以下實(shí)驗(yàn)中使用補(bǔ)充10％FBS和0.5％青霉素鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基(MED-008，IWAKI)。通過胰蛋白酶處理收集指數(shù)生長的PC-3細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次。然后在實(shí)驗(yàn)開始之前1天對細(xì)胞計(jì)數(shù)，將其以5×104細(xì)胞/ml的密度重懸于新鮮培養(yǎng)基中，以三份重復(fù)分配到平底96孔板(3598，Corning-Coster)中，總體積為100μl/孔。將溶于二甲基亞砜的典型抗腫瘤藥紫杉醇(Paclitaxel)(169-18611，Wako)(10mg/ml)在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，然后以50μl/孔加入到含有細(xì)胞的96孔板中。二甲基亞砜的終濃度低于0.1％。在37℃、5％CO2環(huán)境下孵育24小時(shí)后，向各孔中加入在新鮮培養(yǎng)基中稀釋的TRA-8。再孵育24小時(shí)后，向各孔中加入50μl含有1mg/ml XTT和25 mM PMS的極限必需培養(yǎng)基(11095-098，Gibco BRL)中，將板孵育6小時(shí)。然后用SPECTRA MAX250(Molecular Devices)測量OD450，并如下計(jì)算細(xì)胞生存力。
細(xì)胞生存力(％)＝(含用紫杉醇(Taxol)和/TRA-8(藥物)處理的細(xì)胞孔的OD450-不含細(xì)胞也不含藥物孔的OD450)×100/(含細(xì)胞但無藥物孔的OD450-不含細(xì)胞也不含藥物孔的OD450)上述TRA-8與典型抗腫瘤藥紫杉醇(Paclitaxel)聯(lián)合的測定的結(jié)果如下。紫杉醇(Paclitaxel)降低了PC-3細(xì)胞的細(xì)胞生存力，但在至多200nM的濃度下，仍有超過40％指示活的癌細(xì)胞的信號。值得注意的是，加入0.1ng/ml TRA-8大大降低了癌細(xì)胞的細(xì)胞生存力，降至10％，即使在應(yīng)用一次該濃度的TRA-8后觀察到細(xì)胞生存力沒有降低。這一結(jié)果清楚地表明，TRA-8當(dāng)與其它抗腫瘤藥聯(lián)合時(shí)，協(xié)同顯示出抗腫瘤活性。實(shí)施例26.TRA-8的其它類型人源化抗體的分析(1)設(shè)計(jì)人源化抗體通過一般稱為CDR移植的方法進(jìn)行人源化形式的TRA-8的構(gòu)建。如參比實(shí)施例2中所述將mAB58’CL抗體用作受體，將TRA-8抗體的CDR區(qū)移植到該受體上。在構(gòu)架區(qū)中，根據(jù)Queen等給出的標(biāo)準(zhǔn)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))，將某些氨基酸從或者TRA-8或者人共有序列移植到該受體上，如下所述構(gòu)建人源化TRA-8序列。
(2)攜帶其它類型人源化TRA-8或小鼠TRA-8的重鏈可變區(qū)DNA的質(zhì)粒的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.56中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8重鏈氨基酸序列的H1型人源化需要分別用谷氨酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代第3號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(賴氨酸)、第19號氨基酸(賴氨酸)、第40號氨基酸(蘇氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酸)、第44號氨基酸(精氨酸)、第84號氨基酸(絲氨酸)、第88號氨基酸(絲氨酸)、第93號氨基酸(甲硫氨酸)、第114號氨基酸(蘇氨酸)、第115號氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.59中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8重鏈氨基酸序列的H3型人源化需要分別用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代第13號氨基酸(賴氨酸)、第19號氨基酸(賴氨酸)、第40號氨基酸(蘇氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酸)、第44號氨基酸(精氨酸)、第88號氨基酸(絲氨酸)、第93號氨基酸(甲硫氨酸)、第114號氨基酸(蘇氨酸)、第115號氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.60中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8重鏈氨基酸序列的H4型人源化需要分別用谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和纈氨酸取代第13號氨基酸(賴氨酸)、第19號氨基酸(賴氨酸)、第88號氨基酸(絲氨酸)、第93號氨基酸(甲硫氨酸)、第114號氨基酸(蘇氨酸)、第115號氨基酸(亮氨酸)。
如序列表的SEQ ID No.61中所示，攜帶嵌合TRA-8重鏈可變區(qū)DNA的質(zhì)粒命名為“M型”。另外，實(shí)施例17和18中所述的人源化TRA-8命名為“H2型”。
如下構(gòu)建攜帶編碼人源化或嵌合TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA的質(zhì)粒。
用PCR構(gòu)建以下DNA序列，每種序列的構(gòu)成描述如上合成以下24種寡核苷酸5’-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtagcaacagctac aggtgtccac -3’(A；SEQ ID No.32)；5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgagactctcctgtg cagcctctgg -3’(B；SEQ ID No.33)；5’-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgagactctcctgtg cagcctctgg -3’(B2；SEQ ID No.57)；5’-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaactctcctgtg cagcctctgg -3’(B3；SEQ ID No.66)；5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctggagtgggttgca accattagta -3’(C；SEQ ID No.34)；5’-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctggagtgggttgca accattagta -3’(C2；SEQ ID No.64)；5’-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagagacaatgccaa gaacaccctg-3’(D；SEQ ID No.35)；5’-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaaggggtgactcta tgattacgac -3’(E；SEQ ID No.36)；
5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaaggggtgactcta tgattacgac -3’(E2；SEQ ID No.62)；5’-tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaaggggtgactcta tgattacgac -3’(E3；SEQ ID No.67)；5’-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccatcggtc -3’(F；SEQ ID No.37)；5’-ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccatcggtc -3’(F2；SEQ ID No.68)；5’-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3’(G；SEQ ID No.38)；5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcagagtggacacct gtagctgttg -3’(H；SEQ ID No.39)；5’-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcagagtggacacct gtagctgttg -3’(H2；SEQ ID No.58)；5’-tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcagagtggacacct gtagctgttg -3’(H3；SEQ ID No.69)；5’-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaatccagaggctg cacaggagag -3’(I；SEQ ID No.40)；5’-tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaatccagaggctg cacaggagag -3’(I2；SEQ ID No.65)；5’-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccactactaatggt tgcaacccac -3’(J；SEQ ID No.41)；5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagatacagggtgttc ttggcattgt -3’(K；SEQ ID No.42)；5’-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagatacagggtgttc ttggcattgt -3’(K2；SEQ ID No.63)；5’-ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagatacagggtgttc ttggcattgt -3’(K3；SEQ ID No.70)；5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagtagtccgtcgta atcatagagt cacc -3’(L；SEQ ID No.43)和
5’-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagtagtccgtcgta atcatagagt cacc -3’(L2；SEQ ID No.71).
如上所述合成以下2種PCR引物5’-ttggataagc ttggcttgac -3’(P1；SEQ ID No.44)；和5’-gaccgatggg cccttggtgg a -3’(P2；SEQ ID No.45).
