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一種偏甘油酯脂肪酶突變體、質(zhì)粒、重組菌株及制備方法和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):520425閱讀:351來(lái)源:國(guó)知局
一種偏甘油酯脂肪酶突變體、質(zhì)粒、重組菌株及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種偏甘油酯脂肪酶突變體、質(zhì)粒、重組菌株及制備方法和應(yīng)用,該突變體是對(duì)馬拉色霉菌(Malassezia?globosa)偏甘油酯脂肪酶進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得的酶突變體,其中突變位點(diǎn)為278位的Phe;所述Phe突變?yōu)锳rg。本發(fā)明所得的偏甘油酯脂肪酶突變體Phe278Arg對(duì)甘油單酯水解活性提高,更適合工業(yè)生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。經(jīng)改造后的SMG1Phe278Arg突變體對(duì)偏甘油酯有更好的選擇性,對(duì)甘油單酯選擇性因子的值為83.49,明顯高于野生型的偏甘油酯脂肪酶SMG1-WT選擇性因子的49.41,獲得與原始酶基因的不同的底物選擇特性,水解處理混合偏甘油酯可獲得純度大于98%的甘油二酯產(chǎn)物。
【專利說(shuō)明】一種偏甘油酯脂肪酶突變體、質(zhì)粒、重組菌株及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種甘油單酯水解活性提高的偏甘油酯脂肪酶突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰基甘油?;饷?,能夠催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一種只水解甘油單酯和甘油二酯,而不水解甘油三酯的脂肪酶。脂肪酶參與的催化反應(yīng)類型廣泛,包括催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng),廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、油脂加工、食品行業(yè)、生物醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域。
[0003]甘油二酯(簡(jiǎn)稱DAG)是由丙三醇(甘油)與兩個(gè)脂肪酸酯化后得到的產(chǎn)物,具有明確的防止肥胖、降血脂等功能且食用安全,作為普通食用油的換代產(chǎn)品。脂肪酶可以在溫和的條件下催化油脂改性制備甘油二酯,但現(xiàn)有的酶法合成甘油二酯合成工藝中一般含有甘油三酯和單甘油酯(MAG),由于甘油三酯與甘油二酯難以有效分離,使得產(chǎn)品中DAG的純度較低,專利02827094.0公開(kāi)了一種利用利用偏甘油酯脂肪酶通過(guò)酯化方法合成高純度甘油二酯的方法,但其反應(yīng)的副產(chǎn)物含有甘油單酯。雖然可以通過(guò)分子蒸餾等工藝將反應(yīng)混合物中的MAG和未反應(yīng)的?;w分離除去,但處理過(guò)程中高的蒸發(fā)溫度,一方面導(dǎo)致能耗提高,同時(shí)使影響油脂的產(chǎn)品的品質(zhì)。利用特異性的甘油單酯脂肪酶用于降解油脂產(chǎn)品中的MAG可以在溫和的條件下獲得高純度的DAG,但是至今特異性甘油單酯脂肪酶酶制劑仍然缺乏。
[0004]蛋白質(zhì)工程是一種能夠改善酶蛋白質(zhì)特性的可行的方法,借助分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法對(duì)蛋白進(jìn)行定向突變和理性改造,而獲得底物選擇性改變的酶突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種選擇性水解甘油單酯水解的SMGl脂肪酶突變體,可應(yīng)用于制備高純度的甘油二酯。通過(guò)理性選擇突變位點(diǎn),是由馬拉色霉菌屬 (Malassezia globosa)SMGl 脂肪酶基因(genbank 登錄號(hào) XM_001732152.1 ),通過(guò)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)(PDB:3UUE)的分析,運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法而獲得的脂肪酶突變體。進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得酶突變體,親本SMGl-WT的氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置發(fā)生突變,采用 “原始氨基`酸-位置-替換的氨基酸”來(lái)表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸,所述脂肪酶突變體為:Phe278Arg。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下:
[0007]—種偏甘油酯脂肪酶突變體,該突變體是對(duì)馬拉色霉菌(Malassezia globosa)偏甘油酯脂肪酶進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得的酶突變體,其中突變位點(diǎn)為278位的Phe ;所述Phe突變?yōu)?Arg0
[0008]所述突變體的DNA序列為SEQ N0.2。[0009]所述突變體的氨基酸序列為SEQ N0.3。
[0010]所述偏甘油酯脂肪酶突變體在制備高純度甘油二酯中的應(yīng)用,首先,利用上述突變體制備突變質(zhì)粒,再制備重組菌株,最后利用重組菌株表達(dá)制備偏甘油酯脂肪酶突變體,并將偏甘油酯脂肪酶突變體用于制備高純度甘油二酯。
[0011]所述利用上述突變體制備突變質(zhì)粒的方法,包括如下步驟:
[0012](I)利用重疊延伸PCR方法引入目的突變氨基酸位點(diǎn),先分段擴(kuò)增含有突變氨基酸位點(diǎn)的上下游基因片段,然后將帶有突變位點(diǎn)的基因片段拼接成含有突變位點(diǎn)全長(zhǎng)基因片段;
[0013](2)將上述擴(kuò)增基因PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化后,限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sal I分別對(duì)純化的基因片段和質(zhì)粒PGAPZaA進(jìn)行雙酶切消化,連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞,得到含有偏甘油酯脂肪酶突變體基因質(zhì)粒。
[0014]所述PCR的引物序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種偏甘油酯脂肪酶突變體,其特征在于,該突變體是對(duì)馬拉色霉菌(Malasseziaglobosa)偏甘油酯脂肪酶進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得的酶突變體,其中突變位點(diǎn)為278位的Phe ;所述Phe突變?yōu)锳rg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體,其特征在于,所述突變體的DNA序列為SEQN0.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體,其特征在于,所述突變體的氨基酸序列為SEQN0.3。
4.一種利用權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)突變體制得的質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求4所述質(zhì)粒的制備方法,其特征在于,包括如下步驟: (1)利用重疊延伸PCR方法引入目的突變氨基酸位點(diǎn),先分段擴(kuò)增含有突變氨基酸位點(diǎn)的上下游基因片段,然后將帶有突變位點(diǎn)的基因片段拼接成含有突變位點(diǎn)全長(zhǎng)基因片段; (2)將上述擴(kuò)增基因PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化后,限制性內(nèi)切酶KpnI和Sal I分別對(duì)純化的基因片段和質(zhì)粒PGAPZaA進(jìn)行雙酶切消化,連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞,得到含有偏甘油酯脂肪酶突變體基因質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,所述PCR的引物序列如下:
7.—種重組菌株的制備方法,其特征在于,包括如下步驟: (1)將權(quán)利要求4的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnI線性化后,電轉(zhuǎn)至宿主細(xì)胞; (2)將轉(zhuǎn)化液涂布于含有100mg/ml博萊霉素的YPD平板中,30°C培養(yǎng)3天后,平板上長(zhǎng)出酵母單菌落為重組菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于,所述宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母X-33。
9.權(quán)利要求7或8所述方法制備的重組菌株。
10.權(quán)利要求1或2或3所述偏甘油酯脂肪酶突變體在制備高純度甘油二酯中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103525784SQ201310461452
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】藍(lán)東明, 王永華, 劉璐, 王衛(wèi)飛, 楊博 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)
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