專利名稱：無細胞睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子/受體復合物的制作方法
本申請系于1991年12月2日申請、序號為07/801，562的美國專利申請的部分繼續(xù)申請。
1.前言本發(fā)明提供一種基本純化的無細胞CNTF/受體復合物，及相關的雜交型或突變型蛋白或肽，這些蛋白或肽在本發(fā)明的其它實施方案中，可用來促進或拮抗細胞增殖及/或分化，而且可以用于診斷及/或治療細胞增殖及/或分化所致疾病的方法中。本發(fā)明還保證能使這些復合物與由IL-6、LIF及CNTF信號轉(zhuǎn)導途徑共有的受體成分之間能相互作用。
2.發(fā)明背景2.1.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)，如其名所喻，是一種胚雞睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在體外存活特需的蛋白[Manthorpe等，J.Neurochem.3469-75(1980)]。正如Sendtner等于1990年9月14日申請的國際申請PCT/U.S.90/05241中所述.CNTF已在真核細胞表達系及細菌表達系中加以克隆和合成，上述國際申請，全文在此一并資作參考。
近十余年來，除了CNTF支持睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活的能力之外，人們還一直將許多生物效應也歸因于它。人們認為，CNTF誘發(fā)了產(chǎn)期大鼠視神經(jīng)和腦中雙性潛勢神經(jīng)膠質(zhì)遠祖細胞的分化[Hughes等，Nature 33570-73(1988)]。另外，人們還觀察到，它能促進胚雞脊神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元的存活[Skaper及Varon，Brain Res.38939-46(1986)]。
人們還發(fā)現(xiàn)CNTF的一些新效能，其中包括其維持運動神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元的生存和分化，并提高海馬星形細胞增殖的能力(國際申請PCT/US 90/05241，同上)。
2.2.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體如在此全文一并資作參考的美國專利申請(申請?zhí)枮?7/700，677;名稱為“睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體”，由Davis等于1991年5月15日申請)和國際申請(PCT/US 91/03896，1991年6月3日遞交)中所述，CNTF受體(CNTFR或CNTFRα)已于真核細胞中克隆、表達過。
CNTFR的序列揭示，與大多數(shù)包含胞外結(jié)構(gòu)域、疏水性橫跨膜結(jié)構(gòu)域及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的受體不一樣，CNTFR似乎并不具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。此外，橫跨膜疏水結(jié)構(gòu)域還經(jīng)蛋白水解處理，使成熟態(tài)CNFR通過非常規(guī)鍵固著在細胞表面上，該非常規(guī)鍵稱為糖磷脂酰肌醇(GPI)鍵(Id.)。連有GPI的蛋白，例如CNTFR可由于GPI固著被酶，即對磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C切斷而從細胞表面釋出。在已知的受體序列中，CNTFR涉及許多受體，在此謂之CNTF/IL-6/LIF受體族，其中包括IL-6、LIF、G-CSF及制瘤素M(OSM)[Bazan，Neuron 7197-208(1991);Rose及Bruse，Proc.Natl.Acad.Sci.888641-8645，(1991)]，但似乎與IL-6受體序列最為密切相關。然而，IL-6從來未顯示出是連有GPI的蛋白[例如，Taga等，Cell 58573-581(1989);Hibi等，Cell 631149-1157(1989)]。
LIF、G-CSF及OSM都是一些有廣泛效能的因子，盡管它們有著獨特的一些生長調(diào)節(jié)活性，但它們在造血過程及其它過程中，必竟都同IL-6一起起著一些共同的作用。例如，它們都能抑制增殖并誘發(fā)鼠骨髓白血病細胞系M1的分化[Rose及Bruce，Proc.Natl.Acad.Sci.888641-8645，(1991)]。使用相關的受體體系，可為這些造血細胞素的相似生物學作用提供基礎-G-CSF、IL-6、OSM及LIF都具有結(jié)構(gòu)上與gp130同系的受體成分[Fukunaga等，EMBO J.102855-2865(1991);Gearing等，EMBO J.102839-2848(1991);Gearing等，Science2551434(1992)]。此外，近來的研究工作表明，LIF能誘發(fā)類似IL-6的酪氨酸磷酸化作用及基因激活作用[Lord等，Mol.Cell.Biol.114371-4379(1991)]。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、坐骨神經(jīng)、腎上腺組織中，以及在肌肉中，人們都已觀察到CNTFR mRNA表達。這表明，CNTFR不僅具有神經(jīng)營養(yǎng)性活性，而且還具有包括肌營養(yǎng)性活性在內(nèi)的其它活性，這就可以解釋某些臨床綜合征中既牽涉中樞神經(jīng)系統(tǒng)又牽涉肌肉的復雜情況。
可以有理由推斷，CNTF的活性譜主要限于表達CNTFR的細胞。由于已證明CNTF能產(chǎn)生促進存活的效果和細胞分化的效果，如果這樣的活性可擴大到不表達CNTF受體的靶細胞，則是有益的。
鑒別出與CNTF共有受體成分的造血因子，就有可能利用CNTF及其激活通常應答這類造血因子的靶細胞特異受體成分。
3.發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種無細胞CNTF/受體復合物。它部分地以下述發(fā)現(xiàn)為基礎即無細胞CNTF/受體復合物對較表達CNTF受體的細胞類型更廣的細胞類型譜具有生物活性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述CNTF/受體在表達屬于CNTF/IL-6/LIF受體族的受體的細胞類型中，起著分化因子的作用。
本發(fā)明還以CNTF和無細胞CNTFR在正常生理緩沖條件下形成穩(wěn)定的生物活性CNTF/受體復合物的能力為基礎。在本發(fā)明的一個具體的非限定性實施方案中，將等摩爾量(即80mM)的CNTF和CNTFR重組體在正常生理緩沖條件下(100mM Tris-Hcl，50mM NaCl，pH8.0)混合，形成穩(wěn)定的生物活性CNTF/受體復合物。這種CNTF/受體復合物可用凝膠過濾法提純，并用于下文所述的測定中。
本發(fā)明還提供雜交或突變型的、與CNTF/受體復合物相關的、起細胞分化因子激動劑或拮抗劑作用的蛋白。例如，在一個具體實施方案中，雜交型或突變型CNTFR也許不能結(jié)合CNTF，但能轉(zhuǎn)導信號。這種雜交體或突變體，可用來促進或增強能應答CNTF/受體復合物的細胞分化、增殖、生長或存活，所述細胞包括那些不受CNTF含量制約地表達CNTF/IL-6/LIF受體族中成員受體的細胞在內(nèi)。在另一個非限定性的實施方案中，一種突變型受體可顯示出對CNTF結(jié)合的親合力有所提高，但不能有效地誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導。這樣的突變體在結(jié)合到CNTF上并中和CNTF，而不引起對細胞分化的副作用方面，是有用的。
本發(fā)明還提供體外或活體內(nèi)的診斷方法，以及用于檢測靶細胞對使用CNTF/受體的特殊療法的敏感性測定方法。
本發(fā)明還提供了一種治療方法，該方法不僅治療與CNTF相關的疾病，而且還治療與任何應答無細胞CNTF受體復合物或相關化合物的靶細胞相關的分化和/或增殖所致的疾病。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生基本純化的生物活性CNTFR或細菌中相關分子的方法。
本發(fā)明還以這樣一個發(fā)現(xiàn)為基礎，即CNTF和LIF通過IL-6轉(zhuǎn)導受體成分gp130及象gp130那樣的第二受體成分(稱為LIFβ)，在這二種受體一起結(jié)合到CNTF和CNTFR上時，用與IL-6相比的信號途徑一起啟動信號轉(zhuǎn)導而作用于神經(jīng)細胞?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明為利用CNTF和CNTFR在通常應答LIF或IL-6的細胞中誘發(fā)應答(估計因為LIF或IL-6表達gp130和LIFRβ之故)提供了保證。
本發(fā)明還提供以CNTFR(CNTFRα)結(jié)合靶細胞使CNTF可在此類細胞中用來有選擇地啟動信號轉(zhuǎn)導的方法。
本發(fā)明還提供以CNTF取代LIF來防止被培養(yǎng)胚干細胞分化的用途。
4.


圖1.人CNTF的核酸序列(SEQ ID NO1)及推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2.編碼CNTFR的CDNA核酸序列(SEQ ID NO3)及推導的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖3.pRPN 151結(jié)構(gòu)中所用PCR引物的DNA序列。小寫字母表示一些位置，在這些位置上為使表達最優(yōu)化，改變了DNA的序列，而使蛋白序列不改變。意義(SDQ ID NO5)，反義(SEQ ID NO6)。
圖4.pRPN 151的物理限制圖譜。其中示出以堿基對(bp)為單位計的質(zhì)粒長度。一些獨特限制位點的位置，以及huCNTRF1的物理位置(散點帶所示)和β-lactamase(實黑帶所示)基因。
圖5.通過凝膠過濾分離活性受體。(A)S100-HR柱的洗脫圖，用280nm處的吸光度測得。核酸對主峰吸光度的影響約為50%，而對較小的峰只有低于10%的影響。(B)在餾份9-14(每段20μl)和16-21(每段200μl)中的蛋白洗脫物用SDS-PAGE分析?？偟氖┯谥?E段)上的蛋白提取物與尺寸標記14、21、31、45、66及90KD(M段)也一起示出。R-表示在40KD處的受體帶的位置。
圖6.用天然PAGA形成受體配位復合物。恒定量的(1μg)受體與給定量(以μg計)鼠CMTF混合，然后用天然PAGE分析。與CNTFR、CNTF及CNTF/受體復合物相應的帶的位置均被標出。
圖7.用CNTF、LIF及FGF治療后的MAH細胞生長。A.將MAH細胞以250K/35mm皿的密度置于皿中，用CNTF(10ng/ml)或LIF(1ng/ml)在培養(yǎng)物中處理4天。在培養(yǎng)期結(jié)束時，點算明相細胞的數(shù)目。B.將MAH細胞以6K/6mm凹孔的密度置于平板上，用CNTF(10ng/ml)，或LIF(1ng/ml)處理1-4天，然后用MTT染料測定活細胞數(shù)目。C.將不同濃度的CNTF、LIF及FGF加于MAH細胞。在3H一胸苷滲入測定前，對于CNTF和LIF，培養(yǎng)期持續(xù)4天，對于FGF則是3天。對于CNTF和LIF，涂抹密度為6K/6mm凹孔，對于FGF則為40K/16mm凹孔。
圖8.CNTF對神經(jīng)元分化的影響。A.用CNTF(10ng/ml)、LIF(1ng/ml)或FGF(10ng/ml)處理MAH細胞48小時，接著測量CAT活性。B.用CNTF(10ng/ml)將MAH細胞處理24小時。制備總RNA，并用CNTFR探針及GAPDH探針對其進行Northern分析。CNTFR和GAPDH的轉(zhuǎn)錄尺寸為2kb。
圖9.應答CNTF、LIF及FGF時蛋白的劑量依賴性酪氨酸磷酸化。在用各種濃度(0.1-100ng/ml)的CNTF、LIF或FGF處理5分鐘后，用MAH細胞(A)或EW-1細胞(B)制備細胞溶解總產(chǎn)物。按實驗步驟中所述，用抗磷酸酪氨酸抗體使溶解產(chǎn)物免疫沉淀，電泳，并用抗磷酸酪氨酸抗體將之免疫印跡(C)，在按上述程序進行抗磷酸酪氨酸免疫沉淀和印跡之前，用50ng/ml CNTF處理SK-N-LO細胞5或15分鐘。
