專利名稱：受體選擇性增強(qiáng)的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變體及其選擇方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及神經(jīng)元受體選擇性增強(qiáng)的CNTF變體，該變體可用于治療神經(jīng)病或其它疾病或障礙。
睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)是23-KDa的神經(jīng)-細(xì)胞因子，自胚胎后期開(kāi)始，外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都表達(dá)CNTF(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。起初鑒定出CNTF促進(jìn)雞胚副交感神經(jīng)元體外存活的能力，后來(lái)又證明CNTF對(duì)包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，感覺(jué)神經(jīng)元，交感神經(jīng)元，海馬神經(jīng)元和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)有力的生長(zhǎng)促進(jìn)和/或分化作用(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。體內(nèi)施用CNTF可防止發(fā)育過(guò)程中小雞脊運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化，軸突切開(kāi)術(shù)大鼠面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化，和患進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的突變小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化。CNTF的神經(jīng)保護(hù)性作用使其成為治療人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和或許其它神經(jīng)退化性疾病的候選藥物(Manthorpe等，1993；Ip和Yancopoulos 1996)。
除了對(duì)神經(jīng)元的作用以外，CNTF也對(duì)如膠質(zhì)(Hughes等，1988；Louis等，1993)，肝細(xì)胞(Schooltnik等，1992)，骨骼肌細(xì)胞(Helgren等，1994)，胚胎干細(xì)胞(Conover等，1993)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Gimble等，1994)和腫瘤漿細(xì)胞(Zhang等，1994)等非神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)作用。
CNTF蛋白質(zhì)之治療用途的相關(guān)問(wèn)題的一個(gè)起因可能是CNTF的功能多向性。CNTF體內(nèi)半衰期短(Davies等，1994)，需要以高劑量給藥才能在靶組織中達(dá)到藥理學(xué)有用的濃度。高劑量的CNTF產(chǎn)生副作用，如體重減輕和急性期反應(yīng)(Dittrich等，1995)。因此，需要能模擬CNTF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用而不會(huì)產(chǎn)生CNTF的所有或部分副作用的藥物。
CNTF通過(guò)結(jié)合，連續(xù)裝配和激活多亞單位受體復(fù)合物來(lái)行使其生物學(xué)作用，所述復(fù)合物由配體-特異性的a-受體(CNTFR)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位gp130和白血病抑制因子受體-b(LIFR)組成(Ip和Yancopoulos1996)。CNTF與CNTFR的結(jié)合引發(fā)了隨后的gp130和LIFR的結(jié)合和異二聚體化，導(dǎo)致由Jak族蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和STAT轉(zhuǎn)錄激活物介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)激活。與介導(dǎo)gp130同二聚體化的IL-6 a-受體gp80類似，CNTFR可以膜結(jié)合的形式或可溶性形式起作用(Ip和Yancopoulos 1996)。CNTFR的膜結(jié)合形式(m-CNTFR)經(jīng)糖基磷脂酰肌醇鍵錨著于細(xì)胞表面，它主要表達(dá)于神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞(Davies等，1991；Ip等，1993)。CNTFR的可溶性形式(s-CNTFR)可由磷脂酶C介導(dǎo)的m-CNTFR裂解產(chǎn)生，它可用作加強(qiáng)CNTF對(duì)表達(dá)gp130和LIFR之細(xì)胞的作用的輔因子(Davies等，1993)。在腦脊髓液和血清中檢測(cè)到可溶性的CNTFR(Helgren等，1994；Davis等，1993)，這表明它可能參與介導(dǎo)CNTF的一些非神經(jīng)元作用，如急性期反應(yīng)(Dittrich等，1994)。