分別用一種組合的PCR，進(jìn)行編碼多肽鏈的H1型DNA的合成，所述多肽鏈包含一個(gè)分泌信號序列、一個(gè)人源化TRA-8重鏈可變區(qū)和IgG-CH1區(qū)N末端的8個(gè)氨基酸殘基。
如下制備H1型DNA片段。
PCR反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸A，10pmol；寡核苷酸B2，10pmol；寡核苷酸C，10pmol；寡核苷酸D，10pmol；寡核苷酸E，10pmol；寡核苷酸F，10pmol；寡核苷酸G，10pmol；寡核苷酸H2，10pmol；寡核苷酸I，10pmol；寡核苷酸J，10pmol；寡核苷酸K，10pmol；寡核苷酸L，10pmol；寡核苷酸引物P1，2μM；寡核苷酸引物P2，2μM；10×Pyrobest緩沖液II，10μl；dNTP混合物，8μl；Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和重蒸水至終體積50μl。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱5分鐘，此后重復(fù)7次循環(huán)加熱至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分鐘。在完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱15分鐘。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，將所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最小量的重蒸水中，并且通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下對應(yīng)于H1型DNA的DNA條帶，用Geneclean Spin Kit(BIO 101，CA，USA)從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中。
分別用一種組合的PCR，進(jìn)行編碼多肽鏈的H3型DNA的合成，所述多肽鏈包含一個(gè)分泌信號序列、一個(gè)人源化TRA-8重鏈可變區(qū)和IgG-CH1區(qū)N末端的8個(gè)氨基酸殘基。
如下制備H3型DNA片段。
PCR反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸A，10pmol；寡核苷酸B，10pmol；寡核苷酸C，10pmol；寡核苷酸D，10pmol；寡核苷酸E2，10pmol；寡核苷酸F，10pmol；寡核苷酸G，10pmol；寡核苷酸H，10pmol；寡核苷酸I，10pmol；寡核苷酸J，10pmol；寡核苷酸K2，10pmol；寡核苷酸L，10pmol；
寡核苷酸引物P1，2μM；寡核苷酸引物P2，2μM；10×Pyrobest緩沖液II，10μl；dNTP混合物，8μl；Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和重蒸水至終體積50μl。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱5分鐘，此后重復(fù)7次循環(huán)加熱至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分鐘。在完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱15分鐘。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，將所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最小量的重蒸水中，并且通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下對應(yīng)于H3型DNA的DNA條帶，用Geneclean Spin Kit從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中。
分別用一種組合的PCR，進(jìn)行編碼多肽鏈的H4型DNA的合成，所述多肽鏈包含一個(gè)分泌信號序列、一個(gè)人源化TRA-8重鏈可變區(qū)和IgG-CH1區(qū)N末端的8個(gè)氨基酸殘基。
如下制備H4型DNA片段。
PCR反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸A，10pmol；寡核苷酸B，10pmol；寡核苷酸C2，10pmol；寡核苷酸D，10pmol；寡核苷酸E2，10pmol；寡核苷酸F，10pmol；寡核苷酸G，10pmol；寡核苷酸H，10pmol；
寡核苷酸I2，10pmol；寡核苷酸J，10pmol；寡核苷酸K2，10pmol；寡核苷酸L，10pmol；寡核苷酸引物P1，2μM；寡核苷酸引物P2，2μM；10×Pyrobest緩沖液II，10μl；dNTP混合物，8μl；Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和重蒸水至終體積50μl。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱5分鐘，此后重復(fù)7次循環(huán)加熱至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分鐘。在完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱15分鐘。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，將所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最小量的重蒸水中，并且通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下對應(yīng)于H4型DNA的DNA條帶，用Geneclean Spin Kit從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中。
分別用一種組合的PCR，進(jìn)行編碼多肽鏈的M型DNA的合成，所述多肽鏈包含一個(gè)分泌信號序列、一個(gè)嵌合TRA-8重鏈可變區(qū)和IgG-CH1區(qū)N末端的8個(gè)氨基酸殘基。
如下制備M型DNA片段。
PCR反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸A，10pmol；寡核苷酸B3，10pmol；寡核苷酸C2，10pmol；寡核苷酸D，10pmol；
寡核苷酸E3，10pmol；寡核苷酸F2，10pmol；寡核苷酸G，10pmol；寡核苷酸H3，10pmol；寡核苷酸I2，10pmol；寡核苷酸J，10pmol；寡核苷酸K3，10pmol；寡核苷酸L2，10pmol；寡核苷酸引物P1，2μM；寡核苷酸引物P2，2μM；10×Pyrobest緩沖液II，10μl；dNTP混合物，8μl；Pyrobest DNA聚合酶，0.5μl；和重蒸水至終體積50μl。
如下進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先將溶液于94℃加熱5分鐘，此后重復(fù)7次循環(huán)加熱至98℃10秒、55℃30秒和72℃1分鐘。在完成該程序后，將反應(yīng)溶液于72℃加熱15分鐘。
在酚抽提和乙醇沉淀之后，將所得的DNA沉淀真空干燥，溶于最小量的重蒸水中，并且通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下對應(yīng)于M型DNA的DNA條帶，用Geneclean Spin Kit從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中。
用pGEM-T Easy載體(Promega)，如下克隆所得的每種提取的DNA(H1型、H3型、H4型和M型)從所述PCR反應(yīng)中回收的DNA片段(H1型、H3型、H4型或M型)，5μl；10×Taq聚合酶緩沖液，1μl；
dNTP混合物，1μl；Taq聚合酶(5單位/ml)，1μl；和重蒸水至終體積10μl。
在上述每種溶液于70℃反應(yīng)30分鐘后，用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Shuzo Co.，Ltd)，使用生產(chǎn)商的方案，連接每種DNA溶液和pGEM-T Easy載體。
在于15℃保溫4小時(shí)后，將2μl經(jīng)保溫的反應(yīng)溶液與細(xì)胞密度為1-2×109細(xì)胞/ml的100μl感受態(tài)大腸桿菌菌株JM109(Takara ShuzoCo.，Ltd.)混合，將混合物在冰上保持30分鐘，然后于42℃保持30秒，再次在冰上保持1分鐘。然后，將500μl SOC培養(yǎng)基(2％v/v胰蛋白胨、0.5％w/v酵母膏、0.05％w/v氯化鈉、2.5mM w/v氯化鉀、1mM氯化鎂和20mM葡萄糖)加入到混合物中，將其再振蕩孵育1小時(shí)。然后分離轉(zhuǎn)化菌株，如“Molecular Cloning A Laboratory Manual”中所述，從菌株中制備質(zhì)粒DNA。通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，分別證實(shí)編碼人源化TRA-8或小鼠TRA-8重鏈的這種DNA的核苷酸序列。
所得質(zhì)粒命名為pHA15(攜帶編碼H1型人源化TRA-8重鏈的cDNA的質(zhì)粒)、pHC10(攜帶編碼H3型人源化TRA-8重鏈的cDNA的質(zhì)粒)、pHD21(攜帶編碼H4型人源化TRA-8重鏈的cDNA的質(zhì)粒)和pM11(攜帶編碼嵌合TRA-8重鏈的cDNA的質(zhì)粒)。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌JM109/pHA15、大腸桿菌JM109/pHC10、大腸桿菌JM109/pHD21和大腸桿菌JM109/pM11，所述菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號分別為FERM BP-7555、FERM BP-7557、FERM BP-7558和FERM BP-7559。
(3)攜帶幾種類型人源化TRA-8或小鼠TRA-8重鏈可變區(qū)DNA的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建如下通過插入編碼H1型、H3型和H4型人源化TRA-8或M型嵌合TRA-8重鏈的DNA(在上述克隆的)，構(gòu)建用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體。
1μg用于哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體-攜帶人源化抗Fas單克隆抗體HFE7A重鏈可變區(qū)和人IgG1恒定區(qū)基因組DNA的質(zhì)粒pSRHHH3(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)用限制性酶HindIII和ApaI消化，通過3％瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠水溶液染色，使得可以在紫外線下檢測DNA。用剃刀刀片切下含有人IgG1恒定區(qū)基因組DNA但無人源化HFE7A重鏈可變區(qū)的載體DNA條帶，用Geneclean Spin Kit從凝膠中洗脫。在酚抽提后，通過以7,500×g離心，然后進(jìn)行乙醇沉淀，將洗脫的DNA濃縮，最后溶于5μl蒸餾水中，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara ShuzoCo.，Ltd.)，將所得的經(jīng)消化的去磷酸化質(zhì)粒(100ng)與1μg也用HindIII和ApaI消化的含有編碼人源化TRA-8或嵌合TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA的pHA15、pHC10、pHD21或pM11 DNA片段連接。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上鋪平板。
將用該方法獲得的轉(zhuǎn)化子在2ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，隨后用堿-SDS法從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。
所提取的質(zhì)粒DNA用HindIII和ApaI消化，經(jīng)過3％w/v瓊脂糖凝膠電泳，以證實(shí)編碼人源化或嵌合TRA-8重鏈可變區(qū)的DNA的插入片段存在或不存在。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNAAnalyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在所述載體中的插入和方向。所得的攜帶編碼人源化或嵌合TRA-8重鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pHA15-1、pHC10-3、pHD21-1和pM11-1。
