專利名稱：新型蛋白多糖復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型蛋白多糖復(fù)合物。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白(MT)化學(xué)名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，是一類富含半胱氨酸、廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含金屬及巰基的非酶蛋白。MT的分子量介于6000 7000Da之間，通常含有61個(gè)氨基酸，其中20個(gè)為半胱氨酸，可以與7個(gè)二價(jià)金屬離子結(jié)合形成兩個(gè)獨(dú)立的金屬簇。MT對(duì)金屬離子有特定的親和力，其對(duì)金屬的結(jié)合序列為Fe2+ < Co2+ < Zn2+ < Pb2+ < Cd2+ < Cu2+ Ag2+ < Bi2+ < Hg2+，是機(jī)體內(nèi)唯一一種在金屬代謝中起明確作用的小分子蛋白質(zhì)，結(jié)合重金屬是MT蛋白區(qū)別于其他蛋白質(zhì)的重要特性。 MT在生物體內(nèi)具有多種作用，包括解除重金屬的毒害，清除自由基，參與微量元素代謝，促進(jìn)機(jī)體免疫功能以及抗輻射、抗衰老等。同時(shí)，MT能抑制脂質(zhì)(如血脂)的過氧化反應(yīng)，可降低血液粘度，改善血液循環(huán)，能達(dá)到防治心腦血管疾病的目的和穩(wěn)定生物膜等多種生物學(xué)作用。因此，MT可應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。糖胺聚糖(GAGs)存在于動(dòng)物細(xì)胞的表面和細(xì)胞外基質(zhì)，是一種長鏈多糖，是由含已糖醛酸和己糖胺成分的重復(fù)二糖單元連接成的直鏈雜多糖。糖胺聚糖的通式為[己糖醛酸一己糖胺]η，η隨種類而異，一般在30 250之間。二糖單元中至少有1個(gè)單糖殘基帶有負(fù)電荷的羧基或硫酸基。在體內(nèi)1條或多條糖胺聚糖和1個(gè)核心蛋白共價(jià)連接形成蛋白聚糖，但透明質(zhì)酸除外。按單糖殘基、殘基間連鍵的類型以及硫酸基的數(shù)目和位置，糖胺聚糖可分為透明質(zhì)酸，4-硫酸軟骨素，6-硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，硫酸角質(zhì)素，肝素，和硫酸乙酰肝素。GA(is通過結(jié)合受體蛋白介導(dǎo)重要的生物學(xué)機(jī)制，比如保護(hù)蛋白免受降解、抗凝血、維持或抑制細(xì)胞生長、黏附和抗黏附、生物過濾器、促進(jìn)或抑制血管形成、誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長，以及在正常發(fā)育和病理?xiàng)l件下結(jié)合、貯存及向靶細(xì)胞釋放生長因子和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型蛋白多糖復(fù)合物，其功能特性和物理穩(wěn)定性均優(yōu)于獨(dú)立的金屬硫蛋白或糖胺聚糖。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案新型蛋白多糖復(fù)合物，由質(zhì)量百分比為的金屬硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖組成，其中，0 <M< 100。進(jìn)一步，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的最佳質(zhì)量比為4 5 1。作為優(yōu)選，所述金屬硫蛋白通過動(dòng)物體內(nèi)組織獲取或由基因工程方法獲取。作為優(yōu)選，所述糖胺聚糖通過動(dòng)物組織提取。進(jìn)一步，所述糖胺聚糖為透明質(zhì)酸，或4-硫酸軟骨素，或6-硫酸軟骨素，或硫酸皮膚素，或硫酸角質(zhì)素，或肝素，或硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。
