專利名稱：阿魏側(cè)耳多糖及其組合物的醫(yī)藥用途和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從阿魏側(cè)耳(Pleurotus ferulae Lanzi)中制備的具有醫(yī) 藥用途的阿魏側(cè)耳多糖和含有阿魏側(cè)耳多糖的藥物組合物，以及它們的制備、醫(yī)藥用途和 分析方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，新疆是我國宮頸癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率和死 亡率都很高，并有逐年上升及年輕化的趨勢。宮頸癌治療手段由傳統(tǒng)的局部治療手術(shù)、放 療，發(fā)展到全身治療——化療。然而多種治療方法均能減弱抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，在宮頸 癌的治療過程中，提高機(jī)體免疫功能在消滅腫瘤細(xì)胞的過程中起著重要的作用。目前已有大量臨床研究證實(shí)中草藥可改善腫瘤患者生存質(zhì)量，抑制腫瘤，減輕癥 狀，甚至使患者帶瘤延年。作為一種珍稀的藥食兩用資源，阿魏側(cè)耳的抗腫瘤方面的研究 已有一些報道。本實(shí)驗(yàn)選用了文獻(xiàn)中阿魏側(cè)耳多糖的最適劑量500mg/kg，結(jié)果表明，阿魏 側(cè)耳多糖對小鼠宮頸癌U14移植瘤有一定的抑制效果，抑瘤率達(dá)到39%，臨床常用的宮頸 癌化療一線藥順鉬對其的抑瘤率為46. 5%，阿魏側(cè)耳多糖與順鉬共同作用時，抑瘤率達(dá)到 65. 1%，說明阿魏側(cè)耳多糖可以提高順鉬的抗癌療效。同時此多糖對小鼠肝癌H22移植 瘤也有一定的抑制效果，抑瘤率達(dá)到54%。按照腫瘤研究規(guī)程規(guī)定，中草藥的抑瘤率大于 30%時，認(rèn)為對腫瘤有一定療效，阿魏側(cè)耳多糖已超過這一標(biāo)準(zhǔn)，因此有很好的開發(fā)前景。阿魏側(cè)耳的抗癌機(jī)制可能是通過其免疫激活作用實(shí)現(xiàn)的。它可激活機(jī)體免疫系統(tǒng) 的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗腫瘤作用，尤其是細(xì)胞免疫的激活及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子具 有重要的作用。巨噬細(xì)胞是參與殺傷腫瘤的一種十分活躍的免疫效應(yīng)細(xì)胞，ΜΦ主要通過內(nèi)吞和 分泌一些效應(yīng)分子殺傷腫瘤細(xì)胞，同時活化的ΜΦ能在攝入腫瘤后出現(xiàn)“呼吸爆發(fā)”迅速產(chǎn) 生一系列02_、Η202、0Η_等活性氧自由基和活性氮，這些活性基團(tuán)在機(jī)體免疫治療中介導(dǎo)細(xì)胞 免疫和細(xì)胞毒反應(yīng)，參與殺傷腫瘤細(xì)胞；NK細(xì)胞是一類對多種靶細(xì)胞有自發(fā)性細(xì)胞毒活性 的效應(yīng)細(xì)胞，NK細(xì)胞不經(jīng)致敏可直接殺傷敏感的腫瘤細(xì)胞，如Κ562，YAC-I等，在抗新生瘤、 已形成瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移方面也有重要作用。T細(xì)胞在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均有重要作用。其作為免疫效應(yīng)細(xì)胞， 主要有兩方面功能即作為TDHT介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和作為Tc細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞。B細(xì) 胞通過分泌的抗體行使其免疫功能。另外，活化的B細(xì)胞還具有加工和提呈抗原給T細(xì)胞 的作用。B細(xì)胞分泌的抗體可執(zhí)行多種免疫功能。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可以了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。本實(shí)驗(yàn)通過對上述免疫細(xì)胞功 能測定，發(fā)現(xiàn)阿魏側(cè)耳多糖可顯著促進(jìn)荷瘤小鼠ΡΜΦ的吞噬功能，增強(qiáng)脾中NK細(xì)胞殺傷 靶細(xì)胞Κ562的作用，提高Τ、B淋巴細(xì)胞的活性，表明其可通過促進(jìn)荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫功 能抑制移植性腫瘤U14的生長。T細(xì)胞亞群的檢測是觀察機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要方法之 一，⑶47⑶8+比值可直接反映宿主T淋巴細(xì)胞亞群的狀態(tài)，且在一定程度上可間接了解機(jī) 體細(xì)胞免疫功能情況。因而測定CD4+和CD8+細(xì)胞百分比，或是兩種細(xì)胞的比值，成了一種十分便捷的初步評估機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)，只有當(dāng)兩者比例適當(dāng)，才能發(fā)揮正常的抗腫瘤作用。Thl型細(xì)胞因子(TNF- α，IFN- γ )具有激活機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力， 其中TNF-α是一種有效的腫瘤細(xì)胞殺傷因子，也是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié) 因子。TNF-α可與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合形成復(fù)合物，觸發(fā)溶酶體的釋放，引起腫瘤細(xì) 胞溶解；在體內(nèi)，TNF-α對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的毒性作用，可增加內(nèi)皮細(xì)胞與中性 粒細(xì)胞的黏附，誘發(fā)機(jī)體凝血機(jī)制，經(jīng)一系列連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生血栓并阻塞血管，腫瘤組織因 缺氧而發(fā)生壞死。IFN-Y由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，可增強(qiáng)宿主T細(xì)胞受體依賴和HLA限制性 T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，具有增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子表達(dá)，抗腫瘤血管生成等多種 抗腫瘤作用。IFN-Y還可以通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的Fas/FasL表達(dá)以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對Fas 所介導(dǎo)凋亡途徑的敏感性，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊的能力降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞 的惡性增殖。