專利名稱：多糖/雙鏈rna復合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多糖/雙鏈RNA復合物，是雙鏈RNA與具有β -1,3-葡聚糖骨架 的多糖的復合物(complex)，所述雙鏈RNA能夠抑制靶基因表達，所述復合物基于上述雙鏈 RNA的作用能夠有效地發(fā)揮RNA干擾效應，并且通過使上述多糖與功能性分子連接，還能夠 發(fā)揮基于上述功能性分子的作用的有用的功能。
背景技術：
近年，利用21個堿基的短雙鏈RNA (小干涉RNA :siRNA)的RNA干涉(RNA interference =RNAi)法受到關注。上述RNAi法通過將100個左右堿基對的雙鏈RNA導入細 胞內(nèi)，在細胞質(zhì)內(nèi)通過切酶(Dicer)的作用分解為20 25個左右堿基對的雙鏈RNA，之后 與多種蛋白質(zhì)復合，形成RNA/蛋白質(zhì)復合物(該復合物稱作RICS =RNA誘導沉默復合物)， 所述復合物與由靶基因產(chǎn)生的mRNA的同源位點結(jié)合，從而強力地抑制基因表達。今天，利 用在3’末端具有2個堿基懸端(dangling end)的21個堿基長度的化學合成的雙鏈RNA 的方法成為主流。另外，近年，J. Rossi等人報道了 27個堿基對的雙鏈RNA比21個堿基長 度的siRNA產(chǎn)生高100倍左右的RNA干擾效應(參見非專利文獻1)。推斷這是由于27個 堿基對的RNA被作為RNaseIII樣酶的切酶切割成21個堿基長度的siRNA后，蛋白質(zhì)復合 物RISC識別siRNA，使得可以高效地產(chǎn)生siRNA效果。。由于使用上述合成RNA進行的RNA干涉法中樣品制備較容易，操作也簡單，因此 siRNA法不僅在生命科學領域并且在生物技術商業(yè)領域也備受關注。但是，上述優(yōu)異的RNA干涉法期望進一步改善下述問題，在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性、細胞 導入性、細胞內(nèi)定位、基因表達抑制效果、靶向特異性等。最近為了提高合成siRNA的核酸 酶耐性、獲得高活性的RNA干擾效應，嘗試在siRNA上進行各種化學修飾。例如為了提高對 核酸外切酶消化的抗性，合成了在siRNA末端用氨基、巰基或脫堿基位點等修飾的siRNA。 但是，已經(jīng)有報道指出如果對具有RNA干擾效應的雙鏈RNA的末端進行修飾，即使能夠提高 核酸酶抗性及細胞導入率，但RNA干擾效應顯著減弱。如上所述，現(xiàn)狀是現(xiàn)有技術還不能提 高具有RNA干擾效應的雙鏈RNA的核酸酶抗性及細胞導入性，實現(xiàn)更優(yōu)異的RNA干擾效應。另一方面，作為實際上用作肌肉內(nèi)注射制劑的臨床用藥的多糖有β_1，3-葡聚 糖。一直以來已知上述多糖具有天然的三螺旋結(jié)構(gòu)(參見非專利文獻2)。另外，已確認了 上述多糖在體內(nèi)的安全性，作為肌肉內(nèi)注射劑已使用了約20年(參見非專利文獻3)。進 而，有報道指出β-1，3-葡聚糖具有藥物傳遞能力，通過使上述β-1，3-葡聚糖與藥物形成 共價鍵，可以將該藥物傳遞至靶點(參見專利文獻1)。已知β-1，3-葡聚糖具有天然的三螺旋結(jié)構(gòu)。有報道指出將上述多糖溶解于極性 溶劑中，形成獨立存在的單鏈后，加入單鏈核酸，通過用水替代溶劑(復性過程)，可以形成 由核酸單鏈 多糖雙鏈組成的三螺旋復合物(參見非專利文獻4)。推斷上述三螺旋復合物 中核酸和多糖主要通過氫鍵復合。另外，近年本發(fā)明人等公開了通過形成含有β-1，3-葡聚糖和基因的復合物，可以傳遞基因(參見專利文獻2)。并且還報道了使用含有細胞膜穿透性官能團及脂質(zhì)膜破 裂性官能團的β-1，3-葡聚糖的核酸導入法(參見專利文獻3)。但是，上述任何一個報道 均只記載了將單鏈核酸導入細胞內(nèi)的方法，不涉及雙鏈SiRNA等。專利文獻4報道了利用 β-1，3_葡聚糖將具有遺傳信息的雙鏈DNA導入靶細胞的方法，但認為其導入率差，難以實 用化。因此，使β -1，3-葡聚糖單獨與具有干擾效應的雙鏈RNA復合，可能不能形成三螺 旋結(jié)構(gòu)，或者雖然形成三螺旋但RNA不再是雙鏈，無法期待效果。另外，具有RNA干涉作用 的雙鏈RNA在細胞內(nèi)要求的作用機制方面與具有遺傳信息的DNA不同，在細胞內(nèi)與RISC形 成復合物并與由靶基因產(chǎn)生的mRNA的同源位點相結(jié)合，所以即使將專利文獻4中記載的方 法適用于具有RNA干擾效應的雙鏈RNA，但預測其與DNA的情況相同即導入率低，或者引起 RNA干擾效應在細胞內(nèi)的顯著減弱。專利文獻1 國際公開第96/014873號說明書專利文獻2 國際公開第01/34207號說明書專利文獻3 日本特開2006-69913號公報專利文獻4 日本特開2005-204612號公報非專利文獻 1 J. Rossi et. al. Nature Biotech.，23, 222—226 (2005)非專利文獻2 Theresa Μ. et al. J. Am. Chem. Soc.，120，6909 (1998)非專利文獻 3 :Hasegawa，Oncology and Chemotherapy, 8, 225 (1992)非專利文獻4 櫻井和朗等、Polym.Pr印rints. Jpn.，第49卷、第4054頁、2000年

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的在于不減弱具有RNA干擾效應的雙鏈RNA的RNA干擾效 應，并且提高細胞導入性及降解酶抗性。本發(fā)明人等為了解決上述課題反復深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有β-1，3_葡聚糖骨架 的多糖與雙鏈RNA的復合物通過滿足下述(i) (iii)，可以有效保持RNA干擾效應，同時 顯著地提高細胞導入性及降解酶抗性。(i)所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶基因中的 靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有與所述有義鏈RNA互補的堿基序列，所述 雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，。(ii)上述雙鏈RNA中，上述有義鏈及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接 體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接。(iii)上述多糖與上述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，通過進一步的反復研究完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供下述多糖/雙鏈RNA復合物及其制造方法。項1. 一種多糖/雙鏈RNA復合物，其特征在于，為具有β-1，3-葡聚糖骨架的多 糖與雙鏈RNA的復合物，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序 列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有與所述有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈 RNA能抑制所述靶基因表達，
上述雙鏈RNA中，上述有義鏈RNA及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接 體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接，上述多糖與上述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。項2.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，通過使兩個上述多糖與上述單 鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物，上述單鏈多脫氧腺嘌呤與上述多糖形成三螺旋結(jié)構(gòu)。項3.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述有義鏈RNA由15 50個 核苷酸構(gòu)成，并且上述反義鏈RNA由與上述有義鏈RNA數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。項4.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述有義鏈RNA由21個核苷酸 構(gòu)成，并且上述反義鏈RNA由與上述有義鏈RNA具有數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。項5.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述有義鏈RNA由27個核苷酸 構(gòu)成，并且上述反義鏈RNA由與上述有義鏈RNA數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。項6.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述單鏈多脫氧腺嘌呤由20 100個脫氧腺嘌呤構(gòu)成。項7.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述單鏈多脫氧腺嘌呤直接或 者通過連接體與上述有義鏈RNA或者反義鏈RNA的5’末端及/或3’末端相連接。項8.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述多糖類為選自裂裥菌素、凝 膠多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及小核菌葡聚糖中的至少一種。項9.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述多糖類為連接有功能性分 子的β-1，3-葡聚糖。項10.如項9所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述功能性分子為細胞膜穿透 性分子或能夠賦予雙鏈RNA降解酶抗性的分子。項11.如項9所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述功能性分子為肽、陽離子
