一種柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物及其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物開發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種柳生金針菇發(fā)酵液提取物及制備方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 食藥用菌是一類十分重要的天然生物資源，已成為當今新藥發(fā)掘和功能食品開發(fā) 的重要研宄對象。研宄表明，食藥用菌中含有多糖、蛋白、黃酮等多種活性物質(zhì)，具有提高機 體免疫力、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理學(xué)作用。目前已有香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖等通 過衛(wèi)生部門批準，成為臨床上抗腫瘤的免疫治療藥物。盡管已有大量食藥用菌多糖被開發(fā) 和利用，但由于我國菌物資源豐富，野生食用菌超過2000多種，馴化栽培的食用菌種類超 過100種，商品化種類約為60個，因此，仍有大量食藥用菌的食藥用價值有待開發(fā)利用。柳 生金針葫（Flammulina rossica)隸屬擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、金錢菌屬，是一種食用菌。 目前，國內(nèi)外市場尚無柳生金針菇蛋白多糖相關(guān)產(chǎn)品，同時文獻中也無任何關(guān)于柳生金針 菇多糖的提取及生物活性相關(guān)報道。因此本發(fā)明從柳生金針菇中獲得免疫活性多糖的方法 及應(yīng)用為柳生金針菇的深度發(fā)掘及多糖類免疫促進劑藥物和功能食品的開發(fā)提供重要研 宄基礎(chǔ)，具有重大的經(jīng)濟效益和社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供一種柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物及其制備方法及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：包括下列步驟：
[0005] (一）發(fā)酵：將柳生金針菇菌種接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為：溫度22-26?， 轉(zhuǎn)速120-16017/1^11，培養(yǎng)5-6(1后，以10-20%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為 ：溫度 22-26°C，轉(zhuǎn)速 120-160r/min，培養(yǎng) 5-6d 后，4000r/min-6000r/min 離心收集上清液，獲得粗 多糖蛋白復(fù)合物發(fā)酵液；
[0006] (二）提取：將步驟（一）所香粗多糖蛋白復(fù)合物發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 原體積的1/10-1/8,加入3-5倍體積無水乙醇4°C沉淀12~16h，離心10-20min，轉(zhuǎn)速 3000-5000r/min，收集沉淀，45-50°C干燥，即得。
[0007] 所述的種子培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200-300g ;葡萄糖15-20g，KH2PO4L 5-2. 0g， MgSO4 · 7H20,0· 75_lg，VB1，1-1. 5mg，水，1000mL。
[0008] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖100_200g;玉米粉200-400g;酵母浸粉60g; KH2P04,1. 5-2. Og ;MgS04 · 7H20, 7. 5-10g ;VB1，10-15mg ;水，1000 mL0
[0009] 所述的柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物，通過苯酚-硫酸法測定其中多糖含量為 38% -46%，通過考馬斯亮藍法測定蛋白含量為12% -15%。
[0010] 所述柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物在制備具有免疫調(diào)節(jié)活性的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 所述柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物在制備提高正常小鼠血清中的細胞因子INF-γ、 TNF-α和CRP的表達和脾淋巴細胞亞⑶47⑶8+的比值的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 所述柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物在制備提高免疫抑制小鼠抗體生成細胞數(shù)量和 血清中血溶素含量，以及S180瘤小鼠的胸腺指數(shù)抑制其腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的積極效果在于：填補了市場上對柳生金針菇資源開發(fā)和利用的空白。同 時，對于深度開發(fā)多糖類免疫促進劑藥物和具有免疫調(diào)節(jié)作用的保健食品開發(fā)提供了重要 的基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟價值和市場價值。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1
[0015] ( -）發(fā)酵：將柳生金針菇菌種接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為：溫度26°C， 轉(zhuǎn)速12〇171^11，培養(yǎng)5(1后，以1()%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為 ：溫度26°0，轉(zhuǎn)速 120r/min，培養(yǎng)5d后，4000r/min離心收集上清液獲得粗多糖蛋白復(fù)合物發(fā)酵液；所述柳 生金針菇多糖發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200g ;葡萄糖15g ;KH2P041. 5g ;MgS04 · 7H20， 0. 75g ;VB1，Img ;水，1000 mL ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖，100g ;玉米粉200g ;酵母浸粉， 60g ;KH2P04,1. 5g ;MgS04 · 7H20, 7. 5g ;VB1，IOmg ;水，1000 mL ；