由于CNTF的神經(jīng)元作用需要m-CNTFR，而據(jù)認(rèn)為s-CNTFR介導(dǎo)了非神經(jīng)元作用，對(duì)m-CNTFR的選擇性增強(qiáng)的經(jīng)修飾CNTF蛋白有望產(chǎn)生更具神經(jīng)元特異性的藥理學(xué)活性譜。發(fā)明描述本發(fā)明涉及CNTF變體，該變體因本發(fā)明特定氨基酸取代的作用，其結(jié)合CNTFR的能力比天然CNTF低，由可溶性CNTFR介導(dǎo)的生物活性降低，由膜結(jié)合的CNTFR介導(dǎo)的生物活性保持不變。
這些變體基于治療人和動(dòng)物神經(jīng)元病和障礙的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞+可溶性CNTFR和穩(wěn)定表達(dá)CNTFR的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞之間比較了CNTF變體的生物活性，這提供了評(píng)估膜結(jié)合受體選擇性的方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)用異亮氨酸取代hCNTF(SEQ ID NO1)第169位的氨基酸蘇氨酸，用丙氨酸取代第174位氨基酸組氨酸可得到本發(fā)明的變體(下文將該變體稱為Thr169Ile/His174Ala/hCNTF；IA-CNTF，或SEQ ID NO2)。此變體的特征在于結(jié)合可溶性CNTFR的能力降低。
在可溶性CNTFR的存在下，在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中測(cè)定經(jīng)修飾的hCNTF刺激急性期蛋白質(zhì)觸珠蛋白產(chǎn)生的能力。如下文所述，相對(duì)于野生型CNTF而言，經(jīng)修飾的CNTF表現(xiàn)出效力降低。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了經(jīng)修飾的人CNTF蛋白刺激人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中產(chǎn)生膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶的能力。如下文所述，在此試驗(yàn)中，經(jīng)修飾的CNTF表現(xiàn)出與野生型CNTF蛋白相同的效力。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將不能表達(dá)CNTFR的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞改造為能表達(dá)全長(zhǎng)的人CNTFR，使用這些細(xì)胞測(cè)定經(jīng)修飾的CNTF蛋白刺激觸珠蛋白產(chǎn)生的能力。將此試驗(yàn)中的生物活性與存在可溶性CNTFR時(shí)在親代肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中測(cè)定的生物活性相比較。此方法可測(cè)定膜結(jié)合CNTFR對(duì)可溶性CNTFR選擇性激活生物反應(yīng)的能力。如本文所述，在此試驗(yàn)中，經(jīng)修飾的CNTF蛋白與野生型人CNTF具有相同的效力，這表明經(jīng)修飾的CNTF通過(guò)膜結(jié)合的CNTFR維持高生物活性，而通過(guò)可溶性CNTFR顯示出特異性降低的活性。如本文所述，在表達(dá)CNTFR的肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中，以前顯示出具有增強(qiáng)的神經(jīng)元受體選擇性的CNTF變體(意大利專利申請(qǐng)RM96A000492)(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His/人CNTF或AKDH-CNTF；其氨基酸152至167含有意大利專利申請(qǐng)RM96A000492中的SEQ ID NO3所示序列的人CNTF變體)也與野生型CNTF效力相同。這些結(jié)果表明可使用此檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)鑒定CNTF變體，所述變體通過(guò)可溶性的和膜結(jié)合的CNTFR表現(xiàn)出不同的生物活性。
配體保留假說(shuō)(Baumann等，1994)為具有膜結(jié)合和可溶性受體同工型之細(xì)胞因子變體的藥理學(xué)表現(xiàn)提供了似乎最合理的解釋。Baumann及其同事(見(jiàn)Baumann等，1994)計(jì)算出細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體濃度為微摩爾范圍(遠(yuǎn)大于細(xì)胞因子-受體平衡解離常數(shù))，并提出這可導(dǎo)致幾乎單向性的配體捕獲。細(xì)胞因子受體的高膜濃度可解釋受體結(jié)合親和性有所改變的細(xì)胞因子變體為何仍通過(guò)膜結(jié)合受體顯示出未經(jīng)改變的激動(dòng)劑效力。因此，CNTF及其CNTFR親和性有所改變的變體在神經(jīng)元細(xì)胞中效力相同可能是因?yàn)閙-CNTFR準(zhǔn)-不可逆的配體捕獲所致，這類似于在飽和濃度的s-CNTFR的存在下，非神經(jīng)元細(xì)胞中的狀況(意大利專利申請(qǐng)RM96A000492)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，人CNTF野生型蛋白質(zhì)中的某些氨基酸取代會(huì)導(dǎo)致膜結(jié)合(神經(jīng)元)對(duì)可溶性(非神經(jīng)元)CNTFR的選擇性增加的經(jīng)修飾人CNTF蛋白，因此，有望具有增強(qiáng)的治療特性。