因此TNF-α，IFN-γ在機(jī)體抗腫瘤免疫中具有重要的地位和作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿魏側(cè)耳多糖可明顯促進(jìn)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功 能、脾中NK細(xì)胞的免疫活性，增加脾指數(shù)，提高脾臟Τ、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，促使CD3/CD8比 值恢復(fù)正常，提高細(xì)胞因子TNF-α、IFN-Y水平，并且與順鉬聯(lián)用時可改善順鉬對荷瘤鼠 免疫功能抑制的影響。結(jié)果表明阿魏側(cè)耳多糖可通過促進(jìn)小鼠機(jī)體免疫功能抑制小鼠宮 頸癌U14移植瘤的增殖。同時，因?yàn)榘⑽簜?cè)耳多糖能夠促進(jìn)機(jī)體免疫功能，因此有望在抑制腫瘤細(xì)胞生 長、增強(qiáng)人體免疫力、抗凝血、保護(hù)胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦 血管供血不足、去膩醒酒、護(hù)膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改 善血液粘稠度和微循環(huán)、擴(kuò)張血管、清除自由基、抗腫瘤、抗癌藥物、功能食品和食品中得到 廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種從阿魏側(cè)耳(Pleurotus ferulae Lanzi)中制備的 具有醫(yī)藥用途的阿魏側(cè)耳多糖，該多糖不含有蛋白質(zhì)，并且其HPLC-ELSD色譜具有如圖1所 示的特征圖譜。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，以本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖為活性成分，可以根據(jù)需要制備成 任何可服用的藥物劑型如含片，片劑，膠囊，顆粒，口服液，注射劑，代泡茶，飲料等。在使用 時根據(jù)病人的情況，確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋或?；蚱?，每劑 lmg-1000mg。在制備成藥物制劑時，根據(jù)需要，可以加入藥物或食用載體。本發(fā)明還包括本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖的制備方法，該方法包括提取，除蛋白，純化。 除蛋白采用以下方法，(1)溶劑萃取法；(2)離子交換樹脂法；(3)酶法；(4)凝膠色譜法。純 化采用以下方法，⑴溶劑萃取法；⑵乙醇沉淀法；⑶液_液逆流分配色譜法；⑷凝膠 色譜法。優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法，其中提取步驟如下阿魏側(cè)耳粉碎，加水提取，離心或者過濾除去殘渣，回收水提取液，得阿魏側(cè)耳濃 縮液。其特征為1)阿魏側(cè)耳為新鮮或者經(jīng)過水充分浸潤；2)水提取可以加熱提取，并且通過粉碎、破碎，可以使提取時間大為縮短，最佳可至10-60分鐘；3)為了提高離心或者過濾 除去殘渣過程中效率，同時兼顧提取效率，破碎粒度控制在10-300目范圍，其中以30-60目 為最佳。優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法，其中除蛋白方法選自(1)溶劑萃取法，其特征為阿魏側(cè)耳濃縮液中先加入正丁醇 (100 1-100 20)，振搖，再加入三氯甲烷(100 1-100 50)，振搖，離心，蛋白質(zhì)變成 不溶狀態(tài)，存留在有機(jī)溶劑與水的界面，1-100次。最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液中先加入正丁 醇((25 1)，振搖20min，再加入三氯甲烷(25 4)，振搖20min，離心，4000r/min離心 15min，反復(fù)6-8次。其特征為因?yàn)榘⑽簜?cè)耳濃縮液地特殊性，用常規(guī)的正丁醇-三氯甲烷 混合液一起溶劑萃取的方法，難以達(dá)到除去蛋白質(zhì)的目的，一定要先加入正丁醇振搖，再加 入三氯甲烷振搖。(2)離子交換樹脂法，其特征為a)陰離子交換樹脂200g，蒸餾水浸泡10h，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖 洗至中性，Imol/LNaOH沖10個柱體積，蒸餾水沖洗至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5_500ml (相當(dāng) 于原料5-500mg)用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8_14，上樣，蒸餾水洗脫，濃縮得到多糖提取物；繼用 0. Imol/LNaOH洗脫，除去柱上的蛋白質(zhì)。其中用NaOH調(diào)節(jié)pH值最優(yōu)為8_11，上樣量為阿 魏側(cè)耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)。b)陽離子交換樹脂1000g，蒸餾水浸泡10h，Imol/LNaOH沖柱10個柱體積，蒸餾 水沖洗至中性，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml (相 當(dāng)于原料5-500mg)用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1-6，上樣，蒸餾水沖柱，濃縮得到多糖提取物；繼用 lmol/L鹽酸洗脫，除去柱上的蛋白質(zhì)。其中用鹽酸調(diào)節(jié)pH值最優(yōu)為3-5，上樣量為阿魏側(cè) 耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)。(3)酶法，其特征為a)阿魏側(cè)耳濃縮液5_500ml (相當(dāng)于原料5_500mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，調(diào) PH1-9，30-80°C水浴，放至室溫，離心，取上清液，即可除去蛋白質(zhì)。最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液 50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，調(diào)PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室 溫，3000r/min離心5min，取上清液，即可除去蛋白質(zhì)。b)阿魏側(cè)耳濃縮液5_500ml (相當(dāng)于原料5_500mg)加入胃蛋白酶0. 05g，調(diào)PH 0-4. 5，30-45°C水浴，放至室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇量50-95%，振蕩后放置， 離心，取沉淀，即可除去蛋白質(zhì)。最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg) 加入胃蛋白酶0. 05g，調(diào)PH1. 5-2. 5，37°C水浴，放至室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇 量85%，振蕩后放置，3000r/min離心5min，取沉淀，即可除去蛋白質(zhì)。(4)凝膠色譜法，其特征為取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱。用滴管將阿魏側(cè)耳濃 縮液5-500ml (相當(dāng)于原料5-500mg)均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫。每個流份經(jīng)UV 200-500nm全波長掃描，檢查蛋白質(zhì)峰。并每個流份用硫酸-苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測 多糖。合并含有多糖，并不含有蛋白質(zhì)的流份，即得。葡聚糖凝膠最優(yōu)為sephadex G-100 和s印hadex G-50,阿魏側(cè)耳濃縮液l_10ml (相當(dāng)于原料1-lOmg)。優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法，其中純化方法選自