性分子、聚乙二醇。項12.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述雙鏈RNA的靶基因是細胞 的內(nèi)源基因，所述細胞具有與上述多糖結(jié)合的受體。項13.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述細胞為在該細胞膜表面表 達Dectin-I的細胞。項14.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其特征在于，所述多糖/雙鏈RNA復 合物通過由與上述Dectin-I結(jié)合誘導的信號被轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部。項15.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其特征在于，上述靶基因是與疾病的 發(fā)病或者癥狀的惡化相關的因子，所述疾病的發(fā)病或者癥狀的惡化是由于因外部刺激等過 量產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而引起的；或者上述靶基因是具有上述靶基因發(fā)生變異的位點、且其轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物為與病因直接相關的因子。項16.如項15所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其特征在于，由上述靶基因過量轉(zhuǎn) 錄的產(chǎn)物是誘導炎癥的因子。項17.如項15所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，由上述靶基因過量轉(zhuǎn)錄的產(chǎn) 物為選自TNFa、白介素及MIF中的至少一種。項18.如項15所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，由上述靶基因過量轉(zhuǎn)錄的產(chǎn) 物為控制細胞內(nèi)活性的開·關因子。
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項19.如項15所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，由上述靶基因過量轉(zhuǎn)錄的產(chǎn) 物為細胞表面受體，并且為作用于病體發(fā)病或惡化的因子。所述病體發(fā)病或惡化是由該細 胞表面受體引起的。項20.如項1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，上述靶基因是下述因子，所述 因子具有變異位點，因此其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物喪失正常的細胞功能，或者變?yōu)榫哂屑毎拘缘奈镔|(zhì) 并蓄積，從而誘導炎癥或細胞死亡等病態(tài)的發(fā)病·惡化。項21. —種多糖/雙鏈RNA復合物的制造方法，所述方法為項1所述的多糖/雙鏈 RNA復合物的制造方法，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶 基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有與所述有義鏈RNA互補的堿基 序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，其特征在于，包括下述工序通過以相對于1摩 爾多核苷酸連接雙鏈RNA、具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖為1 6摩爾的比例進行混合， 使上述單鏈多脫氧腺嘌呤和上述多糖復合的工序，所述多核苷酸連接雙鏈RNA在上述有義 鏈及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接。項22. —種具有β -1，3-葡聚糖骨架的多糖/雙鏈RNA復合物在體外或離體(ex Vivo)用于抑制靶基因表達的應用，所述多糖/雙鏈RNA復合物含有雙鏈RNA，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義 鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有 與所述有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，在上述雙鏈RNA 中在上述有義鏈RNA及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌 呤連接，上述多糖與上述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。項23. —種靶基因表達抑制方法，所述抑制方法抑制細胞內(nèi)靶基因的表達，所述方法包含將具有β -1，3-葡聚糖骨架的多糖/雙鏈RNA復合物導入細胞內(nèi)的
工序，所述多糖/雙鏈RNA復合物含有雙鏈RNA，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義 鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有 與所述有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，在上述雙鏈RNA 中在上述有義鏈RNA及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌 呤相連接，上述多糖與上述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物，保持由雙鏈RNA產(chǎn)生的RNA干擾效應，同時還具 有優(yōu)異的細胞導入性及降解酶抗性，因此與具有RNA干擾效應的現(xiàn)有雙鏈RNA分子相比，其 使用價值提高。因此，本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物例如可以用作對治療癌癥或艾滋等 疾病有效的基因藥物。另外，本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物，由于其多糖部分可以與細胞膜穿透性分子 或能賦予降解酶抗性的分子等各種功能性分子相連接，因此可以使其具有基于該功能性分 子的有用效果，可以進行多樣的分子設計，在臨床上的有用性也很高。進而，構(gòu)成本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物的雙鏈RNA由27個核苷酸的有義鏈 RNA、及與該有義鏈RNA完全互補的27個核苷酸的反義鏈RNA構(gòu)成時，上述本發(fā)明的效果更 加有效?？紤]其理由如下，但不限定于該解釋含有具有上述結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的多糖/雙鏈 RNA復合物被導入細胞內(nèi)后，通過切酶的作用27個堿基長度的雙鏈RNA有效地轉(zhuǎn)換為21個
7堿基長度且在3’末端具有2個堿基懸端的siRNA，因此通過多脫氧腺嘌呤連接于27個堿基 長度的末端的多糖脫離。即，多糖擔負著與提高雙鏈RNA的細胞導入性或核酸酶抗性等有 關的重要作用，但對RNA干涉反應不產(chǎn)生不良影響。有報道指出，一般而言被修飾的RNA干 涉分子減弱RNA干擾效應，但本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物如上所述由于切酶的作用導 致多糖脫離，所以不妨礙RNA干擾效應。因此，含有具有上述結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的多糖/雙鏈 RNA復合物可以提高細胞導入性或核酸酶抗性等，并且能有效地發(fā)揮其本來具有的RNA干 擾效應。