(4)所述人源化輕鏈的載體的構(gòu)建(4.1)人源化抗體(LM1型)輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.72中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8的輕鏈氨基酸序列的其它人源化(LM1型)，需要分別用谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和蘇氨酸取代所述TRA-8輕鏈氨基酸序列N末端的第3號氨基酸(纈氨酸)、第8號氨基酸(組氨酸)、第9號氨基酸(賴氨酸)、第10號氨基酸(苯丙氨酸)、第11號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(蘇氨酸)、第20號氨基酸(絲氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酰胺)、第43號氨基酸(絲氨酸)、第60號氨基酸(天冬氨酸)、第63號氨基酸(蘇氨酸)、第77號氨基酸(天冬酰胺)、第78號氨基酸(纈氨酸)、第80號氨基酸(絲氨酸)、第83號氨基酸(亮氨酸)、第85號氨基酸(天冬氨酸)、第87號氨基酸(苯丙氨酸)以及第99號氨基酸(甘氨酸)、第103號氨基酸(亮氨酸)和第108號氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名為LM1。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列(LM1型，序列表的SEQ ID No.72)的表達(dá)質(zhì)粒。1)用于制備人源化TRA-8(LM1型)輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM1多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.72)的DNA，其中每種都是人源化抗DR5抗體TRA-8輕鏈(LM1型)可變區(qū)和人Ig輕鏈(K鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、HKCDF11(SEQ ID No.50)、HKCDR12(SEQ ID No.51)、HKCDF22(SEQ ID No.52)、HKCDR22(SEQ ID No.53)和HKCF12(SEQ ID No.54)。
合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga -3’(HKSPR12；SEQ ID No.77).2)質(zhì)粒pCR3.1/LM1-2的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈LM1型的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備編碼序列表的SEQ ID No.72中限定的氨基酸序列的LM1-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM1-F1-DNA片段，該片段編碼一個(gè)分泌信號序列和FRL1區(qū)的一部分，并且在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)。模板質(zhì)粒pHSGHM17和pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0909 816 A1中描述的方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pHSGHM17 DNA，25ng寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物HKSPR12，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼FRL1一部分、CDRL1、FRL2和CDRL2的LM1-F2-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pL28 DNA，25ng
寡核苷酸引物HKCDF11，50pmol寡核苷酸引物HKCDR12，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼CDRL2、FRL3和CDRL3一部分的LM1-F3-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA，25ng寡核苷酸引物HKCDF22，50pmol寡核苷酸引物HKCDR22，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼CDRL3、FRL4和恒定區(qū)以及在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的LM1-F4-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA，25ng寡核苷酸引物HKCF12，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM1-F1-DNA、LM1-F2-DNA、LM1-F3-DNA和LM1-F4-DNA片段融合的LM1-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM1-F1-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM1-F2-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM1-F3-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM1-F4-DNA凝膠片段，寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(InVitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM1-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)，證實(shí)編碼人源化TRA-8(LM1型)輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/LM1-2(攜帶編碼人源化TRA-8(LM1型)輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM1-DNA片段的質(zhì)粒pCR3.1/LM1-2用限制性酶HINd III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶HindIII和EcoR I消化的LM1-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM1-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶人源化LM1 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M1-2-2。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSG/M1-2-2，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7562。3)質(zhì)粒pSR/LM1-2(人源化LM1 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶人源化LM1 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M1-2-2用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/M1-2-2中獲得的Hind III-EcoR I DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在pSRPDHH載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼人源化LM1 TRA-8輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/LM1-2。
(4.2)人源化抗體(LM3型)輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.73中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8的輕鏈氨基酸序列的其它人源化(LM3型)，需要分別用脯氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和蘇氨酸取代所述TRA-8輕鏈氨基酸序列N末端的第8號氨基酸(組氨酸)、第9號氨基酸(賴氨酸)、第10號氨基酸(苯丙氨酸)、第11號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(蘇氨酸)、第20號氨基酸(絲氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酰胺)、第43號氨基酸(絲氨酸)、第77號氨基酸(天冬酰胺)、第78號氨基酸(纈氨酸)、第80號氨基酸(絲氨酸)、第83號氨基酸(亮氨酸)、第85號氨基酸(天冬氨酸)、第87號氨基酸(苯丙氨酸)、第99號氨基酸(甘氨酸)、第103號氨基酸(亮氨酸)和第108號氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名為LM3。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列(LM3型，序列表的SEQ ID No.73)的表達(dá)質(zhì)粒。1)用于制備人源化LM3 TRA-8輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM3多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.73)的DNA，其中每種都是人源化抗DR5抗體TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈(κ鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3’(MOD1F1；SEQ ID No.78)；
5’-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgcttcttaagctt -3’(MOD1R1；SEQ ID No.79)；5’-ctccactgggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3’(MOD1F22；SEQ ID No.80)；5’-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag -3’(MOD1R22；SEQ ID No.81)；5’-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaaccaggaa -3’(MOD1F3；SEQ ID No.82)；5’-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacagatgcagacaaa ga -3’(MOD1R3；SEQ ID No.83)；5’-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggtttacaggcag t -3’(MOD1F42；SEQ ID No.84)；5’-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctgttggtaccag gc -3’(MOD1R4；SEQ ID No.85)；5’-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat-3’(MOD1F5；SEQ ID No.86)；5’-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac -3’(MOD1R52；SEQ ID No.87)；5’-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3’(MOD1F6；SEQ ID No.88)；5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac -3’(MOD1R6；SEQ ID No.89)5’-aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g -3’(MOD1F7；SEQ ID No.90)；5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3’(MOD1R7；SEQ ID No.91)；和5’-agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa(LR17；SEQ ID No.101).2)質(zhì)粒pCR3.1/LM3-3-44的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈LM3型的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備編碼序列表的SEQ ID No.73中限定的氨基酸序列的LM3-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM3-F31B-DNA片段，該片段編碼一個(gè)在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)的分泌信號序列區(qū)、FRL1、CDRL1、FRL2和CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定區(qū)的一部分。
反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol寡核苷酸引物MOD1F5，5pmol寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol寡核苷酸引物MOD1F6，5pmol寡核苷酸引物MOD1R6，5pmol寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物MOD1R7，5pmol寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物L(fēng)R17，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的恒定區(qū)一部分的LM3-F31C-DNA片段。
