專利名稱：一種丙酸桿菌屬菌株質(zhì)粒純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒的純化方法，特別是一種丙酸桿菌屬菌株質(zhì)粒的純化方法。
背景技術(shù)：
丙酸桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，厭氧耐氧，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性的桿狀細(xì)菌，并且細(xì)胞壁較普通的革蘭氏陽(yáng)性菌成分更加復(fù)雜，結(jié)合更加緊密。丙酸桿菌是一類重要的工業(yè)用微生物，已經(jīng)廣泛用于生產(chǎn)微生物B12、四吡咯化合物和丙酸，并且也應(yīng)用于面包、奶酪、藥劑的制作產(chǎn)業(yè)中。特別是丙酸，作為一種初級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于纖維素膜、 除草劑、香水中。丙酸同時(shí)也是一種抑菌劑，可用于食品和糧食的保藏。典型的丙酸桿菌是一類非致病菌，是一類很具有吸引力的異源基因表達(dá)的宿主。 雖然很多研究嘗試對(duì)丙酸桿菌進(jìn)行突變，但是對(duì)于丙酸桿菌的基因工程操作才剛剛起步。 丙酸桿菌基因工程操作的發(fā)展，將使異源基因和細(xì)菌素大量表達(dá)而用于食品工業(yè)?；蚩寺⒔o丙酸桿菌的基因研究和維生素B12、四吡咯化合物、嚇啉化合物的生產(chǎn)帶來(lái)便利。丙酸桿菌缺乏基因工程研究的原因主要有高GC含量，缺乏質(zhì)粒信息，缺乏合適的可用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體，丙酸桿菌存在的強(qiáng)限制性修飾作用和缺乏合適的抗性標(biāo)記。丙酸的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，其主要原因是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)成本較高， 目前還無(wú)法和化學(xué)合成法競(jìng)爭(zhēng)。要實(shí)現(xiàn)丙酸的發(fā)酵法生產(chǎn)以完全替代化學(xué)合成法，就必須大幅提高有機(jī)酸發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和底物轉(zhuǎn)化率，這就要追根于菌體利用代謝途徑生產(chǎn)有機(jī)酸的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。丙酸生產(chǎn)代謝途徑中關(guān)鍵酶酶活力的限制、能荷水平的限制和分支代謝途徑的代謝流分流作用是普遍存在的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。在丙酸代謝中，隨著代謝的進(jìn)行，丙酸代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶限制了由底物轉(zhuǎn)化為丙酸的速度，以及丙酸相關(guān)的代謝部分流向分支代謝途徑，最終導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度較低，生產(chǎn)成本較高。如在丙酸代謝過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源甘油濃度超過(guò)40g/L時(shí)，產(chǎn)酸丙酸桿菌合成丙酸的能力無(wú)法繼續(xù)升高，反而降低，表現(xiàn)為高濃度碳源對(duì)丙酸桿菌生長(zhǎng)有抑制作用；分支代謝途徑的存在導(dǎo)致由碳源流向丙酸的代謝通量降低，產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)量達(dá)2. 56g/L。雖然通過(guò)分批補(bǔ)料控制甘油的濃度使丙酸產(chǎn)量上升，但明顯使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加，染菌機(jī)率增加，且無(wú)法有效降低分支代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。因此，如何有效地提高代謝途徑關(guān)鍵酶的酶活力、提高細(xì)胞的能量生成速率和切斷分支代謝途徑是提高有機(jī)酸生產(chǎn)效率的重要科學(xué)問(wèn)題之一。這就必須牽涉到丙酸桿菌的基因改造問(wèn)題上，而丙酸桿菌的基因改造的前提就是能找到一個(gè)合適的篩選方法，能夠從丙酸桿菌內(nèi)篩選到內(nèi)源性質(zhì)粒進(jìn)行分析改造，從而利用改造的載體系統(tǒng)，對(duì)丙酸桿菌進(jìn)行合適的基因操作。丙酸桿菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌，本身細(xì)胞壁成分較普通的革蘭氏陽(yáng)性菌更加復(fù)雜和緊密，因此普通破壁條件無(wú)法順利破除細(xì)胞壁。J. L. Johnson和C. S. Cummins研究了丙酸桿菌屬菌株細(xì)胞壁成分間的差異，證明丙酸桿菌屬的菌株確實(shí)存在較為復(fù)雜的細(xì)胞壁。其后鮮有報(bào)道丙酸桿菌的研究，P. Kiatpapan和Y. Murooka報(bào)道了一株適用于丙酸桿菌屬菌株的載體的構(gòu)建，但是并未提及具體的質(zhì)粒的篩選提取以及純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種專門針對(duì)于丙酸桿菌屬菌株的質(zhì)粒篩選純化方法。優(yōu)化了前處理酶的種類和處理時(shí)間，提高了提取效率?？疾炝藘鋈趯?duì)質(zhì)粒純化的影響，進(jìn)一步優(yōu)化了質(zhì)粒純化的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為取一定體積的培養(yǎng)菌液離心處理后經(jīng)SET洗脫液洗滌、溶液I、溶液II、堿裂解液III，其中在溶液I處理后添加一定當(dāng)量的溶菌酶、變?nèi)芫亍⒌鞍酌窴提高處理效果，堿裂解液III處理后，通過(guò)常規(guī)的純化步驟，獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒。其中，SET洗脫液最佳用量為1/20菌液體積；溶液I最佳用量為1/20菌液體積；蛋白酶K用量為2倍菌液體積；溶液II最佳用量為1/10菌液體積；堿裂解液III用量為1/13倍菌液體積；異丙醇的最佳用量3/20倍菌液體積。本發(fā)明優(yōu)化了前處理用酶的種類和處理時(shí)間以及考察了凍融條件對(duì)質(zhì)粒純化的影響，大大提高了提取效率，本發(fā)明利用優(yōu)化的前處理步驟，與常規(guī)方法相比大大提高了質(zhì)粒的純度、濃度和穩(wěn)定性。