具體實施例方式本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物作為擔負RNA干擾效應的部分含有雙鏈RNA，所述 雙鏈RNA將具有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列的有義鏈RNA、及具有與上述有義鏈 互補的堿基序列的反義鏈RNA雜交，能抑制上述靶基因的表達。此處，具有與靶序列互補的 堿基序列的有義鏈RNA，是指與該靶序列100%配對的互補序列。此處，所謂“靶基因”是指由于RNA干擾效應抑制其基因表達的基因。本發(fā)明的多 糖/雙鏈RNA復合物中，對靶對象基因無特殊限制，可以根據(jù)上述多糖/雙鏈RNA復合物的 用途進行適當選擇。在本發(fā)明中，優(yōu)選靶基因存在于在細胞表面表達受體的細胞內(nèi)，所述受體能夠與 多糖結(jié)合，作為上述細胞，優(yōu)選例如表達Dectin-I的細胞，所述Dectin-I為β-葡聚糖的 受體。具有β_1，3-葡聚糖骨架的多糖，通過因與細胞表面的Dectin-I結(jié)合而誘導的信號 被轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部。作為本發(fā)明中的靶基因，沒有特殊的限制，但從用于藥物用途的觀點考慮，優(yōu)選與 疾病相關、希望能抑制其表達的基因。作為上述靶基因的具體例，可以舉出下述基因(a) 編碼與疾病的發(fā)病或者癥狀的惡化相關的因子的基因，所述疾病的發(fā)病或者癥狀的惡化是 通過外部刺激等過量產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物而引起的，(b)編碼下述因子的基因，所述因子具有靶基 因變異的位點且其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與疾病的發(fā)病直接相關。作為上述靶基因，可以舉出編碼細胞因子等誘導炎癥的因子的基因，所述細胞因 子例如為TNFa、白介素、MIF等。另外，(a)的靶基因包括為編碼控制細胞內(nèi)活性開·關因子的基因的情況。作為 上述基因，可以舉出蛋白激酶(例如Raf、MEK、Jak2等)、轉(zhuǎn)錄因子(例如Stat5等)等。進而，作為(a)的靶基因，還包括靶基因為編碼細胞表面受體的基因，并且還為編 碼作用于病體發(fā)病或惡化的因子的基因的情況，所述病體發(fā)病或惡化是由該細胞表面受體 引起的。作為上述基因，可以舉出編碼TNFR(腫瘤壞死因子受體)、PDGFR(血小板衍生生長 因子受體)、白介素受體等的基因。作為(b)的靶基因，是指編碼下述因子的基因，所述因子具有該靶基因發(fā)生變異 的位點，因此其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物喪失正常的細胞功能，或者變?yōu)榫哂屑毎拘缘奈镔|(zhì)并蓄積，從而 誘導炎癥或細胞死亡等病態(tài)的發(fā)病 惡化。作為上述基因，可以舉出Jak2變異V617F、ATm 變異CAG重復、TTR變異V30M、KT14變異R125C等。對靶基因中的靶序列沒有特別限制，只要該基因的表達可以被RNA干擾效應抑制 即可。靶序列可以根據(jù)公知方法適當確定，具體而言可以使用NCBI BLAST搜索等。例如靶序列可以是由19 30個堿基組成的區(qū)域，位于堿基“AA”之后，所述堿基“AA”處于靶基因 編碼區(qū)(ORF)起始密碼子的50 100個堿基下游的外顯子區(qū)中，靶序列的GC含量為50% 左右。本領域技術人員根據(jù)經(jīng)驗可知通過采用與上述靶序列互補的鏈，可以獲得優(yōu)異的RNA 干擾效應。另外，例如上述靶序列可以根據(jù)IDT公司(Integrated DNA Technologies, INC.) 的說明(Dicer Substrate RNAi Design)確定。最近有報道指出通過構(gòu)建如下雙鏈RNA可 以產(chǎn)生具有高RNA干擾效應的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA (i)在反義鏈RNA的5’末端具有A/ U對；(ii)在有義鏈RNA的5’末端具有G/C對；(iii)在反義鏈RNA的5’末端具有5個 左右的A/U對；且(iv)雙鏈中不存在9個以上的G/C對。(Ui-Tei et al.，NucleicAcids Res. ，32，936-948(2004))。對構(gòu)成上述有義鏈RNA的核苷酸數(shù)量沒有特別限制，只要能發(fā)揮RNA干擾效應即 可，例如可以舉出15 50個、19 30個，優(yōu)選21 27個、更優(yōu)選21個或27個。另外，上述反義鏈RNA為可以與上述有義鏈RNA雜交形成雙鏈的RNA。S卩，上述反 義鏈RNA為含有與上述有義鏈RNA互補的核苷酸序列的RNA。上述反義鏈RNA也可以不合 與上述有義鏈RNA的全長互補的序列，優(yōu)選具有與上述有義鏈RNA中的15個堿基長度以上 的區(qū)域互補的序列，較優(yōu)選具有與上述有義鏈RNA中的19個堿基長度以上的區(qū)域互補的序 列。對構(gòu)成上述反義鏈核苷酸的數(shù)量沒有特別限制，例如可以舉出15 50個、19 30個、優(yōu)選21 27個、更優(yōu)選21個或27個。需要說明的是，上述有義鏈和上述反義鏈的 核苷酸數(shù)量可以相互不相同，但優(yōu)選兩者的核苷酸數(shù)量相同。另外，上述有義鏈RNA與上述反義鏈可以雜交成雙鏈的狀態(tài)，在有義鏈RNA的5’ 末端側(cè)(即反義鏈的3’末端側(cè))和3’末端側(cè)(即反義鏈的5’末端側(cè))的任一方或雙方 的末端具有懸端(突出端)。另外，上述有義鏈RNA與上述反義鏈相互由數(shù)量相同的核苷酸 構(gòu)成時，可以雜交成雙鏈的狀態(tài)，在有義鏈RNA的5’末端側(cè)(即反義鏈的3’末端側(cè))與3’ 末端側(cè)(即反義鏈的’末端側(cè))的雙方為平滑末端(平端)，即可以為上述有義鏈RNA與上 述反義鏈完全互補地雜交的結(jié)構(gòu)。此處，所謂“懸端”是指在有義鏈RNA與反義鏈雜交成雙 鏈的狀態(tài)下，由于有義鏈RNA或反義鏈的末端部分不存在配對的核苷酸，所以為以單鏈狀 態(tài)存在的末端結(jié)構(gòu)。另外，所謂“平滑末端”是指在有義鏈RNA與反義鏈雜交的雙鏈狀態(tài)下， 有義鏈RNA的末端部分和與該有義鏈配對的反義鏈的末端部分完全配對，而不具有懸端的 末端結(jié)構(gòu)。作為構(gòu)成本發(fā)明多糖/雙鏈RNA復合物的雙鏈RNA的優(yōu)選方案，可以舉出上述有 義鏈RNA由27個核苷酸構(gòu)成，并且上述反義鏈RNA由與上述有義鏈RNA完全互補的27個 核苷酸構(gòu)成的雙鏈RNA。即，雙鏈RNA具有上述結(jié)構(gòu)時，5’及3’兩末端為平滑末端。另外，作為構(gòu)成本發(fā)明多糖/雙鏈RNA復合物的雙鏈RNA的其他具體例，可以舉出 上述有義鏈RNA及上述反義鏈RNA均由21個核苷酸構(gòu)成，并且在上述有義鏈RNA的5’末 端及上述反義鏈RNA的5’末端形成由2個核苷酸構(gòu)成的懸端。即，在上述雙鏈RNA中從上 述反義鏈RNA的3’末端側(cè)開始的第1 19個核苷酸序列，是與從上述有義鏈RNA的5’末 端側(cè)開始的第3 21個核苷酸互補的序列。構(gòu)成本發(fā)明多糖/雙鏈RNA復合物的雙鏈RNA中，上述有義鏈及反義鏈的四個末 端中的至少任一末端，直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤相連接。即，在上述有義鏈RNA的5’末端、上述有義鏈的3’末端、上述反義鏈的5’末端及上述反義鏈的3’末端中的 至少一個末端，與單鏈多脫氧腺嘌呤相連接。對上述單鏈多脫氧腺嘌呤的連接個數(shù)沒有特 別限制，從有效地發(fā)揮RNA干擾效應這一觀點考慮，優(yōu)選為1 3，更優(yōu)選為1或2，特別優(yōu) 選為1。本發(fā)明中，優(yōu)選與上述雙鏈RNA連接的上述單鏈多脫氧腺嘌呤的連接個數(shù)為1，并 且優(yōu)選上述單鏈多脫氧腺嘌呤與上述有義鏈的5’末端相連接。如上所述，上述單鏈多脫氧 腺嘌呤只與上述有義鏈的5’末端連接時，基于雙鏈RNA，可以使RNA干擾效應顯著。進而， 上述單鏈多脫氧腺嘌呤只與上述有義鏈的5’末端連接，并且構(gòu)成上述雙鏈RNA的上述有義 鏈和上述反義鏈的核苷酸數(shù)分別為27個時，可以進一步增強RNA干擾效應。另外，有義鏈RNA及反義鏈RNA由21個核苷酸構(gòu)成時，單鏈多脫氧腺嘌呤可以與 有義鏈/反義鏈、5’末端/3’末端中的任一方連接，能夠發(fā)揮優(yōu)異的RNA干擾效應。作為構(gòu)成上述單鏈多脫氧腺嘌呤的脫氧腺嘌呤的數(shù)量沒有特殊限制，只要能夠與 下述具有β_1，3-葡聚糖骨架的多糖形成復合物即可，例如可以舉出10 100個，優(yōu)選 20 100個，較優(yōu)選20 80個，更優(yōu)選40 60個。單鏈多脫氧腺嘌呤與具有β -1，3-葡聚糖骨架的多糖形成良好的復合物時，上述 得到的多糖/雙鏈RNA復合物具有較高的降解酶抗性。上述單鏈多脫氧腺嘌呤可以與上述雙鏈RNA的有義鏈RNA及/或反義鏈RNA的末 端核苷酸直接連接，也可以通過連接體連接。優(yōu)選后者，即通過連接體連接。為了使單鏈多脫氧腺嘌呤直接與RNA鏈的5’末端連接，具體而言可以使RNA鏈5’ 末端的核苷酸的5’碳原子和磷酸殘基以酯鍵連接，所述磷酸殘基通過酯鍵與單鏈多脫氧腺 嘌呤3’末端的3’碳原子連接。另外，為了使單鏈多脫氧腺嘌呤與RNA鏈的3’末端直接連 接，可以使與RNA鏈3’末端的核苷酸的3’碳原子通過酯鍵連接的磷酸殘基、和單鏈多脫氧 腺嘌呤5’末端的5’碳原子以酯鍵連接。另外，通過連接體使上述單鏈多脫氧腺嘌呤與上述雙鏈RNA的有義鏈RNA及/或 反義鏈RNA連接時，作為上述連接體例如可以舉出雙官能連接體。此處，對雙官能連接體沒有特別限制，只要為含有兩個官能團的連接體即可，可以 使用例如N-琥珀酰亞胺基=3-(2_吡啶基二硫基)丙酸酯、Ν-4-馬來酰亞胺丁酸、S-(2-吡 啶基二硫基)巰基乙胺、碘乙酸基琥珀酰亞胺、N-(4-馬來酰亞胺丁氧基)琥珀酰亞胺、 N-[5-(3’ -馬來酰亞胺丙酰胺)-1_羧戊基]亞氨基二乙酸、N-琥珀酰亞胺基-3-馬來酰 亞胺基丙酸酯等。除上述連接體外，作為上述雙官能連接體，還可以使用下述結(jié)構(gòu)的連接體。-0-C0-0-(L-I)-NH-CO-O-(L-2)-NH-CO-NH-(L-3)-NH-(CH2)nl-(L-4)-S-(CH2)nl-(L-5)-C0-(CH2)n「C0-(L—6)-C0-(CH2)n「NH-(L-7)-NH-(CH2)n「NH-(L-8)