(1)溶劑萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī)溶劑，或以上溶劑的混 合溶劑，與水液液萃取除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，水相中即為純化的阿魏側(cè)耳多糖。(2)乙醇沉淀法除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，加入乙醇至乙醇濃度為50-95%，振蕩后放置，離 心，取沉淀，可反復(fù)2-10次，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖。其最優(yōu)工藝為除去蛋白質(zhì)的阿魏 側(cè)耳提取液，加入乙醇至乙醇濃度為85%，振蕩后放置，3000r/min離心5min，沉淀加水溶 解后再加乙醇離心，反復(fù)3次。(3)液_液逆流分配色譜法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī)溶劑，或以上溶劑的混 合溶劑，與水液_液逆流分配色譜法，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液經(jīng)分離，選取阿魏側(cè)耳 多糖流出部分，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖。(4)凝膠色譜法。取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱。用滴管將除去蛋白質(zhì) 的阿魏側(cè)耳提取液5-500ml (相當(dāng)于原料5-500mg)均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫。每 個流份經(jīng)硫酸_苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測多糖。合并含有多糖部分，即得純化的阿魏 側(cè)耳多糖。葡聚糖凝膠最優(yōu)為s印hadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳 提取液I-IOml (相當(dāng)于原料I-IOmg)。特別優(yōu)選的本發(fā)明的制備方法如下取阿魏側(cè)耳，切成小塊，加水用榨汁機(jī)榨汁， 超聲，煮沸，冷卻，離心取上清液，濾紙抽濾，沉淀加水超聲，煮沸，冷卻，離心，取上清，濾紙 抽濾，合并上清液，濃縮，得濃縮液，濃縮液加入木瓜蛋白酶，調(diào)PH5-6，水浴加熱，放至室溫， 離心，取上清液，加乙醇放置，離心，取沉淀，即得。本發(fā)明還包括通過研究發(fā)現(xiàn)桑枝、桑葉、桑椹及其提取物、阿卡波糖等，可以通過 抑制胃腸道代謝酶，抑制阿魏側(cè)耳多糖在胃腸道內(nèi)的降解，從而提供了 口服給藥系統(tǒng)(片 劑等制劑)和口含給藥系統(tǒng)(含片等制劑)。本發(fā)明還包括本發(fā)明的阿魏側(cè)耳多糖及其藥物組合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長、 增強(qiáng)人體免疫力、抗凝血、保護(hù)胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血 管供血不足、去膩醒酒、護(hù)膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善 血液粘稠度和微循環(huán)、擴(kuò)張血管、清除自由基的藥物或功能食品和食品中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括阿魏側(cè)耳多糖的檢測方法，包括分光光度法和色譜法。其中分光光度法的方法如下a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取烘干至恒重的無水葡萄糖0. IOllg溶于IOOml蒸餾水中，配成1. 011mg/ml的 標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 6,0. 8ml置5只試管中，加蒸餾水1. Oml, 加入硫酸_苯酚顯色液，沸水浴30min，放至室溫，在490nm處，測其吸光度A。用同樣處理 的蒸餾水做空白對照。以吸光度為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。b)硫酸-苯酚配制苯酚5g，用少量水溶解，轉(zhuǎn)移至IOOml容量瓶中，定容至刻度， 配成苯酚溶液。c)測定法IOmg樣品溶解在IOml蒸餾水中，加Iml苯酚溶液，5ml硫酸，沸水浴30min，冷卻至室溫，490nm處測A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計算，即得。其中色譜法的方法如下利用TOSOH TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝膠柱，ELSD 檢測器檢測，進(jìn)行 HPLC 分析的多糖含量測定方法。最優(yōu)條件TOSOH TSKgel G4000PWXL(7. 8X 30cm)凝膠柱，ELSD 檢測器檢測，水為流動相，流速lml/min。(色譜圖見圖1)以下為本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖的功效測定實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)表明，本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖提取物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)人體免疫 力、抗凝血、保護(hù)胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血管供血不足、去 膩醒酒、護(hù)膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和 微循環(huán)、擴(kuò)張血管、清除自由基、抗腫瘤、抗癌藥物、功能食品和食品中的應(yīng)用。以下實(shí)驗(yàn)用于說明本發(fā)明提取物比現(xiàn)有類似物更加優(yōu)越。1毒性試驗(yàn)藥品本發(fā)明實(shí)施例2方法制備的阿魏側(cè)耳多糖提取物本發(fā)明的小鼠口服一次給與最大給藥濃度15g/Kg體重，均未見毒副反應(yīng)，血液生 化指標(biāo)均正常，研究結(jié)果本發(fā)明本發(fā)明實(shí)施例2方法制備的阿魏側(cè)耳多糖提取物的小鼠口服一 次給與最大給藥濃度15g/Kg體重，解剖尸體見肝臟紅腫，肝功能異常。性c
