專利名稱：夾竹桃花多糖及其衍生物、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖類及其作為藥物的應(yīng)用，尤其是涉及夾竹桃花多糖及其衍生物，制備方法及其應(yīng)用。
諸如肝素之類的多糖在血液系統(tǒng)中具有抗凝血作用是較早被發(fā)現(xiàn)的，它已作為藥物應(yīng)用于臨床。五十年代以后隨著對(duì)糖功能認(rèn)識(shí)的深入，逐步發(fā)現(xiàn)一定結(jié)構(gòu)的多糖對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有顯著的作用如抗腫瘤作用，抗病毒特別是抗愛滋病作用，抗炎作用和抗輻射作用。這些多糖已有三種作為藥物在國內(nèi)外臨床上正式使用(非正式使用的還有數(shù)種)。當(dāng)然還發(fā)現(xiàn)某些結(jié)構(gòu)的多糖對(duì)消化道系統(tǒng)也有作用如抗嘔吐，抗?jié)兊?Kigohara H.Yamada H. Kitasato Arch Exp.Med.1991,64:167；方積年多糖類藥物，陳惠黎主編“糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能”上海醫(yī)大出版社，1997,p325)。所有作為藥物而應(yīng)用于臨床的多糖最大特點(diǎn)是毒副作用小。但是多糖對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用至今還未見有人報(bào)道過。根據(jù)糖類的生物學(xué)特性的研究在1998年Thomas曾預(yù)言，多糖有可能作為治療老年性癡呆的藥物應(yīng)用于臨床(Thomas.WR,Current Opinion in Biotechnology,1998,9:74-79)。因此尋找一種具有類似于神經(jīng)生長因子作用的多糖，是一個(gè)很有意義的工作。我們從分離到的30余種多糖中，篩選到一個(gè)來源于夾竹桃花中的多糖，發(fā)現(xiàn)它不但具有較強(qiáng)的免疫促進(jìn)作用，而且還具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12的明顯的促進(jìn)繁殖與分化作用。
為此，本發(fā)明目的是提供一種具有神經(jīng)生長因子作用的夾竹桃花多糖及其衍生物。
本發(fā)明另一目的是提供夾竹桃花多糖的制備方法，是由夾竹桃花中提取分離純化而得。
本發(fā)明又一目的是提供夾竹桃花多糖用于制備治療老年癡呆癥，中風(fēng)，兒童智力低下等疾病的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明夾竹桃花多糖是由夾竹桃花中提取分離獲得的多糖。
由夾竹桃花多糖可制備得硫酸化夾竹桃花多糖和羧甲基化夾竹桃花多糖。
夾竹桃花多糖的制備方法夾竹桃花多糖是由夾竹桃花中提取分離獲得，其步驟如下1、提取、分離夾竹桃花經(jīng)乙醇回流，脫脂后的干花，經(jīng)沸水提取，過濾(a)得濾液，濾液經(jīng)濃縮，三倍乙醇沉淀，沉淀物溶于水，加十六烷基三甲基溴化物(CTAB)沉淀，離心，上清液經(jīng)透析，醇沉、干燥等步驟獲得一多糖組份(NIF2)粗產(chǎn)物。沉淀物經(jīng)醋酸溶解，醇沉，去蛋白等步驟，獲另一多糖組份(NIF1)粗產(chǎn)物。(b)殘?jiān)?jīng)氫氧化鈉溶液提取，再經(jīng)透析、醇沉等步驟獲另一多糖組份(NIF3)粗產(chǎn)物(詳見圖1)。
2、純化多糖組份NIF2經(jīng)二乙氨乙基纖維素(DEAE-Cellulose)柱層析，水，0.2M NaCl,0.4M NaCl,4.0M NaCl展層，獲得初步純化的各多糖組份NIF2Ⅰ,NIF2Ⅱ,NIF2Ⅲ,NIF2Ⅳ，上述四組份再經(jīng)DEAE-Cellulose和/或聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl S-300)和/或葡聚糖凝膠G-200(Sephadex G-200)柱層析獲得最后純化的各多糖組份，分別命名為J7,J8,J6,J4,J5和J1(詳見圖2)。NIF1及NIF3也經(jīng)二乙氨乙基-瓊脂糖凝膠(DEAE-Sepharose)和/或Sephacryl S-300柱層析如NIF2的類似純化過程，分別獲得純的多糖其他組份J10,J3,J2和J9(詳見圖3和圖4)。
各組份經(jīng)常規(guī)方法如全水解，分子量測(cè)定，核磁共振，紅外光譜等化學(xué)及光譜方法證明為多糖結(jié)構(gòu)。
對(duì)上述純化獲得的10個(gè)夾竹桃花多糖組份進(jìn)行純度鑒定以0.001ml/L的NaOH溶液為流動(dòng)相，0.2ml/分的流速在KS-805多糖柱上進(jìn)行純度分析，測(cè)得各多糖組份J1-J10均為單一對(duì)稱峰，說明所有組份均已達(dá)到單一純品。