模板質(zhì)粒pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0 909 816 A1中所述方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHHDNA，25ng寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM3-F31B-DNA和LM3-F31C-DNA片段融合的LM3-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM3-F31B-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM3-F31C-DNA凝膠片段，寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmol
dNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(InVitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM3-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467)，證實(shí)編碼人源化LM3 TRA-8輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/LM3-3-44(攜帶編碼人源化LM3TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM3-DNA片段的質(zhì)粒pCR3.1/LM3-3-44用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III和EcoR I消化的LM3-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM3-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶人源化LM3 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M3-3-22。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSG/M3-3-22，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7564。3)質(zhì)粒pSR/LM3-3-44-10(人源化LM3 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶人源化LM3 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M3-3-22用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/M3-3-22中獲得的HindIII-EcoRI DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在pSRPDHH載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼人源化LM3 TRA-8輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/LM3-3-44-10。
(4.3)人源化抗體(LM4型)輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.74中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8的輕鏈氨基酸序列的其它人源化(LM4型)，需要分別用脯氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和蘇氨酸取代所述TRA-8輕鏈氨基酸序列N末端的第8號氨基酸(組氨酸)、第9號氨基酸(賴氨酸)、第10號氨基酸(苯丙氨酸)、第11號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(蘇氨酸)、第20號氨基酸(絲氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酰胺)、第43號氨基酸(絲氨酸)、第77號氨基酸(天冬酰胺)、第78號氨基酸(纈氨酸)、第80號氨基酸(絲氨酸)、第83號氨基酸(亮氨酸)、第85號氨基酸(天冬氨酸)、第99號氨基酸(甘氨酸)、第103號氨基酸(亮氨酸)和第108號氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名為LM4。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列(LM4型)(序列表的SEQ ID No.74)的表達(dá)質(zhì)粒。1)用于制備人源化LM4 TRA-8輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM4多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.74)的DNA，其中每種都是人源化抗DR5抗體TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈(κ鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、MOD1F1(SEQ ID No.78)、MOD1R1(SEQ ID No.79)、MOD1F22(SEQID No.80)、MOD1R22(SEQ ID No.81)、MOD1F3(SEQ ID No.82)、MOD1R3(SEQ ID No.83)、MOD1F42(SEQ ID No.84)、MOD1R4(SEQID No.85)、MOD1F5(SEQ ID No.86)、MOD1R52(SEQ ID No.87)、MOD1F7(SEQ ID No.90)和MOD1R7(SEQ ID No.91)、LR17(SEQ IDNo.101)，合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3’(MOD1F62；SEQ ID No.92)5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag -3’(MOD1R62；SEQ ID No.93)2)質(zhì)粒pCR3.1/LM4-5-3的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈LM4型的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備編碼序列表的SEQ ID No.74中限定的氨基酸序列的LM4-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM4-F41B-DNA片段，該片段編碼一個(gè)在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)的分泌信號序列區(qū)、FRL1、CDRL1、FRL2和CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定區(qū)的一部分。
反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol寡核苷酸引物MOD1F5，5pmol寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol寡核苷酸引物MOD1F62，5pmol寡核苷酸引物MOD1R62，5pmol寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物MOD1R7，5pmol寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物L(fēng)R17，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的恒定區(qū)一部分的LM4-F41C-DNA片段。
模板質(zhì)粒pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0 909 816 A1中所述方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA，25ng寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀刀片切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM4-F41B-DNA和LM4-F41C-DNA片段融合的LM4-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM4-F41B-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM4-F41C-DNA凝膠片段，寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(In Vitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM4-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用3700 DNA分析儀(ABIPRISM；Perkin Elmer Applied Biosystems，Japan)，通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467)，證實(shí)編碼人源化LM4 TRA-8輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/LM4-5-3(攜帶編碼人源化LM4 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM4-DNA片段的質(zhì)粒pCR3.1/LM4-5-3用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III和EcoR I消化的LM4-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM4-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶人源化LM4 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M4-5-3-1。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSG/M4-5-3-1，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7565。3)質(zhì)粒pSR/LM4-5-3-3(人源化LM4 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶人源化LM4 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M4-5-3-1用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/M4-5-3-1中獲得的HindIII-EcoRI DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在pSRPDHH載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼人源化LM4 TRA-8輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/LM4-5-3-3。
(4.4)人源化抗體(LM5型)輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建如序列表的SEQ ID No.75中所示，小鼠抗人DR5抗體TRA-8的輕鏈氨基酸序列的其它人源化(LM5型)，需要分別用脯氨酸、絲氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸取代所述TRA-8輕鏈氨基酸序列N末端的第8號氨基酸(組氨酸)、第9號氨基酸(賴氨酸)、第10號氨基酸(苯丙氨酸)、第11號氨基酸(甲硫氨酸)、第13號氨基酸(蘇氨酸)、第20號氨基酸(絲氨酸)、第42號氨基酸(谷氨酰胺)、第43號氨基酸(絲氨酸)、第77號氨基酸(天冬酰胺)、第78號氨基酸(纈氨酸)、第80號氨基酸(絲氨酸)、第83號氨基酸(亮氨酸)、第103號氨基酸(亮氨酸)和第108號氨基酸(丙氨酸)。所得的序列命名為LM5。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列(LM5型)(序列表的SEQ ID No.75)的表達(dá)質(zhì)粒。1)用于制備人源化LM5 TRA-8輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM5多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.75)的DNA，其中每種都是人源化抗DR5抗體TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈(κ鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)、7ALCN(SEQ ID No.48)、MOD1F1(SEQ ID No.78)、MOD1R1(SEQ ID No.79)、MOD1F22(SEQID No.80)、MOD1R22(SEQ ID No.81)、MOD1F3(SEQ ID No.82)、MOD1R3(SEQ ID No.83)、MOD1F42(SEQ ID No.84)、MOD1R4(SEQID No.85)、MOD1R52(SEQ ID No.87)、MOD1F7(SEQ ID No.90)和LR17(SEQ ID No.101)，合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-gggtctggga cagaccttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat -3’(MOD1F52；SEQ ID No.94)5’-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc -3’(MOD1F63；SEQ ID No.95)5’-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag -3’(MOD1R63；SEQ ID No.96)5’-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa -3’(MOD1R72；SEQ ID No.102)2)質(zhì)粒pCR3.1/LM5-3-42的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈LM5型的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備編碼序列表的SEQ ID No.75中限定的氨基酸序列的LM5-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM5-F51B-DNA片段，該片段編碼一個(gè)在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)的分泌信號序列區(qū)、FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定區(qū)的一部分。