圖1凍融不同條件對(duì)質(zhì)粒純化的影響；圖2質(zhì)粒純化后核酸電泳圖譜；圖3質(zhì)粒純化后核酸電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1(1)接種6瓶培養(yǎng)基，每瓶200mL 30°C靜置培養(yǎng)35h，分別于4°C、IOOOOg離心 3min，去上清，得六管菌體沉淀，分別編號(hào)為1-6。(2)用IOmL SET洗脫液分別洗滌六管菌體，于4°C、IOOOOg條件下離心3min，去上
清，沉淀干燥得濕重。(3)分別加入IOmL溶液I徹底懸浮。(4)分別加入ImL溶菌酶溶液，37°C水浴，1號(hào)水浴Omin，2號(hào)水浴30min，3號(hào)水浴 Omin, 4號(hào)水浴30min，5號(hào)水浴30min，6號(hào)水浴60min。(5)分別加入400mL蛋白酶K溶液，56°C水浴，1號(hào)水浴Omin，2號(hào)水浴Omin，3號(hào)水浴30min，4號(hào)水浴30min，5號(hào)水浴60min，6號(hào)水浴30min ；(6)分別加20mL新配制的溶液II，輕輕顛倒5_6次，置于冰上。(7)分別加15mL冰預(yù)冷的堿裂解液III，反復(fù)顛倒數(shù)次，檢測(cè)細(xì)胞壁是否完全破裂 (表 1)。表1溶菌酶和蛋白酶K最佳處理時(shí)間篩選
權(quán)利要求
1.一種丙酸桿菌屬菌株質(zhì)粒提取的改良方法，其特征在于主要包括如下步驟(1)取一定體積的培養(yǎng)菌液，4°c、IOOOOg離心:3min，去上清，得菌體沉淀；(2)用步驟(1)中菌液體積1/30-1/10的SET洗脫液洗滌，于4°C、IOOOOg條件下離心 3min,去上清，沉淀干燥得濕重，快速凍融一次；所述SET洗脫液含0. lmol/L NaCl, IOmmol/ L Tris-Cl(pH8. 0),lmmol/L EDTA(pH8. 0)；(3)加入步驟(1)中菌液體積1/30-1/10的溶液I徹底懸浮；所述溶液I含50mmol/L 葡萄糖，20g/mL Rnase A,25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), lOmmol/LEDTA (pH8. 0)；(4)加入1/10溶菌酶溶液和1/10變?nèi)芫厝芤海?7°C水浴30min；所述溶菌酶溶液為 200mg/mL 溶菌酶溶于 Tris-Cl (pH7. 4)，變?nèi)芫厝芤簽?1000U/mL 溶于 Tris-Cl (pH7. 4)；(5)加入步驟(1)中菌液1-3體積的蛋白酶K溶液，56°C水浴30min，期間每個(gè)8-lOmin 混勻一次；所述蛋白酶K溶液為50mg/mL蛋白酶K溶于Tris-Cl (pH7. 5)；(6)加入步驟(1)中菌液體積1/20-1/5的新配制的溶液II，輕輕顛倒5-6次；所述溶液 II 為 0. 2N NaOH,1 % (m/V)SDS ；(7)加入步驟(1)中菌液體積1/20-1/10的冰預(yù)冷的堿裂解液III，反復(fù)顛倒數(shù)次，然后置于冰上3-5min，于4°C、IOOOOg條件下離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中；所述堿裂解液 III 為 5mol/L 乙酸鈉 60mL，冰乙酸 11. 5mL, H2O 28. 5mL ；(8)加入與步驟7制的的液體等體積的酚氯仿(1 1V/V)，劇烈振蕩，于4°C、IOOOOg 條件下離心anin，轉(zhuǎn)移上層水相到另一離心管中；(9)加入步驟(1)中菌液體積1/20-1/5的異丙醇劇烈振蕩，室溫放置aiiin，于室溫 IOOOOg條件下離心5min，吸除上清；(10)加ImL70%乙醇，顛倒數(shù)次，于室溫IOOOOg條件下離心aiiin，除去上清；(11)用ImLTE(pH8. 0)溶解沉淀，溫和震蕩數(shù)次，貯存于_20°C ；所述TE為lOOmmol/L Tris-Cl(pH8. 0)，10mmol/L EDTA(pH8. 0)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟( 中SET洗脫液最佳用量為1/20菌液體積。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中溶液I最佳用量為1/20菌液體積。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中溶菌酶和變?nèi)芫赜昧糠謩e為1/10 倍菌液體積。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟中溶菌酶和變?nèi)芫氐奶幚頃r(shí)間為 30mino
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中蛋白酶K用量為2倍菌液體積。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征步在于步驟(5)中蛋白酶K的處理時(shí)間為30min。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(6)中溶液II最佳用量為1/10菌液體積。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(7)中堿裂解液III用量為1/13倍菌液體積。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(9)中異丙醇的最佳用量3/20倍菌液體積。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)于丙酸桿菌屬菌株質(zhì)粒純化的方法，通過(guò)對(duì)菌體前處理以及后續(xù)處理，能夠從丙酸桿菌屬菌株中得到高純度的質(zhì)粒，與常規(guī)方法相比大大提高了質(zhì)粒的濃度和純度。本發(fā)明對(duì)于丙酸桿菌屬的分子操作方面的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并且對(duì)于其他革蘭氏陽(yáng)性菌(如乳酸菌屬)可能具有普遍的適用意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102321617SQ201110283128
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者劉龍, 堵國(guó)成, 諸葛鑫, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)