本發(fā)明所述的新型蛋白多糖復(fù)合物綜合了兩組分的功能特性，使其功能特性和理化穩(wěn)定性比單獨(dú)的MT或GAGs都有改善，同時(shí)提高了 MT的某些生理活性例如熱穩(wěn)定性。使 MT與GAGs在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用更加廣泛。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的新型蛋白多糖復(fù)合物，是由質(zhì)量百分比為的金屬硫蛋白和 [100-M]%的糖胺聚糖組成，其中，0<M< 100。所述的金屬硫蛋白優(yōu)選通過動(dòng)物體內(nèi)組織獲取或由基因工程方法獲取。所述的糖胺聚糖優(yōu)選通過動(dòng)物組織提取；所述的糖胺聚糖包括透明質(zhì)酸、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素和硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。一、MT-GAGs最佳質(zhì)量配比實(shí)驗(yàn)1、MT 的制備。采用現(xiàn)有的提取方法從動(dòng)物肝臟中提取出活性&1-MT，并制成凍干粉。2、GAGs 的制備。采用現(xiàn)有的提取方法從海洋貝類動(dòng)物提取出的GAGs，并制成水溶液。3、新型蛋白多糖復(fù)合物即MT-GAGs的制備。取一特定濃度的GAk水溶液，按不同的質(zhì)量比加入MT凍干粉，攪拌混勻，得 MT-GAGs復(fù)合物。4、MT_GA(is復(fù)合物的分離取不同質(zhì)量比制備的MT-GAGs復(fù)合物，分別配成MT-GAGs溶液10ml，取Iml分別上柱分離(S印hadex G-751. 6*30，流速5ml/分)，214nm紫外監(jiān)測(cè)，記錄儀顯示當(dāng)MT-GAGs 質(zhì)量比為1 0時(shí)有MT樣品吸收峰，質(zhì)量比為1 1 4 1時(shí)在13 19份洗脫液有 MT-GAk樣品吸收峰，且隨MT量增大吸收峰值也增大，當(dāng)比例增大到5 1時(shí)另外又出現(xiàn) MT吸收峰，表示MT-GAGs配比達(dá)到飽和。5、MT-GAGs復(fù)合物經(jīng)人工胃液作用后分離。取不同質(zhì)量比MT-GAGs復(fù)合物適量，分別加人工胃液配制成1 X IO^mol/LMT-GAGs 溶液，37 °C溫育120min，煮沸3分鐘酶滅火，8000r/min離心5min，取上清液用6000透析膜透析12小時(shí)，將透析后溶液轉(zhuǎn)入IOml容量瓶中，加水至刻度，再取Iml上柱分離 (SephadexG-751. 6*30，流速5ml/分)，214nm紫外監(jiān)測(cè)，記錄儀顯示當(dāng)MT-GAGs質(zhì)量比為 1 0時(shí)MT樣品無吸收峰，質(zhì)量比為1 1 4 1時(shí)吸收峰與未經(jīng)人工胃液處理樣品的吸收峰相同，在質(zhì)量比>4 1時(shí)吸收峰沒有大改變，過量的MT在人工胃液中被降解。6、結(jié)論。MT與GAGs最佳質(zhì)量比為4 5 1。二、MT-GAGs對(duì)鉛中毒小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)1、鉛中毒蓄積模型取小鼠每天灌胃40mg/L的醋酸鉛溶液，按0. 01L/kg體重劑量灌胃，連續(xù)10天后， 測(cè)定血鉛確定已中毒后，隨機(jī)分為染毒低劑量給藥組(LD)、染毒中劑量給藥組(MD)、染毒高劑量給藥組(HD)、染毒對(duì)照組(Pb)和正常對(duì)照組(NC)，每組10只。2、樣品配制
取MT-GAGs 樣品分別配制成 0.01 %、0. 05% 和 0. 10% (mg/100ml)濃度樣品， 105°C，保溫30分鐘，灌胃用。3、動(dòng)物處理LD、MD、HD 3 組每天灌胃不同濃度的 MT_GA(is (MT GAGs = 4. 3 1)樣品，Pb 禾口 NC組灌胃去離子水，按0. 01L/kg體重劑量灌胃，連續(xù)7天，置代謝籠內(nèi)，收集7天的尿和糞便。7天后眼眶取血，并處死動(dòng)物，觀察內(nèi)臟變化，分離腎臟及股骨，測(cè)定尿、糞及血、腎、骨的
