專利名稱：用作化妝品原料的白芨多糖復合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種作為化妝品原料的白芨多糖復合物及其制備方法與一種美白保 濕抗衰老化妝品，屬于天然植物深加工技術領域。
背景技術：
白芨(Bletillast riata Reichb. f.)蘭科白芨屬，又稱小白芨、蓮及草、甘根、白 根、竹粟膠、雪如來、紫蘭(根)等，常見于蔭蔽草叢或林下潮濕地，因其根色白而連生，故名 之，在我國、日本及琉球均有分布?，F(xiàn)代研究分析表明，白芨中含有大量的植物性多糖，在干燥的鱗莖組織中含量約 為40% 50%，這些多糖主要由β-1，4-甘露糖、β-1，4-葡萄糖和β-1，6-葡萄糖殘基 組成，屬中性雜多糖。白芨在我國民間作為藥用已有上千年歷史，白芨已成為現(xiàn)在使用的不少中成藥中 的主要成分之一，民間常將其作為膠粘性止血劑，不僅可以補肺、生肌、祛痰、止血、治療吐 血、肺病、咳血、慢性胃潰瘍等，也可外用治療瘡毒潰爛。例如白芨配伍阿膠、枇杷葉、藕節(jié)用 于治療由陰虛引起的咳血；配伍烏賊骨用于治療吐血；單獨或配伍煅石膏用于外傷組織的 外敷；配伍金銀花、川貝母、甜花粉等構成“內消散”的主要成分；白芨粉末與芝麻油調和后 可治療組織燙傷等。迄今為止，國內有關白芨多糖的制備文獻不多，即使是有，也是常用sevag法來脫 除蛋白質，這樣的方法效率不高，申請?zhí)枮?0071019199. 1的專利申請公開了一種采用蛋 白酶去除植物蛋白來制得白芨多糖膠精制工藝，此法使得脫除蛋白效率得到提高，但是其 中采用了丙酮乙醚等物質，最后產物后處理顯得困難，會給環(huán)境造成污染，不利于環(huán)保。而 且至今尚沒有能將白芨應用于化妝品領域。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于解決上述的技術問題，提供一種作為化妝品原料的白芨多糖復 合物及其制備方法與用途。本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)用作化妝品原料的白芨多糖復合物，其特征在于該復合物包含20 SOKDa的小 分子白芨多糖和500 700KDa的白芨多糖，前者與后者的重量配比為1 1 1 20。進一步地，以上所述用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，(1)按以下步驟制備所述20 SOKDa的小分子白芨多糖步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量 體積比比為1 5 1 20，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2 小時，重復提取兩次；
步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入纖維素酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60 分鐘；步驟六滅酶快速升溫至10(TC，煮沸5 10分鐘，滅活纖維素酶；步驟七除酶降溫至50°C，加入木瓜蛋白酶，反應脫除植物蛋白及失活的纖維素 酶，高速離心去除木瓜蛋白酶和一些脂溶性成分；步驟八收集收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙醇，放置12 24小 時，直至沉淀完全；步驟九離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到小分子白芨多糖。(2)按以下步驟制備所述500 700KDa的白芨多糖步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量 體積比比為1 5 1 2，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2 小時，重復提取兩次；步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入木瓜蛋白酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60分鐘；步驟六收集高速離心30分鐘，收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙 醇，4 6°C放置12 24小時，直至沉淀完全；步驟七離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到白芨多糖；(3)將⑴和⑵制得的小分子白芨多糖和白芨多糖按1 1 1 20的重量比 復配，制得白芨多糖復合物。