硫酸化白芨多糖的新用途及一種治療眼表損傷的制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其設(shè)及硫酸化白巧多糖的新用途及一種治療眼表損傷的 制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 嚴重眼表損傷是眼科最常見、治療最棘手的一類疾病，發(fā)病率高，患病人群廣，而 在運些嚴重的眼表致角膜盲的疾病中，化學(xué)傷、熱燒傷和機械外傷引起者占了 60%W上。目 前臨床多采用異體角膜移植和人工角膜移植手段治療眼表損傷。但是，異體角膜移植面臨 移植排斥、供體不足等問題；而人工角膜構(gòu)建材料具有的異物性不支持角膜上皮細胞的生 長，同時其透明性，可塑性W及拉伸力等等因素依然是限制其發(fā)展的重要因素。
[0003] 為此，近年來大量臨床研究開始嘗試采用種子細胞配合細胞生長基質(zhì)來實現(xiàn)眼角 膜上皮重建。其中細胞生長基質(zhì)多采用特殊手段處理過的羊膜基質(zhì)，從目前臨床研究結(jié)果 來看，具有一定的修復(fù)角膜上皮的效果。但是此療法是采用組織塊聯(lián)合種子細胞的手段，仍 不能很好解決累及角膜深層基質(zhì)助損傷和燒傷后角膜癒痕和血管化的問題，且可操作性相 對較弱。
[0004] 白巧度letillastriata)為蘭科白巧屬多年生草本植物，W干燥的塊莖入藥。白 巧多糖具有的良好吸濕性和親水性，能促進氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和其它水溶性代謝產(chǎn)物的通透 作用，同時還能加強上皮和基質(zhì)細胞的粘附性。但目前未見將其用于治療眼角膜損傷的報 道。
[0005] 廝帶間充質(zhì)干細胞化UC-MSCs)為廝帶組織來源間充質(zhì)干細胞，具有自我更新和 多向分化的能力，可作為種子細胞促進組織損傷的修復(fù)和再生，因此，hUC-MSCs能夠具有修 復(fù)角膜上皮修復(fù)的功能。但是，現(xiàn)有的研究結(jié)果卻表明，hUC-MSCs在體外的存活能力較差， 將其直接用于角膜上皮的修復(fù)效果并不理想。將hUC-MSCs應(yīng)用于角膜上皮的修復(fù)仍是目 前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供硫酸化白巧多糖的新用途及一種治 療眼表損傷的制劑。本發(fā)明通過實驗證實硫酸化白巧多糖具有修復(fù)
[0007] 硫酸化白巧多糖在制備治療眼表損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的實施例中，硫酸化白巧多糖所能治療的眼表損傷為眼角膜損傷。
[0009] 在本發(fā)明的實施例中，硫酸化白巧多糖的分子量為30000D~50000D。
[0010] 在本發(fā)明的實施例中，硫酸化白巧多糖的制備方法為：將白巧粉碎后經(jīng)水提醇沉， 所得沉淀W水重懸，W氯仿和下醇的混合物抽提后，經(jīng)30000D~50000D透析，干燥、純化、 硫酸化，制得硫酸化白巧多糖。
[0011] 在一些實施例中，水提醇沉具體為：將白巧粉W水浸提后，提取液與乙醇水溶液混 合，靜置過夜制得沉淀。
[0012] 在一些實施例中，浸提的溫度為80°C，浸提的時間為4h。
[0013] 在一些實施例中，乙醇水溶液中乙醇的體積分數(shù)為95 %。
[0014] 在一些實施例中，乙醇水溶液與提取液的體積比為1:3。
[0015] 經(jīng)過氯仿和下醇的混合液抽提后，提取物中的蛋白被去除。離屯、后取水相。
[0016] 在一些實施例中，氯仿和下醇的混合物中，氯仿和下醇的體積比為5:1。
[0017] 在一些實施例中，沉淀溶于水后溶液的體積是氯仿和下醇混合物的3倍。
[0018] 在一些實施例中，透析采用的透析液為蒸饋水。
[0019] 在一些實施例中，干燥為凍干。
[0020] 在一些實施例中，干燥后的白巧多糖還經(jīng)過純化。
[0021] 在一些實施例中，純化為將凍干后的白巧多糖溶解后，過交聯(lián)葡聚糖G-100柱。 [002引在本發(fā)明的實施例中，硫酸化的方法為氯橫酸-化晚法。