通過(guò)在原核和真核系統(tǒng)中克隆和表達(dá)，可制備用于本發(fā)明實(shí)踐的CNTF修飾分子?？捎迷试S穩(wěn)定的生物活性蛋白質(zhì)進(jìn)一步形成的任何方法表達(dá)和純化所得的重組基因。
本發(fā)明的目的如下睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)變體和人CNTF變體，其中第169位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代，第174位的組氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，這些變體對(duì)(膜)受體的選擇性增強(qiáng)。含有權(quán)利要求1或2所述的CNTF變體和藥物可接受的載體的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，按本文所述產(chǎn)生的經(jīng)修飾的CNTF分子，或其雜合體或突變體可用于在體外或體內(nèi)促進(jìn)對(duì)CNTF反應(yīng)之細(xì)胞的分化，增殖或存活。本發(fā)明也可用于治療對(duì)CNTF反應(yīng)之任何細(xì)胞的病理學(xué)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可治療表達(dá)膜結(jié)合的CNTF受體之神經(jīng)元細(xì)胞的病理學(xué)。
評(píng)估CNTF變體對(duì)膜結(jié)合受體增強(qiáng)的選擇性的方法是通過(guò)膜結(jié)合的CNTF受體或可溶性的CNTF受體誘導(dǎo)生物反應(yīng)。通過(guò)上述方法選擇的CNTF變體。編碼CNTF變體的分離的和純化的DNA分子。含有上述DNA的DNA重組分子，上述DNA與在所述重組DNA中控制表達(dá)的序列功能性結(jié)合。被重組DNA轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主，單細(xì)胞宿主可選自細(xì)菌，酵母，真菌和動(dòng)物和植物細(xì)胞。上述變體用于制備治療神經(jīng)疾病或障礙之藥物的用途。這些神經(jīng)疾病或障礙包括如視網(wǎng)膜病理學(xué)的退化病理學(xué)，涉及脊髓，膽堿能神經(jīng)元，海馬神經(jīng)元的疾病或病理學(xué)，或涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的疾病或病理學(xué)。
本發(fā)明的變體也可用于治療由神經(jīng)系統(tǒng)損害引起的，由創(chuàng)傷，外科手術(shù)，心臟病發(fā)作，感染和惡性腫瘤，或暴露于毒性劑導(dǎo)致的疾病或病理學(xué)。上述變體與其它蛋白質(zhì)或其它分子的綴合物。上述變體與針對(duì)允許變體穿過(guò)血腦屏障的轉(zhuǎn)移受體之抗體的綴合物。上述變體與降低所述變體之免疫原性的聚乙二醇的綴合物。


圖1顯示出CNTF和IA-CNTF與CNTFR的結(jié)合。在缺乏(對(duì)照)或存在CNTF(()，或IA-CNTF(()時(shí)測(cè)定生物素化的人CNTF與固定化的CNTFR的結(jié)合。結(jié)果被表示為對(duì)照結(jié)合的百分比，并描述了重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的平均值±偏差。數(shù)據(jù)得自重復(fù)3次類似結(jié)果的代表性實(shí)驗(yàn)。
圖2顯示出HepG2細(xì)胞中由s-CNTFR介導(dǎo)的生物活性。在80ng/mls-CNTFR和CNTF(()或IA-CNTF(()的存在下測(cè)定對(duì)HepG2細(xì)胞中觸珠蛋白產(chǎn)生的刺激。結(jié)果被表示為最大CNTF-誘導(dǎo)反應(yīng)的百分比。每個(gè)點(diǎn)是至少2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m。
圖3顯示出IMR-32細(xì)胞中由m-CNTFR-介導(dǎo)的生物活性。測(cè)定IMR-32細(xì)胞中由CNTF(()或IA-CNTF(()誘導(dǎo)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chat)活性。結(jié)果被表示為最大CNTF-誘導(dǎo)反應(yīng)的百分比。每個(gè)點(diǎn)是重復(fù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿的平均值±s.e.m。
圖4顯示出HepG2細(xì)胞中由CNTF+s-CNTFR聯(lián)合介導(dǎo)的早期信號(hào)傳遞反應(yīng)和HepG2/CNTFR細(xì)胞中由CNTF介導(dǎo)的早期信號(hào)傳遞反應(yīng)?；蛘卟挥萌魏渭?xì)胞因子處理細(xì)胞(-)，或者用100ng/ml IL-6，LIF，CNTF或100ng/ml s-CNTFR+100ng/ml CNTF(CNTF+s-R)將細(xì)胞處理15分鐘。通過(guò)電遷移率變動(dòng)分析測(cè)定細(xì)胞STAT因子的激活。箭頭表示結(jié)合的STAT3同二聚體(a)，Stat1Stat3異二聚體(b)，Stat1同二聚體(c)的遷移位置。圖中的n表示非特異性結(jié)合。