圖10.用FGF或NGF處理過的細胞與用CNTF或LIF處理過細胞相比較的獨特蛋白酪氨酸磷酸化圖型。A.用50ng/ml CNTF、LIF或FGF將EW-1細胞處理5分鐘。用抗磷酸酪氨酸抗體免疫印跡總?cè)馨a(chǎn)物。B.在用50ng/mlCNTF、LIF或FGF處理后，用EW-1細胞制備總?cè)馨a(chǎn)物，用抗磷酸酪氨酸抗體將之免疫沉淀。作為對照，用ERK特異性抗體將ERK1和ERK2，從PC12溶胞產(chǎn)物中沉淀出來。用ERK抗體進行免疫印跡。C.由經(jīng)CNTF(50ng/ml)或LIF(50ng/ml)處理過的EW-1細胞及用NGF(50ng/ml)處理過的PC12細胞制取總?cè)馨a(chǎn)物。使溶胞產(chǎn)物電泳，并用抗磷酸酪氨酸抗體進行免疫印跡。
圖11.蛋白酪氨酸磷酸化變化對MAH細胞中應答CNTF和LIF時tis11誘發(fā)的時間過程比較。A.用50ng/ml CNTF或LIF將MAH細胞處理5-60分鐘。如圖3所示，用抗磷酸酪氨酸抗體使總?cè)馨a(chǎn)物免疫沉淀并免疫印跡。B.用CNTF或LIF對MAH細胞以類似方法處理15-120分鐘。按實驗步驟中所述制取總RNA，用甲醛瓊脂糖凝膠電泳分級，再雜交成tis11及c-fos DNA探針。C.用CNTF(50ng/ml)或LIF(50ng/ml)或FGF，將MAH或EW-1細胞處理30分鐘。制取總RNA并按上述方法分析tis11和c-fos表達。tis11和c-fos的轉(zhuǎn)錄尺寸分別為2.3及2kb。
圖12.應答EW-1及M1細胞中CNTF、LIF或IL-6時酪氨酸磷酸化變化的比較。用CNTF(50ng/ml)、LIF(50ng/ml)或mIL-6(100ng/ml)處理EW-1或M1細胞5分鐘。如上文所述，用抗磷酸酪氨酸抗體使總?cè)馨a(chǎn)物免疫沉淀和免疫印跡。
圖13.蛋白激酶抑制劑對CNTF及LIF誘發(fā)的蛋白酪氨酸磷酸化及tis11基因表達的影響。在添加CNTF(50ng/ml)、LIF(50ng/ml)或mIL-6(100ng/ml)之前，用蛋白激酶抑制劑H-7(40μg/ml)，或星狀孢子素(Staurosporine)(100ng/ml)，將MAH(A)或EW-1(B)細胞處理15分鐘。如上文所述，用抗磷酸酪氨酸抗體使總?cè)馨a(chǎn)物免疫沉淀和免疫印跡。為檢驗蛋白激酶抑制劑對tis11誘發(fā)的影響，在添加CNTF(50ng/ml)、LIF(50ng/ml)或mIL-6(100ng/ml)之前，用蛋白激酶抑制劑H-7(40μg/ml)處理MAH(C)或M1(D)細胞30分鐘。制備總RNA并用tis11探針對之進行Northevn分析。
圖14.CLIPS由CNTF和LIF(A)共同調(diào)節(jié)，并在細胞表面(B)上，而CLIPS之一(CLIP2)為gp 130。A.用CNTF和LIF共調(diào)節(jié)CLIP1和CLIP2。如已指出的那樣，用CNTF(50ng/ml)或LIF(50ng/ml)處理EW-1細胞5或60分鐘，于此60分鐘時間點之后，再以5分鐘向細胞中另外添加CNTF(3和7段)或LIF(4和6段)。然后，用抗磷酸酪氨酸抗體使總?cè)馨a(chǎn)物免疫沉淀和免疫印跡。B.生物素化(Biotinylation)分析表明，CLIP1和CLIP2在細胞表面上。EW-1細胞如本文所述，已經(jīng)表面生物素化(biotinylated)。該圖示出，對照細胞(C)或CNTF刺激過的、在抗生蛋白鏈菌素瓊脂糖上被分成未結(jié)合的(UB)或結(jié)合的(B)餾分之前，接著被生物素化或未生物素化的細胞(CNTF)的抗磷酸酪氨酸免疫印跡。C.CLIP2是gp130。該圖示出，由對照細胞(C)或CNTF/LIF刺激過，經(jīng)用抗磷酸酪氨酸抗體(α pTyr)或用gp130特異性抗體(αgp130)免疫沉淀過的EW-1細胞所得溶胞產(chǎn)物的抗磷酸酪氨酸免疫印跡。如上所述，各免疫沉淀抗體，或單個地或以順次的方式使用。
圖15.gp 130mRNA的隨機分布與CNTFRα mRNA限制神經(jīng)元分布的比較。從所指出的細胞系中制取總RNA，再用人gp130 cDNA探針(上圖)或鼠CNTFR cDNA探針(下圖)對之進行Northern分析;對嚙齒動物細胞系用gp130探針查得的較弱雜交，是由于交叉種之間雜交不良之故。SH-SY5Y為成神經(jīng)細胞瘤;EW-1為Ewing氏肉瘤;SK-N-LO為神經(jīng)上皮瘤;MAH為交感腎上腺原始粒子;M1為骨髓原始粒子;B9為不應答CNTF的IL-6依賴性β細胞雜交瘤。
圖16.gp130mRNA在組織中的隨機分布?？俁NA及Northern分析按圖15所示進行。
圖17.阻斷gp130的抗體防止了CNTF/LIF誘發(fā)的酪氨酸磷酸化及基因誘導。檢驗了抗體阻斷CNTF和LIF在EW-1細胞中誘導酪氨酸磷酪化的能力。CLIP1和CLIP2(圖A)的酪氨酸磷酸化以及CNTF或LIF(圖B)所誘導的tis11基因表達均完全被反gp130所阻斷。
圖18.LIF和CNTF對ES細胞的作用。ES細胞在設有飼養(yǎng)細胞，但有未分化的致密小細胞集落狀態(tài)保留下來的LIF(10-20ng/ml)存在下，加以保持。較低濃度的LIF(小于10ng/ml)，導致ES細胞在2-7天的時間內(nèi)分化，這可由內(nèi)胚層狀細胞及扁平大細胞的存在并有一些細胞死亡發(fā)生，而被證實(圖18A)。ES細胞在有5pg/ml-10ng/mlCNTF的明膠平皿上生長，導致分化和一些細胞死亡。濃度大于10ng/ml直至50ng/ml的CNTF，使ES細胞保持為小的致密細胞集落(圖18B)。在既無LIF又無CNTF的條件下保存的ES細胞，在2-7天的時間內(nèi)呈內(nèi)胚層狀或大而扁平狀(圖18C)。
圖19.CNTFR在ES細胞中的表達。對來源于ES細胞和鼠腦的RNA進行Northern分析，表明了CNTFR的表達。
圖20.ES細胞中CNTF和LIF對tis11的誘導。將ES細胞涂在平皿中，并在有CNTF(20ng/ml)或LIF(20ng/ml)存在下，以不分化的狀態(tài)加以保存。制取總細胞RNA，使之在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳，移到尼龍膜上，然后雜交成以32P標記的tis11探針。在ES細胞中，CNTF和LIF的在tis11基因表達中產(chǎn)生類似的誘導。
圖21.G-CSF、IL-6、CNTF及LIF受體復合物的示意模型。A.描繪指定細胞素受體復合物已知成分的模型。B.假設CLIP1是LIFRβ時，CNTF和LIF受體復合物的修正“統(tǒng)一”模型。在B部分所示的模型中，CNTFRα全都是將起作用的LIF受體復合物轉(zhuǎn)變成起作用的CNTF受體復合物所需的。因子以方塊表示;已知α亞單位因IL-6及CNTF受體復合物而存在，并因而用實線繪出(鄰近CNTFRα/膜結(jié)點的星號表示GPI鍵)，潛在的LIFRα成分則用虛線標出。盡管被描述成與膜結(jié)合，但α亞單位還可起著可溶性輔助因子的作用。
5.本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及無細胞CNTF/受體復合物及相關化合物，以及其在促進可表達或不表達CNTFR的細胞的存活、分化、增殖和/或生長中的用途。為了公開得清楚而又不作為限定，本發(fā)明將分成下列小節(jié)加以詳述(ⅰ)CNTF/受體復合物;
(ⅱ)CNTF/受體復合物的特征;及(ⅲ)CNTF/受體復合物的用途。
本發(fā)明基于一些進一步的發(fā)現(xiàn)即CNTF和LIF經(jīng)共有的、包括IL-6信號轉(zhuǎn)導受體成分gp130的信號途徑而作用于神經(jīng)元細胞，以及CNTF和LIF要求一種第二CLIPI/LIFRβ成分來啟動信號轉(zhuǎn)導。因此，本發(fā)明的詳述再分成以下小節(jié)進行(ⅳ)CNTF，IL-6和LIF的共有信號轉(zhuǎn)導成分;
(ⅴ)共有的獨特信號轉(zhuǎn)導成分的用途。
5.1.CNTF/受體復合物本發(fā)明涉及穩(wěn)定生物活性無細胞CNTF/受體復合物的形成。它部分基于有效量CNTF和CNTFR的產(chǎn)生和提純，以及在正常的生理條件下，它們形成穩(wěn)定生物活性復合物的能力。
比如，可先通過克隆再接著通過對每種相關的蛋白進行基因編碼測序，來制備有效量的CNTF和CNTFR。然后可使每個經(jīng)克隆的基因在原核或真核表達體系中表達。本技術領域中普通技術人員可獲得的多種方法中的任何一種方法，都可被用來將CNTF和CNTFR克隆并測序。比如(但不限于)可將CNTF在某一細菌表達體系中表達之前加以克隆和測序，這正如美國專利申請No.07/570，651(題為“睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子”，Sendtner等于1990年8月20日申請)及國際申請No.PCT/US90/05241中所述，此兩文獻全文在一并資料作參考。另外，舉例而不限定地說，CNTFR可如美國專利申請No.07/700，677(題為“睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子”，Davis等于1991年5月15日申請)及國際申請No.PCT/US91/03896(Davis等于1991年6月3日申請)中所述，以克隆和定序。在較佳實施方案中，可用具有基本如圖1中所示序列的CNTF和具有基本如圖2中所示序列的CNTFR。
可用多種方法中的任何一種方法表達和提純重組CNTFR基因。在本發(fā)明的一個較佳但非限制性的實施方案中，CNTFR可按如下所述，用表達重組CNTFR的細菌細胞來制取。編碼基因的人CNTFR可亞克隆成細菌表達載體，比如(但不限于)pCP110。所得到的質(zhì)粒pRPN151編碼一種重組的成熟態(tài)人CNTFR(huCNTFR)，該成熟態(tài)人CNTFR(huCNTFR)由具有成熟huCNTFR編碼區(qū)和在NH2端另有三個氨基酸，met ser Thr的327個氨基酸構(gòu)成。如第6節(jié)實施例中所述，在編碼區(qū)開始處的附加操作進一步優(yōu)化了huCNTFR表達，而不改變蛋白序列。這種重組質(zhì)粒然后可轉(zhuǎn)化成適宜的細菌菌株，如E.coli菌株RFJ26，并在本技術領域中已知的培養(yǎng)條件下生長，以誘發(fā)重組蛋白的合成，從而獲得有效量的重組huCNTFR。
任何可隨后形成穩(wěn)定生物活性CNTF/受體復合物的工藝，都可用來提純該重組huCNTFR。例如(但不限于)，可從RFJ26/pRPN151細胞中作為包含體回收huCNTFR，接著按下文第7節(jié)，在8M氯化鈲中定量萃取并滲析。為了進一步提純CNTFR，采用諸如常規(guī)的離子交換色譜法，疏水相互作用色譜法，或反相色譜法等方法，也許不符合需要，因為活性CNTFR可能難于按這些方法加以分離。反之，本發(fā)明提供了一種進一步提純CNTFR的方法，其中包括凝膠過濾法。根據(jù)本發(fā)明，除CNTFR之外，以低含量(即＜2%)表達的蛋白也可用此法提純。
CNTF/受體復合物可在CNTF和CNTFR提純之后形成。能產(chǎn)生穩(wěn)定CNTF/受體復合物的任何比例的CNTF和CNTFR都可采用，這包括(但不限于)1∶1，2∶1，3∶1等。比如(但不限于)，等摩爾量(即80nM)的重組CNTF和重組CNTFR可在生理緩沖溶液(即100mM Tris HCl，50mM NaCl，PH8.0)中，于室溫下加以混合。然后可將此混合物涂于凝膠過濾柱上，接著可回收與CNTF/受體復合物相應的峰，以便用與下文所述的多種測定。
本發(fā)明提供一種其中CNTF和CNTFR被共價或優(yōu)選的非共價鍵合的復合物。
本發(fā)明還涉及任何可用來促進，或任選地拮抗細胞分化的復合物或分子。在本發(fā)明各具體實施方案中，提供這樣一種作用的CNTF/受體復合物，它可為雜交或嵌合的核酸序列所編碼，這種雜交或嵌合的核酸序列，可用本技術領域中已知的任何多種重組DNA方法構(gòu)成，從而使CNTF和CNTFR的序列編碼機能部分都被轉(zhuǎn)譯連接;亞克隆成原核或真核的表達質(zhì)粒，以使該雜交或嵌合的核酸序列為多種啟動子成分中的任何一種與原核或真核宿主系統(tǒng)及表達質(zhì)粒中雜交基因的取向相容的啟動子成分所控制。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，CNTF和CNTFR中起編碼核酸序列作用的部分，以相同的取向并在控制相同調(diào)節(jié)序列的條件下被亞克隆，形成“dicistronic”結(jié)構(gòu)。橫跨CNTF及CNTFR基因結(jié)合點的核酸區(qū)，或者會具有促進轉(zhuǎn)譯前起始轉(zhuǎn)錄拼接的序列，或者作為選擇，該區(qū)將編碼本技術領域中已知的肽序列，以促進宿主細胞中具活性的蛋白酶所進行的后轉(zhuǎn)譯蛋白水解處理。這種雜交或嵌合分子的結(jié)構(gòu)，促進了等摩爾量CNTF/受體復合物的兩種起作用成分的表達，并使CNTF/受體復合物可以直接在原核抑或真核宿主細胞中提純。本發(fā)明還涉及編碼突變型CNTFR的核酸序列。給定的CNTFR基因可在體外或體內(nèi)突變，在編碼區(qū)內(nèi)形成位點特異性變化，添加或刪除。任何為本技術領域所知的誘變技術都可使用，這包括(但不限于)體外位點定向誘變[Hutchinson等，J.Biol.Chem.2536651(1978)]、使用TAB銜接物(Pharmacia)等。在本發(fā)明的各非限定性實施方案中，如上述制備的雜交或突變型分子或復合物，可具有一些不同于天然CNTF/受體復合物的特征。比如，這樣的雜交或突變體可以有能力促進在沒有CNTF存在下的信號轉(zhuǎn)導(即不形成CNTF/受體復合物)。