進一步地，以上所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，所述小分 子白芨多糖的制備過程中，步驟五所述纖維素酶的比活力為400u/mg，且纖維素酶與白芨提 取液的質量體積比為1 100000 1 100。進一步地，以上所述所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，所述 小分子白芨多糖的制備過程中，步驟七加入木瓜蛋白酶以脫除植物蛋白及失活纖維素酶的 反應時間為1 3小時。進一步地，以上所述所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，制 備小分子白芨多糖的步驟七和制備白芨多糖的步驟五，加入的木瓜蛋白酶的比活力均為 600u/mg，且木瓜蛋白酶與白芨提取液的質量體積比均為1 100000 1 100。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明在制備白芨多糖和小分子白芨多糖的工藝 中用木瓜蛋白酶去除植物蛋白，與常用的Sevage法相比，脫除蛋白效率更高，脫除蛋白后 白芨多糖中蛋白含量在0. 2%以下，由于在整個生產過程中不引入氯仿等有機溶劑，未用 到水和乙醇之外的其他任何溶劑，生產工藝綠色環(huán)保，產物后處理簡便易操作，簡化了生產 工藝，降低了生產成本。而且也是首次將白芨多糖復合物作為一種活性原料添加到化妝品 中，，拓展了白芨的應用。


圖1 白芨多糖和降解白芨多糖中蛋白含量經BCA法檢測結果示意圖。
圖2 燕麥葡萄糖標準曲線示意圖。
圖3 白芨多糖含量標準曲線示意圖。
圖4 白芨多糖復合物對B16細胞增殖的影響示意圖。
圖5 白芨多糖復合物對HaCat角質形成細胞增殖的影響示意圖。
圖6 白芨多糖復合物對成纖維增殖的影響示意圖。
圖7 白芨多糖和小分子白芨多糖對B16黑色素含量的影響示意圖。
圖8 BCA法測定蛋白濃度標準曲線示意圖。
圖9 白芨多糖復合物對B16來源酪氨酸酶的抑制效果示意圖。
圖10不同濃度白芨多糖復合物對B16細胞中TRP1，TRP2，PMEL-17表達的影響示意圖。
圖11白芨多糖復合物對HaCat細胞中VEGF表達量的影響示意圖。
圖12經紫外照射的HaCat中Capase-9的表達量在添加白芨多糖復合物后的變化示意圖Io
圖13熒光值/蛋白含量對白芨多糖提取物濃度影響示意圖。
圖14含有白芨多糖復合物的產品即使保濕效果示意圖。
圖15含有白芨多糖復合物的產品對皮膚中黑色素含量的影響示意圖。
圖16含有白芨多糖復合物的產品對皮膚亮度提升效果示意圖。
圖17含有白芨多糖復合物的產品對皮膚角質層水分含量的影響示意圖。
圖18含有白芨多糖復合物的產品對水分透皮散失率影響示意圖。
圖19含有白芨多糖復合物的產品抗衰老效果示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明揭示了一種作為化妝品原料的白芨多糖復合物，該復合物包含20 SOKDa 的小分子白芨多糖和500 700KDa的白芨多糖，前者與后者的重量配比為1 1 1 20。該白芨多糖復合物包含以下步驟(1)按以下步驟制備所述小分子白芨多糖步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量 體積比比為1 5 1 20，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2 小時，重復提取兩次；步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入纖維素酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60分鐘，纖維素酶的比活力為400u/mg，且纖維素酶與白芨提取液的質量體積比為 1 100000 1 100 ；步驟六滅酶快速升溫至100°C，煮沸5 10分鐘，滅活纖維素酶；