圖5表示HepG2/CNTFR細(xì)胞中由m-CNTFR介導(dǎo)的生物活性。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果的處理如圖2所述。受試的蛋白質(zhì)是CNTF(()，IA-CNTF(()和AKDH-CNTF(()。保藏物于1997年2月12日將被編碼SEQ ID NO2的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HB2151細(xì)菌保藏于國(guó)家工業(yè)和海生細(xì)菌保藏股份有限公司(NCIMB)，Aberdeen，Scotland，UK.保藏號(hào)為NCIMB 40860。
上文已給出本發(fā)明的一般性描述，借助于下列實(shí)施例，將給出本發(fā)明具體實(shí)施方案的更詳細(xì)描述，以更清楚地說(shuō)明本發(fā)明的目的，特征，優(yōu)點(diǎn)和操作方法。實(shí)施例實(shí)施例1制備經(jīng)修飾的CNTF蛋白a)構(gòu)建編碼經(jīng)修飾的CNTF蛋白的DNA制備Thr169Ile/His174Ala/人CNTF(IA-CNTF；SEQ ID NO2)，使用pHenD-CNTF載體(Baumann等，1993)為模板，通過(guò)重疊延伸PCR(Horton和Pease，1991)產(chǎn)生突變。使用寡核苷酸引物組1(5’-GATCGTCGACATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGC-3’)+2(5’-AGAAATGAAACGAAGGTCAGCGATGGACCTTACTGTCCA-3’)和3(5’-TGGACAGTAAGGTCCATCGCTGACCTTCGTTTCATTTCT-3’)+4(5’-GAAACCATCGATAGCAGCACCGTAAT-3’)，以94℃2分鐘，50℃2分鐘和72℃3分鐘為循環(huán)進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的PCR擴(kuò)增。使用Qiaex試劑盒分離兩個(gè)PCR產(chǎn)物，混合，并在第二個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。在缺乏引物1+4時(shí)進(jìn)行5輪PCR循環(huán)(如上所述)，在存在引物1+4時(shí)進(jìn)行35輪循環(huán)。用SalI和ClaI消化PCR產(chǎn)物，通過(guò)Qiaex純化，亞克隆至經(jīng)SalI/ClaI消化的pHenD-CNTF載體中，產(chǎn)生載體pHenD-IA-CNTF。DNA測(cè)序揭示出存在產(chǎn)生預(yù)期由所用誘變引物所致的His174Ala取代的突變，以及在編碼的蛋白質(zhì)序列中產(chǎn)生Thr169Ile取代的其它點(diǎn)突變(可能是聚合酶的錯(cuò)誤所致)。使用下列方法將IA-CNTF的編碼序列亞克隆至pRSET質(zhì)粒，該質(zhì)粒可以使細(xì)菌高水平表達(dá)蛋白質(zhì)(Horton和Pease，1991)。使用寡核苷酸引物5(5’-GTCACCATGGCTT TCACAGAGCATTCACCG-3’)和6(5’-TGACGCGGCCGCCCTACACATTTTCTTGTTGTTAG CAATATA-3’)，以pHenD-IA-CNTF載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以94℃2分鐘，50℃2分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行25輪循環(huán)。用NcoI和BamHI消化PCR產(chǎn)物，使用Wizard PCR試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并亞克隆至經(jīng)NcoI/BamHI消化的質(zhì)粒pRSET-CNTF(Horton和Pease，1991)。通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)最后的構(gòu)建體的同一性。b)產(chǎn)生和純化經(jīng)修飾的CNTF蛋白在大腸桿菌中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)并根據(jù)前述方法(Saggio等，1995；Di Marco等，1996)通過(guò)反相HPLC純化該重組蛋白質(zhì)。實(shí)施例2經(jīng)修飾的CNTF蛋白的受體結(jié)合活性使用前述方法(Saggio等，1994；Saggio等，1995)，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)和生物素化的CNTF競(jìng)爭(zhēng)與固相-固定化CNTFR結(jié)合的能力來(lái)測(cè)定CNTF和IA-CNTF的CNTFR結(jié)合活性。如圖1所示，IA-CNTF對(duì)CNTFR的親和性比野生型蛋白質(zhì)低15倍。實(shí)施例3非神經(jīng)元細(xì)胞中由可溶性CNTFR介導(dǎo)的生物活性人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2表達(dá)LIFR和gp130，但不表達(dá)CNTFR(Baumann等，1993)。