作為另一實施例，雜交體或突變體可以有能力結(jié)合CNTF而不導致信號轉(zhuǎn)導。那么，可以下文中所述的任何一種測定方法來測定這些CNTFR阻斷突變體或雜交體在CNTF存在下起信號轉(zhuǎn)導拮抗劑作用的能力。在一些較佳實施方案中，這類CNTFR阻斷突變體或雜交體可以與高于天然CNTFR對CNTF親合力的親合力結(jié)合CNTF。在本發(fā)明的另一實施方案中，可產(chǎn)生一種結(jié)合在CNTFR上的CNTF突變體，以使所得到的復合物無能力進行信號轉(zhuǎn)導。
5.2.CNTF/受體復合物的特征本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的CNTF/受體復合物，在第5.1節(jié)和第6節(jié)實施例中所述的本發(fā)明具體實施方案中，在室溫下向生理緩沖液中添加等摩爾量的CNTF和CNTFR，以此形成生物活性的CNTF/受體復合物。該具體實施方案中的CNTF/受體復合物在天然聚丙烯酰胺凝膠中，具有不同于CNTF或CNTFR純化餾份中任一餾份的移動性。
該CNTF/受體復合物還可根據(jù)其生物活性來表征，在CNTF應答細胞中，CNTF/受體復合物的活性與CNTF的活性相當。
CNTF促進細胞分化以及初級神經(jīng)元的存活。表達CNTFR的CNTF的靶細胞包括(但不限于)睫狀神經(jīng)節(jié)細胞，脊神經(jīng)節(jié)細胞，海馬細胞及運動神經(jīng)元細胞。
CNTF在這些靶細胞中的生物應答，通過CNTF/受體復合物共有信號轉(zhuǎn)導途經(jīng)而產(chǎn)生(例如，參見下文第9節(jié))。比如，CNTF在MAH細胞系的生長停滯和分化之間進行調(diào)節(jié)。MAH細胞系暴露于CNTF，就快速誘發(fā)三種性質(zhì)不同CLIP蛋白的酪氨酸磷酸化型式。此外，這些CLIP基因的磷酸化，立即領先于誘發(fā)有特征的前早基因，tis11。這些早期應答CNTF的磷酸化現(xiàn)象，是這種信號轉(zhuǎn)導途徑存在的標志。
然而，在本發(fā)明的另一實施方案中，CNTF/受體復合物對不表達CNTF受體的靶細胞傳遞如上文中所述的類似的作用(如見下文第8節(jié))，條件是，這種細胞表達一種第二成分，本文中稱之為“信號轉(zhuǎn)導成分”，也即與受體分子相互作用而誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導的一種第二成分，如與IL6受體體系聯(lián)合的gp130或白血病抑制因子(LIF)受體的β鏈。表達這些信號轉(zhuǎn)導成分的細胞，在此被認為是應答CNTF/受體復合物的。CNTF/受體復合物的靶細胞可以是在應答CNTF/受體復合物處理時，任何有助于通過體外信號轉(zhuǎn)導測定進行鑒定的細胞(例如，如上文所討論的，諸如表明表型分化，前早基因表達或CLIP蛋白磷酸化的靶細胞)，或者這些細胞能模擬或改變CNTF/受體復合物正常生理作用的雜交體或突變體。
CNTF/受體復合物，或相關的雜交或突變型化合物對靶細胞的影響，可用多種表征特定細胞類型的表型和/或生物化學應答的任何一種來測定。如果靶細胞應答CNTF，則該復合物的活性可作為CNTF相關生物作用，如睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元或運動神經(jīng)的存活等的函數(shù)來測量。
如果靶細胞不應答CNTF，但應答CNTF/受體復合物，則可測量它們，以知道分化的其它標志。比如(但不限于)，可將M1細胞系用于檢測CNTF/受體復合物或其雜交或突變型蛋白以類似于IL-6或LIF受體途徑的方式促進分化的能力。未分化的M1細胞是園的，而且是明相的，又不附著于基質(zhì)。由于分化，當被CNTF/IL-6/LIF受體族促進時，M1細胞分化得更多，而且附于基質(zhì)。因此，容易對M1培養(yǎng)物計數(shù)這種分化表型。
如上文中對MAH細胞所述的那樣，細胞的特異性標志，如CLIP蛋白圖型的變化或者磷酸化及前早基因激活等其它圖型變化(如，tis11;見下文第9節(jié))也都可利用。
CNTF/受體復合物促進M1細胞(如屬于IL-6/LIF受體族的)中的表型分化的能力表明，任何應答這種復合物的其它靶細胞，都是此CNTF/受體的靶細胞。除象M1細胞系這樣的髓樣白血病細胞外，CNTF/受體或其雜交體或突變體的潛在靶細胞，包括白血病細胞、造血干細胞、巨核細胞及其先祖細胞、DA1細胞、破骨細胞、成骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上表皮細胞、胚干細胞、腎小球系膜細胞、T細胞、B細胞等。
CNTF/受體復合物的靶細胞，可以是任何有助于通過體外信號轉(zhuǎn)導測定加以鑒定的細胞(例如，如上文中所討論，諸如表明表型分化、前早基因表達或CLIP蛋白磷酸化的靶細胞)，這種靶細胞對CNTF/受體復合物或其雜交體或突變體的處理有反應，而所述的雜交體或突變體，或者模擬或者改變該CNTF/受體復合物的正常生理作用。
5.2.1.直接125I-hCNTF結(jié)合測定如上文所討論，本發(fā)明的另一實施方案，涉及對CNTF的結(jié)合能力有所改變的CNTFR突變體的分離。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，pCMX-hCNTFR(12)(所給的登記號為NRRL B-18789)誘變后，接著進行如美國專利申請NO.07/700，677(標題“睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子”，Davis等于1991年5月15日申請)中所述的直接125I-hCNTF結(jié)合測定。簡而言之，用乳過氧化物酶6ng/μl(Sigma)，在20℃下可使10μghCNTF(以560μg/ml的濃度溶于10mM Na3PO4，PH7.4)1mCi125INa碘化15分鐘。15分鐘后，可用含0.1M NaI、0.1%BSA和0.1%細胞色素C、0.3%HOAc、0.05%苯酚磺酞及0.02%NaN3的等體積緩沖液，使該反應驟停?？扇〉确衷嚇右源_定TCA的可沉淀的讀數(shù)?？蓪埩粑锛拥接?.05MNa3PO4、0.1M NaCl、0.5mg/ml魚精蛋白硫酸鹽及1mg/ml BSA平衡的Bio Rad PD-10 Biogel柱上。各餾份可予收集并測定TCA沉淀數(shù)。接著，可用已誘變的質(zhì)粒DNA使COS細胞轉(zhuǎn)染。48小時后，可除去該介質(zhì)，再用0.25ml的只含125I-hCNTF的結(jié)合緩沖液(RPM1 1640與10%FBS及0.1%NaN3)，或用未標記的hCNTF替代之。在室溫下以125I-hCNTF進行培育，可歷時60分鐘。培育完畢后，除去125I-hCNTF溶液，用1.0ml結(jié)合緩沖液將細胞洗滌3次，然后用0.25ml的0.1N NaOH溶解。這種溶解產(chǎn)物可移往12×75mm的聚苯乙烯管，再置于γ計數(shù)器中。通過添加至少100倍的過量的未標記hCNTF，可確定非特異性結(jié)合。最后一次洗滌后，可對這些平皿作自體放射照像測定。
可選擇顯示高CNTF結(jié)合的，或低CNTF結(jié)合的，或根本沒有CNTF結(jié)合的CNTFR突變型，供進一步分析用。從被轉(zhuǎn)染的所涉及細胞系得到的上清液，可被用于任意數(shù)次的分化測定中，以確定每種突變體促進信號轉(zhuǎn)導的能力。
5.2.2.信號轉(zhuǎn)導測定如上文中所討論，M1細胞測定方法對測量CNTF/IL-6/LIF受體族各成員的信號轉(zhuǎn)導能力是有用的。
這種測定方法對于實施本發(fā)明中另一些實施方案也是有用的，即對鑒定轉(zhuǎn)導信號但不結(jié)合CNTF的突變型CNTF受體，及結(jié)合CNTF但不誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導的突變型CNTF受體是有用的。比如，如果一種CNTFR突變體在125I-hCNTF直接結(jié)合測定中只給出弱的，或不存在的信號，那么就在M1測定中對這種突變型受體進行促進表型分化能力的計數(shù)。相反，顯出較高結(jié)合的CNTFR突變體也可在該M1方法中測定。突變型CNTF受體可與不同量的未標記CNTF混合，并在M1測定中作抑制表型分化(如，突變型CNTFR對信號轉(zhuǎn)導途徑起拮抗劑作用)能力的計數(shù)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，CNTF/IL-6/LIF族的不同靶細胞，可用如對M1細胞所述的相同類型的測定方法來鑒定。
作為選擇，可按下文第9節(jié)中所述，用證實有信號轉(zhuǎn)導如CLIP蛋白磷酸化或前早基因誘導的測定方法來鑒定靶細胞。比如，可將公認的靶細胞培養(yǎng)物暴露于有效濃度的CNTF/受體復合物，然后評價CLIP蛋白的磷酸化，tis11前早基因表達的傳導等，其中這類信號轉(zhuǎn)導證據(jù)表明，這種細胞確實是CNTF/受體復合物的靶。
5.3.CNTF/受體復合物的用途按照本發(fā)明，CNTF/受體復合物，或其雜交體或突變體可被用于促進一些細胞的分化、增殖或體外或體內(nèi)存活，所述細胞是對CNTF/受體復合物有反應的細胞，這包括表達CNTF/IL-6/LIF受體族中的受體的細胞，或任何為上文第5.2節(jié)所述的特征(如，CLIP蛋白磷酸化和/或前早基因誘發(fā))所證明，表達適宜信號轉(zhuǎn)導成分的細胞。突變體或雜交體可任選地用來拮抗細胞分化或存活。
5.3.1.體外應用本發(fā)明可被用于鑒定CNTF/受體復合物的潛在醫(yī)療和診斷用途的新靶細胞。比如(但不限于)，確定形態(tài)學變化(如，細胞從園細胞到扁平細胞的進展，細胞病變的漫延及從自由漂浮細胞到附著細胞的轉(zhuǎn)變)，或生物化學標志(如細胞特異性標志的表達，細胞基因、如前早基因tis11的激活，或者磷酸化型式，如CLIP蛋白磷酸化型式的變化)，或細胞生長或增殖，都可用來鑒定這類新的靶細胞。
反之，應答CNTF/受體復合物的細胞，可用來鑒別與CNTF/受體復合物相關的雜交或突變化合物。比如，這類細胞可被暴露于不同濃度的CNTF/受體復合物相關雜交或突變化合物，然后可確定生理效應，如細胞增殖、細胞形態(tài)學、CLIP蛋白的磷酸化、前早基因誘變等的有無及大小。如果該雜交體或突變體起著CNTF/受體復合物活性的激動劑作用，那么生理變化應與CNTF/受體復合物所產(chǎn)生的變化相似。作為選擇，如果雜交體或突變體起著CNTF/受體復合物活性的拮抗劑的作用，那么與CNTF/受體復合物有關的生理變化就應減弱或消除。
任何通過形態(tài)的或生物生學型式變化而被鑒定為應答CNTF/受體復合物細胞的靶細胞，都是用于診斷性測定的候選細胞。這些診斷性測定，包括檢查病人活體細胞，對特定治療方案的敏感度，所述方案包括使用CNTF/受體復合物或其能促進或拮抗該受體族中的信號轉(zhuǎn)導的雜交體或突變體。
本發(fā)明可用來診斷可能與CNTF或CNTFR表達型式變化相關，并因而與CNTF/受體復合物的形成相關的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和障礙。比如，取自病人的細胞對CNTF/受體復合物有異常應答，可支持對病人神經(jīng)障礙的診斷。
這樣的細胞活組織檢查，可用來檢測、預測、診斷或監(jiān)測與CNTF表達改變有關的狀況、障礙或病狀，尤其包括導致已知對CNTF有反應的神經(jīng)元損傷及退化的各種狀況，所說的神經(jīng)元例如為副交感神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、脊髓神經(jīng)元、或神經(jīng)細胞瘤細胞及腎上腺髓質(zhì)細胞。這些疾病和狀況包括(但不限于)中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、梗塞、感染、退化性神經(jīng)病、惡性腫瘤或手術后變化，其中包括(但不限于)早老性癡呆、帕金森病、享延頓舞蹈病及肌萎縮性側(cè)索硬化。