[0016] (二）提?。簩⒋侄嗵堑鞍讖?fù)合物發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體1/10,加入3倍體積 無水乙醇4°C沉淀12h，3000r/min，離心10min，收集沉淀，45°C干燥獲得免疫活性多糖蛋白 復(fù)合物。
[0017] 實施例2
[0018] ( -）發(fā)酵：將柳生金針菇菌種接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為：溫度24°C，轉(zhuǎn) 速14〇1'/1^11，培養(yǎng)5.5(1后，以15%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為 ：溫度24°0，轉(zhuǎn)速 140r/min，培養(yǎng)5d后，4000r/min離心收集上清液獲得粗多糖蛋白復(fù)合物發(fā)酵液；所述柳生 金針菇多糖發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯250g ;葡萄糖17. 5g ;KH2P041. 75g ;MgS04 ·7Η20， 0. 88g ;VB1，I. 25mg ;水，1000 mL ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖，150g ;玉米粉300g ;酵母浸粉， 60g ;KH2P04,1. 75g ;MgS04 · 7H20,8. 8g ;VB1，12. 5mg ;水，1 OOOmT,；
[0019] (二）提?。簩⒋侄嗵堑鞍讖?fù)合物發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體1/9,加入4倍體積 無水乙醇4°C沉淀14h，4000r/min，離心15min，收集沉淀，47. 5°C干燥獲得免疫活性多糖蛋 白復(fù)合物。
[0020] 實施例3
[0021] (一）發(fā)酵：將柳生金針菇菌種接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件為：溫度22°C， 轉(zhuǎn)速16〇171^11，培養(yǎng)6(1后，以2()%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為 ：溫度22°0，轉(zhuǎn)速 160r/min，培養(yǎng)6d后，6000r/min離心收集上清液獲得粗多糖蛋白復(fù)合物發(fā)酵液；所述柳 生金針菇多糖發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯300g ;葡萄糖20g ;KH2P042. Og ;MgS04 · 7H20， Ig ;VB1，I. 5mg ;水，1000 mL ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖，200g ;玉米粉400g ;酵母浸粉，60g ; KH2PO4, 2. Og ;MgS04 · 7H20, IOg ;VB1，15mg ;水，10OOmT,；
[0022] (二）提?。簩⒋侄嗵堑鞍讖?fù)合物發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體1/8,加入5倍體積 無水乙醇4°C沉淀16h，5000r/min，離心20min，收集沉淀，50°C干燥獲得免疫活性多糖蛋白 復(fù)合物。
[0023] 對上述實施例通過苯酚-硫酸法測定其中多糖含量為38% -46%，通過考馬斯亮 藍法測定蛋白含量為12% -15%。
[0024] 下邊通過藥效學(xué)試驗來進一步說明本發(fā)明的效果。
[0025] 試驗例1
[0026] 昆明雄鼠50只，隨機分為5組，分為陽性對照組黃芪多糖、柳生金針菇多糖蛋白 復(fù)合物（簡稱本發(fā)明）高劑量組（500mg/kg)、中劑量組（250mg/kg)、低劑量組（125mg/kg) 和空白對照組生理鹽水。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)30天。實驗前12h斷糧不斷水，實驗的 第30天進行眼球取血，取得血清，依照Elisa說明書方法進行TNF- a，INF- γ，CRP的含量 測定。實驗結(jié)果見表1。
[0027] 表1柳生金針菇胞免疫活性多糖蛋白復(fù)合物對正常小鼠 TNF- a，INF- γ，CRP的 影響
[0029] 注：與空白對照組相比**Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05
[0030] 由表1結(jié)果可以看出，柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物可以極顯著提高正常小鼠血清 中的TNF-α含量，同時可以顯著提高正常小鼠血清中的INF-γ，CRP的含量。
[0031] 試驗例2
[0032] 昆明雄鼠50只，隨機分為5組，分為陽性對照組黃芪多糖、柳生金針菇多糖蛋白 復(fù)合物高劑量組（500mg/kg)、中劑量組（250mg/kg)、低劑量組（125mg/kg)和空白對照組生 理鹽水。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)30天。實驗前12h斷糧不斷水，第30天處死小鼠，取其 脾臟放置在300目篩網(wǎng)中，加入ImL培養(yǎng)液輕輕研磨，收集細胞，3000r離心5min，加入紅細 胞裂解液使其裂解，離心后細胞沉淀呈現(xiàn)乳白色，用PBS洗兩遍后，調(diào)整細胞個數(shù)到I X IO6 個/lOOyL，分別加入IOuL CD4-PE及CD8-APC，4°C避光染色lh，PBS洗兩遍后使其重懸，流 式細胞儀檢測。實驗結(jié)果見表2.
[0033] 表2柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物對正常小鼠淋巴細胞亞群的影響
[0034]
[0035] 注：與空白對照組相比呷〈0. 01，*P〈0. 05
[0036] 由表2結(jié)果看以看出，柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物可以通過提高CD4+含量同時降 低CD8+含量來提高CD4 +/CD8+的比值，從而對正常小鼠起到提高免疫力作用。
[0037] 試驗例3
[0038] 定量溶血分光光度測定法（QHS)測定抗體生成細胞。昆明雄鼠48只，隨機分為6 組，即為正常對照組、模型對照組、柳生金針菇多糖蛋白復(fù)合物低劑量組（125mg/kg