-CO-NH-(CH2)nl-NH-CO--C ( = S) -NH- (CH2) nl-NH_C0-
-C ( = S) -NH- (CH2) n「NH_C ( = S)-CO-O- (CH2)nl-O-CO--C ( = S) -0- (CH2) nl-0-C0--C ( = S) -0- (CH2) nl-0-C ( = S)--CO-NH-(CH2)nl-O-CO--C ( = S) -NH- (CH2) nl-0_C0--C ( = S) -NH- (CH2) nl-0_C ( = S)--CO-NH-(CH2)nl-O-CO--C ( = S) -NH- (CH2) nl-0_C0--C ( = S) -0- (CH2) nl-NH-C0--C ( = S) -NH- (CH2) nl-0-C ( = S)--NH- (CH2CH2O) n2_CH (CH2OH)--NH- (CH2CH2O)n2-CH2--NH-(CH2CH2O)n2-CH2-CO-
(L-22) (L-23) (L-24)
(L-9) (L-IO) (L-Il) (L-12) (L-13) (L-14) (L-15) (L-16) (L-17) (L-18) (L-19) (L-20) (L-21)-o- (CH2) n3-S-S- (CH2) η4_0_Ρ ( = 0) 2_ (L-25)此處，上述通式(L-4) (L-21)中，nl表示1 40的整數(shù)，優(yōu)選2 20的整數(shù)， 更優(yōu)選2 12的整數(shù)。另外，上述通式(L-22) (L-24)中，n2表示1 20的整數(shù)，優(yōu)選1 10的整數(shù)， 更優(yōu)選1 6的整數(shù)。另外，上述通式(L-25)中，η3及n4相同或不同，表示1 20的整數(shù)，優(yōu)選1 10 的整數(shù)，較優(yōu)選1 6的整數(shù)。上述通式(L-4) (L-25)表示的連接體，其右側(cè)或左側(cè)的任一側(cè)可以與單鏈多脫 氧腺嘌呤相連接。優(yōu)選結(jié)構(gòu)為其左側(cè)與單鏈多脫氧腺嘌呤連接，其右側(cè)與上述雙鏈RNA的 有義鏈RNA及/或反義鏈RNA的末端相連接。另外，對于上述雙鏈RNA的有義鏈RNA及/或反義鏈RNA的末端核苷酸與連接體的 連接位點沒有特殊限制。例如，上述連接體可以通過取代構(gòu)成磷酸殘基的氫原子進行連接， 所述磷酸殘基為上述有義鏈RNA及/或反義鏈RNA的末端核苷酸的磷酸殘基，另外也可以 通過取代構(gòu)成上述末端核苷酸的羥基的氫原子進行連接。進而，對于上述單鏈多脫氧腺嘌 呤的末端脫氧核苷酸與連接體的連接位點沒有特殊限制。例如，上述連接體可以通過取代 構(gòu)成磷酸殘基的氫原子進行連接，所述磷酸殘基為上述單鏈多脫氧腺嘌呤的末端脫氧核苷 酸的磷酸殘基，另外也可以通過取代構(gòu)成上述末端脫氧核苷酸的羥基的氫原子進行連接。本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物中，作為擔負除RNA干擾效應之外的所期待功能 的部分，含有具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖。所謂“ β -1,3-葡聚糖”是指葡萄糖通過β 1 — 3糖苷鍵連接而成的多糖，已知各 種β_1，3-葡聚糖，所述β-1，3-葡聚糖側(cè)鏈的葡萄糖殘基數(shù)相對于主鏈的葡萄糖殘基數(shù) 比例(以下簡稱為側(cè)鏈率)不同。對于本發(fā)明使用的多糖類沒有特殊限制，只要具有β-1， 3_葡聚糖骨架即可，但從使其易于與上述單鏈多脫氧腺嘌呤復合，進一步提高本發(fā)明的多
11糖/雙鏈RNA復合物的細胞內(nèi)導入率這一觀點考慮，優(yōu)選使用含有側(cè)鏈率較高的β -1， 3-葡聚糖骨架的多糖。作為本發(fā)明多糖/雙鏈RNA復合物中使用的多糖，具體而言，可以舉出裂裥菌素、 凝膠多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖、小核菌葡聚糖等。上述多糖中，由于裂裥菌素 能進一步顯著提高細胞內(nèi)導入性及酶降解抗性，因此為本發(fā)明中優(yōu)選的多糖。對于本發(fā)明多糖/雙鏈RNA復合物中使用的多糖的分子量沒有特殊限制，可以根 據(jù)所使用多糖的種類、上述單鏈多脫氧腺嘌呤的鏈長等進行適當確定。具體而言，作為上述 多糖的分子量，可以舉出通常為25，000 2500，000，優(yōu)選為25，000 150，000。本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物通過將單鏈多脫氧腺嘌呤和上述多糖復合而形 成，所述單鏈多脫氧腺嘌呤與上述雙鏈RNA連接。對于上述單鏈多脫氧腺嘌呤與上述多糖 的復合結(jié)構(gòu)沒有特殊限制，通常優(yōu)選將1個上述單鏈多脫氧腺嘌呤與2個上述多糖復合而 成的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)。上述三鏈螺旋結(jié)構(gòu)的形成可以根據(jù)下述方法具體實施。具有β-ι， 3_葡聚糖骨架的多糖在天然狀態(tài)下或在水中為三螺旋結(jié)構(gòu)。將上述多糖溶解于DMSO(二甲 基亞砜)等極性溶劑成為單鏈后，加入連接有單鏈多脫氧腺嘌呤的雙鏈RNA，通過用水替代 溶劑(復性過程)，可形成由連接有雙鏈RNA的多核苷酸單鏈部分與兩個多糖形成的、復合 為三螺旋型的結(jié)構(gòu)(裝配結(jié)構(gòu)(association structure))。上述多核苷酸與多糖的復合主 要是通過氫鍵和疏水性相互作用形成的。另外，本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物中含有的上述多糖可以與功能性分子連接。 通過使用上述與功能性分子相連接的多糖，可以使本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物具有基 于該功能性分子的有用功能。作為上述功能性分子，具體而言可以舉出肽、蛋白質(zhì)、糖、氨基 酸、DNA、RNA、低分子有機 無機材料、膽固醇、樹狀聚體(dendrimer)、脂質(zhì)、高分子材料等。作為上述肽，可以舉出例如由3 40個，優(yōu)選6 30個，更優(yōu)選8 25個氨基酸 組成的肽。具體而言，可以舉出細胞膜穿透肽(八聚精氨酸(R8)、穿膜肽等)、核定位信號 肽序列(HIV-1 Tat、SV40T抗原等)、核輸出信號肽(HIV-lRev、MAPKK等)、細胞膜融合肽 (gp41、病毒融合肽等)。其中，本發(fā)明中優(yōu)選使用R8。R8具有促進向細胞內(nèi)導入的作用，如 果使用連接有R8的多糖，則可以獲得能將多糖/雙鏈RNA復合物更有效地導入細胞內(nèi)的優(yōu) 點ο作為上述蛋白質(zhì)，可以使用存在于體內(nèi)的蛋白質(zhì)、具有藥理作用的蛋白質(zhì)、具有分 子識別作用的蛋白質(zhì)等，作為上述蛋白質(zhì)的例子，可以舉出輸出蛋白/輸入蛋白·蛋白質(zhì)、 纖連蛋白、抗生物素蛋白、抗體等。作為上述糖，可以舉出例如葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖胺等單糖、任意組 合上述單糖所得的寡糖或多糖等。作為上述低分子有機.無機材料，可以舉出例如精胺、亞精胺等陽離子性分子； FITC、AleXa、Cy3、Cy5等熒光物質(zhì)；生物素；量子點；金微粒等。作為上述樹狀聚體，可以舉出例如聚酰胺-胺樹狀聚體等。作為上述脂質(zhì)，可以舉出例如亞油酸、DOPE (1，2- 二油酰-sn-甘油_3_磷酰乙醇 胺)等。作為上述高分子材料，可以舉出例如聚乙二醇、聚乙烯亞胺等。上述功能性分子中，優(yōu)選肽、陽離子性分子、聚乙二醇，更優(yōu)選肽。另外，上述功能
12性分子中，優(yōu)選具有細胞膜穿透性的分子(細胞膜穿透性分子)及能賦予雙鏈RNA降解酶 抗性的分子。上述功能性分子中，作為細胞膜穿透性分子可以舉出肽等，作為能賦予雙鏈 RNA降解酶抗性的分子可以舉出聚乙二醇。對于上述多糖與功能性分子的連接，可以直接或通過連接體使上述功能性分子與 上述多糖的側(cè)鏈相連接。作為使功能性分子與多糖側(cè)鏈相連接的方法，可以采用各種反應， 優(yōu)選對主鏈的糖苷鍵不產(chǎn)生影響的、選擇性導入至側(cè)鏈的方法。作為上述方法，例如可以 舉出以下方法。即，首先使用高碘酸鈉等氧化劑氧化從裂裥菌素等的主鏈分枝出的具有1， 6-吡喃葡萄糖苷鍵的葡萄糖殘基，使其開環(huán)形成醛。然后，在硼氫化鈉等還原劑存在下，使 用具有氨基的功能性分子，或者使用與具有氨基的連接體相連接的功能性分子的氨基還原 氨化上述醛基。通過上述方法可以合成與功能性分子相連接的多糖。另外，作為其他方法，例如可以舉出以下方法。首先，使用高碘酸鈉等的氧化劑氧 化從裂裥菌素等的主鏈分枝出的具有1，6_吡喃葡萄糖苷鍵的葡萄糖殘基，使其開環(huán)形成 醛。然后，使用次氯酸鈉將上述醛基氧化成羧酸后，使用疊氮磷酸二苯酯使具有氨基的功能 性分子、或者與含有氨基的連接體相連接的功能性分子和羧酸發(fā)生縮合反應，也同樣可以 得到目標產(chǎn)物。多糖與功能性分子連接時，作為功能性分子的連接比例，例如可以舉出相對于每 100個多糖的側(cè)鏈，功能性分子為1 200個，優(yōu)選為1 100個，特別優(yōu)選為1 50個。 