在另一實施方案中，本發(fā)明使任何經(jīng)上文所述生物測定方法鑒定的靶細胞得以實用。任何這樣的靶細胞都是用于檢測、預測、診斷或監(jiān)測分化障礙或疾病狀況的體外測定方法的候選細胞，所述狀況包括(但不限于)惡性或贅生性狀況，而特別是與下述細胞有關的疾病或障礙白血病細胞、造血干細胞、巨核細胞及其直系先祖細胞、DA1細胞、破骨細胞、成骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚干細胞、腎小球系膜細胞、T細胞、B細胞等。
5.3.2.體內(nèi)應用本發(fā)明可被用來治療任何應答CNTF/受體復合物的細胞的障礙，這些細胞包括應答CNTF的細胞以及對其不應答的細胞。在本發(fā)明的較佳實施方案中，按這些方法可治療表達CNTF/IL-6/LIF族中成員的細胞的障礙。這些障礙的例子包括(但不限于)涉及下列細胞的障礙白血病細胞、造血干細胞、巨核細胞及其直系先祖細胞、DA1細胞、破骨細胞、成骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚干細胞、腎小球系膜細胞、T細胞、B細胞等。
因而，本發(fā)明提供一些方法，其中患有與CNTF有關的神經(jīng)病學或分化方面的障礙或疾病的病人被給用有效量的CNTF/受體復合物，或其雜交體或突變體進行治療。該CNTF/受體復合物或其適宜的雜交體或突變體可被用于治療如國際申請PCT/US90/05241(Sendtner等申請)中就CNTF所述的，以及美國專利申請NO.07/700，677(標題“睫狀神經(jīng)受體”，Davis等于1991年5月15日申請)就CNTFR所述的障礙或疾病。包括給用CNTF/受體復合物、誘導信號轉(zhuǎn)導而不結(jié)合CNTF的CNTFR突變體或CNTF/受體復合物拮抗劑(如有高度CNTF結(jié)合親合力的，不誘發(fā)信號轉(zhuǎn)導的CNTFR突變體)的治療方法，均在本發(fā)明的范圍之中。
本發(fā)明還提供在適宜藥用載體中含有CNTF/受體復合物、其雜交體或突變體的藥用組合物。
可系統(tǒng)地或局部給用CNTF/受體復合物、其雜交體或突變體。任何在本技術領域中已知的用藥方式均可采用，這包括(但不限于)靜脈內(nèi)、椎管內(nèi)、動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)口、皮下、腹膜內(nèi)給藥，或局部封閉注射或外科埋入給藥。還提供緩釋劑型。
5.3.2.1活性成分的制劑可含有穩(wěn)定CNTF/受體復合物或其雜種體或突變體的活性成分，應在用于體內(nèi)給藥的適宜的藥用載體中配劑，給藥可通過任何合適的方式進行，所述的方式包括(但不限于)注射(例如，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、神經(jīng)內(nèi)、神經(jīng)周、脊髓內(nèi)、心室內(nèi)、椎管內(nèi)等);可通過經(jīng)上皮層或粘膜層(例如，口腔粘膜、直腸粘膜及腸粘膜)的吸收進行;或通過包括細胞植入劑或組織植入劑在內(nèi)的緩釋植入劑進行。
取決于給藥方式，該活性成分可在液態(tài)載體，如鹽水中制成劑型，可滲入脂質(zhì)體、微囊體、聚合物或蠟基物中，其釋放性能可被控制，或配制成片劑、丸劑或膠囊劑。
配制時用的活性成分濃度將取決于所需的有效劑量及所用的給藥方式。所用的劑量應是足以達到活性成分有效的循環(huán)血漿濃度。比如，當CNTF/受體復合物是活性成分時，可用范圍在約50微微摩爾-100毫微摩爾的循環(huán)血清濃度。有效劑量可從由體外或動物模型試驗方法得到的劑量應答曲線外推求出。
在另一實施方案中，提供了CNTF/受體復合物的配制品，其中一種以上的CNTF/受體復合物直接連接在一起，或通過另一個成員，如一種小珠連接在一起。
5.4.CNTF、IL-6及LIF共有信號轉(zhuǎn)導成分將由MAH細胞系中及其它神經(jīng)元細胞系中的CNTF和LIF所激活的信號轉(zhuǎn)導途徑，與造血細胞系中LIF和IL-6所激活的信號轉(zhuǎn)導途徑進行了比較。在此一并資作參考的美國專利申請NO.676，847(1991年3月28日申請)中，我們敘述了CNTF、CNTF受體和信號轉(zhuǎn)導物gp130之間可能發(fā)生的相互作用。本說明書中所述的研究，進一步證實這樣一個結(jié)果，即CNTF信號途徑有gp130參與，而且進一步表明，LIF也利用有IL-6信號轉(zhuǎn)導物gp130參與的信號途徑。本文還要述及的發(fā)現(xiàn)是CNTF和LIF共有一種類似gp130的第二受體組分。這暗示著CNTFR(CNTFRα)才是將LIF受體復合物變成起作用的CNTF應答受體復合物所需的。
在IL-6的情況下，復合物在IL-6及其受體成分之間結(jié)合了gp130，然后它再以某種程度激活信號轉(zhuǎn)導過程[Taga等，Cell 58573-581(1989);Hibi等，Cell 631149-1157(1990)]。gp130轉(zhuǎn)導機能信號的能力與其在酪氨酸上被磷酸化的能力相關[Murakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8811349-11353(1991)]。這里我們已鑒別出可用來比較對CNTF和LIF反應的細胞系，IL-6的遠緣系。令人注目的是，被檢測的CNTF應答神經(jīng)元細胞系，顯示出對LIF的難以分辨的表型和生物化學應答;相反，應答LIF的造血細胞不應答CNTF。神經(jīng)細胞中CNTF和LIF的應答可以為由三種CLIP的酪氨酸磷酸化所啟動，該CLIP中至少兩種(CLIP1和CLIP2)是可相互作用而形成穩(wěn)定可免疫沉淀復合物的細胞表面蛋白。
CLIP磷酸化居先進行，而且基于激酶抑制物的研究，CLIP磷酸化明顯地被要求有后續(xù)的特征基因誘導。LIF和CNTF顯示同樣的劑量應答、時間過程及與這些磷酸化相關的抑制劑分布模式及基因誘導，而且在用任一種因子處理之前，對另一因子的應答調(diào)小。不僅CNTF和LIF在神經(jīng)元細胞中被誘導出基本上難以區(qū)分的信號現(xiàn)象，而且它們似乎與造血細胞中為LIF所誘發(fā)的信號現(xiàn)象相同。除CLIP1磷酸化是CNTF和LIF響應的特有特性外，這些現(xiàn)象也與造血細胞中由IL-6所誘發(fā)的信號現(xiàn)象非常相似。通過提出各CLIP中之一(CLLP2)是IL-6信號轉(zhuǎn)導物gp130的證據(jù)，我們提供了CNTF、LIF和IL-6信號途徑中相似性的基礎。
我們的發(fā)現(xiàn)提出了許多關系到各種CNTF和LIF受體成分與gp130/CLIP2相互作用的問題。CNTF可同與IL6R相關的CNTFR直接結(jié)合[Davis等，Science 25359-63(1991)]，基于我們的數(shù)據(jù)及由于與IL-6系統(tǒng)(圖21A)相似，然后估計CNTFR會與gp130相互作用。然而，CNTF受體復合物顯然還包括在應答CNTF時被酪氨酸磷酸化，而且可直接與gp130(圖21A)相互作用的另一種細胞表面蛋白，即CLIP1。已知LIF結(jié)合分子量約為190KD，新近克隆過的gp130相關受體組分(以下稱為LIFR)，而且LIF-受體β(以下稱為LIFR)的存在已被提出[Gearing等，Cell669-10(1991)]。我們的數(shù)據(jù)表明，LIF受體復合物還包括CLIP1和gp130(圖21A)。最后，與IL-6/CNTF/LIF相關的G-CSF所相宜的受體復合物，顯然是與gp130相關的G-CSF受體的同型二聚體[Fukunaga等，EMBO J.102855-2865(1991)](圖21A)。
雖然，圖21A中所描繪的各受體復合物，介導對結(jié)構(gòu)上相關的配位體的結(jié)合，但如圖所示，它們的區(qū)別不能令人滿意。然而，如果人們考慮到尺寸上相似于LIFRβ的CLIP1確實是LIFRβ(圖21B)的可能性，那么就有可能提出更“統(tǒng)一的”受體模型。因此，CNTF和LIF受體復合物將各利用兩種不同象gp130的成分，LIFRβ/CLIP1以及gp130本身?；谖覀兊墓渤恋頂?shù)據(jù)，這兩種β成分將直接相互作用，而且它們都可誘導地在酪氨酸上被磷酸化。為支持這種受體結(jié)構(gòu)，新近的交聯(lián)數(shù)據(jù)[Godard等，J.Biol，Chem，267(正在印刷)]表明，LIF可與兩種尺寸同LIFRβ/CLIP1和gp130相應而性質(zhì)不同的蛋白結(jié)合。LIF和CNTF受體復合物中包含兩種β組分，會使人想起G-CSF受體的結(jié)構(gòu)(圖21B)，并提高了IL-6受體復合物也可包含gp130同型二聚物的可能性。實際上，這可能是，β亞單位的二聚作用和/或活化作用導致了信號過程的活化，這就象對受體酪氨酸激酶和某些細胞素受體所提出的那樣[Aaronson等，Science 2541146-1153(1991)];De Vos等，Science 255306-312(1992)]。
在圖21B中所示模型中，β受體成分能起調(diào)節(jié)各因子與該β組分結(jié)合的作用，并因此是使配位體具有共有轉(zhuǎn)導機理的特異性的原因。交聯(lián)數(shù)據(jù)[Godard等，J.Biol.Chem.267(印刷中)]許能提示，對于LIF來說，如同G-CSF那樣，這些組分可能都不是必要的。因此，CNTFR組分可能才是將起作用的LIF受體轉(zhuǎn)變?yōu)槠鹱饔玫腃NTF受體所需要的。這后一種可能性連同CNTFR對神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺、坐骨神經(jīng)及骨骼肌的限制表達一起[Davis等，Science 25359-63(1991)]，可以解釋為什么所有CNTF應答神經(jīng)細胞也同樣應答LIF[見上文;也見Rao等，Dev.Biol.13965-74(1990)]，而在該神經(jīng)系統(tǒng)之外應答LIF的細胞都不應答CNTF。
有趣的是，為了與其轉(zhuǎn)導成分相互作用，IL-6或CNTF的成分不必經(jīng)膜束縛[Taga等人，Cell58573-581(1989)]。因此，含有這些因子連同其受體可溶形式的復合物，可作為細胞的雜二聚物因子，該細胞不能單獨地應答因子(因其不表達相宜的受體)，但其確實表達適宜的轉(zhuǎn)導成分。受體成分與自然殺傷細胞刺激因子(正常出現(xiàn)的雜二聚物因子)的兩個亞單位中一個亞單位之間的同源性，支持了這類雜二聚物復合物在活體內(nèi)實際起可溶因子成分作用的可能性[Gearing and Cosman，Cell 669-10(1991)]。此外，不常見且易于開裂的CNTFR糖基磷脂酰肌醇對細胞表面的連鎖，表明了調(diào)節(jié)釋放這一受體成分的功能[Davis等，Science 25359-63(1991)]。
盡管上面提出的各受體模式需要進一步實驗證實，但它們顯然具有切合的先例。過多的G-蛋白偶聯(lián)受體與少數(shù)信號轉(zhuǎn)導雜二聚物G-蛋白相互進行類似的反應，使得廣泛排列的不同信號(如，神經(jīng)遞質(zhì)，多肽激素和氣味物質(zhì))會聚在較為適當數(shù)量的信號通道上[Gilman，Ann.Rev.Biochem.56615-647(1987)]。更直接與gp130偶聯(lián)受體體系相關的是IL-3、IL-5和GM-CSF的那些受體系,由IL-3、IL-5和GM-CSF導致的重疊活性和類似的酪氨酸磷酸化作用使我們發(fā)現(xiàn)，這些因子使用不同的受體成分，但共有這些成分[又見Nicola and Metcalf，Cell671-4(1991);Miyajima等，Annu.Rev.Immunol(1992)，正在印刷]。受體成分又一次主要參與結(jié)合因子，但缺少擴展的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，因此似乎不具有信號轉(zhuǎn)導能力。對這些共有亞單位似乎要求高度的親合性結(jié)合，其決定著啟動包含酪氨酸磷酸化的信號轉(zhuǎn)導作用。當用gp130(且估計可能是LIFR/CLIP1)時，這些亞單位自身酪氨酸磷酸化，但看來不具有固有的激酶活性。雖然幾乎不了解將這些亞單位酪氨酸磷酸化的機制，但多組分IL2受體也利用一個決定著高親合性結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導作用的亞單位(LI2R)，且該鏈被與其物理聯(lián)接的src型酪氧酸激酶(lck)所酪氨酸磷酸化(又見Miyajima等，正在印刷)。有趣的是，CLIP磷酸化和IL-2誘導的lck磷酸化對激酶抑制劑都表現(xiàn)出相似的敏感分布[Hatakeyama等，Science2521523-1528(1991)]。這就是說，兩種磷酸化都對星狀孢子敏感，而對H-7不敏感，這示意，可能含有類似的酪氨酸激酶;CLIP3可為這種象src的激酶的應選者。