因此說明本發(fā)明阿魏側(cè)耳多糖提取物無3 2藥效試驗(yàn)
藥品本發(fā)明實(shí)施例2方法制備的阿魏側(cè)耳多糖提取物 2. 1阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤鼠生長的影響 2. 1. 1阿魏側(cè)耳多糖對U14荷瘤鼠生長的影響
表1結(jié)果顯示，500mg/kg的阿魏側(cè)耳多糖抑瘤率達(dá)到39%，表明其具有很強(qiáng)的抑 制小鼠宮頸癌U14移植瘤生長的作用；臨床抗宮頸癌藥順鉬的抑瘤率為46. 5% ；阿魏側(cè)耳 且與臨床抗宮頸癌藥順鉬共同作用時，抑瘤率達(dá)到65. 1%，說明阿魏側(cè)耳多糖可以提高順 鉬的抗癌療效。 表1阿魏側(cè)耳多糖對U14荷瘤鼠生長的影響
組別
劑量 (mg/kg)
荷瘤小鼠平均體重(g)
開始
結(jié)束
平均瘤重(g)
抑瘤率 (%)
NS
19.43 士 1.13 29.43±2.23
.30±0.09
DDP P.ferulae P.ferulae+DD P
319.75±0.96 25.00士 1.83 0.69土 0.24
500 18.8±0.83 30.60±2.61 0.79±0.11*
500+3
18.8±0.84 25.75士2.06 0,48士 0.12
46.5 39
65.1*p < 0. 05VsNS2. 1. 2阿魏側(cè)耳多糖對H22荷瘤鼠生長的影響從表2可以得出，與模型組相比，阿魏側(cè)耳多糖高、中、低各劑量組對H22肉瘤細(xì)胞 的生長均具有抑制作用，并且隨給藥劑量的增加其抑制作用增強(qiáng)。與模型組瘤重相比，各劑量組的抑瘤率均達(dá)到30%以上。表2阿魏側(cè)耳多糖對H22荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影響
分組劑量瘤重(g)抑瘤率(％)(g/l^g)模荊對照組-1.056土 0.35-1.00.576土 0.24**53.88阿魏側(cè)耳多糖0.50.577土 0.27**45.450.250.714 土 0.30*45.36環(huán)磷酰胺0.020.487±0.20**32.39*Ρ < 0. 05，**P < 0. Olvs 模型對照組2. 2阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠免疫器官的影響2. 2. 1阿魏側(cè)耳多糖對U14荷瘤鼠免疫器官的影響表3結(jié)果表明，500mg/kg的阿魏側(cè)耳多糖可顯著提高U14荷瘤小鼠的脾指數(shù) (Vs NS, _p< 0.001)，順鉬組荷瘤鼠脾指數(shù)與阿魏側(cè)耳組相比明顯降低(Vs DDP，###p <0. 001)，阿魏側(cè)耳與順鉬共同作用時可改善順鉬對小鼠免疫器官抑制的影響。表3阿魏側(cè)耳多糖對U14荷瘤鼠免疫器官的影響
M劑量(mg/kg)脾指數(shù)
NS-7.42 土 1.03
DDP36.62±0.83
P.ferulae50010.02士 2.37***###
P.ferulae+DDP500+37.96±0.82*****p < 0. OlVs NS ；***p < 0. OOlVs NS ；###p < 0. OOlVs DDP2. 2. 2阿魏側(cè)耳多糖對H22荷瘤鼠免疫器官的影響從表4可以得出，阿魏側(cè)耳多糖高、中劑量組可以顯著增加H22荷瘤小鼠的胸腺指 數(shù)和脾指數(shù)，提示阿魏側(cè)耳多糖可提高H22荷瘤小鼠的免疫力。表4阿魏側(cè)耳多糖對H22荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響
^jI胸腺指數(shù)
11(mg/kg)
模剛對照組-0.14土0.030.51±0.041.0000.26 士 0.03*0.72±0.03**阿魏側(cè)耳多糖5000.31 土 0.04**0.70±0.06**2500.21 土 0.020.63 士 0.02環(huán)磷酰胺200.15±0.020.41 ±0.04*P < 0. 05，**P < 0. Olvs 模型對照組2. 3阿魏側(cè)耳多糖對二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，阿魏側(cè)耳多糖中、高劑量組的腫脹度均有顯著 性差異，阿魏側(cè)耳多糖各劑量均可增加小鼠的胸腺指數(shù)；阿魏側(cè)耳多糖中劑量組可以增加 小鼠的脾指數(shù)，提示阿魏側(cè)耳多糖可提高正常小鼠的細(xì)胞免疫功能。結(jié)果見表5。表5阿魏側(cè)耳多糖對DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)免疫功能的影響
組別劑量 (g/kg)腫脹度 (mg)胸腺指數(shù)脾指數(shù)空白對照組5.02 十 0.520.15 十 0.020.81 土 0.09陽性對照組0.0039.73 土 1.23*0.20 土 0.030.85 土 0.141.09.04 十.0.68*0.31 .七 0.29**1.10 十 0.13阿魏側(cè)耳多糖0.59.60 十.1.62*0.35 十.0.05**1.54 十.0.19*0.256.25 土 0.750.31 十 0.03**1.29 土 0.13*P < 0. 05，**P < 0. Olvs 空白對照組(n=i0’ X 土2. 4阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠腹腔M 吞噬功能影響圖2和圖3結(jié)果顯示，500mg/kg的阿魏側(cè)耳多糖可明顯提高荷瘤小鼠PM小的吞噬 功能，吞噬百分率和吞噬指數(shù)均高于NS對照組(_p < 0. OOlvs NS)，而順鉬組荷瘤鼠的吞 噬百分率和吞噬指數(shù)與模型對照組相比均下降，阿魏側(cè)耳與順鉬共同作用時，可顯著提高 受順鉬抑制的荷瘤小鼠PM小的吞噬功能(###p < 0. OOlvs DDP)。2. 5阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠脾中N K細(xì)胞殺傷活性的影響表6顯示，與NS對照組相比，500mg/kg的阿魏側(cè)耳多糖可明顯增強(qiáng)脾中NK細(xì)胞的 殺傷活性，其殺傷率可達(dá)78. 29%廣p<0.001)。而順鉬組荷瘤鼠的NK細(xì)胞的殺傷活性與 與阿魏側(cè)耳組相比顯著下降(AAP < 0. 05)。此劑量的阿魏側(cè)耳多糖與順鉬共同作用時，脾 中NK細(xì)胞殺傷率比單獨(dú)使用順鉬時，作用明顯提高(#p < 0. 05)，說明其可恢復(fù)受順鉬抑制 的脾中NK細(xì)胞的活性。表6阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤鼠脾中NK細(xì)胞殺傷活性的影響