反應(yīng)溶液的組成寡核苷酸引物MOD1F1，5pmol寡核苷酸引物MOD1R1，5pmol寡核苷酸引物MOD1F22，5pmol寡核苷酸引物MOD1R22，5pmol寡核苷酸引物MOD1F3，5pmol寡核苷酸引物MOD1R3，5pmol寡核苷酸引物MOD1F42，5pmol寡核苷酸引物MOD1R4，5pmol寡核苷酸引物MOD1F52，5pmol寡核苷酸引物MOD1R52，5pmol寡核苷酸引物MOD1F63，5pmol寡核苷酸引物MOD1R63，5pmol寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物MOD1R72，5pmol寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物L(fēng)R17，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)的恒定區(qū)一部分的LM5-F51C-DNA片段。模板質(zhì)粒pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0 909 816 A1中所述方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHH DNA，25ng寡核苷酸引物MOD1F7，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀刀片切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM5-F51B-DNA和LM5-F51C-DNA片段融合的LM5-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM5-F51B-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM5-F51C-DNA凝膠片段，寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(In Vitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM5-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用DNA分析儀，通過雙脫氧法(Sanger，F(xiàn).S.等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467)，證實(shí)編碼人源化LM5 TRA-8輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/LM5-3-42(攜帶編碼人源化LM5TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM5-DNA片段的質(zhì)粒pCR3.1/LM5-3-42用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III和EcoR I消化的LM5-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM5-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶人源化LM5 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M5-3-27。3)質(zhì)粒pSR/LM5-3-27-1(人源化LM5 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶人源化LM5 TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M5-3-27用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA(歐洲專利申請EP 0 909 816 A1)用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara Syuzo Co.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/M5-3-27中獲得的HindIII-EcoR I DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀(ABI Prism 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems)，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在pSRPDHH載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼人源化LM5 TRA-8輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/LM5-3-27-1。
(4.5)人源化抗體(嵌合型)輕鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建嵌合型TRA-8輕鏈氨基酸序列-序列表的SEQ ID No.76中所示序列命名為LM6。
如下構(gòu)建攜帶抗人DR5抗體TRA-8的這種類型人源化輕鏈氨基酸序列(LM6型)(序列表的SEQ ID No.75)的表達(dá)質(zhì)粒。1)用于制備人源化LM6 TRA-8輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的引物的合成采用各種組合的PCR，分別合成編碼LM6多肽鏈(序列表中的SEQ ID No.75)的DNA，其中每種都是小鼠抗DR5抗體TRA-8輕鏈(LM6型)可變區(qū)和人Ig輕鏈(κ鏈)恒定區(qū)的融合體。
此外對于7AL1P(SEQ ID No.47)和7ALCN(SEQ ID No.48)，合成用于PCR的以下寡核苷酸引物5’-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagygg a -3’(HKSPR13；SEQ ID No.97)；5’-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c -3’(MVF11；SEQ ID No.98)；5’-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc -3’(MVR11；SEQID No.99)；和5’-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc -3’(MCF11；SEQ IDNo.100).2)質(zhì)粒pCR3.1/LM6-1-16的構(gòu)建(人源化TRA-8輕鏈LM6型的克隆)通過進(jìn)行兩步PCR，制備編碼序列表的SEQ ID No.75中限定的氨基酸序列的LM6-DNA片段，將其插入到質(zhì)粒載體中，并且在大腸桿菌中克隆。a)第一步PCR在以下條件下制備LM6-F1-DNA片段，該片段編碼一個(gè)分泌信號序列和FRL1區(qū)一部分，并且在5’端加入一個(gè)Hind III限制性酶切位點(diǎn)。模板質(zhì)粒pHSGHM17和pSRPDHH通過采用歐洲專利申請EP 0909 816 A1中所述方法獲得。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pHSGHM17 DNA，25ng寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物HKSPR13，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer)，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備編碼FRL1一部分、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4和恒定區(qū)的一部分的LM6-F2-DNA片段。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pL28 DNA，25ng寡核苷酸引物MVF11，50pmol寡核苷酸引物MVR12，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μl
ampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在以下條件下制備LM6-F3-DNA片段，該片段編碼FRL4一部分和恒定區(qū)，并且在3’端加入一個(gè)EcoR I限制性酶切位點(diǎn)。
反應(yīng)溶液的組成質(zhì)粒pSRPDHHDNA，25ng寡核苷酸引物MCF11，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5μl10×PCR緩沖液，5μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
在PCR后，擴(kuò)增的DNA片段通過5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳后，凝膠用1μg/ml溴化乙錠染色，以在紫外線下檢測所產(chǎn)生的DNA。用剃刀刀片切下如此檢測出的相應(yīng)DNA條帶。b)第二步PCR在以下條件下制備其中上述LM6-F1-DNA、LM6-F2-DNA和LM6-F3-DNA片段融合的LM6-DNA。
反應(yīng)溶液的組成在第一步PCR中制備的LM6-F1-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM6-F2-DNA凝膠片段，在第一步PCR中制備的LM6-F3-DNA凝膠片段，
寡核苷酸引物7AL1P，50pmol寡核苷酸引物7ALCN，50pmoldNTPs混合物，5.0μl10×PCR緩沖液，5.0μlampliTaq DNA聚合酶，2.5單位通過加入重蒸水將具有上述組成的反應(yīng)溶液調(diào)至50μl的終體積，用于PCR。
PCR熱條件于94℃加熱2分鐘，此后進(jìn)行30次熱循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，然后于72℃加熱10分鐘。
用真核TA克隆試劑盒(Invitrogen)，按照生產(chǎn)商的方案，將如此制備的LM6-DNA片段插入到質(zhì)粒pCR3.1DNA中，將其導(dǎo)入試劑盒中含有的感受態(tài)大腸桿菌TOP10F’中。采用DNA分析儀，通過雙脫氧法，證實(shí)編碼人源化TRA-8輕鏈的這些DNA的核苷酸序列。
所得的質(zhì)粒命名為pCR3.1/LM6-1-16(攜帶編碼小鼠TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Ig輕鏈恒定區(qū)的cDNA的質(zhì)粒)。
所獲得的含有LM6-DNA片段的質(zhì)粒pCR3.1/LM6-1-16用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pHSG399 DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pHSG399 DNA和用限制性酶Hind III和EcoR I消化的LM6-DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有0.1mM IPTG、0.1％X-Gal和50μg/ml氯霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的白色轉(zhuǎn)化子在含有50μg/ml氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA用Hind III和EcoR I消化，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇出一個(gè)攜帶LM6-DNA片段的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得攜帶小鼠TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/M6-1-4-1。帶有這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌DH5α/pHSG/M6-1-4-1，該菌株按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日保藏于國際專利生物保藏機(jī)構(gòu)-國立高級工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)，1-1，Higashi 1 chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-5466，Japan，記錄的保藏號為FERM BP-7566。3)質(zhì)粒pSR/LM6-1-4-6(嵌合型LM6 TRA-8輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒)的構(gòu)建所獲得的攜帶小鼠TRA-8輕鏈可變區(qū)和人Igκ鏈恒定區(qū)的融合片段的質(zhì)粒pHSG/LM6-1-4-1用限制性酶Hind III和EcoR I消化。