步驟七除酶降溫至50°C，加入木瓜蛋白酶以脫除植物蛋白及失活纖維素酶，反 應時間為1 3小時，高速離心去除木瓜蛋白酶和一些脂溶性成分，木瓜蛋白酶的比活力為 6000u/mg，且木瓜蛋白酶與白芨提取液的質量體積比為1 100000 1 100;步驟八收集收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙醇，放置12 24小 時，直至沉淀完全；步驟九離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到小分子白芨多糖。(2)按以下步驟制備所述白芨多糖步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量 體積比比為1 5 1 2，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2 小時，重復提取兩次；步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入木瓜蛋白酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60分鐘，木瓜蛋白酶的比活力為6000u/mg，且木瓜蛋白酶與白芨提取液的質量體積比為 1 100000 1 100 ；步驟六收集高速離心30分鐘，收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙 醇，4 6°C放置12 24小時，直至沉淀完全；步驟七離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到白芨多糖；(3)將⑴和⑵制備獲得的所述小分子白芨多糖和白芨多糖按1 1 1 20 的重量比進行復配。白芨多糖復合物在制備美白保濕化妝品過程中可作為添加劑加入。該化妝品的基 質是動植物油、礦物油、蠟、高級醇、脂肪醇、硅油、表面活性劑、磷脂、醇類、多元醇類、水溶 性聚合物、油溶性聚合物類、礦物質或去離子水，化妝品的劑型為水劑、霜劑、油劑、洗液或 乳狀液。采用上述方法獲得的白芨多糖復合物通過利用黑色素瘤細胞(B16-F1)模型，人 永生化角質形成細胞(HaCat)模型和人皮膚成纖維細胞模型檢驗表明白芨多糖復合物對 三種細胞均無細胞毒性，有抑制B16中黑色素產生的作用，不影響已產生的酪氨酸酶的活 性，而是通過降低TRP2、PLEM-17的表達，從而抑制黑色素產生的作用，充分表明白芨多糖 復合物是一種有效且安全的美白劑。而且可以提高HaCat細胞中VEGF的表達量，促進甘油 的合成，抵抗和修復紫外線UVA、UVB對細胞造成的損傷，抑制紫外線照射引起的細胞凋亡， 清除細胞中過量產生的活性氧(ROS)。同時動物安全性和刺激性實驗證明，白芨多糖復合物 安全，無刺激。將白芨多糖復合物添加到化妝品中，配制成具有美白，保濕、抗衰老等作用的功能 化妝品，通過無創(chuàng)性皮膚測試模型研究該白芨多糖復合物對皮膚角質層含水量，皮膚透皮 水分散失率，皮膚色度，皮膚皺紋和彈性的影響。實驗結果表明白芨多糖復合物可修復皮膚 屏障，提高皮膚水分含量，美白皮膚，促進角質更新，提高皮膚彈性，抵御紫外傷害，延緩皮 膚衰老的作用。
具體的檢測方法如下—、蛋白濃度的測定；利用BCA 法測定蛋白濃度，采用 Thermo scientific 生產的 BCATMProtein Assay Kit進行測定，白芨多糖和降解白芨多糖中蛋白含量經此方法檢測結果如圖1所示。表1、待測樣品的吸光值 二、多糖分子量測定；利用HPLC方法測定多糖分子量以燕麥β -Glucan (武漢百特純大分子科技有限公司)做標準品，標準曲線如圖2 所示；所制備白芨多糖和小分子白芨多糖的分子量檢測結果如表3所示測定表明降解 后小分子白芨多糖的分子量在5 40KDa之間。表2、標準品HPLC保留時間與對應的分子量表 表3、待測樣品的保留時間及計算分子量 三、多糖濃度的測定；本發(fā)明采用苯酚硫酸法測定多糖濃度，以葡萄糖為標準品，將待測樣品編號1、白 芨多糖；2、降解白芨多糖；3、白芨多糖復合物；4、未經木瓜蛋白酶脫除蛋白的白芨多糖。標 準曲線如圖3所示；所制備白芨多糖和小分子白芨多糖的多糖含量檢測結果見表5。表4、多糖濃度與光吸收值表 表5、待測樣品吸光值與計算出的多糖含量 四、細胞增殖測定；利用細胞試驗中廣泛使用的MTT測定細胞增殖的方法，測定結果如圖4 其中，圖4 中每個濃度五組平行，F(xiàn)檢驗(P < 0. 05)，由圖4可知白芨多糖對B16無細胞毒性，存活率 均在90%以上。白芨多糖復合物對HaCat角質形成細胞增殖的影響如圖5所示其中，圖5中每個 濃度五組平行，F(xiàn)檢驗(P < 0. 05)，由圖5得知在最高濃度為2mg/ml時，細胞存活率依然為 105%，證明無細胞毒性。白芨多糖復合物對成纖維細胞增殖的影響如圖6所示，其中，圖6中每個濃度五組 平行，F(xiàn)檢驗(P < 0. 05)。五、白芨多糖復合物對黑色含量影響測定；