鉛含量。4、結(jié)果Pb組小鼠肉眼可見肝、腸明顯病變。其它各組小鼠內(nèi)臟未見異常。染毒小鼠經(jīng)用 MT-GAk灌胃后，3個(gè)濃度劑量組的小鼠的排泄鉛(尿鉛和糞鉛)均明顯高于未服MT-GAGs 的1 組染毒小鼠；血、腎、骨中的鉛含量明顯低于未服MT-GAGs的1 組小鼠；HD、MD組的腎鉛和HD組的骨鉛接近于正常NC組，說明MT-GAGs能明顯增加體內(nèi)鉛的排泄，降低體內(nèi)鉛的蓄積，對(duì)鉛中毒小鼠具有與MT相同的保護(hù)作用。與單純MT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。三、MT-GAGs對(duì)熱的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)1、紅細(xì)胞懸液的制備取新鮮兔肝素抗凝血2ml，2500r/min離心5min，吸掉血漿與白細(xì)胞，紅細(xì)胞用10 倍PBS清洗后，2500r/min離心5min，棄掉上清液，重復(fù)清洗三次后，配成1 X IO8紅細(xì)胞/ml
懸液，備用。2、氯化汞濃度與溶血率的關(guān)系測(cè)定Hg2+(汞離子)濃度0 2X 10_4mol/L對(duì)兔血紅細(xì)胞溶血的影響。取以上配制的紅細(xì)胞懸液，吸取0. 1ml，分別加入7. 90ml不同濃度的HgCl2 (氯化汞)溶液(Hg2+濃度 0 2X l(T4mol/L)，輕搖后于37°C溫育30min，然后在3000r/min離心5min，取上清液測(cè)定 417nm下的吸光值，按下式計(jì)算溶血率Hp Hp = (A-A0)Z(Aoo-A0)式中Aq-不加HgCl2時(shí)上清液的吸光值A(chǔ)——加入一定HgCl2后對(duì)應(yīng)的上清液吸光值A(chǔ)00——HgCl2濃度大到紅細(xì)胞完全溶血時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光值從下表中可見隨Hg2+濃度增加，Hp %增大，當(dāng)Hg2+濃度> 37. 5 X 10_6mO 1 /L時(shí)，Hp % 有突躍，大于56. 3 X 10_6mol/L時(shí)，紅細(xì)胞全部溶血，試驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。
權(quán)利要求
1.新型蛋白多糖復(fù)合物，其特征在于，由質(zhì)量百分比為的金屬硫蛋白和[100-M]% 的糖胺聚糖組成，其中，0 < M < 100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型蛋白多糖復(fù)合物，其特征在于，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的質(zhì)量比為4 5 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型蛋白多糖復(fù)合物，其特征在于，所述金屬硫蛋白通過動(dòng)物體內(nèi)組織獲取或由基因工程方法獲取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型蛋白多糖復(fù)合物，其特征在于，所述糖胺聚糖通過動(dòng)物組織提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型蛋白多糖復(fù)合物，其特征在于，所述糖胺聚糖為透明質(zhì)酸，或4-硫酸軟骨素，或6-硫酸軟骨素，或硫酸皮膚素，或硫酸角質(zhì)素，或肝素，或硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種新型蛋白多糖復(fù)合物。所述新型蛋白多糖復(fù)合物由質(zhì)量百分比為M％的金屬硫蛋白和[100-M]％的糖胺聚糖組成，其中，0＜M＜100。進(jìn)一步，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的最佳質(zhì)量比為4～5∶1。本發(fā)明綜合了兩組分的功能特性，使其功能特性和理化穩(wěn)定性比單獨(dú)的MT或GAGs都有改善，同時(shí)提高了MT的某些生理活性例如熱穩(wěn)定性。使MT與GAGs在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用更加廣泛。
文檔編號(hào)A61K31/728GK102188693SQ201110122299
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者吳怡, 李國躍 申請(qǐng)人:湛江市索奇生物技術(shù)有限公司