1μg克隆質(zhì)粒pSRPDHH DNA用限制性酶Hind III和EcoR I消化，然后用CIP去磷酸化。用DNA連接試劑盒Version 2.0(Takara SyuzoCo.，Ltd.)，連接所得的去磷酸化pSRPDHH DNA和從pHSG/LM6-1-4-1中獲得的HindIII-EcoRI DNA片段。然后用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB瓊脂上。獲得的轉(zhuǎn)化子在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照堿-SDS法，從所得的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA。用基因序列分析儀，通過DNA測序證實(shí)所需DNA片段在所述載體中的插入和方向。
所得的攜帶編碼TRA-8(嵌合型)輕鏈的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒命名為pSR/LM6-1-4-6。(5)幾種類型的人源化或嵌合TRA-8抗體的產(chǎn)生采用FUGENE6轉(zhuǎn)染試劑法(Boehringer Mannheim Biochemica)，按照試劑盒中提供的說明手冊，進(jìn)行COS-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
讓COS-7細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心No.CRL-1651)在含有補(bǔ)充10％胎牛血清(在下文縮寫為“FCS”；Moregate)的Dulbecco氏改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(在下文稱為“D-MEM”；Gibco BRL)的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)面積57cm2；Sumitomo Bakelite)中生長至半?yún)R合(3×106細(xì)胞/皿)。
同時(shí)，將用堿-SDS法制備的10μg/皿(總共5皿)的人源化DR5重鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA(pHA15-1)和10μg/皿的人源化DR5輕鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA與氯化銫密度梯度離心物混合，然后用乙醇沉淀，接著懸浮于5μl/皿的dH2O中。
在將15μl/皿的FUGENE6轉(zhuǎn)染試劑與180μl/皿無FCS的D-MEM混合后，將該FUGENE溶液(185μl/皿)與5μl/皿含有10μg/皿人源化DR5重鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA和10μg/皿人源化DR5輕鏈表達(dá)質(zhì)粒DNA的DNA溶液混合。于室溫孵育15分針后，將所得的質(zhì)粒懸浮液(200μl)加入到預(yù)先制備的COS-7平板上。在5％CO2、37℃下孵育24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為無FCS的D-MEM。在5％CO2、37℃下孵育72小時(shí)后，回收培養(yǎng)上清液，以純化上清液中的表達(dá)產(chǎn)物。采用如上所述的方法，用每種以下質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(A)pHA15-1和pSR/LM1-2共轉(zhuǎn)染(H1L1)(B)pHB14-1和pSR/M2-1共轉(zhuǎn)染(H2L2)(C)pHB14-1和pSR/LM3-3-44-10共轉(zhuǎn)染(H2L3)(D)pHB14-1和pSR/LM4-5-3-3共轉(zhuǎn)染(H2L4)(E)pHC10-3和pSR/M2-1共轉(zhuǎn)染(H3L2)(F)pHC10-3和pSR/LM3-3-44-10共轉(zhuǎn)染(H3L3)(G)pHC10-3和pSR/LM4-5-3-3共轉(zhuǎn)染(H3L4)(H)pHD21-1和pSR/LM5-3-27-1共轉(zhuǎn)染(H4L5)(I)pM11-1和pSR/LM6-1-4-6共轉(zhuǎn)染(嵌合)然后將培養(yǎng)物離心(3,500r.p.m.，15分鐘)，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜(ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs，Cat # 25CS045 AS)過濾。用G蛋白-POROS親和色譜(Applied Biosystems)在以下條件下完成從濾液中純化IgGHPLC系統(tǒng)BioCAD 700E(Applied Biosystems)柱子G蛋白-ID傳感柱(柱尺寸2.1mmID×30mn LD，床體積0.1ml；Applied Biosystems)洗脫緩沖液0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)中和緩沖液1M Tris-HCl(pH8.5)
檢測280nm流速1ml/min流分大小0.5ml/0.5min流分收集管1.5ml聚丙烯微量試管溫度4℃在所有濾液上柱后，用50ml PBS(Sigma，Cat # 1000-3)洗滌柱子。當(dāng)將洗脫緩沖液上柱后，開動流分收集器。每個(gè)流分收集微量試管預(yù)先含有55μl 1M NaCl、110μl中和緩沖液和74μl 2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma，Cat # A-7030)的PBS溶液。收集第7-8號的流分。
通過ELISA，用針對抗人IgG的抗體，進(jìn)行所制備的培養(yǎng)上清液中所述人源化抗體表達(dá)的證實(shí)以及所述表達(dá)產(chǎn)物的定量測定。
向96孔板(MaxiSorp，Nunc)的各孔中，加入100μl以0.5μg/ml的終濃度溶于吸附緩沖液(0.05M碳酸氫鈉，0.02％疊氮化鈉，pH9.6)的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆抗體(Kappel)，將孔板于37℃保溫2小時(shí)，以使得抗體吸附。然后，所述板用350μl PBS-T洗滌5次。洗滌后，向各孔加入用含10％FCS的D-MEM稀釋的培養(yǎng)上清液，于37℃保溫2小時(shí)。用PBS-T再次洗滌后，向各孔加入100μl用PBS-T稀釋10,000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆抗體(JacksonImmuno Research Lab.)，于37℃保溫2小時(shí)。用PBS-T再次洗滌后，按照試劑盒中提供的說明手冊，加入得自堿性磷酸酶底物試劑盒(BioRad)的對硝基苯磷酸底物溶液。于37℃保溫0.5-1小時(shí)后，測量405nm的吸光度。在所述實(shí)驗(yàn)中，使用以含10％FCS的D-MEM稀釋至一定濃度的人血漿免疫球蛋白G亞類1(IgG1)(Biopure AG)作為所述培養(yǎng)上清液中含有的人源化DR5抗體的濃度參比樣品。
因此，用所述抗人IgG抗體特異性地檢測培養(yǎng)上清液中的表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物。人IgG抗體的終濃度分別為44.03μg/ml(H1L1)、39.8μg/ml(H2L2)、26.7μg/ml(H2L3)、41.0μg/ml(H2L4)、39.3μg/ml(H3L2)、24.7μg/ml(H3L3)、21.5μg/ml(H3L4)、16.7μg/ml(H4L5)和18.3μg/ml(嵌合)。(6)幾種類型人源化抗體或嵌合抗體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性用Jurkat細(xì)胞(ATCC No.TIB-152)檢查純化的人源化TRA-8抗體的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
Jurkat細(xì)胞在含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco BRL)中在5％CO2存在下于37℃培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)的所述細(xì)胞以50μl/孔分配到96孔微量培養(yǎng)板(Sumitomo Bakelite)的各孔中。通過按照實(shí)施例26中所述的方法估計(jì)所述培養(yǎng)液中感興趣的終產(chǎn)物的濃度，用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基將實(shí)施例26中制備的人源化TRA-8調(diào)至100ng/ml的感興趣的終產(chǎn)物濃度。用每種如此調(diào)至100ng/ml的表達(dá)產(chǎn)物的溶液，通過用含10％FCS的PRMI1640重復(fù)連續(xù)的2倍稀釋，產(chǎn)生連續(xù)稀釋液。將每種稀釋的人源化TRA-8溶液(H1L1、H2L2、H2L3、H2L4、H3L3、H3L4或H4L5)以50μl/孔加入到各孔中。于37℃反應(yīng)12小時(shí)后，加入50μl含有1mg/ml XTT的25μM PMS(XTT的終濃度為250μg/ml，而PMS的終濃度為5μM)。在孵育3小時(shí)后，利用線粒體的還原能力作為指標(biāo)，測量各孔的450nm吸光度以便計(jì)算細(xì)胞生存力。
各孔中細(xì)胞的生存力按照以下公式計(jì)算生存力(％)＝100×(a-b)/(c-b)其中“a”為試驗(yàn)孔的測量結(jié)果，“b”是無細(xì)胞孔的測量結(jié)果，而“c”是未加入抗體孔的測量結(jié)果。
結(jié)果，證明所測試的人源化抗體在表達(dá)人DR5抗原的T淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
此外，通過加入紫杉醇(Taxol)，按照實(shí)施例25中所述的方法，檢查人源化TRA-8對PC-3的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
人前列腺癌細(xì)胞系PC-3(ATCC No.CRL-1435)得自美國組織培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)、1％L-谷氨酰胺-200mM(25030-149，Gibco BRL)和0.5％青霉素鏈霉素溶液(Penicillin Streptomycin Solution)(P-7539，Sigma)的F-12K營養(yǎng)混合物(Nutrient Mixture)(21127-022，Gibco BRL)中維持。在以下實(shí)驗(yàn)中使用補(bǔ)充10％FBS和0.5％青霉素鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基(MED-008，IWAKI)。通過胰蛋白酶處理收集指數(shù)生長的PC-3細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次。然后在實(shí)驗(yàn)開始之前1天對細(xì)胞計(jì)數(shù)，將其以5×104細(xì)胞/ml的密度重懸于新鮮培養(yǎng)基中，以三份重復(fù)分配到平底96孔板(3598，Corning-Coster)中，總體積為100μl/孔。將溶于二甲基亞砜的典型抗腫瘤藥紫杉醇(Paclitaxel)(169-18611，Wako)(10mg/ml)在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，然后以50μl/孔加入到含有細(xì)胞的96孔板中。二甲基亞砜的終濃度低于0.1％。在37℃、5％CO2環(huán)境下孵育24小時(shí)后，向各孔中加入在新鮮培養(yǎng)基中稀釋的人源化TRA-8抗體(H1L1、H2L2、H2L3、H2L4、H3L2、H3L3、H3L4或H4L5)。再孵育24小時(shí)后，向各孔中加入50μl含有1mg/ml XTT和25mM PMS的極限必需培養(yǎng)基(11095-098，Gibco BRL)中，將板孵育6小時(shí)。然后用ARVO HTS 1420Multilabel Counter(多標(biāo)記計(jì)數(shù)器)(Wallac Berthold)測量OD450，并如下計(jì)算細(xì)胞生存力。
細(xì)胞生存力(％)＝(含用紫杉醇(Taxol)和人源化TRA-8(藥物)處理的細(xì)胞孔的OD450-不含細(xì)胞也不含藥物孔的OD450)×100/(含細(xì)胞但無藥物孔的OD450-不含細(xì)胞也不含藥物孔的OD450)結(jié)果，證實(shí)所測試的人源化抗體在表達(dá)人DR5抗原的人前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
說明書中提及的任何專利或出版物說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。這些專利和出版物通過引用結(jié)合到本文中，其程度如同將每個(gè)單獨(dú)的出版物具體而單獨(dú)地指出通過引用結(jié)合到本文中一樣。
本發(fā)明不限于實(shí)施例中公開的以上所述的保藏物或?qū)嵤┓桨傅姆秶?，所述?shí)施例用來說明本發(fā)明的幾個(gè)方面以及在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能等同的任何實(shí)施方案。除本文所示和所述的實(shí)施方案之外的本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，這些修改落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