上述功能性分子的連接比例，在上述方法中可以通過控制相對于分枝葡萄糖殘基的高碘酸 鈉等氧化劑的添加量進行調(diào)整。上述多糖與功能性分子連接時，優(yōu)選通過連接體將上述功能性分子連接于上述多 糖的側(cè)鏈。作為上述連接體，優(yōu)選使用上述雙官能連接體。另外，對于上述多糖與上述功能性分子或連接體的連接位點沒有特殊的限制，所 述連接體與上述功能性分子連接，優(yōu)選上述功能性分子或與上述功能性分子相連接的連接 體取代具有1，6_吡喃葡萄糖苷鍵的葡萄糖的1，2-二醇部位進行連接，所述葡萄糖從上述 多糖的β-1，3-葡聚糖的主鏈分枝出。本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物，可以按照公知的方法制備。具體而言，可以舉 出通過下述(1) (3)工序進行制備的方法(1)根據(jù)公知的方法制備多核苷酸連接雙鏈 RNA，所述多核苷酸連接雙鏈RNA直接或通過連接體連接有上述單鏈多脫氧腺嘌呤，(2)另 外，分別準備具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖，或制備直接或通過連接體連接有功能性分 子相連接的具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖(修飾型多糖)，(3)然后，使用連接在DNA連 接雙鏈RNA上的單鏈多脫氧腺嘌呤和上述多糖或上述修飾型多糖形成復合物。在上述方法的(3)的工序中，優(yōu)選上述多核苷酸連接雙鏈RNA與上述多糖或上述 修飾型多糖以1 1 1 5、優(yōu)選1 1.3 1 2的摩爾比進行混合，使上述多核苷酸 連接雙鏈RNA中的單鏈多脫氧腺嘌呤區(qū)域與上述多糖或上述修飾型多糖復合。以上述摩爾 比，將上述多核苷酸連接雙鏈RNA與上述多糖或上述修飾型多糖置于復合物形成條件下， 由此可以使兩者有效地相互作用，從而能夠提高本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物的制備效 率。本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物由于可以被導入細胞內(nèi)而抑制在細胞內(nèi)的靶基因 的表達，因此可以用作以靶基因的表達抑制為目的的藥物。將本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物向細胞內(nèi)導入的導入量或者方法，與現(xiàn)有的SiRNA的情況相同。需要說明的是，由于本 發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物單獨使用即具有優(yōu)異的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，因此可以不使用用 于將SiRNA導入細胞內(nèi)的現(xiàn)有基因?qū)朐噭?，或減少現(xiàn)有基因?qū)朐噭┑氖褂昧?，而將?發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合物導入細胞內(nèi)。需要說明的是，本發(fā)明的多糖/雙鏈RNA復合 物的靶基因的表達抑制可以在體內(nèi)進行，或者也可以在體外或離體進行。另外，本發(fā)明也提供了用于抑制在細胞內(nèi)靶基因的表達的、上述多糖/雙鏈RNA復 合物的應用。并且，本發(fā)明還提供了利用上述多糖/雙鏈RNA復合物的靶基因表達的抑制 方法。上述應用及方法中，關于多糖/雙鏈RNA復合物及其使用方法等如上所述。實施例以下基于實施例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。需要說明的是， 以下分別用“SPG”及“修飾SPG”表示裂裥菌素及連接有功能性分子的裂裥菌素。另外，用 “聚(dA)”或“poly (dA)”表示多脫氧腺嘌呤。另外，用“PEG”表示聚乙二醇。實施例11.修飾型SPG的合成根據(jù)文獻(A.C. S. 38 (1) , 253 (1997) ；Carbohydrate Research, 89， 121-135(1981))記述的方法制備三螺旋結(jié)構(gòu)的SPG。即，使用最少的培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)從 ATCC(美國標準菌種收藏所)得到的裂褶菌(ATCC44200)7天后，將離心分離細胞成分及不 溶殘渣得到的上清液進行超音處理，得到分子量45萬的三螺旋結(jié)構(gòu)的SPG。以下有時也用 “SPGl ”表示上述得到的SPG。然后，將制備的分子量45萬的IOOmg SPGl溶解于80ml蒸餾水中。將26. 4mg高 碘酸鈉(相對于側(cè)鏈葡萄糖為0.8當量)溶解在少量的蒸餾水中，在4°C下邊冷卻攪拌邊緩 慢加入上述SPGl溶液中。用透析膜(排阻極限14，000)透析反應液后，冷凍干燥，得到白 色固體(導入醛基的SPG)。使用上述得到的化合物，進行肽、精胺、或者PEG的連接。肽的連接將上述得到的白色固體溶解于35ml 二甲基亞砜中，加入2_氨基乙醇(過量)，室 溫下攪拌2日后，加入300mg的硼氫化鈉(過量)。用透析膜(排阻極限14，000)透析反 應液后，冷凍干燥，得到白色固體。按照以下方法將肽連接到上述得到的導入了氨基的SPG 上。作為肽使用R8(氨基酸序列CRRRRRRRR(序列號1))、tat (氨基酸序列 CGGSGRKKRRQRRRPPQ (序列號2))及RGD (氨基酸序列CRGD)，將上述肽與導入了氨基的 SPG相連接。具體而言，使用作為連接體的N-琥珀酰亞胺基-3-馬來酰亞胺基丙酸酯 (SMP)將上述肽的巰基部位與被導入SPG的氨基部位相連接，參考文獻Takahisa Anada et al. ,Journal of Controlled Release, Volumel08,Issues2_3,28November2005,Pages 529-539 ；Matsumoto Takahiro,et al.，Biochim Biophys Acta,1670(2), (2004)，91—104。以下分別用“SPG2”、“SPG3”及“SPG4”表示上述得到的R8肽修飾SPG、tat肽修飾 SPG及RGD肽修飾SPG。精胺的連接使用上述得到的白色固體與精胺(Sigma Corporation公司；結(jié)構(gòu)式 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2)進行還原氨化反應，從而使導入SPG的醛基部位與精胺的氨基部位相連接。使用還原氨化反應連接精胺的氨基部位與被導入SPG中的醛基部位。參 考文獻Matsumoto Takahiro et al.，Biochim Biophys Acta, 1670(2), (2004)，91—104 ； NAGASAKI Takeshi et al.，Bioconjugate chemistry 2004，vol. 15，pp.249—259。以下用“SPG5”表示上述得到的精胺修飾SPG。PEG的連接使用上述得到的白色固體與導入了氨基的PEG(甲氧基聚乙二醇胺(平均分子 量 5000)，Sigma Corporation,結(jié)構(gòu)式=H2NCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3)進行還原氨化反應，由 此將被導入SPG中的醛基部位與PEG的氨基部位相連接。參考文獻Ryouji Karinaga, Biomaterials. 2005 Aug ；26 (23) :4866_73·以下用“SPG6”表示上述得到的PEG修飾SPG。2.在有^禪的5’末端含有聚dA mmrn RNA的合成合成在27個堿基長度的RNA鏈的5’末端含有40個堿基長度的DNA鏈(聚腺嘌 呤；polyA40)的67個堿基長度的DNA-RNA嵌合體多核苷酸，將其作為有義鏈。合成具有與 上述67個堿基長度的DNA-RNA嵌合體多核苷酸中的RNA區(qū)域完全互補序列的27個堿基長 度的反義RNA，通過對兩者進行退火，形成含有40個堿基長度的單鏈多脫氧腺嘌呤區(qū)域的 雙鏈寡核苷酸(DNA連接雙鏈RNA)。另外，分別合成在上述DNA-RNA嵌合體多核苷酸中的DNA區(qū)域與RNA區(qū)域之間插 入下述結(jié)構(gòu)式表示的連接體的DNA-RNA嵌合體多核苷酸(含有連接體)。 對上述DNA-RNA嵌合體多核苷酸(含有連接體)、及具有與上述嵌合體多核苷酸中 的RNA區(qū)域完全互補序列的27個堿基長度的反義RNA進行退火，合成含有40個堿基長度 的單鏈多脫氧腺嘌呤區(qū)域的、DNA與雙鏈RNA以連接體連接的DNA-RNA嵌合體雙鏈寡核苷酸。另外，合成不合DNA區(qū)域的27個堿基長度的雙鏈RNA作為對照。另外，還使用通 常被廣泛使用的21個堿基長度的siRNA作為對照。此處使用的多核苷酸是含有與海腎熒 光素酶基因具有相同序列的反義RNA，是為了在細胞中進行RNA干擾反應而設計的雙鏈多 核苷酸。另外，上述合成中通過使用UV光譜檢測儀測定260nm的吸光度算出單鏈RNA的濃 度。另外雙鏈RNA的退火如下進行，即在通用緩沖液(林化成株式會社)中混合等摩爾量 的有義鏈及反義鏈寡核苷酸，在92°C下加熱2分鐘后，緩慢降低溫度至4°C。使用的RNA及DNA-RNA嵌合體寡核苷酸的序列如下所示。有義鏈21s :5，-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3，(序列號 3)27s :5，-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3，(序列號 4)pA40-27Rl :5，-(a) 40-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3，(序列號 5)pA40-27R2 5，- (a) 40-X-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3，(序列號 6)