1、細胞傳代分盤，用含10% FCS, 10ng/ml MSH的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。2、細胞貼壁后，加入待測樣品，每個樣品設置3 6組平行，同時設置空白對照，溶 劑對照，陽性對照。3、空白細胞長至90%滿時，消化，用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基制成細胞懸液0. 7ml，移入 1. 5ml離心管中，再用0. 7ml培養(yǎng)基沖洗，移入同一管中。4、IOOOrpm 離心 lOmin，棄去上清。5、每支離心管中加入0. 7ml Tris-Triton溶液，50°C烘箱放置2小時。6、加入0.7ml 20% TCA溶液，放置1小時后，8500rpm離心20分鐘。7、小心用移液器吸去上清，丟棄，離心管敞口放在50°C鼓風干燥箱中烘干。8、用無水乙醇洗滌兩次，烘干。9、每支離心管中加入200ul 3N NaOH，放入沸水浴中煮沸20min。10、冷卻后移入96孔板，測定450nm的吸光值，以630nm為參照波長。白芨多糖和小分子白芨多糖對B16黑色素含量的影響，結果如圖7 其中，圖7中 每個濃度五組平行，F(xiàn)檢驗(P < 0. 05)。由圖7可以看出白芨多糖和降解白芨多糖均對B16細胞的黑色素產生有良好的 抑制作用，熊果苷抑制B16黑色素產生的IC50濃度約為800ug/ml，白芨多糖和降解白芨多 糖的IC50均在IOOug左右，抑制效果遠強于高于熊果苷，IC50指活性物對黑色素產生具有 50%抑制率時的濃度。六、白芨多糖復合物對B16細胞酪氨酸酶活力抑制的測定；1、B16細胞來源的酶的制備消化離心收集對數(shù)生長期的細胞，加入Triton X-100，冰浴磁力攪拌2小時， 制成裂解細胞混合液，將裂解細胞混合液放入Amicon Ultra_15超濾離心管(50KDa)中， 4500rpm，4°C低溫離心30分鐘；將膜上部分移入離心管中，迅速放入冰浴備用(放置時間不 宜過長)，膜下部分棄去。2、BCA法測定含酶細胞提取液的蛋白濃度，如圖8所示。3、經計算細胞提取物蛋白濃度為7430ug/ml，調整為1300ug/ml進行酪氨酸酶抑 制試驗。表6、B16酪氨酸酶活性測定 白芨多糖復合物對B16細胞來源的酪氨酸酶的抑制作用結果如圖9所示其中，圖 7中每個濃度五組平行，F(xiàn)檢驗(P < 0. 05)。
由圖9可知，熊果苷對B16細胞來源的酪氨酸酶的抑制IC50 = 0.01%,白芨多糖 復合物雖然對B16細胞來源的酪氨酸酶具有一定抑制作用，但是效果不及熊果苷，由此可 推知白芨多糖復合物對黑色素生成的抑制不只是通過抑制酪氨酸酶活性，而是還有其它作 用途徑，我們通過實驗七進行驗證。七、B16細胞中TRP1、TRP2、PMEL-17表達量的測定；1、SDS-PAGE凝膠電泳，丙烯酰胺濃度(10% )，將B16細胞裂解液中蛋白成分進行 分離。2、將分離好的蛋白進行電泳轉PVDF (0. 22um)膜進行印跡3,10% BSA封膜，利用TRPl，TRP2，PMEL-17抗體進行免疫結合，PBS清洗清洗除去 未結合的一抗，然后再用連接有辣根過氧化物酶的酶連二抗進行免疫結合，PBS清洗，加入 顯色液，避光顯色至條帶清晰時加入雙蒸水終止反應。不同濃度白芨多糖復合物對B16細胞中TRP1，TRP2，PMEL-17表達的影響如圖10 所示由western blotting顯影結果可以看出，白芨多糖復合物對三種酪氨酸酶相關蛋 白的表達均有不同程度的抑制，尤其是對TRP-I表達量的影響最為顯著。驗證了由實驗六 的結果所作之推測。八、利用Eliasa試劑盒檢測白芨多糖復合物對HaCat細胞中VEGF的表達量的影 響。試劑盒購自上海美季生物技術有限公司購買，按照試劑盒說明書操作，結果如圖 11所示=HaCat細胞經80ug/ml白芨多糖復合物處理后，與空白相比較VEGF表達量的變化， 縱坐標數(shù)值為平均值士標準偏差(η = 6)，F(xiàn)檢驗，(P < 0. 