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序列表<110>UBA研究基金會(The UAB Research Foundation)<120>腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體受體的選擇性抗體及其應(yīng)用<130>SAN-10052/22<160>102<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>25<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>1gacgatgccc gatctacttt aaggg 25<210>2<211>22<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>2ccactgggtg atgttggatg gg22<210>3<211>24<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>3ggatccgtgg acacattcga tgtc 24<210>4<211>20<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>4Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu
20<210>5<211>20<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>5Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser20<210>6<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>6cagcactgaa cacggacccc20<210>7<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>7aaaggtaatt tattgagaag20<210>8<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>8cctcaccatg aacttcgggc20<210>9<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>9ctgttgtatg cacatgagac20<210>10<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>10gaagtgatgc tggtggagtc20<210>11<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>11agtgtgaagt gatgctggtg20<210>12<211>21<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>12tttaccagga gagtgggaga g 21<210>13<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>13tgcagagaca gtgaccagag20<210>14<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>14tgttcaggac cagcatgggc20<210>15<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>15aagacatttt ggattctaac20<210>16<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>16tatcatgaag tctttgtatg20<210>17<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>17gatggagaca cattctcagg20<210>18<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>18gacattgtga tgacccagtc20<210>19<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>19ttaacactca ttcctgttga20<210>20<211>20<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>20gactgggtca tcacaatgtc20<210>21<211>1398<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>21atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa60gtgatgctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgtaatgt cttgggttcg ccagactccg 180gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acggggggac 360tctatgatta cgacggacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 420acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 660aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380ggtaaaaatc actagtga1398<210>22<211>705<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>22atgaagtctt tgtatgtgtt agtgtataca cattatctgt ttctgtttgc aggtgttgaa 60ggagacattg tgatgaccca gtctcacaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta tcaacagaaa 180ccagggcaat ctcctaaact actgatttac tgggcatcca cccggcacac tggagtccct 240gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag caatgtgcag 300tctgaagact tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac gttcggtgga 360ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa 705<210>23<211>464<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>23Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
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115 120 125Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Gly Glu Cys210<210>77<211>60<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>77gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60<210>78<211>65<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>78atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60ccagg 65<210>79<211>69<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>79cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt 60cttaagctt 69<210>80<211>67<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>80ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga 60cagggtc67<210>81<211>54<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>81acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag54<210>82<211>67<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>82accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60ccaggaa67<210>83<211>72<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>83tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga 60tgcagacaaa ga 72<210>84<211>71<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>84aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt 60ttacaggcag t 71<210>85<211>72<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>85cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg 60ttggtaccag gc 72<210>86<211>63<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>86gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc 60tat63<210>87<211>60<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>87actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac 60<210>88<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>88tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57<210>89<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>89cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac 57<210>90<211>51<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>90aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g 51<210>91<211>63<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>91gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc 60gaa63<210>92<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>92ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57<210>93<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>93cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag 57<210>94<211>63<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>94gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat 60tat63<210>95<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>95ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc 57<210>96<211>57<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>96cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag 57<210>97<211>51<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>97tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a 51<210>98<211>51<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>98tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c 51<210>99<211>49<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>99aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc49<210>100<211>45<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>100aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc45<210>101<211>30<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>101agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa 30<210>102<211>63<212>DNA<213>合成構(gòu)建體<400>102gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc 60gaa6權(quán)利要求