反義鏈21as :3，-GACCGGAAA⑶GAUGAGGAUG-5，(序列號 7)27as :3，-GACCGGAAA⑶GAUGAGGAUGCUCGUG-5，(序列號 8)上述有義鏈序列中，“ (a)40"表示40個堿基長度的聚腺嘌呤。另外，有義鏈 PA40-27R2中X表示上述連接體X。3.各種SPG/雙鏈RNA復合物的形成為了使未修飾及修飾SPG與含有聚dA的雙鏈RNA形成復合物，在含有聚dA的雙 鏈RNA溶液(雙鏈RNA的濃度為10 μ M ；緩沖液通用緩沖液(林化成株式會社)中含有 1% DMS0)中混合各種SPG，在4°C下培育3天。各種SPG以溶解在DMSO(二甲基亞砜)的 狀態(tài)進行使用，以相對于含有聚dA的1摩爾雙鏈RNA，各種SPG為2摩爾的比例進行混合。 需要說明的是，設定雙鏈RNA溶液中的DMSO的最終濃度為1容量％。在預實驗中確認了 1 容量％ DMSO水溶液對細胞及RNA干擾效應不產(chǎn)生影響。制備的各種SPG/雙鏈RNA復合物的結(jié)構(gòu)示于圖1。使用20%聚丙烯酰胺凝膠 確認是否合成了上述SPG/雙鏈RNA復合物。具體而言，將10 μ 1(2 μ M)雜交溶液加入 20%聚丙烯酰胺凝膠中，在250V下對樣品進行70分鐘電泳。之后，用銀染色試劑盒(GE Health Care Bioscience)對產(chǎn)物進行染色(染色條件參見產(chǎn)品手冊)，用ChemiImager 4000 (AlphaInnotech公司)進行凝膠分析。結(jié)果示于圖2。結(jié)果表明含有聚dA的雙鏈RNA 在遷移距離小于27個堿基長度的雙鏈RNA的位置出現(xiàn)條帶，因此確認形成了目標產(chǎn)物即含 有聚dA的雙鏈RNA。另外，各種SPG/雙鏈RNA復合物殘留于聚丙烯酰胺的孔中，從而確認 了 SPG與含有聚dA的雙鏈RNA形成了復合物。另外，對SPG/雙鏈RNA復合物進行CD光譜解析，結(jié)果示于圖3。圖3中的左圖表 示DNA-RNA嵌合體雙鏈寡核苷酸的CD光譜。由于雙鏈中添加有SPG的SPG/雙鏈RNA復合 物與雙鏈的光譜相比變化較大，所以可以判斷雙鏈與SPG形成了復合物(在5°C下進行)。 圖3中的右圖為使用CD光譜測定所形成復合物的解離溫度的結(jié)果。通過研究隨溫度變化 在281. 6nm的⑶值的變化，可以了解雙鏈的熱力學行為。雙鏈由于在70°C附近⑶強度下 降，因此可知雙鏈在約70°C下解離。另一方面，SPG/雙鏈RNA復合物除了上述雙鏈解離的 區(qū)域外，還可以觀察到在47°C附近CD強度急劇下降。這是由于雙鏈從復合物解離而產(chǎn)生 的，由上述結(jié)果可知復合物的解離溫度為約47°C。4.利用切酶對各種SPG/雙鏈RNA復合物的加工研究利用切酶對27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA及各種SPG/雙 鏈RNA復合物進行加工。利用切酶的切割實驗如下所述在樣品管中準備下述溶液，在20mM Tris-HCl (pH為 8. 0)、15mM NaCl 及 2. 5mM MgC12 的溶液中含有 0. 5U重組切酶(GeneTherapy Systems公司制)和10 μ 1最終濃度調(diào)節(jié)至2 μ M的27個堿基長度的雙鏈RNA，或含有聚 dA的雙鏈RNA，或各種SPG/雙鏈RNA復合物，然后在設定為37°C的培養(yǎng)箱中溫育樣品12 小時。之后為了終止利用切酶的切割反應，向反應溶液中加入2μ 1切酶終止溶液(Gene Therapy Systems公司制)，再加入2 μ 1加樣染料。將得到的樣品產(chǎn)物在250V下使用20% 聚丙烯酰胺凝膠進行電泳70分鐘。之后，用銀染色試劑盒(GE Health Care Bioscience公 司制)對產(chǎn)物進行染色(染色條件參見產(chǎn)品手冊)，用ChemiImager 4000 (Alpha Innotech 公司制)進行凝膠分析。另外，使用由未經(jīng)切酶加工的21個堿基長度雙鏈RNA構(gòu)成的
16siRNA(21siRNA)作為對照。結(jié)果示于圖4。結(jié)果表明作為27個堿基長度的雙鏈RNA的27s/27as及在有義鏈 的5’末端具有40個堿基長度單鏈多脫氧腺嘌呤區(qū)域的pA40-27Rl/27as在重組切酶存在 下，在與21個堿基長度的siRNA的相同的位置觀察到條帶，強有力地表明通過切酶的切割 生成了具有2個堿基懸端的21個堿基長度的siRNA。另外，也強有力地表明在由SPG(1 6)和pA40-27Rl/27as形成的復合物中，通過重組切酶加工也生成了具有2個堿基懸端的 21個堿基長度的siRNA。上述結(jié)果表明，即使在存在長鏈單鏈多脫氧腺嘌呤或SPG的狀態(tài)下，27個堿基 長度的雙鏈RNA(SPG/雙鏈RNA復合物)也可以通過重組切酶被加工成21個堿基長度的 siRNA。5.各種SPG/雙鏈RNA復合物的降解酶抗件關于(5-l)SPG/雙鏈RNA(27個堿基長度)復合物的降解酶抗性。研究27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA及各種SPG/雙鏈RNA復合物 (以下有時也記作試驗樣品)的核酸酶抗性。實驗如下進行在37°C下在含有10%FBS(三 光純藥株式會社)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中(最終體積為110 yl) 溫育試驗樣品，所述試驗樣品的最終濃度被調(diào)節(jié)為2 y M。在0小時、0. 5小時、1小時、2小 時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時、48小時后分別取10 u 1，將其加入含有加 樣染料的樣品管中。為了終止降解反應，樣品采集后迅速在液氮中凍干，并且在-20°C下保 存。在250V下使用20%聚丙烯酰胺凝膠對所得產(chǎn)物進行電泳70分鐘。之后，用銀染色試 劑盒(GEHealth Care Bioscience公司制)對產(chǎn)物進行染色(染色條件參見產(chǎn)品手冊)， 用Chemilmager 4000 (Alpha Innotech公司制)進行凝膠分析。另外，作為對照也使用相 同的方法研究通常在siRNA法中使用的在3’末端具有2個堿基懸端的21個堿基長度的 21siRNA的降解酶抗性。結(jié)果示于圖5。結(jié)果表明具有2個堿基懸端的21個堿基長度的雙鏈RNA(21siRNA)在含有10% FBS的培養(yǎng)基中迅速降解，而27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA及各種SPG/ 雙鏈RNA復合物具有非常高的降解酶抗性。另外，合有聚dA的雙鏈RNA與27個堿基長度 的雙鏈RNA相比顯示出高降解酶抗性，并且各種SPG/雙鏈RNA復合物與含有聚dA的雙鏈 RNA相比顯示出高降解酶抗性。特別是表明SPG/雙鏈RNA復合物在48小時后幾乎未被核 酸酶降解。上述結(jié)果表明含有聚dA的雙鏈RNA及各種SPG/雙鏈RNA復合物在含有血清的 培養(yǎng)基中具有極高的穩(wěn)定性。關于(5_2)SPG/雙鏈RNA(21個堿基長度)復合物的降解酶抗性。研究21個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA、含有聚dT的雙鏈RNA及各 種SPG/雙鏈RNA復合物(dA，dT ；以下有時也記作試驗樣品)的核酸酶抗性。 使用的RNA及DNA-RNA嵌合體寡核苷酸的序列如下所示。有義鏈21s :5，-GGUG⑶GACGAUCUGGGCUUU-3，(序列號 9)pA40-21 :5，-(a)40-GGUG⑶GACGAUCUGGGCUUU-3，(序列號 10)pT40-21 :5，-(t)40-GGUG⑶GACGAUCUGGGCUUU-3，(序列號 11)反義鏈
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21as :3，-UUUCGGGUCUAGCA⑶GGUGG-5，(序列號 12)上述有義鏈的序列中，“(a)40”表示40個堿基長度的聚dA，“(t)40”表示40個堿 基長度的dT。實驗如下進行在37 °C下在含有10 % FBS (MP Biomedicals, inc.制)的 RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma Corporation公司制)中(最終體積為100 u 1)溫育試驗樣品， 所述試驗樣品的最終濃度被調(diào)節(jié)為40nM。在0小時、0. 25小時、3小時、6小時、12小時、24 小時、48小時后回收樣品，為了終止降解反應在-80°C下凍干。通過苯酚提取、氯仿處理、醇 沉等對得到的試驗樣品進行精制，在250V下使用20%聚丙烯酰胺凝膠對試驗樣品電泳60 分鐘。之后，使用 SYBER Gold(Invitrogen 公司制)進行染色，用 Lumino image analyzer LAS3000 (FUJIFILM公司制)進行凝膠分析。結(jié)果示于圖6。結(jié)果表明含有1個堿基懸端的21個堿基長度的雙鏈RNAfcakedsiLamin 21bp)、沒 有形成復合物的雙鏈RNA (naked siLamind A40)及含有聚dT的SPG/雙鏈RNA復合物(SPG complex siLamin dT40)在含有10% FBS的培養(yǎng)基中迅速降解，而含有聚dA的SPG/雙鏈 RNA復合物(SPG complex siLamin dA40)具有較高的降解酶抗性。