在HepG2細(xì)胞中加入可溶性的CNTFR可導(dǎo)致對(duì)CNTF反應(yīng)性的劑量-依賴性增加，這是高親和性CNTF受體復(fù)合物形成所致。IA-CNTF的生物活性示于圖2。s-CNTFR的濃度為亞飽和時(shí)，此變體在HepG2試驗(yàn)中作為完全的激動(dòng)劑起作用，其EC50值比CNTF的高5倍，這與其對(duì)CNTFR的親和性降低一致。實(shí)施例4在神經(jīng)元細(xì)胞中由膜結(jié)合的CNTFR介導(dǎo)的生物活性對(duì)IMR-32細(xì)胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的刺激測(cè)定CNTF和IA-CNTF在表達(dá)m-CNTFR的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32(Baumann等，1993；Halvorsen等，1996)中誘導(dǎo)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的能力。與HepG2細(xì)胞形成對(duì)照的是，如圖3所示，CNTF和IA-CNTF在此試驗(yàn)中效力相同。實(shí)施例5經(jīng)改造可表達(dá)膜結(jié)合的CNTFR的非神經(jīng)元細(xì)胞中的生物活性為了檢測(cè)膜結(jié)合的CNTFR是否足以賦予經(jīng)修飾的CNTF蛋白(盡管其對(duì)CNTFR的親和性降低)以高反應(yīng)性，用編碼全長(zhǎng)CNTFR的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。為此，通過(guò)由SH-SY5Y細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄-PCR得到編碼全長(zhǎng)人CNTFR(編碼氨基酸1-372的核苷酸264-1382(Davis等，1991))的人cDNA，并將此cDNA克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)的EcoRV位點(diǎn)，所述質(zhì)粒攜有新霉素抗性基因。DNA(20mg)作為磷酸鈣沉淀物被轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中(Graham和Vander Eb，1973)，在添加有1mg/ml G418的完全培養(yǎng)基(含有青霉素，鏈霉素和10％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基)中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇。以CNTF表面結(jié)合和CNTF-誘導(dǎo)的對(duì)觸珠蛋白產(chǎn)生的刺激為基礎(chǔ)鑒定穩(wěn)定表達(dá)CNTFR(HepG2/CNTFR)的亞克隆。在添加有0.2mg/ml G418的完全培養(yǎng)基中維持HepG2/CNTFR細(xì)胞。
通過(guò)缺乏s-CNTFR時(shí)，CNTF快速誘導(dǎo)STAT轉(zhuǎn)錄因子激活的能力進(jìn)一步證實(shí)HepG2/CNTFR細(xì)胞中功能性m-CNTFR的存在。與之形成對(duì)照的是，如圖4所示，HepG2細(xì)胞中由CNTF所致的STAT激活需要s-CNTFR的存在。電遷移率變動(dòng)分析將HEPG2和HEPG2/CNTFR細(xì)胞平鋪于100ml的培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后，當(dāng)生長(zhǎng)為半鋪滿時(shí)使用。將細(xì)胞血清饑餓4小時(shí)，然后用多種試劑處理15分鐘。再用含50mM NaF的磷酸鹽緩沖液的冰冷溶液洗滌細(xì)胞，離心收集細(xì)胞并將細(xì)胞冷凍于液氮中。按前述方法(Demartis等，1996)制備總的細(xì)胞提取物。使用10g細(xì)胞提取物，根據(jù)Sadowsky和Gilman(見(jiàn)Sadowsky和Gilman，1993)的電遷移率變動(dòng)分析測(cè)定激活的STAT因子與寡核苷酸SIE m67(Wagner等，1990)的高親和性結(jié)合。在[(-32P]dATP和[(-32P]dCTP(3000Ci/mmol)的存在下，用Klenow酶標(biāo)記寡核苷酸探針的5’末端。在含5％甘油的2.5％/0.5TBE(Tris-Borato 45mM，EDTA 0.5mM，pH7.8)中，在聚丙烯酰胺凝膠上分辨復(fù)合物，然后干燥并進(jìn)行放射自顯影。
在HeG2/CNTFR細(xì)胞中，CNTF和IA-CNTF刺激觸珠蛋白產(chǎn)生的效力相同(圖5)，這表明非神經(jīng)元細(xì)胞中CNTFR的膜錨著足以賦予類似于在神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞中觀察到的相對(duì)生物活性分布。以前顯示出具有增強(qiáng)的神經(jīng)元受體選擇性的人CNTF變體AKDH-CNTF(意大利專利申請(qǐng)RM96A000492)(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His/人CNTF)在表達(dá)CNTFR的肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中也非常有效。