12 **p < 0. Olvs NS ;#p < 0. 05，ΔΔρ < 0. Olvs DDP2. 6阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠脾臟Τ、Β淋巴細(xì)胞的影響表7結(jié)果顯示，經(jīng)阿魏側(cè)耳多糖處理的荷瘤小鼠Τ、Β淋巴細(xì)胞對ConA、LPS的增殖 活性都不同程度的增高ΓΡ < 0. 5)，而DDP不能夠增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞的活性甚至抑制免疫功 能，DDP單獨(dú)作用荷瘤小鼠后，其顯著T、B淋巴細(xì)胞的活性顯著低于阿魏側(cè)耳多糖組(ΔΔΡ < 0. 01)。表7阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤鼠脾臟Τ、B淋巴細(xì)胞的影響 *ρ < 0. 5vs NS ；ΔΔρ < 0. Olvs DDP2. 7阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠鼠細(xì)胞因子水平的影響表8結(jié)果表明，500mg/kg的阿魏側(cè)耳多糖可提高荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子 TNF- α (**ρ < 0. Olvs NS)和 IFN- γ (*ρ < 0. Olvs NS)的水平。而順鉬組荷瘤鼠的 TNF-α (ΔΔρ < 0. OlvsDDP)和IFN-γ (Δρ < 0. 05vs DDP)水平與阿魏側(cè)耳組相比顯著下 降。當(dāng)阿魏側(cè)耳與順鉬共同作用時，可顯著提高受順鉬抑制的荷瘤小鼠血清中TNF-α水平 (Δρ < 0. 05vs DDP)，但I(xiàn)FNi水平提高不顯著。表8阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤鼠細(xì)胞因子水平的影響 **p < 0. 01，*p < 0. 05vs NS ；ΔΔρ < 0. 01，Δρ < 0. 05vs DDP2. 8阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠外周血T細(xì)胞亞型的影響表9結(jié)果表明，腫瘤模型組外周血⑶47⑶8+比值增大，應(yīng)用順鉬后更為明顯，而阿 魏側(cè)耳多糖可以逆轉(zhuǎn)這種狀況，與腫瘤模型組和順鉬組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
表9阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤鼠外周血CD4+/⑶8+比值的影響
組別齊1J 量(mg/kg)CD4+/CD8+Normal_1.65 土 0.42NS_2.25 士 0.94DDP33.45 士 0.80**P. ferulae5001.85 士 0.42δδP.ferulae+DDP500+32.99±0.91**p < 0. Olvs NS ；ΔΔρ < 0. Olvs DDP同時，因?yàn)榘⑽簜?cè)耳多糖能夠促進(jìn)機(jī)體免疫功能，因此有望在抑制腫瘤細(xì)胞生 長、增強(qiáng)人體免疫力、抗凝血、保護(hù)胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦 血管供血不足、去膩醒酒、護(hù)膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改 善血液粘稠度和微循環(huán)、擴(kuò)張血管、清除自由基、抗腫瘤、抗癌藥物、功能食品和食品中得到 廣泛應(yīng)用。


圖1 阿魏側(cè)耳多糖HPLC-ELSD圖譜，色譜條件(T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝膠柱，ELSD檢測器檢測，水為流動相，流速lml/min)圖2阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠腹腔M Φ吞噬功能的影響圖3阿魏側(cè)耳多糖對荷瘤小鼠腹腔M Φ吞噬指數(shù)的影響
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 阿魏側(cè)耳多糖的提取制備阿魏側(cè)耳(新鮮)20kg，切成小塊，每IOOg加水400ml，用榨汁機(jī)榨汁lmin，超聲 30min,煮沸3h，冷卻，離心取上清液，濾紙抽濾。沉淀加6被量水超聲30min，煮沸l(wèi)h，冷卻， 離心，取上清，濾紙抽濾，合并上清液，濃縮，得濃縮液9L。出膏率7. 825%。實(shí)施例2 阿魏側(cè)耳多糖的純化實(shí)施例1制備的阿魏側(cè)耳濃縮液50ml (相當(dāng)于原料50mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g， 調(diào)PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室溫，3000r/min離心5min，取上清液，加乙醇至含醇量85%， 振蕩后放置，3000r/min離心5min，取沉淀，反復(fù)操作3次，即得純化阿魏側(cè)耳多糖。實(shí)施例3 木瓜蛋白酶酶解工藝考察1、最適酶用量的確定取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分別加入木瓜蛋 白酶(酶與底物質(zhì)量比)Omg/g、2mg/g、4mg/g、6mg/g、8mg/g、1 Omg/g、12mg/g，用 HCL 調(diào) PH6， 50°C水浴2h后沸水浴IOmin使酶滅活，冷卻至室溫，3000r/min離心5min，取上清液加95% 乙醇至醇濃度80%，3000r/min離心IOmin取沉淀，同法洗滌沉淀三次，測多糖得率。最佳 酶底比為8mg/g。
2、最適酶解時間的確定取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分別加入木瓜 蛋白酶 6. 96mg 用 HCL 調(diào) PH6，分別 50°C 水浴 0min、30min、60min、90min、120min、150min、 180min后沸水浴lOmin使酶滅活，冷卻至室溫，3000r/min離心5min，取上清液加95%乙醇 至醇濃度80%，3000r/min離心lOmin取沉淀，同法洗滌沉淀三次，測多糖得率。最佳酶解 時間為:120min。
3、最適PH值的確定取3個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分別加入木瓜蛋 白酶6. 96mg用HCL分別調(diào)PH為5、7、9，分別50°C水浴120min后沸水浴lOmin使酶滅活， 冷卻至室溫，3000r/min離心5min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3000r/min離心 lOmin取沉淀，同法洗滌沉淀三次，測多糖得率。最佳酶解PH值為5。
4、最適酶解溫度的確定取7個具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分別加入木瓜蛋 白酶 6. 96mg 用 HCL 分別調(diào) PH 為 5 左右，分別 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C水浴 120min后沸水浴lOmin使酶滅活，冷卻至室溫，3000r/min離心5min，取上清液加95%乙醇 至醇濃度80%，3000r/min離心lOmin取沉淀，同法洗滌沉淀三次，測多糖得率。最佳酶解 溫度為:60°C。