6.聚dA-雙鏈RNA/SPG復合物的細胞毒件(6-1)聚dA-雙鏈RNA(27個堿基長度)/SPG復合物對HeLa細胞的細胞毒性評價27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA及各種SPG/雙鏈RNA復 合物(以下有時也記作試驗樣品)對HeLa細胞的細胞毒性。將實驗前調(diào)節(jié)至1X105細 胞/ml的HeLa細胞(人子宮頸癌細胞；東北大學老年醫(yī)學研究所)接種在96孔板上，每 孔為100 yl，在37°C下培養(yǎng)一夜。次日，除去孔中的舊培養(yǎng)基，加入不含抗生素的新培養(yǎng) 基，每孔為_1。為了評價細胞內(nèi)的毒性，通過使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司制)將2種試驗樣品有效地導入細胞中來評價各種試驗樣品的細胞毒性。將試驗 樣品與LipOfectamineTM2000 (Invitrogen公司制)混合進行復合，使試驗樣品的最終濃 度為 0nM、0. 2nM、0. 5nM、lnM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM，將 10 ii 1 上述溶液加入上述含 有90iU培養(yǎng)基的HeLa細胞中，使每個孔的最終體積為100 yl。需要說明的是，試驗樣 品與LipOfectamineTM2000的復合如下制備將每孔的試驗樣品水溶液與每孔5 yl 的LipOfectamineTM2000(0. 2iil)0ptiMem溶液混合，將上述混合溶液在室溫下溫育30 分鐘。導入試驗樣品的HeLa細胞在5% C02存在下，在37 °C下培養(yǎng)48小時。之后，將 CellTiter-Glo發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒(Promega公司制)中的CellTiter-Glo試劑加 入各孔中，每孔中加入50 iil，攪拌約60分鐘后，使用發(fā)光計(MicroLumat LB96p :BERTH0LD 公司制)測定各孔中的發(fā)光量。由于測定的發(fā)光量依賴于活細胞中的ATP，因此計算對照細 胞的發(fā)光量(1 離為0碰，1^ (^6(^311111161112000為0111時。將其視為存活率100%。)和導入 了各種試驗樣品的細胞的發(fā)光量的相對值，由此可以算出各孔中的存活率(參見Promega 公司CellTiter-Glo發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒手冊。)。圖7表示在此次使用的試驗樣品的最大濃度lOnM時的細胞存活率的結(jié)果。結(jié)果 表明，全部SPG/雙鏈RNA復合物的細胞毒性均在被充分允許的范圍內(nèi)。(6-2)聚dA-雙鏈RNA(21個堿基長度)/SPG復合物對RAW264. 7細胞的細胞毒性以作為核膜構(gòu)成成分的LaminA/C作為靶標評價21個堿基長度的雙鏈RNA、含有 聚dA的雙鏈RNA的復合物(以下有時也記作試驗樣品)的RNA干擾效應。使用的RNA及DNA-RNA嵌合體寡核苷酸的序列如上述(5-2)欄中所示。將實驗前調(diào)節(jié)至5 X 104細胞/ml的RAW264. 7細胞(來自鼠巨噬細胞樣細胞)接 種在96孔板上，每孔為100 ill，在37 °C下培養(yǎng)一夜。次日，除去孔中的舊培養(yǎng)基，加入90 ill 新培養(yǎng)基，將調(diào)節(jié)了濃度的含有聚dA的雙鏈RNA/SPG復合物溶液各10 yl分別加入含有 RAW264. 7細胞的孔中。將含有聚dA的雙鏈RNA/SPG復合物的最終濃度調(diào)節(jié)至600nM(siRNA 濃度)。導入試驗樣品后，在37°C下培養(yǎng)24小時，在-80°C下冷凍干燥，使用RNeasy小型 試劑盒(QIAGEN公司制)提取總RNA，使用PrimerScript RT試劑盒(TAKARA BI0公司制) 制備cDNA，使用SYBR prmix Ex Taq (TAKARA BIO公司制)測定實時PCR反應，使用Smart Cycler II (Cepheid公司制；TAKARA BIO公司銷售)測定LaminA/C的mRNA量，通過使用 通常用作管家基因的GAPDH對LaminA/C的mRNA表達水平進行補正，從而測定LaminA/C的 mRNA表達水平。結(jié)果示于圖8。評價naked si RNA dA40 (LaminA/C)、SPG only、以及 SPG 和 naked si RNA dA40 (LaminA/C)在加入細胞之前剛剛混合的混合物的RNA干擾效應，將結(jié)果作為比較 對象。結(jié)果表明，naked si RNA dA40 (LaminA/C)、SPGonly、以及 SPG 和 naked si RNA dA40 (LaminA/C)在加入細胞之前剛剛混合的混合物不具有RNA干擾效應，僅在含有聚dA的 雙鏈RNA的SPG復合物中確認到RNA干擾效應。上述結(jié)果表明單獨使用的SPG對RAW264. 7 細胞不具有LaminA/C的mRNA抑制效果，并且naked狀態(tài)的siRNA也同樣不具有抑制效果。7.聚dA-雙鏈RNA/SPG復合物的RNA干擾效應以海腎熒光素酶為靶標評價27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈RNA 及各種SPG/雙鏈RNA復合物(以下有時也記作試驗樣品)的RNA干擾效應。將實驗前 調(diào)節(jié)至1X105細胞/ml的HeLa細胞(人子宮頸癌細胞；東北大學老年醫(yī)學研究所)接 種在96孔板上，每孔為lOOiU，在37°C下培養(yǎng)一夜。次日，除去孔中的舊培養(yǎng)基，加入 不含抗生素的新培養(yǎng)基，每孔為80 u 1，將表達螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的載體 (psiCHECK -2 Vector :Promega 公司制)與 Lipof ectamine 2000 (商品名；Invitrogen 公司制)的復合溶液加入各加入了含有HeLa細胞的孔中，每孔加入10iU。設定表 達載體使每個孔為0. 02 ii g，另外設定Lipofectamine 2000使每個孔為0. 2 yl，使用 OptiMemanvitrogen公司制)將其調(diào)節(jié)為所需量。為了形成復合物，使用OptiMem將表達載 體與LipOfectamineTM2000混合，然后在室溫下培養(yǎng)30分鐘。加入上述復合溶液后，在5% 0)2存在下，于37°C培養(yǎng)細胞4小時。之后，將試驗樣品與Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司制)形成復合物來制備復合溶液，使試驗樣品的最終濃度為0. 2nM或0. 5nM,將10 yl 上述溶液加入導入了表達載體的HeLa細胞中。此時，每個孔的最終體積為100 yl。需要 說明的是，試驗樣品和LipOfectamineTM2000的復合溶液如下制備將每孔的試驗樣 品水溶液與每孔5 ill的Lipof ectamineTM2000 (0. 2 u 1) OptiMem溶液混合，將上述混合溶液 在室溫下溫育30分鐘。導入試驗樣品后，溫育48小時，使用Dual-Glo 熒光素酶分析系統(tǒng) (Promega公司制)和發(fā)光計(MicroLumat LB96p ；Berthold公司制)測定螢火蟲熒光素酶 及海腎熒光素酶的表達水平。并以螢火蟲熒光素酶的表達水平為對照計算海腎熒光素酶的 表達水平(％)。圖9表示RNA干擾效應的結(jié)果。圖9表示樣品各種SPG/雙鏈RNA復合物的添加 濃度為0. 5nM時的RNA干擾效應。另外，作為對比也表示出了 siRNA法中使用的在3’末端具有2個堿基懸端的21個堿基長度的siRNA、27個堿基長度的雙鏈RNA、含有聚dA的雙鏈 RNA的RNA干擾效應的結(jié)果。結(jié)果顯示SPG/雙鏈RNA復合物與27個堿基長度的雙鏈RNA 相比RNA干擾效應降低。考慮其理由為，通過加入SPG1，寡核苷酸與轉(zhuǎn)染試劑的相互作用減 弱，因此SPG/雙鏈RNA復合物的細胞導入性比27nt dsRNA差，結(jié)果導致基因表達抑制能也 比27nt dsRNA弱。另一方面，使用以功能性分子修飾SPG所得的修飾型SPG (SPG2 SPG6) 制備的各種SPG/雙鏈RNA復合物顯示出與27個堿基長度的雙鏈RNA的基因表達抑制能具 有相同程度的RNA干擾效應，可知比使用SPG1制備的SPG/雙鏈RNA復合物的基因表達抑 制能高。認為上述結(jié)果表明導入到SPG的功能性分子提高了細胞導入性。綜合上述結(jié)果表明各種SPG/雙鏈RNA復合物具有非常優(yōu)異的降解酶抗性且?guī)缀?無毒性，因此與普通的siRNA相比具有較高的持續(xù)性及安全性。進一步表明通過使用各種 功能性分子修飾SPG，可以構(gòu)建出SPG/雙鏈RNA復合物，所述SPG/雙鏈RNA復合物即使不 使用細胞毒性強的基因?qū)雱?，單獨即可到達細胞內(nèi)。參考試驗例1為了證明專利文獻4 (櫻井和朗等、Polym. Preprints. Jpn.，第49卷、第4054頁、 2000年)公開的技術即使適用于具有RNA干擾效應的雙鏈RNA但是導入率較低而進行了如 下實驗。EGFP(增強型綠色熒光蛋白)為238個氨基酸的熒光性蛋白質(zhì)。使用pEGFP載體 將通過基因操作生成的EGFP基因?qū)牖铙w細胞時，其不定位于細胞內(nèi)而是分布于全部細 胞中，通過激發(fā)光照射形成發(fā)色團，而具有發(fā)出熒光的性質(zhì)(圖11)。使用限制酶Sph I切割上述pEGFP載體，將接合體0DN (脫氧核苷酸)和 poly (dA) 80mer連接，所述pEGFP載體的3’末端可以與接合體0DN雜交。將產(chǎn)物與SPG復 合(圖10)。將各種長度(例如800 2500bp)的兩端復合的DNA加入強迫表達Dectin-1的 RAW細胞中，使用作為熒光物的Alexa對DNA側(cè)鏈進行化學修飾(圖12)。通過計數(shù)檢測出 Alexa的細胞數(shù)，研究導入細胞的導入率與DNA長度的關系。結(jié)果示于圖13。圖13中將使 用圖10方法制備的CMV-EGFP的細胞導入率記作1。圖13表明雙鏈DNA的長度越長導入效率越降低。即，表明本法作為將較長的pDNA 導入細胞的傳遞技術實用性較低。