這些結(jié)果表明此試驗(yàn)可用于鑒定對(duì)膜結(jié)合的CNTFR選擇性增強(qiáng)的CNTF變體。參考文獻(xiàn)(1)Manthorpe，M.，Louis，J.C.，Hagg，T.，e Varon，S.(1993)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophic factors)(Loughlin，S.E.e Fallon，J.H.，eds)p.443-473，科學(xué)報(bào)道(Academic Press)，San Diego，CA(2)Ip，N.Y.e Yancopoulos，G.D.(1996)神經(jīng)科學(xué)年評(píng)(Annu.Rev.Neurosci.)19，491-515(3)Hughes，S.M.Lillien，L.E.，Raff，M.C.，Rohrer，H.，eSendtner，M.(1988)自然(Nature)335，70-73(4)Louis，J.-C.，Magal，E.，Takayama，S.，e Varon，S.(1993)科學(xué)(Science)259，689-692(5)Schooltink，H.，Stoyan，T.，Roeb，E.，Heinrich，P.C.，eRose-John，S.(1992)FEBS快訊(FEBS Lett.)314，280-284(6)Helgren，M.E.，Squinto，S.P.，Davis，H.L.，Parry，D.J.，Boulton，T.G.，Heck，C.S.，Zhu，Y.，Yancopoulos，G.D.，Lindsay，R.M.，e Distefano，P.S.(1994)細(xì)胞(Cell)76，493-504(7)Conover，J.C.，Ip，N.Y.，Poueymirou，W.T.，Bates，B.，Goldfarb，M.P.，DeChiara，T.M.，e Yancopoulos，G.D.(1993)發(fā)展(Development)119，559-565(8)Gimble，J.M.，Wanker，F(xiàn).，Wang，C.-S.，Bass，H.，Wu，X.，Kelly，K.，Yancopoulos，G.D.，e Hill，M.R.(1994)細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)54，122-133(9)Zhang，X.-G.，Gu，J.-J.，Lu，Z.-Y.，Yasukawa，K.，Yancopoulos，G.D.，Turner，K.，Shoyab，M.，Taga，T.，Kishimoto，T.，Bataille，R.，e Klein，B.(1994)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)177，1337-1342(10)Dittrich，F(xiàn).，Thoenen，H.，e Sendtner，M.(1994)神經(jīng)學(xué)年鑒(Ann.Neurol.)35，151-163(11)Davis，S.，Aldrich，T.H.，Valenzuela，D.M.，Wong，V.，F(xiàn)urth，M.E.，Squinto，S.P.，e Yancopoulos，G.D.(1991)科學(xué)(Science)253，59-63(12)Ip，N.Y.，McClain，J.，Barrezueta，N.X.，Aldrich，T.H.，Pan，L.，Li，Y.，Wiegand，S.J.，F(xiàn)riedman，B.，Davis，S.，eYancopoulos，G.D.(1993)神經(jīng)元(Neuron)10，89-102(13)Davis，S.，Aldrich，T.H.，Ip，N.Y.，Stahl，N.，Scherer，S.，F(xiàn)arruggella，T.，DiStefano，P.S.，Curtis，R.，Panayotatos，N.，gascan，H.，Chevalier，S.，e Yancopoulos，G.D.(1993)科學(xué)(Science)259，1736-1739.(14)Baumann，G.，Lowman，H.B.，Mercado，M.，e Wells，J.A.(1994)臨床內(nèi)分泌代謝雜志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)78，1113-1118(15)Horton，R.M.e Pease，L.R.(1991)in定向誘變操作方法(Directed mutagenesisa practical approach，)(編者M(jìn)cPherson，M.J.)牛津大學(xué)出版社(Oxford，pp.217-247)(16)Saggio，I.，Paonessa，G.，Gloaguen，I.，Graziani，R.，DiSerio，A.，e Laufer，R.(1994)分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)221，387-391(17)Saggio，I.，Gloaguen，I.，Poiana，G.，e Laufer，R.(1995)EMBO雜志(EMBO J.)14，3045-3054(18)Di Marco，A.，Gloaguen，I.，Graziani，R.，Paonessa，G.，Saggio，I.，Hudson，K.R.，e Laufer，R.(1996)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院科研進(jìn)展(Proc.Nat1.Acad.Sci.，USA)93，9247-9252(19)Baumann，H.，Ziegler，S.F.