在某些重要方面，CNTF與其遠緣細胞素相比，似乎相當異乎尋常。最重要的是，CNTF有限制性很大的受體成分分布，且迄今為止，它表現(xiàn)出是對CNTF有反應的神經(jīng)系的主要細胞[Davis等，Science25359-63(1991)]。這一局限性同與CNTF相關的細胞素的廣譜作用形成對比;該CNTF實例意示，可能存在作用范圍顯得非常有限的另外相關細胞素。對MAH細胞系的鑒定，提供了一種對CNTF和LIF，以及對使用不相關受體系(諸如，F(xiàn)GF和NGF)的因子，表現(xiàn)生理性相關反應的神經(jīng)元先祖細胞系。使用MAH細胞系，會有助于理解，不同因子使用各自信號通道，如何能夠相互作用，而影響神經(jīng)元遠祖細胞的生長和分化。將MAH細胞系和造血細胞系的應答同細胞素對比，還會使我們深入了解，性質(zhì)不同的細胞組織改變極相似起始信號感應和譯碼的機制。
5.5.一般和特殊受體成分的用途如本文所述，CNTF和LIF共有某種受體復合物/信號轉(zhuǎn)導途徑的各成分。因而可以證實，單獨的或與CNTFR(CNTFα)相結(jié)合的CNTF，可在通常應答LIF的細胞中，用作啟動應答的工具。視細胞所具有的各受體成分而定，它可能應答CNTF或應答CNTF與CNTFR的結(jié)合體。如果細胞含有gp130，則LIFRβ和CNTFα(如采用ES細胞系的情況中出現(xiàn))，單獨的CNTF具有與LIF相同的作用。如果細胞僅有gp130和LIFRβ，則CNTF和CNTFR相結(jié)合將模擬LIF的作用。
5.5.1.用CNTF阻止胚干細胞的分化近來已確證，可采用CNTF代替LIF來阻止ES細胞的分化。胚干(ES)細胞為從預植入階段鼠胚分離的全能性細胞，可將其在試管中培養(yǎng)并處理，然后將其再引入寄主胚，它們在其中可正常發(fā)育，并有助于包括種系在內(nèi)的所有細胞譜系。因此，ES細胞對向鼠體引入特異性突變提供了一種理想的載體體系。
在培養(yǎng)物中維持全能性ES細胞，要求或有成纖維細胞(如，STO細胞)飼養(yǎng)層存在，或有可溶因子白血病抑制因子(LIF)存在[Smith等，Nature336688-690(1988);Williams等，Nature3365，684-687(1988)]。使用飼養(yǎng)細胞很可靠，但制備飼養(yǎng)層卻耗費時間。STO細胞必須用絲裂霉素C處理2-3小時，以停滯其生長，再用PBS洗滌數(shù)次之后，可將STO細胞涂于帶明膠層的平皿上。該平皿第二天即可使用，但僅在涂復后一周內(nèi)有效[Robertson，Nature323，445-448(1987)]。為防止飼養(yǎng)層發(fā)生問題，Williams等[Nature(1988)，同上]及Pease與Williams[Exp.Cell Res.190，209-211，(1990)]發(fā)現(xiàn)，無飼養(yǎng)細胞存在下所維持的ES細胞，保留著其形成種系嵌合體的潛能，但條件是，培養(yǎng)基內(nèi)須含LIF。
在有CNTF存在，但無飼養(yǎng)細胞和LIF存在下培養(yǎng)的ES細胞，會保留小細胞密集集落的特征性干細胞形態(tài)。這是非LIF因子防止ES細胞分化的第一個實例。兩種引發(fā)相似應答的因子的存在提供了研究ES細胞分化轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)機制的又一個機會。
5.5.2.用CNTF/CNTFR激活LIF應答細胞如本文所述，CNTF與CNTFR或可溶性CNTFR(sCNTFR)的聯(lián)合使用，應結(jié)合到任何應答LIF的細胞上，并激活該細胞。不過，LIF應答細胞相當隨遇，因此，就增強特異性而言，使用CNTF及其可溶性受體去激活這類細胞，不可期望獲得任何可觀的優(yōu)越之處。此外，與經(jīng)GPI固著將CNTFR并連在細胞表面相比，可溶性受體/CNTF復合物的效率顯得低得多。
為了同時提高CNTF/CNTFR復合物的特異性以及其效率，本發(fā)明考慮將CNTFR復合在靶細胞表面，并接著用CNTF激活這樣一種細胞，以此來靶定細胞。在另一實施方案中，以某一方式修飾該CNTF/CNTFR復合物，使其對特定靶細胞具有特異性。
將蛋白質(zhì)(如CNTFR)靶定在細胞表面的方法是本領域普通技術人員公知的。通常，用一連接分子將這類蛋白質(zhì)并連在細胞表面，該連接分子是既能與CNTFR又能與靶細胞結(jié)合的分子。較佳的是，這類連接分子可與靶細胞上自然產(chǎn)生的受體柔性結(jié)合。例如，有端部半乳糖的連接分子與CNTFR并連，即可在肝中使這種復合物并連在肝去唾液酸糖蛋白受體上。另一實施側(cè)包括用含F(xiàn)c連接分子與CNTFR并連，這就能使CNTFR并連在含F(xiàn)c受體的靶細胞上。
另外，抗體(最好是單克隆抗體)可有效地用作連接分子。例如，可將識別特定細胞表面受體的抗體與CNTFR連接。另一方面，抗原決定基也可與CNTFR并連，其中該抗原決定基被同時結(jié)合CNTFR-抗原決定基復合物和靶細胞上抗原決定基的連接抗體所識別。如果直接面對靶細胞的抗體結(jié)合一種未知抗原決定基，則該抗體可為全隨機肽表達庫所識別[見，如PNAS 891865(1992)]。
若CNTFR并連在靶細胞表面上，則可通過添加CNTF來激活該細胞。另外，并連在連接分子(能使之并連在靶細胞表面的分子)上的CNTFR，可與CNTF聯(lián)合使用。在此情況下，活化劑便為CNTF/CNTFR/連接分子的復合物。
5.5.3.CNTFR拮抗體的鑒定在本文識別IL-6，ILF和CNTF共有信號轉(zhuǎn)導途徑的基礎上，可以看出，識別會與CNTF結(jié)合，并會與LIFRβ和gp130相互作用形成復合物，但不能轉(zhuǎn)導信號的可溶性CNTR類似物，也會對LIF或IL-6所致激活作用起有效抑制劑作用。CNTF突變體也可表現(xiàn)這些活性。
在一個具體實施方案中，用HepG2細胞提供一種測定CNTF激動劑或拮抗劑的方法，所述HepG2細胞，在涉及包括纖維蛋白原在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)節(jié)的快時應答中，應答LIF和IL-6。實驗表明，由ChAT和應答基因上游序列(即纖維蛋白原啟動子)構(gòu)成的受體構(gòu)建，會通過上調(diào)節(jié)ChAT活性而準確反映IL-6的功能信號。與分泌酶或細胞表面酶(如堿性磷酸酶)連接的記錄構(gòu)建，可用來篩選CNTF-sCHTFR的突變體，以便具有阻斷LIF或IL-6激活極導體的能力?？蓪⒃撏蛔凅w轉(zhuǎn)染到HepG-2細胞中，并在96凹孔的平板上篩選。
另外，用CNTFR轉(zhuǎn)染的HepG-2細胞，可向CNTF激活劑及/或抑制劑的篩選提供有價值的測定體系。
6.實施例在E.COLI中生成人CNTF受體6.1.材料和方法1.pCP110的構(gòu)建親本質(zhì)粒表達載體pCP110，見Masiakowski等在J.Neurochem.57∶1003-1012(1991)中所述。
2.huCNTFR1表達載體的構(gòu)建用圖3所示的DNA引物，以從質(zhì)粒pCMX-hCNTFR(12)復制的PCR片段代替pCP110中單一Sall與Eagl限制位點間的DNA，以此產(chǎn)生質(zhì)粒pRPN151。人CNTFR1由成熟huCNTFR序列的327個氨基酸和Met-Ser-Thr序列的NH2末端上的另外三個氨基酸組成。含有該另外三個氨基酸，是為了在所需的氨基酸位置上啟動信號轉(zhuǎn)譯，也為了簡化隨后的基因工程操作。與此同時，為了在不改變蛋白質(zhì)序列的前提下優(yōu)化表達，則要進一步修飾DNA序列編碼區(qū)的起始端。這通過將所需的變化參入有義PCR引物(圖3)來實現(xiàn)。然后將質(zhì)粒pRPN151轉(zhuǎn)染到E.coli菌株，RFJ26中。在RFJ26/pRPN151細胞的適宜誘導條件下，huCNTFR1達到為總蛋白10-20%的含量。
3.huCNTFR1的提純?nèi)鐚χ亟M體鼠體和人CNTF所述(國際申請NO.PCT/U.S.90/05241，Sendtner等人1990年9月14日申請)，將于RFJ26/pRPN151細胞中合成的受體主要部分置于內(nèi)含體中，在8M氯化鈲中將其從內(nèi)含體中定量萃取出來，并以可溶形式透析回收。用凝膠過濾回收具有活性且正確折疊的受體，以便使正確折疊的CNTFR1分子以其真實尺寸自含空隙體積的集聚蛋白質(zhì)中洗脫出來。
6.2.結(jié)果對從這樣一種柱上洗脫的還原SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠以280nm吸光度進行的分析和電泳表明，盡管大多數(shù)受體在空隙體積中顯凝聚態(tài)洗脫(30-40%純度)，還有些受體在裁然的尖峰(純度80-90%)范圍內(nèi)以適當分子量位置(40KD)洗脫。后峰中的受體為起始物質(zhì)中受體的10-50%，具體含量取決于再折疊的條件(圖5)。
對天然凝膠上洗脫分布的分析表明，正如對凝聚蛋白所予料的那樣，處于無峰段的受體蛋白質(zhì)不進入凝膠，另一方面，正如對有統(tǒng)一構(gòu)象的分子群體所預料的那樣，40KD峰的受體移動形成一尖譜帶。
7.實施例CNTF/受體復合物的形成將按第6.1.3.節(jié)所述回收的40KD峰受體用于與純化大鼠CNTF的混合實驗。
7.1.材料和方法如Goldenberg[Analysis of Protein Conformation by Gel Electrophoresis，in“Protein Structure”，edCreighton IRL Press，Oxford(1989)]所述，將恒量的受體與增量的大鼠CNTF混合，并使各樣品在PH7.4的天然凝膠體上流動。
接著，在室溫下，將純化受體與大鼠CNTF在生理緩沖液(100mM Tris-HCl，50mM NaCl，PH8.0)中混合，并裝載于Superdex-75柱(Pharmacia)上?；厥障鄳谠撌荏w-CNTF復合物的吸收峰譜物，并將其在5℃下儲存48小時，到此時間后，將部分樣品進行如上文中所述的凝膠過濾。
7.2.結(jié)果當使無峰段受體與大鼠CNTF混合，并在天然凝膠上分析時，受體連同一些CNTF保留在凹孔中。作為對比，當40KD峰的受體與大鼠CNTF混合時，兩種蛋白在凝膠的新位置上以單譜帶形式遷移(圖6)。凝膠遷移率的偏移，看來在CNTF與CNTF受體的摩濃度大致相等時完成。這些結(jié)果表明，huCNTF1與CNTF聯(lián)合緊密。
在那時，對部分試樣在如上所述的相同凝膠過濾柱上進行的分析表明，全部蛋白質(zhì)都以相應于受體-CNTF復合物的主吸收峰區(qū)內(nèi)洗脫，而不存在對應各別蛋白成分峰的跡像。作為對比，將第二部分樣品在0.1%三氟乙酸-乙腈中用C8柱體(Applied Biosystems)做反相色譜分析。如同所預計和先前在這種強酸-有機溶劑溶混合物中用其它受體[Cunningham等，Science，254，821-825(1991)]所觀察的那樣，受體-CNTF復合物解離成其所含的兩個各別成分，從而證實了該復合物的組成。
這些結(jié)果表明，在這些實驗條件下(即受體和CNTF濃度為80nM并接近生理的離子強度，PH和溫度諸條件)，重組CNTF受體與CNTF形成穩(wěn)定的復合物。
8.實施例CNTF/受體復合物促使髓樣白血病細胞的分化8.1.材料和方法8.1.1.細胞培養(yǎng)條件將M1細胞(一種髓樣白血病衍化的細胞系)在Dulbecco改變的Eagle培養(yǎng)基和10%馬血清中進行培養(yǎng)。以每凹孔50，000個細胞的密度將其接種于NUNC24凹孔平板中。將細胞素和/或CNTF受體加到各凹孔中，并于5天后對培養(yǎng)物評價分化的表型?？扇苄訡NTF受體在E.Coli中產(chǎn)生，并純化成均質(zhì)。
8.1.2.表型評價未分化的M1細胞為圓形且有明相又不粘連底物。這些細胞被評為(-)。當細胞越加分化時，就粘連底物，相光澤減退，呈現(xiàn)不規(guī)則至紡錘形的形態(tài)，且延長各過程。根據(jù)其具有這些特征的程度，將培養(yǎng)物評為(+)到(++++)。在最佳條件下，IL-6處理得分(++)而LIF處理得分(+++)。極高濃度的CNTF和CNTFR使這些特征表現(xiàn)得最強，且被評為(++++)。
8.2.結(jié)果在20ng/ml濃度下，觀察到的細胞最大應答是在IL-6(++)和LIF(+++)時。表1列出大鼠CNTF和可溶性人受體在不同結(jié)合使用情況下所處理M1細胞的應答結(jié)果。表2列出該細胞對人CNTF和人受體在不同結(jié)合使用情況下的應答。顯然，CNTF與其受體結(jié)合使用的情況要比二者中任用一種的情況所引發(fā)的應答要有效得多。單有受體，在所試的任何濃度下，都不引起分化，即使很高的各濃度下也是如此，單有CNTF，看來確實會引起應答。最后，對一些實驗而言，天然受體在COS細胞中產(chǎn)生且經(jīng)磷脂酶C處理后，自細胞表面切斷下來。在這些實驗中，可溶受體的濃度未予測定。這種受體與200ng/ml大鼠體CNTF的結(jié)合使用，也產(chǎn)生分化，而僅只CNTF抑或CNTFR卻沒有這種作用。