酶質(zhì)量mg6. 976. 976. 946. 956. 976. 946. 97多糖得率34. 9%35. 5%35. 7%36. 1 %28. 2%25. 8%24. 0%實(shí)施例4 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)，設(shè)計L9(33)正交試驗(yàn)，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝。為了提高統(tǒng) 計分析的可靠性，每一條件下都作了重復(fù)試驗(yàn)(η = 3)，測定結(jié)果取其平均值。因素水平 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 從R值來看，Rc > Ra > Rb,即影響阿魏側(cè)耳多糖提取率的諸因素的主次關(guān)系依次 是料液比(C) >浸提溫度(A) >浸提時間(B)，從kl、k2、k3來看，最佳組合為A1B2Cy即浸 提溫度70°C，浸提時間3h，料液比1 40實(shí)施例5 阿魏側(cè)耳多糖含片的制備處方該藥物每5000片主要原輔料的配比如下
阿魏菇多糖1250g
桑葉提取物125g
可溶性淀粉淀粉625g
微晶纖維素125g
糊精250g
10%淀粉漿適量(2g-20ml)
滑石粉25g
甜蜜素5g
具體的制備方法包括以下步驟進(jìn)行
1.阿魏菇多糖冷凍干遅I法干燥后，粉碎過100目篩。
2.精密稱取處方量的甜蜜素，可溶性淀粉2克加入20
均勻，放在80_85°C水浴下加熱攪拌至半透明狀態(tài)，取出備用。3.精密稱取處方量的阿魏菇多糖，可溶性淀粉，微晶纖維素，糊精充分?jǐn)嚢杌旌暇?勻。4.用滴管吸取10%淀粉漿加入3中，邊加邊攪至“握之成團(tuán)，觸之即散”，過16號 篩制成濕顆粒，50-60°C溫度下烘干，過16號篩整粒，壓片。

實(shí)施例6 阿魏側(cè)耳多糖片的制備 處方
該藥物每5000片中主要原輔料的配比
阿魏菇多糖 桑椹提取物 可溶性淀粉淀粉 微晶纖維素 糊精
二氧化硅 10%淀粉漿
1250g 50g 450g 125g 250g 25g
適量(2g-20ml) 硬脂酸鎂12. 5g
具體的制備方法包括以下步驟進(jìn)行 阿魏菇多糖冷凍干燥法干燥后，粉碎過100目篩。
精密稱取可溶性淀粉2克加入20毫升純凈水充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，放?0-85 °C水 浴下加熱攪拌至半透明狀態(tài)，取出備用。精密稱取處方量的阿魏菇多糖，可溶性淀粉，微晶纖維素，糊精充分?jǐn)嚢杌旌暇?勻。用滴管吸取10%淀粉漿加入3中，邊加邊攪至“握之成團(tuán)，觸之即散”，過16號篩 制成濕顆粒，50-60°C溫度下烘干，過16號篩整粒，壓片。阿魏菇多糖干燥方法有兩種直接冷凍干燥法，按重量的0. 5% -90. 0%糊精或微 晶纖維素加入后再冷凍干燥。直接冷凍干燥不容易粉碎，加入糊精或微晶纖維素再干燥容 易粉碎。
1權(quán)利要求
一種從阿魏側(cè)耳中提取的阿魏側(cè)耳多糖，其特征為，不含有蛋白質(zhì)，并且其HPLC ELSD色譜具有如圖1所示的特征圖譜。
2.權(quán)利要求1所述的阿魏側(cè)耳多糖，其特征為，用以下方法制備而成，阿魏側(cè)耳提取， 提取物除蛋白，除蛋白后的提取物純化得到，其中所述提取步驟如下阿魏側(cè)耳粉碎，加水提取，離心或者過濾除去殘渣，回收水提取液，得阿魏側(cè)耳濃縮液，其中所述除蛋白方法選 自(1)溶劑萃取法阿魏側(cè)耳濃縮液中先加入正丁醇，振搖，再加入三氯甲烷，振搖，離 心，蛋白質(zhì)變成不溶狀態(tài)，存留在有機(jī)溶劑與水的界面，1-100次，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液 中先加入正丁醇，振搖20min，再加入三氯甲烷，振搖20min，離心，4000r/min離心15min，反 復(fù)6-8次，其特征為因?yàn)榘⑽簜?cè)耳濃縮液地特殊性，用常規(guī)的正丁醇_三氯甲烷混合液一 起溶劑萃取的方法，難以達(dá)到除去蛋白質(zhì)的目的，一定要先加入正丁醇振搖，再加入三氯甲 烷振搖，(2)離子交換樹脂法a)陰離子交換樹脂200g，蒸餾水浸泡10h，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖洗至 中性，Imol/LNaOH沖10個柱體積，蒸餾水沖洗至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5_500ml用NaOH調(diào) 節(jié)PH值為8-14，上樣，蒸餾水洗脫，濃縮得到多糖提取物；繼用0. Imol/LNaOH洗脫，除去柱 上的蛋白質(zhì)，其中用NaOH調(diào)節(jié)pH值最優(yōu)為8-11，上樣量為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml，b)陽離子交換樹脂1000g，蒸餾水浸泡10h，Imol/LNaOH沖柱10個柱體積，蒸餾水沖洗 至中性，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml用鹽酸調(diào)節(jié) PH值為1-6，上樣，蒸餾水沖柱，濃縮得到多糖提取物；繼用lmol/L鹽酸洗脫，除去柱上的蛋 白質(zhì)，其中用鹽酸調(diào)節(jié)PH值最優(yōu)為3-5，上樣量為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml，(3)酶法a)阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml加入木瓜蛋白酶0.6g，調(diào)PH1-9，30_80°C水浴，放至室 溫，離心，取上清液，即可除去蛋白質(zhì)，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml加入木瓜蛋白酶 0. 6g，調(diào)PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室溫，3000r/min離心5min，取上清液，即可除去蛋白 質(zhì)，b)阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml加入胃蛋白酶0.05g，調(diào)PH0-4. 5，30-45 °C水浴，放至 室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇量50-95 %，振蕩后放置，離心，取沉淀，即可除去蛋 白質(zhì)，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)加入胃蛋白酶0. 05g, 調(diào)PH1. 5-2. 