，Mosley，B.，Morella，K.K.，Pajovic，S.，e Gearing，D.F.(1993)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)268，8414-8417(20)Halvorsen，S.W.，Malek，R.，Wang，X.，e Jiang，N.(1996)神經(jīng)藥理學(xué)(Neuropharmacology)35，257-265(21)Graham，F(xiàn).L.and Van der Eb，A.J.(1973)病毒學(xué)(Virology)52，456-461(22)Demartis，A.，Bernassola，F(xiàn).，Savino，R.，Melino，G.，eCiliberto，G.(1996)癌癥研究(Cancer Res.)56，4213-4218(23)Wagner，B.J.，Hayes，T.E.，Hoban，C.J.，e Cochran，B.H.(1990)EMBO雜志(EMBO J)9，4477-4484(24)Sadowski，H.B.e Gilman，M.Z.(1993)自然(Nature)362，79-83(25)Gearing，D.P.(1993)免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.Immunol.)53，31-58序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.(ii)發(fā)明題目受體選擇性增強(qiáng)的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變體及其選擇方法(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)收件人Societa’Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra，39(C)城市羅馬(D)國(guó)家意大利(E)郵政編碼I-00186(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤3.5”1.44MBYTES(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS Rev.5.0(D)軟件Microsoft Word 6.0(viii)代理人/代理資料(A)姓名DI CERBO Mario(Dr.)(B)登記號(hào)RM/X89001/PC-DC(ix)通訊資料(A)電話06/6785941(B)傳真06/6794692(C)電報(bào)612287 ROPAT(1)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度200個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱人CNTF(D)其它資料人CNTF的序列(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu1 5 10 15Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr20 25 30Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile35 40 45Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp50 55 60Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr65 70 75 80Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val85 90 95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu100 105 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile115 120 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145 150 155 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu165 170 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His180 185 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195 200(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度200個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱(Thr169Ile/His174Ala)人CNTF；IA-CNTF(D)其它資料人CNTF的序列(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu1 5 10 15Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr20 25 30Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile35 40 45Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp50 55 60Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr65 70 75 80Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val85 90 95His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu100 105 110Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile115 120 125Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile130 135 140Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys145 150 155 160Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Ile Val Arg Ser Ile Ala Asp Leu165 170 175Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His180 185 190Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met195 200
權(quán)利要求
1.睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)的變體，其特征在于其中第169位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代，第174位的組氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，這些變體對(duì)膜受體的選擇性增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1所述的變體，其中CNTF是人CNTF，其特征在于其中第169位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代，第174位的組氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，這些變體對(duì)受體的選擇性增強(qiáng)。
3.藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述的CNTF變體和藥物可接受的載體。
4.在通過(guò)膜結(jié)合的CNTF受體或可溶性的CNTF受體誘導(dǎo)生物反應(yīng)的過(guò)程中評(píng)估CNTF變體對(duì)膜結(jié)合受體增強(qiáng)的選擇性的方法。
5.CNTF變體，其特征在于是通過(guò)權(quán)利要求4的方法選擇的。
6.編碼權(quán)利要求1或2所述的CNTF變體的分離的和純化的DNA分子。
7.含有權(quán)利要求6所述DNA的DNA重組分子，所述DNA與在所述重組DNA中控制表達(dá)的序列功能性結(jié)合。
8.被權(quán)利要求7所述的重組DNA轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主。
9.權(quán)利要求8所述的單細(xì)胞宿主，該宿主選自細(xì)菌，酵母，真菌和動(dòng)物和植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1，2或5所述的變體用于制備治療神經(jīng)疾病或障礙之藥物的用途。
11.權(quán)利要求1，2或5所述的變體與其它蛋白質(zhì)或其它分子的綴合物。
12.權(quán)利要求11所述的權(quán)利要求1，2或5所述的變體的綴合物，它是與針對(duì)允許變體穿過(guò)血腦屏障的轉(zhuǎn)移受體之抗體的綴合物。
13.權(quán)利要求11所述的權(quán)利要求1，2或5所述的變體的綴合物，它是與降低所述變體之免疫原性的聚乙二醇的綴合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的是受體選擇性增強(qiáng)的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變體(CNTF),該變體可用于治療包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和肌肉退化性疾病的疾病和障礙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定上述CNTF變體的方法。相對(duì)于人CNTF而言,本發(fā)明具有氨基酸取代的hCNTF變體經(jīng)可溶性CNTFR引發(fā)生物作用的能力降低,而不會(huì)影響其激活膜結(jié)合神經(jīng)元CNTF受體的能力,從而改善了它的治療特性。圖1顯示了本發(fā)明的CNTF受體(IA－CNTF;SEQ ID NO:2)對(duì)CNTFR的結(jié)合親和性降低。顯然,與野生型人CNTF分子相比,該變體對(duì)CNTFR的結(jié)合親和性降低。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1251132SQ98803484
公開(kāi)日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月20日
發(fā)明者I·戈勞古恩, A·狄馬科, A·德馬提斯, R·勞夫, I·薩吉奧 申請(qǐng)人:布·安格萊荻公司分子生物學(xué)研究所