夾竹桃花多糖的分子量測(cè)定以標(biāo)準(zhǔn)T-葡聚糖系列T-500,T-110,T-70,T-40,T-20為標(biāo)準(zhǔn)品，按純度鑒定中所述條件進(jìn)行HPLC，測(cè)得保留時(shí)間，以保留時(shí)間對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)數(shù)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線然后進(jìn)行夾竹桃花多糖樣品，相同條件進(jìn)行HPLC，測(cè)得保留時(shí)間，從標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得對(duì)應(yīng)的分子量，分別為J1(分子量＞1×106),J2(1.6×104),J3(1.6×105),J4(＞1×106),J5(＞1×106),J6(＞1×106),J7(5.0×103),J8(1.1×104),J9(＞1×106),J10(＞1×106)。
本發(fā)明夾竹桃花多糖衍生物的制備(1)硫酸化夾竹桃花多糖制備取純的夾竹桃花多糖在無水吡啶中，與氯磺酸反應(yīng)，NaOH中和，透析，凍干即得硫酸化夾竹桃花多糖。
(2)羧甲基化夾竹桃花多糖的制備取純夾竹桃花多糖溶解于NaOH中，與氯乙酸反應(yīng)，醋酸中和，透析、凍干，即得羧甲基化夾竹桃花多糖。
本發(fā)明夾竹桃花多糖經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞(PC-12細(xì)胞)有明顯的促生長分化作用，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞有明顯的促進(jìn)修復(fù)功能。夾竹桃花多糖對(duì)PC-12細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在刺激細(xì)胞的伸長，帶有活動(dòng)的生長錐軸突樣的神經(jīng)軸突生長。由圖5中可見，PC-12細(xì)胞置于不同濃度的夾竹桃花多糖溶液中，以神經(jīng)生長因子(NGF)作陽性對(duì)照，均顯示至少兩倍于原細(xì)胞神經(jīng)軸突的生長，夾竹桃花多糖在濃度為10μg/ml時(shí)即能誘導(dǎo)神經(jīng)節(jié)伸展，由此證明其作用十分類似于NGF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其作用或與NGF相當(dāng)或優(yōu)于NGF。因此夾竹桃花多糖可用于制備治療老年癡呆癥，中風(fēng)、兒童智力低下等疾病的藥物。也可對(duì)抗H2O2等化學(xué)物質(zhì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，對(duì)損傷細(xì)胞有明顯的促進(jìn)修復(fù)功能。夾竹桃花多糖還可用于實(shí)驗(yàn)中促神經(jīng)細(xì)胞生長，分化及神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的陽性對(duì)照試劑。
本發(fā)明夾竹桃花多糖具有類似于NGF的作用，而NGF在動(dòng)物體內(nèi)含量少，分離純化困難，而夾竹桃來源豐富，夾竹桃花多糖的分離純化相對(duì)來說比較簡(jiǎn)單，便于生產(chǎn)。因此對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有生物活性的夾竹桃花多糖，具有重大的學(xué)術(shù)意義及應(yīng)用前景。
本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。


圖1由夾竹桃花提取分離獲得夾竹桃花多糖的粗產(chǎn)物NIF1,NIF2及NIF3的流程圖。
圖2由夾竹桃花多糖粗產(chǎn)物NIF2純化得多糖組份J1,J4,J5,J6,J7和J8流程圖。
圖3由夾竹桃花多糖粗產(chǎn)物NIF1純化得多糖組份J10流程圖。
圖4由夾竹桃花多糖粗產(chǎn)物NIF3純化得多糖組份J2,J3和J9流程圖。
圖5是夾竹桃花多糖組份J1,J2,J3,J4和J5對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC-12的作用示意圖。
實(shí)施例1夾竹桃花500g置于沙氏提取器中，用95％乙醇回流8小時(shí)，乙醇液棄去，夾竹桃花置于紅外燈下去乙醇，得干花，然后用10升沸水提取8小時(shí)，過濾得濾液，濾液減壓濃縮至1.5升，攪拌下加入4.5升95％之乙醇，得沉淀，沉淀經(jīng)離心，棄去上清液。沉淀物溶于水1000ml，然后滴加5％濃度的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)300ml，離心得上清液及沉淀物，上清液經(jīng)水透析，三倍乙醇沉淀，離心，真空干燥，得粗多糖NIF24.6g。沸水提取后的殘?jiān)儆?％NaOH室溫提取過夜，離心，上清液用鹽酸調(diào)PH至7.0，透析，加入3倍乙醇沉淀，離心，真空干燥，得另一粗多糖NIF33.2g。用5％CTBA沉淀之沉淀物，溶于5％HOAC 500ml中，加入1500ml乙醇沉淀，離心得沉淀物，沉淀物溶于400ml水中，加入15％三氟乙酸(TCA)，離心去沉淀，上清液經(jīng)誘析，三倍乙醇沉淀、離心、真空干燥得另一粗多糖NIF12.2g。