[圖1]為表示合成的各種SPG/RNA復合物結(jié)構(gòu)的圖。[圖2]為表示確認各種SPG/RNA復合物是否形成的結(jié)果的圖。[圖3]左圖為表示使用CD光譜解析確認SPG/RNA復合物是否形成的結(jié)果的圖，并 且右圖為表示使用CD光譜解析確認SPG/RNA復合物解離溫度的結(jié)果的圖。[圖4]為表示研究各種SPG/RNA復合物通過切酶加工結(jié)果的圖。[圖5]為表示評價各種SPG/RNA(27個堿基長度)復合物核酸酶抗性結(jié)果的圖。[圖6]為表示評價各種SPG/RNA(21個堿基長度)復合物核酸酶抗性結(jié)果的圖。[圖7]為表示評價各種SPG/RNA(27個堿基長度)復合物細胞毒性結(jié)果的圖。[圖8]為表示評價各種SPG/RNA(21個堿基長度)復合物細胞毒性結(jié)果的圖。
[圖9]為表示評價各種SPG/RNA復合物RNA干擾效應結(jié)果的圖。[圖10]為表示CMV-EGFP制備方法的簡圖。[圖11]為使用pEGFP載體將EGFP基因?qū)牖铙w細胞內(nèi)時的細胞顯微鏡照片。[圖12]為表示被參考試驗例1中使用的熒光物質(zhì)Alexa化學修飾的兩端復合DNA 的制備方法的簡圖。[圖13]為表示參考試驗例1結(jié)果的圖。序列表自由文本序列號1表示R8的序列。序列號2表示tat的序列。序列號3表示21S的序列。序列號4表示27s的序列。序列號5表示pA40-27Rl RNA區(qū)域的序列。序列號6表示pA40-27R2 RNA區(qū)域的序列。序列號7表示2las的序列。序列號8表示27as的序列。序列號9表示21s的序列序列號10表示pA40-21的序列。序列號11表示pT40-21的序列。序列號12表示21as的序列。
2權利要求
一種多糖/雙鏈RNA復合物，為具有β 1，3 葡聚糖骨架的多糖與雙鏈RNA的復合物，其特征在于，所述雙鏈RNA具有有義鏈RNA和反義鏈RNA，所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA含有與所述有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，所述雙鏈RNA中，所述有義鏈RNA及反義鏈RNA中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接，所述多糖與所述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。
2.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述有義鏈RNA由15 50個核 苷酸構(gòu)成，并且所述反義鏈RNA由與所述有義鏈RNA數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。
3.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述有義鏈RNA由21個核苷酸 構(gòu)成，并且所述反義鏈RNA由與所述有義鏈RNA數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。
4.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述有義鏈RNA由27個核苷酸 構(gòu)成，并且所述反義鏈RNA由與所述有義鏈RNA數(shù)量相同的核苷酸構(gòu)成。
5.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述單鏈多脫氧腺嘌呤由20 100個脫氧腺嘌呤構(gòu)成。
6.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述單鏈多脫氧腺嘌呤直接或者 通過連接體與所述有義鏈RNA或者反義鏈RNA的5’末端及/或3’末端相連接。
7.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述多糖類為選自裂裥菌素、凝 膠多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及小核菌葡聚糖中的至少一種。
8.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述多糖類為連接有功能性分子 的β-1，3-葡聚糖。
9.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述雙鏈RNA的靶基因是細胞的 內(nèi)源基因，所述細胞具有與所述多糖結(jié)合的受體。
10.如權利要求1所述的多糖/雙鏈RNA復合物，其中，所述細胞為在所述細胞膜表面 表達Dectin-I的細胞。
11.一種多糖/雙鏈RNA復合物的制造方法，所述方法為權利要求1所述的多糖/雙 鏈RNA復合物的制造方法，所述雙鏈RNA具有有義鏈RNA和反義鏈RNA，所述有義鏈RNA由 有與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA含有與所述有義鏈RNA互補 的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，其特征在于，包括下述工序通過以相對于1摩爾多核苷酸連接雙鏈RNA，具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖為1 6摩爾的比例進行混合，使所述單鏈多脫氧腺嘌呤和所述多糖復合的工序，所述多核苷酸連 接雙鏈RNA在所述有義鏈及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧 腺嘌呤連接。
12.—種具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖/雙鏈RNA復合物在體外或離體用于抑制靶 基因表達的應用，所述多糖/雙鏈RNA復合物含有雙鏈RNA，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義鏈RNA， 所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA含有與所述 有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，在所述雙鏈RNA中在所述有義鏈RNA及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接， 所述多糖與所述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。
13. —種抑制細胞內(nèi)靶基因表達的方法，所述方法包括將具有β-1，3-葡聚糖骨架的 多糖/雙鏈RNA復合物導入細胞內(nèi)的工序，所述多糖/雙鏈RNA復合物含有雙鏈RNA，所述雙鏈RNA含有有義鏈RNA和反義鏈RNA， 所述有義鏈RNA由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈RNA具有與所述 有義鏈RNA互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制所述靶基因表達，在所述雙鏈RNA中，在 所述有義鏈RNA及反義鏈的中至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤相 連接，所述多糖與所述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種具有RNA干擾效應的新型雙鏈RNA，所述新型雙鏈RNA不減弱RNA干擾效應，并且細胞導入性及降解酶抗性提高。具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖與雙鏈RNA的復合物通過滿足下述(i)～(iii)，可以有效保持RNA干擾效應，同時顯著地提高細胞導入性及降解酶抗性。(i)所述雙鏈RNA具有有義鏈和反義鏈，所述有義鏈由與靶基因中的靶序列互補的堿基序列組成，所述反義鏈含有與所述有義鏈互補的堿基序列，所述雙鏈RNA能抑制上述靶基因表達；(ii)所述雙鏈RNA中，所述有義鏈及反義鏈中的至少一方的末端直接或通過連接體與單鏈多脫氧腺嘌呤連接；(iii)所述多糖與所述單鏈多脫氧腺嘌呤形成復合物。
文檔編號C12N15/09GK101918554SQ20088012472
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2007年12月18日
發(fā)明者三成壽作, 久保貴紀, 大庭英樹, 宇野篤, 櫻井和朗 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所;納帕杰公司