05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，VEGF的表達量也隨之增加，表明白芨多糖復合物可促進角 質形成細胞中VEGF的表達。九、利用熒光檢測的方法測定Caspase-9表達量的變化；a、細胞培養(yǎng)前處理細胞培養(yǎng)120小時后，吸取培養(yǎng)基，PBS清洗一次，加入PBS直到正好覆蓋細胞， 200mJ/cm2UVB照射5分鐘，設置空白對照(未用UVB)照射，然后更換培養(yǎng)基，加入IOOug/ ml白芨多糖復合物，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。b、采收細胞，加入復合蛋白酶抑制劑，Triton裂解，測定裂解液蛋白濃度。c、加入 caspase-9 的熒光底物，37°C反應60min，400/505nm測定熒光值(INFINITE M200酶標儀)。d、以熒光值/蛋白含量(F/Protein)對白芨多糖提取物濃度做圖。經紫外照射的HaCat中Caspase-9的表達量在添加白芨多糖復合物之后的變化， 結果如圖12所示，其中圖中數(shù)據(jù)為平均值士標準偏差，P < 0. 05，與空白及UVB對照組在 統(tǒng)計學上有明顯差異。由圖12可知在白芨多糖復合物的作用下，被紫外損傷的HaCat細胞中凋亡信號 Caspase-9的表達量大大降低。十、檢測經紫外照射后的HaCat中ROS的表達量在添加白芨多糖復合物之后的變 化；
a、37°C，5% C02 進行細胞培養(yǎng)；b、細胞培養(yǎng)120小時后，吸取培養(yǎng)基，PBS清洗一次，加入PBS到正好覆蓋細胞， 200mJ/cm2UVB照射5分鐘，設置空白對照(未用UVB)照射，每組實驗設5個平行；C、更換培養(yǎng)基，加入lOOug/ml白芨多糖復合物，繼續(xù)培養(yǎng)4小時；d、加入二氫羅丹明123 (熒光探針)，培養(yǎng)20min ；e、采收細胞，制成Iml PBS懸液，超聲破碎，IOOOOrpm低溫離心；f、用酶標儀檢測500/536nm的熒光值，同時用BCA法測定蛋白濃度。以熒光值/蛋白含量(F/Protein)對白芨多糖提取物濃度做圖13，其中圖中數(shù)據(jù) 為平均值士標準偏差，P < 0. 05，與空白及UVB對照組在統(tǒng)計學上有明顯差異。由圖13可知，經紫外照射的HaCat中ROS的生成量在添加白芨多糖復合物之后明 顯降低，并呈劑量依賴性(25 250ug/ml內)。十一、白芨多糖復合物在化妝品種的應用，及添加有白芨多糖復合物的化妝品的 人體非創(chuàng)性功效評測按照本發(fā)明技術方案制得的白芨多糖復合物，可以作為美白，保濕，防曬和抗衰老 的功效性原料，其使用形式沒有特殊要求，它可以用于水劑、霜劑、油劑、洗液、乳狀液等各 種不同劑型的化妝品中。作為本發(fā)明應用的典型基質，涉及的已知物質有動植物油、礦物油、蠟、高級醇、 脂肪醇、硅油、表面活性劑、磷脂、醇類、多元醇類、水溶性聚合物、油溶性聚合物類、礦物質、 去離子水等，另外，根據(jù)需要可適當加入PH調節(jié)齊IJ、抗氧化齊 、螯合齊 、顏料、防腐劑和香精 等。此外，也可以與具有美白作用、抗衰老作用或護膚作用的其它活性成分結合使用，如防 曬齊 、血液循環(huán)促進劑、消毒劑、消炎劑、細胞活化劑、維生素類、氨基酸類、潤濕劑、角質層 分離劑。產品配料表1是添加有白芨多糖復合物的化妝品的具體配料組成。配制時，將表 中組分A加熱至85°C，溶化攪拌均勻，作為油相，將組分B放入容器加熱至85°C，攪拌溶解 成水相原料，油相原料加入水相原料中攪拌，乳化均質Imin后，繼續(xù)攪拌冷卻至45°C時， 加入香精、防腐劑等，攪拌均勻，陳化24小時后即可灌裝、包裝、檢驗，制得本發(fā)明之實例產
P
BFI ο配料表1:
12 以不添加白芨多糖復合物的產品為空白對照，將產品進行即時保濕人體非創(chuàng)性功 效評測，實驗方法如下1、篩選30名18 50歲之間的健康志愿者，選定前臂內側作為產品使用部位， 每個產品實驗部位面積為3X3CM2，產品使用量為2mg/CM2，約為半粒綠豆大小。2、志愿者 清洗前臂，在恒溫恒濕實驗室靜坐30分鐘，測定受試部位的水分含量值和水分透皮散失率 (TEffL)作為空白值。3、在測試部位使用產品，4使用產品的第2、4、6個小時測定測試部位 的水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)的變化，每個部位測5次，取平均值。6、統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)的變化情況。含有白芨多糖復合物的產品的即時保濕效果如圖14所示，圖中數(shù)值為平均值 士SD，P< 0. 05，經過F檢測，在添加量為時，對皮膚角質層含水量的即時提升度最高達 33%，在使用6個小時后提升度依然達到19%，遠高于空白產品的即時保濕效果。十二、以不添加白芨多糖復合物的產品為空白對照，將產品進行長效美白，保濕， 抗衰老人體非創(chuàng)性功效評測，實驗方法如下1、篩選30名18 50歲之間的健康志愿者，選定產品測試部位，每個測試部位面 積為2X2 3X3CM2，產品使用量為2mg/CM2，約為半粒綠豆大小。2、志愿者清洗測試部位，在恒溫恒濕實驗室靜坐30分鐘，運用皮膚測試儀測 定受試部位的黑色素含量值(Mexameter)和皮膚亮度值(Colorimeter)，水分含量值 (Cornemeter)和水分透皮散失率(TEWL) (Tewameter)，皮膚彈性和皺紋狀況(MPA580)作為
空白值。3、產品發(fā)放給志愿者，早晚在固定部位涂抹一次，實驗期間實驗部位不得使用其 他化妝品。4、測試周期6周，每兩周在恒溫恒濕環(huán)境中測定一次測定受試部位的黑色素含量 值和皮膚亮度值，水分含量值和水分透皮散失率(TEWL)，皮膚彈性和皺紋狀況的變化情況。5、統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析使用前后黑色素含量值和皮膚亮度值、水分含量值和水分透皮 散失率(TEWL)，皮膚彈性和皺紋狀況的變化。含有白芨多糖復合物的產品的美白效果如圖15，16所示圖15和16中數(shù)值為平 均值士SD，P<0. 05，經過F檢測，白芨多糖復合物本身具有一定的美白作用，可以提升皮 膚亮度，降低皮膚黑色素含量，但是單獨使用的效果并不突出，與熊果苷一起對熊果苷具有 增效協(xié)同作用的，建議和熊果苷一起使用，后續(xù)我們將進一步研究和其他具有美白活性的 原料的搭配使用效果。含有白芨多糖復合物的產品的保濕效果圖17，18所示由圖17，18可知白芨多糖復合物具有良好的保濕效果，小分子白芨多糖和白芨多 糖的結合即可快速提高皮膚角質層含水量，又可修復皮膚屏障，長期使用具有修復保濕的 作用，從根本上提升皮膚的保濕效果。含有白芨多糖復合物的產品的抗衰老效果如圖19所示，以R2，R5兩個指標衡量 皮膚彈性的變化，圖中R2顯示無負壓使皮膚有負壓時的最大的拉伸量之比，超接近1，彈性 超好；R5測試的第一個循環(huán)過程中，皮膚恢復過程的彈性部分與加負壓過程的彈性部分之 比，超接近1，彈性超好；兩個指標都有明顯的提升，說明白芨多糖復合物可以明顯提升測 試部位皮膚彈性圖19的數(shù)值為平均值士SD，P < 0. 05，R2，R5與不使用樣品部位存在顯 者差升。通過以上理化性質檢測，細胞模型評價，動物模型評價和非創(chuàng)性人體評價，證明 白芨多糖復合物是一種質量穩(wěn)定，指標與成分明確，具有美白，修復保濕，抗氧化，抗紫外、 抗衰老作用的植物多糖原料，安全無刺激，可以作為功能原料單獨或復配其他功能原料使 用在任何劑型的化妝品中。本發(fā)明對白芨多糖進行精制提取，并利用細胞培養(yǎng)技術和非創(chuàng)性皮膚評價技術進 行研究，驗證了白芨多糖可促進Hacat角質形成細胞中VEGF的表達，發(fā)現(xiàn)白芨多糖可明顯 降低皮膚的經皮水分散失率，證明其對皮膚屏障具有良好的修復作用，鑒于白芨是一種分子量較大的植物多糖，我們進一步利用生物酶加工技術對其進行了降解，非創(chuàng)性皮膚評價 實驗發(fā)現(xiàn)一定分子量范圍(20 SOKDa)的小分子白芨多糖可顯著提高皮膚的水分含量，對 皮膚具有良好的保濕效果，在此基礎上，結合白芨在其他傳統(tǒng)領域的應用，我們將白芨多糖 和小分子白芨多糖按一定比例合理搭配成白芨多糖復合物，綜合利用生物酶加工技術，細 胞培養(yǎng)技術，非創(chuàng)性皮膚評測技術，全面研究了白芨多糖復合物在細胞水平和人體水平上 的美白，保濕，抗紫外，抗氧化，延緩衰老作用，發(fā)現(xiàn)白芨多糖復合物具有顯著的保濕和抗氧 化作用，并具有一定的美白，延緩衰老作用。 本發(fā)明尚有多種具體的實施方式，凡采用等同替換或者等效變換而形成的所有技 術方案，均落在本發(fā)明要求保護的范圍之內。