5，37°C水浴，放至室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇量85%，振蕩后放置， 3000r/min離心5min，取沉淀，即可除去蛋白質(zhì)，(4)凝膠色譜法取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱，用滴管將阿魏側(cè)耳濃縮液 5-500ml均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫，每個流份經(jīng)UV 200-500nm全波長掃描，檢查蛋 白質(zhì)峰，并每個流份用硫酸-苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測多糖，合并含有多糖，并不含有 蛋白質(zhì)的流份，即得，葡聚糖凝膠最優(yōu)為s印hadex G-100和s印hadex G_50，阿魏側(cè)耳濃縮 液 l-10ml,其中所述純化方法選自(1)溶劑萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī)溶劑，或以上溶劑的混合溶劑，與水液液萃取除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，水相中即為純化的阿魏 側(cè)耳多糖，(2)乙醇沉淀法除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，加入乙醇至乙醇濃度為50-95%，振 蕩后放置，離心，取沉淀，可反復(fù)2-10次，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖，其最優(yōu)工藝為除去蛋 白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，加入乙醇至乙醇濃度為85%，振蕩后放置，3000r/min離心5min， 沉淀加水溶解后再加乙醇離心，反復(fù)3次，(3)液-液逆流分配色譜法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī) 溶劑，或以上溶劑的混合溶劑，與水液_液逆流分配色譜法，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液 經(jīng)分離，選取阿魏側(cè)耳多糖流出部分，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖，(4)凝膠色譜法取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱，用滴管 將除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液5-500ml均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫，每個流份經(jīng) 硫酸_苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測多糖，合并含有多糖部分，即得純化的阿魏側(cè)耳多 糖，葡聚糖凝膠最優(yōu)為si^phadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液 I-IOml。
3.權(quán)利要求1所述的阿魏側(cè)耳多糖，其特征為，用以下方法制備而成，阿魏側(cè)耳，切成小塊，加水用榨汁機(jī)榨汁，超聲，煮沸，冷卻，離心取上清液，濾紙抽濾， 沉淀加水超聲，煮沸，冷卻，離心，取上清，濾紙抽濾，合并上清液，濃縮，得濃縮液，濃縮液加 入木瓜蛋白酶，調(diào)PH5-6，水浴加熱，放至室溫，離心，取上清液，加乙醇放置，離心，取沉淀， 即得。
4.權(quán)利要求1所述的阿魏側(cè)耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟如下提取，除蛋白， 純化，其中除蛋白方法選自(1)溶劑萃取法；(2)離子交換樹脂法；(3)酶法；(4)凝膠色譜 法，其中純化方法選自(1)溶劑萃取法；(2)乙醇沉淀法；(3)液-液逆流分配色譜法；(4) 凝膠色譜法。
5.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于其中所述提取方法，步驟如下阿魏側(cè)耳粉 碎，加水提取，離心或者過濾除去殘渣，回收水提取液，得阿魏側(cè)耳濃縮液，其中1)阿魏側(cè) 耳為新鮮或者經(jīng)過水充分浸潤；2)水提取可以加熱提取，并且通過粉碎、破碎，可以使提取 時間大為縮短，最佳可至10-60分鐘；3)為了提高離心或者過濾除去殘渣過程中效率，同時 兼顧提取效率，破碎粒度控制在10-300目范圍，其中以30-60目為最佳。
6.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于其中所述除蛋白方法選自(3)溶劑萃取法，其特征為阿魏側(cè)耳濃縮液中先加入正丁醇(100 1-100 20)，振 搖，再加入三氯甲烷(100 1-100 50)，振搖，離心，蛋白質(zhì)變成不溶狀態(tài)，存留在有機(jī)溶 劑與水的界面，1-100次，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液中先加入正丁醇((25 1)，振搖20min， 再加入三氯甲烷(25 4)，振搖20min，離心，4000r/min離心15min，反復(fù)6-8次，其特征 為因?yàn)榘⑽簜?cè)耳濃縮液地特殊性，用常規(guī)的正丁醇_三氯甲烷混合液一起溶劑萃取的方 法，難以達(dá)到除去蛋白質(zhì)的目的，一定要先加入正丁醇振搖，再加入三氯甲烷振搖，(4)離子交換樹脂法，其特征為a)陰離子交換樹脂200g，蒸餾水浸泡10h，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖洗至 中性，Imol/LNaOH沖10個柱體積，蒸餾水沖洗至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5_500ml (相當(dāng)于 原料5-500mg)用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8_14，上樣，蒸餾水洗脫，濃縮得到多糖提取物；繼用0. Imol/LNaOH洗脫，除去柱上的蛋白質(zhì)，其中用NaOH調(diào)節(jié)pH值最優(yōu)為8-11，上樣量為阿魏 側(cè)耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)，b)陽離子交換樹脂lOOOg，蒸餾水浸泡10h，Imol/LNaOH沖柱10個柱體積，蒸餾水沖洗 至中性，lmol/L鹽酸沖10個柱體積，蒸餾水沖至中性，阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml (相當(dāng)于原 料5-500mg)用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1_6，上樣，蒸餾水沖柱，濃縮得到多糖提取物；繼用lmol/ L鹽酸洗脫，除去柱上的蛋白質(zhì)，其中用鹽酸調(diào)節(jié)pH值最優(yōu)為3-5，上樣量為阿魏側(cè)耳濃縮 液 50-100ml (相當(dāng)于原料 50-100mg)，(3)酶法，其特征為a)阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml(相當(dāng)于原料5-500mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，調(diào)PH1-9， 30-80°C水浴，放至室溫，離心，取上清液，即可除去蛋白質(zhì)，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液 50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，調(diào)PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室 溫，3000r/min離心5min，取上清液，即可除去蛋白質(zhì)，b)阿魏側(cè)耳濃縮液5-500ml(相當(dāng)于原料5-500mg)加入胃蛋白酶0. 