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9.實施例CNTF在介導CLIP蛋白磷酸化和前早基因表達方面類似LIF9.1.材料和方法9.1.1.試劑用于此項研究的重組大鼠CNTF的制備和純化，先前已有記述[Masiakowski等，J.Neurochem.571003-1012(1991)]。鼠IL-6(mIL-6)購自UBI(Upstate Biotech，Inc.NY)，而重組人LIF購自Amgen Biologicals(CA)。從牛腦中提純的bFGF，購自R &amp; D System，而NGF從小鼠下頜腺中提純。所用的蛋白激酶抑制劑，包括H-7[1-(5-異喹啉磺酰基)-2-甲基哌嗪二鹽酸鹽，Seikagaku Kagyo Co.]和星狀孢子(Kamiya Biomed.Co)。與瓊脂糖珠接合的抗磷酸酪氨酸單克隆抗體，來源于Upstate Biotech.，Inc.(NY)。
9.1.2.細胞結(jié)構(gòu)如先前文獻中所述[Birren等，Neuron 4189-201(1990)]，將MAH細胞保持在培養(yǎng)物中。簡短地說，將該細胞以6K/6mm凹孔或40K/16mm凹孔的密度鋪復在預先涂以聚D-賴氨酸(100μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)的培養(yǎng)皿中。所用的培養(yǎng)基為補充以10%FBS和地塞米松(5μM)的改型L15-CO2培養(yǎng)基。將IARC-EW-1(Ewing肉瘤細胞)和SK-N-LO(神經(jīng)上皮瘤細胞)在含10%胎牛血清、補充以2mM L-谷氨酰胺和100單位/ml的青霉素與鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。PC12細胞在補充以6%馬血清、6%幼牛牛清、2mM L-谷氨酰胺及100單位/ml青霉素與鏈霉素的Dulbecco改變的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
9.1.3.MTT測定，3H-胸苷參入測定及ChAT測定在添加MTT染劑(最終濃度0.5mg/ml)之前，用因子處理MAH細胞不同時間周期。繼續(xù)保溫8小時，并添加DMSO，以溶解由活體細胞所吸收的染料產(chǎn)物。用FLow Titretek多重掃描儀測定570-650nm的光密度值。為進行3H-胸苷摻入測定，將細胞用各種因子處理不同時間周期，再以1uCi/ml的最終濃度添加3H-胸苷(NEN-NET-027E)，并在37℃下保溫4小時。然后，用PBS洗滌細胞三遍，在室溫下用NaOH(0.5N)溶解2小時，并計數(shù)3H-DNA。采用標準技術生產(chǎn)ChAT。簡短地說，用不同因子處理細胞，用冰冷的PBS洗滌該細胞，加入含20mM Tris-HCl(PH8.6)和0.1% Triton X-100的ChAT收集緩沖劑，并將其在冰上保溫15min。然后，在37℃下將細胞萃取物同反應混合物一起保溫60分鐘，所述反應混合物含11mM膽堿鹽酸鹽，0.2mM 14C-乙?；鵆oA，0.14mM毒扁豆堿，300mM NaCl，50mM Na3PO4，20mM EDTA。將此混合物的一個等分試樣與含乙腈/四苯硼(5mg/ml)的閃爍流體混合，并記數(shù)。
9.1.4.RNA分離與分析將細胞以100mm平皿上含5×106個細胞的密度鋪復，再用因子處理不同時間周期。用早先文獻中所述的硫氰酸鈲法制備總RNA[Chomczynski等，Anal，Biochem.162156-159(1987)]。將10μg RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(MSI)上，并雜交到由無規(guī)微啟動(stragene)標記的32p-探針上。所用的探針包括tis11(2.3 kb EcoR1片段)、c-fos(1kb Pst片段)、大鼠CNTF受體(rCNTFR，0.4kb Pst片段)和GAPDH(1.25kb Pst片段)。
9.1.5.蛋白質(zhì)分離，免疫沉淀和免疫印跡為了檢測蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，在無血清的規(guī)定培養(yǎng)基中，將約1-2×106個細胞斷養(yǎng)60分鐘，用不同因子處理5分鐘，并如早先文獻中所述，用RIPA緩沖劑(補充以蛋白酶和磷酸酶抑制劑)制備蛋白質(zhì)溶胞產(chǎn)物[Glass等，Cell66405-413(1991)]。為制備總蛋白樣品，將承截蛋白的染劑直接加入RIPA溶胞產(chǎn)物上清液中，并于90℃沸騰3分鐘。另外，將RIPA溶胞產(chǎn)物的上清液在4℃下，用100μl與抗-磷酸酪氨酸抗體(4G10)接合的瓊脂糖沉淀過夜，再用RIPA緩沖液洗滌3遍。用200μl(1x)承載蛋白的染劑將蛋白從瓊脂糖珠洗脫出來，再沸騰3分鐘。將50μl的總蛋白試樣品抑或免疫沉淀物，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如早先文獻中用抗-磷酸酪氨酸抗體進行免疫印跡[Glass等，Cell66405-413]，并用125I標記的山羊抗小鼠多克隆抗體(1μl的4.91uCi/μg每ml緩沖液，DuPont)。為免疫沉淀PC12細胞中的ERK蛋白質(zhì)起見，用ERK特異性抗體(Zymed，Inc)和隨后用與瓊脂糖接合的山羊抗小鼠IgG抗體免疫沉淀細胞的溶胞產(chǎn)物。將沉淀物進行如上所述的電泳并用同樣的ERK抗體免疫印跡。
9.1.6.細胞表面生物素化測定在同LIF或CNIF一起保溫5分鐘以誘導CLIP磷酸化后，將細胞在補充1mM原釩酸鹽的5ml PBS(PBSV)中洗滌，然后在含1mg/ml NHS-SS-生物素(3-[2-(生物素氨基)乙基]二硫代]丙酸 3-硫代琥珀酰亞胺酯;一種不透膜試劑，Pierce)的PBSV中，于冰上保溫10分鐘。然后將細胞平皿用含原釩酸鹽的tris-緩沖鹽水洗滌，并如上所述用RIPA緩沖液溶解。如前所述，用固定化的抗-磷酸酪氨酸抗體沉淀溶胞產(chǎn)物，然后經(jīng)在PH8.2且含1%SDS的50mM tris中沸騰5分鐘，以此將結(jié)合的磷蛋白自瓊脂糖珠取出。同20L抗生蛋白鏈菌素-瓊脂糖(Pierce)一起保溫1小時，以此使生物素化蛋白自該溶液中沉淀出來。在添加樣品緩沖液后，將含未生物素化蛋白的上清液置于SDS PAGE。在結(jié)合緩沖液中，再一次洗滌含生物素化蛋白的小珠，然后在含10%β-疏基乙醇的2X SDS PAGE樣品緩沖液中沸騰5分鐘使結(jié)合的生物素化蛋白自小珠中洗脫出來。按上所述進行這樣品上的抗-磷酸酪氨酸免疾印跡。
9.2.結(jié)果9.2.1.CNTF與LIF的介導生長停滯和MAH細胞的分化本實施例中所用的MAH細胞系，通過用v.myc致癌基因使交感腎上腺先植細胞不滅化(immortalizing)而得[Birren等，Neuron 4189-201(1990)]。用CNTF處理MAH細胞，顯著地阻斷了培養(yǎng)這類細胞時通常出現(xiàn)的細胞數(shù)量的增長。對成熟交感神經(jīng)元具有類似CNTF作用的LIF在CNTF或LIF-處理的培養(yǎng)物中也阻斷MAH細胞中通常出現(xiàn)的細胞數(shù)量增長，使該培養(yǎng)物在4天時間內(nèi)細胞數(shù)基本保持不變，而對比培養(yǎng)物則以指數(shù)速率不斷累積(圖7B)。CNTF和LIF的作用均表現(xiàn)出非常相似的劑量依賴性，其EC50值約為50pg/ml(或2pM)(圖7C);這一劑量依賴性相似于觀察CNTF對睫狀神經(jīng)元存活作用所知的劑量依賴性[Masiakowski等，J.Neurochem 571003-1012(1991)]。不像CNTF抑或LIF，堿性成纖維細胞生長因子(FGF)對這些細胞起著潛在促有絲分裂劑的作用(圖7C插圖)，這正如早先文獻[Birren等，Neuron 4189-201(1990)]中所述的那樣。
在MAH細胞中CNT和LIF，都不誘導軸突擴張或神經(jīng)元分化的其它形態(tài)學變化特征。然而，細胞周期分析顯示，用CNTF處理的MAH細胞在細胞周期的G1階段停滯，該階段記憶許多誘導增生狀態(tài)和細胞分化間轉(zhuǎn)變的因子。已表明CNTF誘導交感先祖細胞的膽堿能分化，且CNTF和LIF都誘導成熟交感神經(jīng)元的膽堿能分化。為了尋求CNTF和LIF對MAH細胞具有分化效應的可能性，我們測定了膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)應答這些配體時的活性誘導。如圖8A所示，用CNTF或LIF處理MAH細胞，導致ChAT活性約提高2倍，而bFGF則沒有效應。而且，將MAH細胞暴露于CNTF24小時，在用NGF刺激PC12細胞分化時，會導致低親和性NGF受體mRNA的增加。
總之，上面的數(shù)據(jù)表明，CNTF對交感腎上腺先祖細胞起著生長停滯/分化因子的作用。這些行為看來與FGF的行為截然不同。FGF除了起MAH細胞促有絲分裂劑作用外，還誘導軸突增生并引發(fā)這些細胞的神經(jīng)元分化(而不是膽堿能分化);FGF誘導的分化，可能產(chǎn)生NGF-依賴細胞。因此，多因子通常能夠影響神經(jīng)元先祖細胞的分化。MAH細胞看來是一種非常有效的模型體系，該體系中剖析不同因子在調(diào)解神經(jīng)元分化不同方面的作用。
9.2.2.CNTF和LIF快速誘導細胞蛋白酪氨酸磷酸化的不易分辨圖型盡管細胞素并不利用含有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的受體，但酪氨酸磷酸化仍被多種不同細胞素快速誘導。為了確定CNTF是否在應答細胞中誘導酪氨酸磷酸化，也為了將這類磷酸化與由CNTF結(jié)構(gòu)遠緣所誘導的磷酸化相比較，我們首先檢驗了CNTF和LIF在MAH細胞及在神經(jīng)上皮瘤及Ewing肉瘤細胞中的應答。如圖9所示，CNTF和LIF都快速誘導MAH細胞，Ewing肉瘤(EW-1)和神經(jīng)上皮瘤(SK-N-LO)細胞中的三種蛋白(標為CNTF-和LIF-可誘導磷蛋白的p200CLiP1、p160CLiP2和P75CLiP3)酪氨酸磷酸化。任一因子在檢驗的不同細胞系中誘導的磷酸化圖型是難于分辨的，因此，對CNTF有不同表型應答(即就細胞生長而言)的CNTF受體陽性細胞系，在應答CNTF時呈現(xiàn)難于分辨的磷酸化圖型。所觀察的酪氨酸磷酸化應答，具有劑量依賴性，CNTF和LIF都在10ng/ml時獲得最大誘導。
為了確定是否CLIP磷酸化為CNTF和LLF應答的特異性特征，我們將CNTF和LIF的磷酸化圖型與FGF和NGF的磷酸化圖型做了比較。雖然MAH細胞和EW-1細胞都應答FGF，但各種CLIP在任何一種細胞系中應答FGF時都不被磷酸化(圖9)。同樣，各CLIP在應答NGF的嗜鉻細胞瘤細胞系PC12中應答NGF時，也不被磷酸化(Figure 10C)。
被稱為胞外信號調(diào)節(jié)激酶或ERKs的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家系，近來已被確認，定性并被分子克隆[Boulton等，Cell65663-675(1991)]。該ERKs(也稱為MAP或MBP激酶)的激活，要求酪氨酸磷酸化[Boulton等，Cell65663-675(1991)]，而且在受體酪氨酸激酶與其相關配體結(jié)合后很快發(fā)生(如對NGF來說，見圖10C)。ERKs在應答不利用受體酪氨酸激酶的不同種促有絲分裂劑和分化劑時，也被激活。我們選擇檢驗了ERK在EW-1細胞中應答CNTF，LIF和FGF時的磷酸化。與FGF相比，CNTF或LIF并不誘導可能被識別為ERK2(圖10B)的40KD蛋白的快速酪氨酸磷酸化(圖10A)。
我們的發(fā)現(xiàn)表明，誘導p200CLiP1、p160CLiP2和P75CLiP3酪氨酸磷酸化以CNTF和LIF所激活的信號轉(zhuǎn)導途徑為特征，并對該轉(zhuǎn)導途徑具有特異性。使一種尺寸類似于p160CLIP2的蛋白在同時應答IL-6和LIF時在酪氨酸上磷酸化[Nakajima and Wall，Mol.Cell.Biol，111409-1418(1991);Lord等，Mol.Cell.Biol.114371-4379(1991)];將這些被誘導蛋白之間可能有的聯(lián)系將在下面提及。與CNTF和LIF受體介導的應答不同，激活酪氨酸激酶受體的應答(諸如FGF和NGF所誘導者)，不產(chǎn)生CLIP磷酸化。相反，酪氨酸激酶受體的刺激，則使ERKs被快速激活，而ERKs不被CNTF抑或LIF快速磷酸化。