權利要求
用作化妝品原料的白芨多糖復合物，其特征在于該復合物包含20～80KDa的小分子白芨多糖和500～700KDa的白芨多糖，前者與后者的重量配比為1∶1～1∶20。
2.權利要求1所述用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，其特征在于(1)按以下步驟制備所述20 SOKDa的小分子白芨多糖 步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量體積 比比為1 5 1 20，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2小 時，重復提取兩次；步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入纖維素酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60分鐘；步驟六滅酶快速升溫至10(TC，煮沸5 10分鐘，滅活纖維素酶； 步驟七除酶降溫至50°C，加入木瓜蛋白酶，反應脫除植物蛋白及失活的纖維素酶， 高速離心去除木瓜蛋白酶和一些脂溶性成分；步驟八收集收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙醇，放置12 24小時，直 至沉淀完全；步驟九離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到小分子白芨多糖。(2)按以下步驟制備所述500 700KDa的白芨多糖 步驟一粉碎將干燥的白芨塊莖粉碎至100目；步驟二 粗提取加入70 75%乙醇水溶液煮沸，白芨塊莖粉碎料與乙醇液質量體積 比比為1 5 1 2，重復提取三次，去除脂溶性成分和植物色素，收集沉淀；步驟三再提取向沉淀中加入去離子水，加熱并維持溫度50 55°C，連續(xù)攪拌2小 時，重復提取兩次；步驟四過濾濃縮離心，收集上清液，過濾，濃縮至原體積的1/10 1/2 ；步驟五加酶向濃縮液中加入木瓜蛋白酶，維持溫度45 50°C，攪拌反應30 60分鐘；步驟六收集高速離心30分鐘，收集上清液，攪拌后加入上清液的三倍體積乙醇，4 6°C放置12 24小時，直至沉淀完全；步驟七離心20分鐘，收集上清液，回收乙醇，將沉淀真空干燥，得到白芨多糖；(3)將⑴和⑵制得的小分子白芨多糖和白芨多糖按1 1 1 20的重量比復 配，制得白芨多糖復合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，其特征在 于所述小分子白芨多糖的制備過程中，步驟五所述纖維素酶的比活力為400u/mg，且纖維 素酶與白芨提取液的質量體積比為1 100000 1 100。
4.根據(jù)權利要求2所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，其特征在 于所述小分子白芨多糖的制備過程中，步驟七加入木瓜蛋白酶以脫除植物蛋 白及失活纖 維素酶的反應時間為1 3小時。
5.根據(jù)權利要求2所述的用作化妝品原料的白芨多糖復合物的制備方法，其特征在于制備小分子白芨多糖的步驟七和制備白芨多糖的步驟五，加入的木瓜蛋白酶的比活力 均為600u/mg，且木瓜蛋白酶與白芨提取液的質量體積比均為1 100000 1 100。
全文摘要
本發(fā)明提供了用作化妝品原料的白芨多糖復合物及其制備方法，白芨塊莖經干燥、粉碎、提取、酶處理、濃縮、干燥等步驟進行處理獲得白芨多糖，然后將白芨多糖經過酶加工處理、色譜精制，制成一定分子量的小分子白芨多糖，將白芨多糖與小分子白芨多糖按照1∶1～1∶20比例復配成白芨多糖復合物。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本法脫除蛋白效率更高，生產工藝綠色環(huán)保，產物后處理簡便易操作，簡化了生產工藝，降低了生產成本，且首次將白芨多糖復合物應用到化妝品中。
文檔編號A61Q19/08GK101899174SQ20101025040
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權日2010年8月11日
發(fā)明者姚志蕊, 張婷婷, 許至安, 趙毅, 陳婷婷, 馬立偉 申請人:珈儂生化科技(中國)有限公司;趙毅