[0023] 在一些實施例中，硫酸化的試劑為氯橫酸與化晚。
[0024] 在一些實施例中，氯橫酸與化晚的體積比為1:6。
[0025] 在本發(fā)明的實施例中，白巧多糖的硫酸化具體為：將白巧多糖溶于無水N，N-二甲 基甲酯胺，室溫攬拌30min后，加入硫酸化試劑，置于60°C水浴攬拌反應(yīng)化。
[0026] 在一些實施例中，硫酸化試劑為氯橫酸與化晚的混合物，其中氯橫酸與化晚的體 積比為1:6。
[0027] 在一些實施例中，經(jīng)硫酸化后，調(diào)整抑值為7. 5,減壓濃縮后W蒸饋水為透析液透 析3d，透析液濃縮后經(jīng)冷凍干燥得到硫酸化多糖。
[0028] 本發(fā)明制得硫酸化白巧多糖的分子量為30000D~50000D。
[0029] 本發(fā)明應(yīng)用體外細胞劃痕法建立上皮細胞損傷模型，人角膜上皮細胞W硫酸化白 巧多糖處理24小時后倒置顯微鏡下照相記錄計算遷移率。結(jié)果表明硫酸化白巧多糖與能 促進角膜上皮細胞的遷移，說明其能夠起到修復(fù)角膜損傷的作用。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種多糖-干細胞制劑，包括廝帶間充質(zhì)干細胞和硫酸化白巧多 糖。
[0031] 在本發(fā)明的實施例中，廝帶間充質(zhì)干細胞的數(shù)量為1X105個/mL~5X105個/mL。
[0032] 在一些實施例中，廝帶間充質(zhì)干細胞的密度為IX105個/mL~3X10 5個/mL。
[0033] 在一些實施例中，廝帶間充質(zhì)干細胞的密度為1.OX105個/mL。
[0034] 在本發(fā)明的實施例中，硫酸化白巧多糖的質(zhì)量分數(shù)為50yg/mL~300yg/mL。
[0035] 在一些實施例中，硫酸化白巧多糖的質(zhì)量分數(shù)為200yg/mL。
[0036] 在本發(fā)明的實施例中，廝帶間充質(zhì)干細胞為P3代~P5代的廝帶間充質(zhì)干細胞。
[0037] 在本發(fā)明的實施例中，廝帶間充質(zhì)干細胞的分離方法為組織塊培養(yǎng)法。
[0038] 具體的，hUC-MSCs的原代分離方法包括W下步驟：
[0039] 步驟1:將廝帶用含有l(wèi)OOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS緩沖液漂洗2次， W體積分數(shù)為75%的乙醇水溶液浸泡Imin~2min后，去除廝帶外膜和血管；
[0040] 步驟2:W人干細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%C02、37°C、濕度95%;第 5~7天半量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12~14天后全量換液去掉組織塊，收集細胞傳代培養(yǎng)。
[0041] 本發(fā)明將廝帶間充質(zhì)干細胞與硫酸化白巧多糖復(fù)配，所得制劑經(jīng)試驗證明能夠顯 著促進角膜上皮細胞的增殖，其效果顯著優(yōu)于單獨使用硫酸化白巧多糖或廝帶間充質(zhì)干細 胞。細胞遷移試驗表明，本發(fā)明提供的制劑能夠顯著促進角膜上皮細胞的遷移，其效果顯著 優(yōu)于單獨使用硫酸化白巧多糖或廝帶間充質(zhì)干細胞。說明本發(fā)明提供的制劑能夠具有修復(fù) 角膜損傷的作用。
[0042] 本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細胞制劑作為作為治療眼表損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0043] 在本發(fā)明的實施例中，眼表損傷為眼角膜損傷。
[0044] 本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細胞制劑的制備方法，其特征在于，包括W下步驟：將 廝帶間充質(zhì)干細胞W生理鹽水重懸后，與〇°C~4°C預(yù)冷的硫酸化白巧多糖溶液混合。
[0045] 在本發(fā)明的實施例中，白巧多糖溶液為硫酸化白巧多糖的PBS溶液。