9.2.3.CLIPS的快速瞬時磷酸化先于特征性前早應答基因Tis11的誘導由配位體受體相互作用啟動的某個信號轉(zhuǎn)導串(cascade)的誘導，常常從激活酪氨酸磷酸化開始，隨后激活前早應答基因。先前的文獻中之記載，在p160的快速瞬時酪氨酸磷酸化居先于LIF及IL-6同時對前早基因表達的激活[Nakajima and Wall，Mol.Cell.Biol.111409-1418(1991);Lord等，Mol.Cell.Bilo.114371-4379(1991)]。在圖11中，我們將CNTF或LIF誘導的CLIPs酪氨酸磷酸化時程與前早基因表達的激活進行了比較。我們專門檢驗了一種表現(xiàn)得具有IL-6所介導應答特征的前早應答基因tis11的表達，以及另一種對IL-6應答不表現(xiàn)出其特異性的前早基因c-fos的表達。在MAH細胞中，CNTF和LIF對所有三種CLIPs的酪氨酸磷酸化誘導都很快，在5分鐘內(nèi)發(fā)生，且在30分鐘后明顯減弱(圖11)。在EW-1細胞中，兩種因子的磷酸化動力學很相似。
在MAH細胞中，CNTF和LIF都在CLIP磷酸化誘導之后產(chǎn)tis11基因表達誘導。最大程度的激活發(fā)生在45分鐘時，并在120分鐘以前回降到無激活水平(圖11B)。
在EW-1細胞中，觀察到tis11的相似基因激活動力學，在MAH細胞中無論用CNTF，還是用LIF，都未觀察到c-fos表達的誘導(圖11B)。然而，bFGF不像CNTF和LIF，它在沒有tis11基因誘導的情況下，卻在MAH細胞中誘導c-fos基因表達(圖11C)。CNTF和LIF在EW-1細胞中，既誘導tis11，又誘導c-fos(圖11C)。
我們的試驗結(jié)果表明，繼而誘導tis11基因表達的三種CLIPS的快速磷酸化以CNTF和LIF都在神經(jīng)元細胞系中應答為特征。對有一種160KD磷蛋白(CLIP2)及tis11參與的上述那些過程進行測時，可以看出CNTF和LIF在神經(jīng)元細胞中利用的轉(zhuǎn)導途徑與IL-6和LIF在造血細胞中激活的途徑之間有著相似性。直接比較酪氨酸磷酸化過程，會看出明顯相似性與不同性。LIF在M1髓樣先祖細胞系中誘導了與CLIP1，CLIP2和CLIP3尺寸等同的蛋白的酪氨酸磷酸化，而IL-6僅誘導了這些蛋白中相應于CLIP2(可能為p160)和CLIP3的兩種蛋白的酪氨酸磷酸化;CNTF在M1細胞中并不誘導任何可檢測的酪氨酸磷酸化(圖12)。
特異性磷酸化過程，可用不同的蛋白激酶抑制劑加以區(qū)別。我們利用蛋白激酶抑制劑星狀孢子與H-7，來進一步證實CNTF與LIF誘導的磷酸化是等同的，并確定激酶級聯(lián)(cascades)導致的tis11激活對CNTF，LIF和IL-6來說是否相似;使用H-7是因其特異地阻斷IL-6誘導tis11基因所需的下游激酶又不影響引發(fā)酪氨酸磷酸化過程[Nakajima及Wall，Mol.Cell.Biol.111409-1418(1991);Lord等Mol.Cell.Biol 114371-4379(1991)]。如圖13所示，在MAH細胞抑或EW-1細胞中，CNTF和LIF誘導的酪氨酸磷酸化過程都被星狀孢子所阻斷，但不被H-7所阻斷。然而，H-7同樣阻斷MAH細胞中CNTF和LIF誘導tis11基因誘導(圖13C)或M1細胞中IL-6和LIF誘導tis11基因誘導(圖13D);如根據(jù)磷酸化數(shù)據(jù)所予見，星狀孢子也阻斷tis11基因誘導。
因此，通過直接比較同時使用蛋白激酶抑制劑的各磷酸化過程可表明，神經(jīng)元細胞系中被CNTF和LIF激活的信號途徑相應于造血細胞中LIF所用的信號途徑。而且，這一途徑難于區(qū)別于，但共有造血細胞中IL-6所激活途徑的許多新特征。
因此，該tis11誘導表現(xiàn)得能應答數(shù)種這類遠緣細胞系的特征，而這些不同的細胞素誘導的機制，表現(xiàn)了類似于蛋白激酶抑制劑的敏感性。
M1細胞并不表達CNTF受體，也不應答CNTF，而所檢驗的MAH細胞系、Ewing肉瘤細胞系和神經(jīng)上皮瘤細胞系，則不應答IL-6。能夠找到可將對CNTF，LIF或IL-6的應答加以分離的細胞系，這一發(fā)現(xiàn)表明，這些因子中的任意兩種因子都不采用等同的受體。
9.2.4.以CNTF或LIF予處理所致CLIP1和CLIP2的下調(diào)節(jié)不能經(jīng)添加CNTF或LIF而逆轉(zhuǎn)正如所料，若CNTF和LIF共有信號轉(zhuǎn)導成分，則由于用CNTF或LIF予處理造成的CLIP1和CLIP2磷酸化下調(diào)節(jié)，不能通過隨后添加其它因子而克服(圖14A)。而且，這些因子的亞飽和濃度，呈現(xiàn)對MAH細胞生長抑制的累加效應，而飽和濃度則不再累加。
9.2.5.CLIPS在細胞表面的表達為確定CLIPs是否在細胞表面表達，我們利用一種專門造成細胞表面蛋白生物素化的測定方法[Stah1等，Biochemistry29，5405-5412(1990)]。這種測定揭示，CLIP1和CLIP2確實表達能被生物素化的胞外結(jié)構(gòu)域(圖14B);CLIP1的表面定位還與這樣的發(fā)現(xiàn)相符合，即在進行肽-N-糖苷酶F處理時，CLIP1的表現(xiàn)尺寸減小。
10、實施例CLIP2的特征記述10.1.CLIP2等同于gp130
用一種對人gp130特異的單克隆抗體(AM64)考察IL-6、CNTF和LIF共有與對CNTF和LIF都應答的人體細胞系協(xié)同的gp130可能性[Hibi等，Cell 631149-1157(1990)]。這種抗體不結(jié)合任何與gp130相關的蛋白，也不結(jié)合嚙齒種的gp130。gp130的免疫沉淀揭示，在EW-1細胞中它在應答CNTF抑或LIF時都被強烈酪氨酸磷酸化，而且這種磷酸化的gp130與CLIP2一起共遷移(將圖14C中第3，7道與第2，6道比較)。而且，抗-gp130抗體可用來從CNTF/LIF-誘導的EW-1細胞的萃取物中完全排除CLIP2(將圖14C中的第4，8道與第2，6道比較)。由這些數(shù)據(jù)我們可以推斷，CNIP2確實為gp130，因而gp130在應答CNTF和LIF時是被磷酸化的酪氨酸。有趣的是，當使用AM64抗體時，CLIP1部分地與gp130共沉淀，這表明該兩種分子可能存在于復合物中，不太強烈的溶胞條件(如用毛地黃皂苷)能夠在應答CNTF處理時提高CLIP1與gp130的共沉淀量。
10.2.抗gp130抗體選擇阻斷CLIPs的酪氨酸磷酸化和tis11誘導在有或無抗-gp130抗體雞尾酒(2μg/ml)存在下在規(guī)定的培養(yǎng)介質(zhì)中使EW-1細胞斷養(yǎng)1小時。分別在酪氨酸磷酸化測定和RNA分析之前，將該細胞用不同因子處理5分鐘或45分鐘。
檢驗抗-gp130抗體在EW-1細胞中阻斷CNTF和LIF誘導的酪氨酸磷酸化的能力，所述抗體之顯示抑制肝細胞瘤細胞系中的IL-6應答。數(shù)據(jù)表明，由CNTF或LIF誘導的CLIP1和CLIP2的酪氨酸磷酸化(圖17A)及tis11基因表達(圖17B)都被抗-gp130抗體完全阻斷。另一方面，由不相關配位體EGE誘導的酪氨酸磷酸化則不受影響。
10.3.gp130被普遍表達而CNTFR的表達較為有限基于gp130轉(zhuǎn)錄本比IL-6R轉(zhuǎn)錄本分布寬得多的發(fā)現(xiàn)[Hibi等，Cell631149-1157(1990)]，前已推測，gp130起著IL-6之外其它因子的轉(zhuǎn)導物的作用。與這種見解和我們關于CNTF和LIF發(fā)信號體系共用gp130的發(fā)現(xiàn)相符，我們認為，gp130轉(zhuǎn)錄本在應答IL-6(而不是CNTF)的兩種造血細胞系中(圖15，注意M1和B9細胞系)及應答CNTF和LIF(而不是IL-6)的成熟腦組織(圖16)和神經(jīng)元細胞系中(圖15，注意MAH，EW-1，SK-N-LO和SH-SY5Y細胞系)被表達。對比來看，inCNTFR mRNA呈限制性分布，且在這一實驗中，僅在應答CNTF的腦細胞系和神經(jīng)元細胞系中表達(圖15)。
實施例11.ES細胞應答CNTF11.1.以LIF或CNTF培養(yǎng)ES細胞此項研究所用的129/Sv/Ev XY ES細胞系(Elizabeth Robertson贈)得自黑灰色(BBAA)小鼠[Robertson等，Nature323 445-448(1986)]。一般，使ES細胞生長在STO細胞喂養(yǎng)層上[以絲裂霉素C(Sigma chemical Co.產(chǎn))停滯生長]，并在Du lbecco改型的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Irvine Scientific)內(nèi)保持，該培養(yǎng)基中補充了10% FBS(Lot ＃ 11111020，Hyclone，)、0.1 mM β-巰基乙醇(Sigma Chemical Co.)、292mg/ml L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G和100mcg/ml硫酸鏈霉素(由L-谷氨酰胺、青霉素和硫酸鏈霉素組成的100倍儲液Irvine Scientific產(chǎn))。作為予防措施，以10ng/ml的濃度添加LIF(重組人LIF，Amgen Biologicals)，以防止分化。如先前文獻中所述，使ES細胞每隔3-4天在新制備的飽養(yǎng)細胞板(plates)上傳代[Robertson等，Nature323，445-448(1986)]。
為確定CNTF對ES細胞的效應，從ES細胞培養(yǎng)物中消除STO細胞和LIF。將ES細胞在LIF(20ng/ml)存在下，兩次繼代接種在涂膠的平皿上(0.1%豬皮明膠，Sigma Chemical Co.)，第二次繼代接種后，很少有STO細胞保留下來。在LIF(20ng/ml)存在下，使ES細胞生長一天，洗至無LIF，然后在有CNTF、LIF存在或無因子存在下培養(yǎng)7天。
11.2.RNA分析如先前文獻中所述[chomczynski等，Anal.Biochem.162，156-159(1987)]，用硫氰酸鈲法自ES細胞制備總RNA，使其在無STO飽養(yǎng)細胞存在下生長，并在LIF(20ng/ml)存在下保持。將10μg RNA在甲醛瓊脂凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(MSI)上，并雜交成32P標記的CNTF受體的cDNA探針(800bp，PstI片段)，該探針用隨機激啟動(Stratagene)標記。
11.3.CNTF結(jié)合到ES細胞上用Bolton-Hunter方法碘化重組大鼠CNTF[Bolton and Hunter，Biochem J.133529-539，(1973)]。在結(jié)合之前，將ES細胞以2.5×106細胞/35mm凹孔的密度鋪復在明膠板上，并使其在20ng/ml LIF存在下生長4天。自凹孔中去除培養(yǎng)基，并用測定緩沖劑(PBS，PH7.4，含BSA(1mg/ml)，0.1mM桿菌肽，1mM PMSF和抑酶醛肽(leupeptin)，(1μg/ml)將細胞洗滌一遍。將細胞同125 I-rCNTF(700pM)一起于室溫下保溫2小時，隨后用測定緩沖劑快速洗滌兩次。用含1% SDS的PBS溶解該細胞，并監(jiān)測其放射性。
11.4.結(jié)果11.4.1.ES細胞培養(yǎng)在無飼養(yǎng)細胞而有LIF(10-20ng/ml)存在下維持的ES細胞，保持為未分化小細胞的致密集落。不過，較低濃度的LIF(低于10ng/ml)則導致ES細胞內(nèi)分化2-7天，這為內(nèi)胚層類細胞和扁平大細胞的存在所證實。也發(fā)生某種程度的細胞死亡(圖18，A部)。為確定在無飼養(yǎng)細胞存在下，CNTF是否還能維持ES細胞呈不分化態(tài)，使ES細胞在有不同濃度CNTF的明膠板上生長。低濃度的CNTF(5pg/ml-10ng/ml CNTF)產(chǎn)生分化和某種程度的細胞死亡。然而，高于10ng/ml直至50ng/ml濃度的CNTF，則使ES細胞維持小而密集的細胞集落(圖18，B部)。維持在既無LIF又無CNTF存在下的ES細胞，在2-7天內(nèi)呈現(xiàn)內(nèi)胚層狀或大而扁平狀(圖18，C部)。
11.4.2.CNTFR在ES細胞的表達對源于ES細胞的RNA進行的Northern分析表明，CNTF受體mRNA以比成熟大鼠腦低的含量存在(圖19)。
11.4.3.CNTF對ES細胞的結(jié)合ES細胞對125I-rCNTF呈85%特異性結(jié)合，其總結(jié)合體CPMave(每分鐘平均記數(shù))＝10235+157而非特異性CPMave＝1517+163。