1.一種識別TRAIL受體DR5的抗體，其中所述抗體在體內(nèi)具有對表達(dá)DR5細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
2.一種識別TRAIL受體DR5、但不識別TRAIL受體DR4、DcR1或DcR2的抗體。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1、2或3的抗體，其中所述抗體的抗原是人DR5。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的抗體，其中所述細(xì)胞是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1、2、3或4的抗體，其中所述細(xì)胞是惡性腫瘤細(xì)胞。
7.一種由ATCC保藏號為PTA-1428的小鼠-小鼠雜交瘤TRA-8生產(chǎn)的單克隆抗體。
8.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括下述步驟將表達(dá)DR5的細(xì)胞暴露于治療量的能夠與所述DR5結(jié)合的抗體以及一種權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的所述抗體的合適載體。
9.一種權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物包含治療量的有效針對DR5的單克隆抗體；和一種藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求9的藥理學(xué)組合物，其中所述治療量為每劑0.1-10,000微克。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述單克隆抗體的存在濃度為每毫升所述載體0.2納克至2000納克。
12.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體在用于異常細(xì)胞或調(diào)節(jié)異常細(xì)胞的選擇性細(xì)胞凋亡的治療藥制備方面的應(yīng)用。
13.一種與腫瘤壞死因子配體受體相互作用的固定化抗體，所述受體選自DR4、DR5、DrR1、DrR2和OPG，所述抗體在表達(dá)所述受體的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
14.一種固定化抗體，所述抗體能夠選擇性結(jié)合激動性或拮抗性腫瘤壞死因子配體受體的表位。
15.一種治療細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的方法，所述方法包括下述步驟將表達(dá)所述細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的靶組織暴露于治療量的權(quán)利要求1或13的第一抗體。
16.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括下述步驟給予藥用有效量的與所述第一抗體協(xié)同作用的治療藥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述治療藥是雙吲哚基馬來酰亞胺。
18.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括下述步驟將所述組織暴露于治療量的權(quán)利要求13的第二抗體，其中所述第一抗體和所述第二抗體協(xié)同與所述組織相互作用。
19.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括下述步驟在將所述組織暴露于所述第一抗體之前或期間，將所述組織暴露于致敏劑。
20.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含一個(gè)抗原性TRAIL受體氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少10個(gè)堿基，且與下述部分偶聯(lián)一個(gè)免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白或其片段能夠在受治療者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答。
21.一種基因治療方法，所述方法包括下述步驟用包含可表達(dá)TRAIL受體核酸序列的載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞；在所述細(xì)胞上表達(dá)由所述TRAIL受體核酸序列編碼的TRAIL受體；和將所述細(xì)胞暴露于選擇性結(jié)合所述TRAIL受體的抗體。
22.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
23.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列包含能夠選擇性識別DR5的抗體的重鏈免疫球蛋白的編碼序列。
24.核苷酸1-1398的權(quán)利要求23的核苷酸序列，所述核苷酸序列被描述為SEQ ID NO21。
25.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包含能夠識別DR5的抗體的TRA-8重鏈免疫球蛋白的編碼序列。
26.權(quán)利要求25的氨基酸序列，其中所述編碼序列含有一個(gè)完整的可讀框，并且被描述為SEQ ID NO23的殘基1-464。
27.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列包含能夠識別DR5的抗體的TRA-8輕鏈免疫球蛋白的編碼序列。
28.權(quán)利要求27的核苷酸序列，所述核苷酸序列被描述為SEQ IDNO22的核苷酸1-705。
29.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包含能夠識別DR5的抗體的TRA-8輕鏈免疫球蛋白的編碼序列。
30.權(quán)利要求29的氨基酸序列，其中所述編碼序列含有一個(gè)完整的可讀框，并且被描述為SEQ ID NO24的殘基1-234。
31.一種對人DR5具有選擇性的抗體，所述抗體包含一個(gè)人源化重鏈免疫球蛋白和一個(gè)人源化輕鏈免疫球蛋白。
32.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包含權(quán)利要求30的抗體的人源化重鏈免疫球蛋白的編碼序列。
33.權(quán)利要求32的氨基酸序列，所述氨基酸序列被描述為SEQ IDNO31的殘基1-119。
34.一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包含權(quán)利要求30的抗體的人源化TRA-8輕鏈免疫球蛋白的編碼序列。
35.權(quán)利要求34的氨基酸序列，所述氨基酸序列被描述為SEQ IDNO46的殘基1-213。
36.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列包含權(quán)利要求30的抗體的人源化輕鏈免疫球蛋白的編碼序列。
37.權(quán)利要求36的核苷酸序列，所述核苷酸序列被描述為SEQ IDNO55的核苷酸1-711。
38.一種載體，所述載體包含(a)權(quán)利要求23或28中至少一項(xiàng)的核苷酸序列；和(b)一個(gè)調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件與所述核苷酸序列有效連接，使得所述核苷酸序列在宿主中被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
39.權(quán)利要求38的載體，所述載體選自病毒和質(zhì)粒。
40.權(quán)利要求39的載體，其中所述病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。
41.一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼權(quán)利要求31的抗體的重鏈或輕鏈人源化免疫球蛋白的核酸序列。
42.一種用權(quán)利要求38的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
43.一種用權(quán)利要求41的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，其中所述質(zhì)粒選自pHB14、pHB14-1、pHSG/M2-1-4、pCR3.1/M2-1和pSR/M2-1。
45.一種生產(chǎn)權(quán)利要求22的人源化抗體的宿主細(xì)胞。
46.一種生產(chǎn)人源化DR5抗體的方法，所述方法包括下述步驟(a)用編碼人源化免疫球蛋白輕鏈或人源化免疫球蛋白重鏈中的至少一種的第一載體轉(zhuǎn)化宿主，并且如果所述第一載體缺乏所述輕鏈或所述重鏈，則還用編碼所述第一載體中所缺乏的輕鏈或重鏈的第二載體轉(zhuǎn)化所述宿主；和(b)將所述轉(zhuǎn)化宿主孵育預(yù)定的時(shí)間長度，使得產(chǎn)生所述人DR5抗體。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述宿主選自真核細(xì)胞和原核細(xì)胞。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述真核細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是體內(nèi)細(xì)胞。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是離體細(xì)胞。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是體外細(xì)胞。
52.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使靶細(xì)胞與藥用有效量的人源化DR5抗體接觸的步驟。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是選自以下的一種人類癌細(xì)胞乳癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、造血細(xì)胞癌、前列腺癌、淋巴瘤、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝癌。
54.權(quán)利要求52的方法，所述方法還包括使所述靶細(xì)胞與藥用有效量的治療藥接觸的步驟。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述治療藥是一種抗腫瘤化合物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述抗腫瘤化合物選自紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol)、放線菌酮、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、放線菌素D、己烯雌酚、多柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法侖、氨甲蝶呤、絲裂霉素、6-巰基嘌呤、替尼泊苷、6-硫代鳥嘌呤、長春新堿和長春堿。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是一種人類細(xì)胞。
58.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是一種非人類細(xì)胞，所述非人類細(xì)胞起源于選自以下動物非人類靈長類、大鼠、小鼠、兔、山羊、綿羊、牛、豬、馬和雞。
59.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是體內(nèi)細(xì)胞。
60.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是離體細(xì)胞。
61.權(quán)利要求52的方法，其中所述靶細(xì)胞是體外細(xì)胞。
62.一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的商業(yè)試劑盒，所述試劑盒包含一種作為有效針對表達(dá)DR5的治療藥的對人DR5具選擇性的人源化抗體，所述人源化抗體與使用說明一起包裝在合適的容器中。
63.一種提高細(xì)胞內(nèi)NFκB水平的方法，所述方法包括下述步驟給予藥用有效量的DR5選擇性識別抗體。
全文摘要
本發(fā)明的抗體與人DR5相互作用，在所述受體下游產(chǎn)生激動或拮抗作用，包括抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。已經(jīng)闡明了抗DR5抗體的核酸序列和氨基酸序列以及產(chǎn)生了含有且表達(dá)這些序列的載體和細(xì)胞。詳細(xì)描述了關(guān)于所述抗體的方法和應(yīng)用，包括治療細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病和治療調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞生長。
文檔編號C07D305/14GK1440424SQ01812038
公開日2003年9月3日 申請日期2001年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月2日
發(fā)明者T·周, K·伊赤卡瓦, R·P·金伯利, W·J·科普曼 申請人:Uab研究基金會