實(shí)施例2NIF24.6g如圖2所示，經(jīng)DEAE-纖維素層析柱后，用水，0.2M NaCl，0.4M NaCl及4M NaCl相繼展層，分部收集，取硫酸-苯酚法顯色之陽性部份，各部份分別對(duì)蒸餾水透析2天，然后冷凍干燥，分別得到NIF2Ⅰ0.83g,NIF2Ⅱ 0.65g,NIF2Ⅲ 0.94g及NIF2Ⅳ 0.76g。NIF2Ⅰ再經(jīng)DEAE-纖維素柱層析一次，水展層，取糖部份，透析，冷凍干燥得NIF2ⅠA0.64g,NIF2ⅠA再經(jīng)DEAE-纖維素柱層析一次，經(jīng)水展層，如前法透析，冷凍干燥得二個(gè)組份，J70.19g,J80.21g。NIF2Ⅱ經(jīng)Sephacryl S-300柱層析，0.2M NaCl展層，然后透析，冷凍干燥，得J60.32g。NIF2Ⅲ經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，0.4M NaCl展層，透析，然后冷凍干燥得NIF2ⅢB 0.234g,NIF2ⅢC 0.518g。NIF2ⅢB再經(jīng)Sephadex G-200柱層析，水展層，透析，冷凍干燥得J40.18g。NIF2ⅢC經(jīng)Sephacryl S-300柱層析，0.2M NaCl展層，然后透析，冷凍干燥得J50.4g。NIF2Ⅳ經(jīng)Sephacryl S-300柱層析，0.2M NaCl展層，然后透析，冷凍干燥得J10.35g。
實(shí)施例3NIF12.2g溶于200ml水中，在攪拌中逐步加入100％的乙醇，使溶液的最終濃度為45％，離心，去上清液，得沉淀。溶解于水，經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析，0.4M NaCl展層，然后對(duì)蒸餾水透析2天，未透過液，冷凍干燥得NIF1E450.53g。然后再經(jīng)Sephacryl S-300柱層析，0.2M NaCl展層，透析，冷凍干燥，得J100.2g。
實(shí)施例4
NIF33.2g溶于少量水中，然后DEAE-Sepharose柱層析，相繼用水及0.4M NaCl展層，分別得NIF3Ⅰ，NIF3Ⅲ各1.2g及0.61g, NIF3Ⅰ再經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析，水展層得NIF3ⅠA，再一次DEAE-Sepharose柱層析，水展層得J30.16g,J20.42g。
NIF3Ⅲ經(jīng)Sephacryl S-300柱層析，0.2M NaCl洗脫，然后透析，冷凍干燥得J90.29g。
權(quán)利要求
1.一種具有神經(jīng)生長因子作用的多糖，其特征在于它是夾竹桃花多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的多糖的衍生物，其特征在于它們是硫酸化夾竹桃花多糖和羧甲基化夾竹桃花多糖。
3.如權(quán)利要求1所述的多糖的制備方法，其特征在于是由夾竹桃花中提取分離得夾竹桃花多糖，其步驟如下a．提取分離由夾竹桃花經(jīng)乙醇脫脂，水提取后得(1)濾液用十六烷基三甲基溴化物處理后得夾竹桃花多糖二個(gè)組份的粗產(chǎn)物，(2)殘?jiān)肗aOH提取處理，得夾竹桃花多糖另一個(gè)組份的粗產(chǎn)物；b．純化將提取分離得的竹夾桃多糖組份粗產(chǎn)物選用下列的層析柱二乙氨乙基-纖維素和/或二乙氨乙基-瓊脂糖凝膠和/或聚丙烯酰胺葡聚糖S-300和/或葡聚糖凝膠G-200進(jìn)行2-3次層析提純得夾竹桃花多糖的純產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的多糖的應(yīng)用，其特征在于所述夾竹桃花多糖可用于制備治療老年癡呆癥、中風(fēng)、兒童智力低下疾病的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種具有神經(jīng)生長因子作用的夾竹桃花多糖及其衍生物,夾竹桃花多糖是由夾竹桃花中提取分離再通過柱層析純化制得。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)夾竹桃花多糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的促生長分化作用,對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞有明顯的修復(fù)功能,其作用或與神經(jīng)生長因子相當(dāng)或優(yōu)于神經(jīng)生長因子,因此夾竹桃花多糖可用于制備治療老年癡呆癥、中風(fēng)、兒童智力低下等疾病的藥物。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1301774SQ9912574
公開日2001年7月4日 申請(qǐng)日期1999年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
發(fā)明者方積年, 丁侃 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海藥物研究所