11.4.4.ES細胞中CNTF和LIF對tis11的誘導將ES細胞鋪復在涂有明膠的平皿上;并使具在有CNTF(20ng/ml)抑或LIF(20ng/ml)存在下，保持未分化態(tài)。將細胞在規(guī)定的培養(yǎng)基中洗滌兩次，并在持續(xù)45分鐘添加CNTF(50ng/ml)或LIF(50ng/ml)之前，于規(guī)定的培養(yǎng)基中使其斷養(yǎng)2小時。制備總細胞RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠上電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜(MSI)，并雜交到32P-標記的tis11探針上(圖20)。在ES細胞中，CNTF和LIF都在tis11基因表達中產(chǎn)生類似的誘導，這表明ES細胞對這些細胞素都應答。
參考資料本文援引了多種公開文獻，均在此一并資作參考。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Ip等(ⅱ)發(fā)明名稱無細胞睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子/受體復合物(ⅲ)序列數(shù)6(ⅳ)通信地址(A)收件人Pennie &amp; Edmonds(B)街道美國1155大道(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家U.S.A.
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(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度200氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1591堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(cDNA)(ⅸ)特征(A)名稱/標示CDS(B)位置289..1404(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3的序列描述
(2)SDQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度372氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO4
(2)SED ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度43堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5CGCAGTGTCG ACAGCACAGC GICACAGTCC ACAAGAAGCA CCC 43(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型DNA(ⅳ)反意義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6GGACGCCGGC CGATTAGGGT GCGCAGGGTC CCCCG 3權利要求
1.一種基本純化的無細胞蛋白復合體，其含有穩(wěn)定結(jié)合于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
2.權利要求1的蛋白復合物，其中該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子具有基本如圖1所示的氨基酸序列。
3.權利要求1的蛋白復合物，其中該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體具有基本如圖2所示的氨基酸序列。
4.權利要求1、2或3的蛋白復合物，其中該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子非共價健合于該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體。
5.權利要求1、2或3的蛋白復合物，其中該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子共價健合于該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體。
6.權利要求1、2或3的蛋白復合物，其進一步含有能夠?qū)⑺鰪秃衔锱c一靶細胞連接的連接分子。
7.權利要求6的復合物，其中所述連接分子為一種抗體。
8.權利要求6的復合物，其中所述的連接分子為一種抗原決定基。
9.權利要求8的復合物，其中所述的抗原決定基結(jié)合一種與靶細胞結(jié)合的抗體。
10.一種基本純化的無細胞蛋白復合物，其含有睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體(CNTFR)和一種能夠?qū)⑺鍪荏w結(jié)合于靶細胞的連接分子。
11.權利要求10的復合物，其中所述連接分子為一種抗體。
12.權利要求10的復合物，其中所述連接分子為抗原決定基。
13.權利要求12的復合物，其中所述抗原決定基結(jié)合一種與靶細胞結(jié)合的抗體。
14.一種含權利要求1所述蛋白復合物的藥用組合物。
15.一種含權利要求2所述蛋白復合物的藥用組合物。
16.一種含權利要求3所述蛋白復合物的藥用組合物。
17.一種含權利要求4所述蛋白復合物的藥用組合物。
18.一種含權利要求5所述蛋白復合物的藥用組合物。
19.一種含權利要求6所述蛋白復合物的藥用組合物。
20.一種含權利要求7所述蛋白復合物的藥用組合物。
21.一種含權利要求8所述蛋白復合物的藥用組合物。
22.一種含權利要求9所述蛋白復合物的藥用組合物。
23.權利要求22的藥用組合物，其還含有能夠結(jié)合抗原決定基和靶細胞的抗體。
24.一種含權利要求10所述蛋白復合物的藥用組合物。
25.一種含權利要求11所述蛋白復合物的藥用組合物。
26.一種含權利要求12所述蛋白復合物的藥用組合物。
27.權利要求26的藥用組合物，其還含能結(jié)合抗原決定基和靶細胞的抗體。
28.權利要求24-27中任一項所述的藥用組合物，其還含CNTF。
29.一種促細胞分化的方法，其包括將應答CNTF/受體復合物的細胞露置于有效量的權利要求1所述蛋白復合物。
30.一種促細胞分化的方法，其包括將應答CNTF/受體復合物的細胞露置于有效量的權利要求2所述蛋白復合物。
31.一種促細胞分化的方法，其包括將應答CNTF/受體復合物的細胞露置于有效量的權利要求3所述蛋白復合物。
32.一種促細胞分化的方法，其包括將應答CNTF/受體復合物的細胞露置于有效量的權利要求4所述蛋白復合物。
33.一種促細胞分化的方法，其包括將應答CNTF/受體復合物的細胞露置于有效量的權利要求5所述蛋白復合物。
34.一種促細胞分化的方法，其包括將表達一種受體的細胞露置于有效量的權利要求1所述蛋白復合物，該受體為CNTF/IL-6/LIF受體家系一成員。
35.一種促細胞分化的方法，其包括將表達一種受體的細胞露置于有效量的權利要求2所述蛋白復合物，該受體為CNTF/IL-6/LIF受體家系之一成員。
36.一種促細胞分化的方法，其包括將表達一種受體的細胞露置于有效量的權利要求3所述蛋白復合物，該受體為CNTF/IL-6/LIF受體家系之一成員。
37.一種促細胞分化的方法，其包括將表達一種受體的細胞露置于有效量的權利要求4所述蛋白復合物，該受體為CNTF/IL-6/LIF受體家系之一成員。
38.一種促細胞分化的方法，其包括將表達一種受體的細胞露置于有效量的權利要求5所述蛋白復合物，該受體為CNTF/IL-6/LIF受體家系之一成員。
39.權利要求34的方法，其中該細胞應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
40.權利要求35的方法，其中該細胞應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
41.權利要求36的方法，其中該細胞應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
42.權利要求37的方法，其中該細胞應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
43.權利要求38的方法，其中該細胞應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
44.權利要求34的方法，其中該細胞不應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
45.權利要求35的方法，其中該細胞不應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
46.權利要求36的方法，其中該細胞不應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
47.權利要求37的方法，其中該細胞不應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
48.權利要求38的方法，其中該細胞不應答睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
49.權利要求34-36之任一項所述的方法，其中所述受體為gp130或LIFRβ。
50.一種處治細胞分化障礙患者的方法，包括向患者投用有效量的權利要求1所述蛋白復合物。
51.權利要求50的方法，其中的病癥為髓樣白血病。
52.一種在細菌中產(chǎn)生睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體的方法，其包括(ⅰ)在于細菌宿主中轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒表達載體中表達編碼核酸的睫狀神經(jīng)營性因子;(ⅱ)從細菌宿主中分離包含體;(ⅲ)用氯化鈲處理包含體;(ⅳ)透析步驟(ⅲ)的產(chǎn)物;(ⅴ)將步驟(ⅳ)的產(chǎn)物凝膠過濾。
53.制備權利要求1所述蛋白復合物的方法，其包括在正常的生理條件下，將基本等摩爾量的重組睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性受體相配合。
54.權利要求53的方法，其中正常的生理條件為PH＝8.0，100mM Tris-HCl和50mM NaCl。
55.識別睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子/受體復合物所用靶細胞的方法，包括(ⅰ)將公認的靶細胞露置于有效量的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子/受體復合物中;(ⅱ)評價CLIP蛋白在按步驟(ⅰ)制備的細胞中的磷酸化作用;和(ⅲ)將步驟(ⅱ)測定的CLIP蛋白磷酸化與由IL-6，LIF或CNTF在其靶細胞中引發(fā)的磷酸化型式相比較，其與任一型式的類似性表明該公認的靶細胞即為該睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子/受體復合物的靶細胞。
56.權利要求52的方法所產(chǎn)生的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性分子。
57.一種防止ES細胞分化的方法，包括在有效濃度的CNTF存在下培養(yǎng)該ES細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的生物活性CNTF/受體復合物及其雜交體或突變體。本發(fā)明還部分基于這樣一個發(fā)現(xiàn)，即CNTF/受體復合物通過不表達該CNTF/受體的靶細胞上的信號轉(zhuǎn)導途徑來促進分化。本發(fā)明還提供一種促使信號轉(zhuǎn)導而不結(jié)合CNTF的特異性CNTFR突變體。本發(fā)明也提供一種CNTF/受體阻斷突變體，該突變體對CNTF的結(jié)合親和力高，但其不具有信號轉(zhuǎn)導功能。本發(fā)明還證實了該IL-6，CNTF，LIF和OSM信號轉(zhuǎn)導途徑所共用的受體成分，而啟動信號轉(zhuǎn)導則基于這類組分的存在。本發(fā)明另外還提供了治療及診斷應用方法，這種應用與該CNTF/受體復合物，雜交體或突變體在適宜靶細胞上引發(fā)生理應答的能力有關。
文檔編號C07K14/71GK1074220SQ9211535
公開日1993年7月14日 申請日期1992年12月2日 優(yōu)先權日1991年12月2日
發(fā)明者N·葉, N·彭納亞塔托斯, T·H·阿爾德里希, S·戴維斯, D·埃弗迪思, S·H·奈伊, S·P·施昆托, N·施塔爾, J·康諾弗, G·D·揚科普洛斯 申請人:里珍納龍藥品有限公司