[0046] 在本發(fā)明的實施例中，生理鹽水的體積為硫酸化白巧多糖溶液體積的1/20。
[0047] 本發(fā)明提供了硫酸化白巧多糖在制備治療眼表損傷的制劑中的應(yīng)用，并提供了包 括硫酸化白巧多糖和廝帶間充質(zhì)干細胞的制劑及其在治療眼表損傷中的應(yīng)用。本發(fā)明將廝 帶間充質(zhì)干細胞與硫酸化白巧多糖復(fù)配，所得制劑經(jīng)試驗證明能夠顯著促進角膜上皮細胞 的增殖，其效果顯著優(yōu)于單獨使用硫酸化白巧多糖或廝帶間充質(zhì)干細胞。細胞遷移試驗表 明，本發(fā)明提供的制劑、硫酸化白巧多糖皆能夠顯著促進角膜上皮細胞的遷移，但本發(fā)明提 供制劑的效果顯著優(yōu)于單獨使用硫酸化白巧多糖或廝帶間充質(zhì)干細胞。說明，本發(fā)明提供 的制劑能夠具有修復(fù)角膜損傷的作用。
【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明提供了一種廝帶間充質(zhì)干細胞制劑及其制備方法與應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已 經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本 文的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0049] 本發(fā)明采用的試劑和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0050] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[00川 實施例1
[0052] 白巧飲片研成粉末在80°C蒸饋水中分散溶解4h后過濾，濾去雜質(zhì)。
[0053] 濾液經(jīng)由3倍體積的95%乙醇浸泡過夜，沉淀物用蒸饋水重懸。
[0054] 加入1/3體積的氯仿和下醇的混合液（體積比5:1。）混均離屯、抽提蛋白成分，提 取水相層的液體。
[00巧]經(jīng)30000D-50000D透析柱透析（透析液為蒸饋水），制成凍干粉，得到白巧多糖粗 品。將白巧多糖粗品溶解后經(jīng)交聯(lián)葡聚糖G-100進一步純化制得白巧多糖。
[0056] 將白巧多糖氯橫酸-化晚法進行硫酸化修飾。具體步驟為：
[0057] 將0. 2g多糖粉末溶于35ml無水N，N-二甲基甲酯胺中，室溫攬拌30min后，加入 17. 5ml硫酸化試劑（氯橫酸與化晚的體積比為1:6)，置于60°C水浴攬拌反應(yīng)化。反應(yīng)結(jié) 束后冷卻至室溫，反應(yīng)液加入100ml冰水，用Imol/L化0H中和至抑7. 5,減壓濃縮至一定濃 度，用蒸饋水透析3d，透析液濃縮后經(jīng)冷凍干燥得到硫酸化多糖。
[00則 實施例2
[0059]將廝帶（乙肝、丙肝、HIV、支原體、梅毒等血清學(xué)檢查均為陰性）置于含有l(wèi)OOU/mL 青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS中漂洗2次，加入預(yù)冷的75%酒精，浸泡l-2min，期間不停 翻動廝帶；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用組織剪將廝帶剪成2mm左右的小段，每段用眼科 剪縱向開，用血管錯去除廝帶內(nèi)=根血管（兩條動脈，一條靜脈），同時去除廝帶外膜；將分 離好的廝帶用眼科剪剪成約1皿3大小的組織塊，取適量放入直徑為10cm的無菌培養(yǎng)皿中， 覆蓋70%培養(yǎng)皿的底面積。加入L0NZA人干細胞無血清培養(yǎng)液化onza叫traCULTURE?)， 5%C02、37°C、濕度為95%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第5天~7天半量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 天~14天左右全量換液去掉組織塊同時收集細胞傳代培養(yǎng)。
[0060] 經(jīng)傳遞3~5代的hUC-MSCs細胞