05g，調(diào)PH 0-4.5， 30-45°C水浴，放至室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇量50-95%，振蕩后放置，離心，取 沉淀，即可除去蛋白質(zhì)，最優(yōu)為阿魏側(cè)耳濃縮液50-100ml (相當(dāng)于原料50-100mg)加入胃 蛋白酶0. 05g，調(diào)PHl. 5-2. 5，37°C水浴，放至室溫，加NaOH調(diào)至中性，加乙醇至含醇量85%， 振蕩后放置，3000r/min離心5min，取沉淀，即可除去蛋白質(zhì)，(4)凝膠色譜法，其特征為取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱，用滴管將阿魏側(cè)耳濃縮 液5-500ml (相當(dāng)于原料5-500mg)均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫，每個流份經(jīng)UV 200-500nm全波長掃描，檢查蛋白質(zhì)峰，并每個流份用硫酸_苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測 多糖，合并含有多糖，并不含有蛋白質(zhì)的流份，即得，葡聚糖凝膠最優(yōu)為sephadex G-100和 sephadex G-50，阿魏側(cè)耳濃縮液Ι-lOml (相當(dāng)于原料Ι-lOmg)。
7.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于其中純化方法選自(4)溶劑萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī)溶劑，或以上溶劑的混合溶 劑，與水液液萃取除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，水相中即為純化的阿魏側(cè)耳多糖，(5)乙醇沉淀法除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液，加入乙醇至乙醇濃度為50-95%，振蕩后放置，離心，取 沉淀，可反復(fù)2-10次，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖，其最優(yōu)工藝為除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提 取液，加入乙醇至乙醇濃度為85%，振蕩后放置，3000r/min離心5min，沉淀加水溶解后再 加乙醇離心，反復(fù)3次，(6)液-液逆流分配色譜法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、石油醚、汽油等有機(jī)溶劑，或以上溶劑的混合溶 劑，與水液_液逆流分配色譜法，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液經(jīng)分離，選取阿魏側(cè)耳多糖 流出部分，即為純化的阿魏側(cè)耳多糖，(4)凝膠色譜法，取葡聚糖凝膠5g粉末，用蒸餾水浸泡在燒杯中溶漲，裝柱，用滴管將除去蛋白質(zhì)的阿 魏側(cè)耳提取液5-500ml (相當(dāng)于原料5-500mg)均勻加入到凝膠柱中，蒸餾水洗脫，每個流份經(jīng)硫酸_苯酚法反應(yīng)后在490nm處檢測多糖，合并含有多糖部分，即得純化的阿魏側(cè)耳多 糖，葡聚糖凝膠最優(yōu)為s印hadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白質(zhì)的阿魏側(cè)耳提取液 l-10ml (相當(dāng)于原料l-10mg)。
8.權(quán)利要求1所述的阿魏側(cè)耳多糖在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)人體免疫力、抗凝 血、保護(hù)胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血管供血不足、去膩醒酒、 護(hù)膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和微循環(huán)、 擴(kuò)張血管、清除自由基的藥物、功能食品以及食品中的應(yīng)用。
9.含有權(quán)利要求1的阿魏側(cè)耳多糖的組合物，其特征在于，含有阿魏側(cè)耳多糖以及藥 物或食品可接受的載體，并且/或者含有桑枝、桑葉、桑椹及其提取物、阿卡波糖等糖苷酶 抑制劑，制備成任何可服用的藥物劑型如含片，片劑，膠囊，顆粒，口服液，注射劑，代泡茶， 飲料等，在使用時根據(jù)病人的情況，確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋 或?；蚱?，每劑lmg-1000mg。其中，糖苷酶抑制劑包括桑枝、桑葉、桑椹及其提取物、阿卡波 糖等糖苷酶抑制劑，我們發(fā)現(xiàn)加入它們的作用是可以通過抑制胃腸道代謝酶，抑制阿魏側(cè) 耳多糖在胃腸道內(nèi)的降解，從而提供了 口服給藥系統(tǒng)(片劑等制劑)和口含給藥系統(tǒng)(含 片等制劑)。
10.權(quán)利要求1所述的阿魏側(cè)耳多糖的檢測方法，其特征為包括分光光度法和色譜法，其中分光光度法的方法如下a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取烘干至恒重的無水葡萄糖0. lOllg溶于100ml蒸餾水中，配成1. 011mg/ml的標(biāo)準(zhǔn) 溶液，然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 6,0. 8ml置5只試管中，加蒸餾水1. 0ml，加入硫 酸_苯酚顯色液，沸水浴30min，放至室溫，在490nm處，測其吸光度A，用同樣處理的蒸餾水 做空白對照，以吸光度為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，b)硫酸-苯酚配制苯酚5g，用少量水溶解，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，定容至刻度，配成 苯酚溶液，c)測定法10mg樣品溶解在10ml蒸餾水中，加1ml苯酚溶液，5ml硫酸，沸水浴30min， 冷卻至室溫，490nm處測A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計算，即得，其中色譜法的方法如下利用T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝膠柱，ELSD檢測器檢測，進(jìn)行HPLC分析 的多糖含量測定方法，最優(yōu)條件T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝膠柱，ELSD檢測 器檢測，水為流動相，流速lml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及從阿魏側(cè)耳中制備的阿魏側(cè)耳多糖及其組合物的醫(yī)藥用途和制備方法，本發(fā)明的制備方法，包括提取，除蛋白，純化，除蛋白采用以下方法，(1)溶劑萃取法；(2)離子交換樹脂法；(3)酶法；(4)凝膠色譜法，純化采用以下方法，(1)溶劑萃取法；(2)乙醇沉淀法；(3)液-液逆流分配色譜法；(4)凝膠色譜法。
文檔編號A61K47/46GK101914168SQ20101027298
公開日2010年12月15日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者盧立娜, 鞏平, 張翠, 李國玉, 楊琳, 王瑩, 王金輝, 秦穎, 魏秀巖, 黃健 申請人:石河子大學(xué)