專利名稱：用雜合前原區(qū)域表達神經(jīng)營養(yǎng)性因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在真核宿主細胞中構(gòu)建并表達作為生物活性神經(jīng)營養(yǎng)性因子的新的嵌合前原蛋白或前原肽。實質(zhì)上，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)嵌合前原蛋白或前原肽經(jīng)有效的翻譯后加工后，導致有生物活性的第二種神經(jīng)營養(yǎng)性因子蛋白的表達水平提高，所述的嵌合前原蛋白或前原肽含有與第二種，不同神經(jīng)營養(yǎng)性因子的成熟蛋白或其部分融合的第一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的前原區(qū)。
神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持依賴于已知稱之為神經(jīng)營養(yǎng)性因子的蛋白。神經(jīng)營養(yǎng)性因子是一種細胞激活素，一種作為信使并與其他細胞相聯(lián)系持續(xù)地協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)生物學功能。神經(jīng)營養(yǎng)性因子促進神經(jīng)系統(tǒng)組分的存活和/或分化。普遍的神經(jīng)細胞死亡伴隨著中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，并在調(diào)節(jié)可突出到指定靶區(qū)域的神經(jīng)元的數(shù)量中起明顯的作用(Berg，D.K.，1982，NeuronalDevelopment297-331)。對發(fā)育期間外周靶組組的部分切除和移植研究已經(jīng)表明，為了限制在它們的突出區(qū)域產(chǎn)生的存活因子(神經(jīng)營養(yǎng)性因子)的數(shù)量，在神經(jīng)元之間的競爭引起神經(jīng)細胞的死亡。目前鑒定的重要的神經(jīng)營養(yǎng)性因子包括神經(jīng)生長因子(NGF;Levi-MontalciniandAngeletti，1968，Phys.Rev.48534);促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3(NT-3;Hohnetal.，1990，Nature344∶339;Maisonpierreetal.，1990，science247∶1446)，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子(BDNF;Bardeetal.，1982，EMBOJ.，1549)，促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-4(NT-4;Hallbooketal.，1991，Neuron6∶845-858)，和纖毛神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF;Linet al.，1979，Science.246∶1023)。
在體內(nèi)，通常合成作為“前原”前體蛋白質(zhì)的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素?！扒霸眳^(qū)域是指前體的NH2-末端，在蛋白質(zhì)的成熟的，生物活性形式的生物合成中，經(jīng)蛋白水解作用除去上述末端?！扒啊眳^(qū)域是指在穿過細胞膜的過程中，通過蛋白水解作用過程，除去正常的信號序列以便產(chǎn)生一種蛋白原;然后通過蛋白水解作用除去“原”區(qū)域以產(chǎn)生成熟形式的蛋白質(zhì)(參見如Darnell et al.，1990，Molecular Cell Biology 2d ed.，Scientific American Books pp.650-657)。
2.1.1神經(jīng)生長因子神經(jīng)生長因子(NGF)是迄今為止這些神經(jīng)營養(yǎng)性分子中特征描述最完全的，并且在體外和體內(nèi)試驗已經(jīng)表明，在小雞和大鼠的早期發(fā)育中，神經(jīng)生長因子對于交感和神經(jīng)脊衍生的感受器神經(jīng)元的存活是必需的(Levi-MontalciniandAngeletti，1963，Develop.Biol.7∶653-659;Levi-Montalcinietal.，1968，Physiol.Rev.48524-569)。直到最近，對NGF的幾乎全部的研究都集中在它在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF也影響特定神經(jīng)元群體的發(fā)育和維持(Thoerenetal.，1987，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109∶145-178;WhittemoreandSeiger，1987，BrainRes.Rev.12∶439-464)。
在小鼠下頜腺中富含NGF蛋白質(zhì)從而允許通過相應的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學方法(AngelettiandBradshaw1971，Proc.Natl.Acad.Sci.682417-2420)確定初級氨基酸序列。使用基于由小鼠NGF蛋白質(zhì)序列能夠設(shè)計適當?shù)墓押塑账崽结槥榛A(chǔ)的傳統(tǒng)分子生物學術(shù)技術(shù)，已經(jīng)從許多種，包括鼠(Scottetal.，1983，Nature302∶538-540)，人(Uilrichetal.，1983，Nature303∶821-825)，牛和小雞(Meieretal.，1986EMBOJ.5∶1489-1493)和大鼠(Whitte-moreetal.，1988，J.Neurosci.Res.20∶402-410)中克隆了NGF基因。
小鼠NGF基因有約45kb，含數(shù)個小5′外顯子，通過不同的拼接而產(chǎn)生四種不同的mRNA(Serby et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3057-3064)。兩種主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生“長”和“短”NGF前肽原(Edwards，et al.，1986，Nature 319∶784-787;Serby，et al.，1987，Mol Cell.Biol.7∶3057-3064)?！岸獭鼻绑w在NH2-末端含一個位于原區(qū)域側(cè)的傳統(tǒng)的信號序列(前區(qū)域)?！伴L”前體在其NH2一末端含一個附加的“原區(qū)域”(參見如，Suter et al.，1991，EMBO.J.10∶2395-2400，

圖1)。到此為止，還未闡明“長”和“短”NGF前原前體之間的功能差異。然而，在大多數(shù)組織中。含有更豐富的較短的mRNA轉(zhuǎn)錄體(Edwards et al.，1986，J.Biol.Chem.263∶6810-6815)。
小鼠NGF的生物活性形式是一個含一個二聚體的7s復合體，該二聚體是NGF的α-亞單位和γ-亞單位與經(jīng)過完全加工的β-NGF成熟形式結(jié)合，所述的NGF的α-亞單位和γ亞單位是絲氨酸蛋白酶的激肽釋放酶家族的兩個成員(Varonetal.，Biochemistry7∶1296-1303;Masonetal.，1983，Nature.303∶300-307)。NGF前體的翻譯，加工分泌而形成NGF的生物活性形式已了解得很清楚。關(guān)于已報告的編碼小鼠NGF的cDNA序列長度(Scott，etal.，1983，Nature302∶538-540)，Darling等人(1983，ColdSpringHarborsymp.Quan.Biol.48427-433)利用一個體外無細胞翻譯系統(tǒng)鑒定在NGF7S復合體的生物合成中關(guān)鍵的中間體。經(jīng)蛋白水解處理除去前原NFG前體的信號序列，以便產(chǎn)生一個約31KD的NGF原。NGF原中間體的原區(qū)域含一對已知作為內(nèi)蛋白水解加工位點的精氨酸殘基。在這兩個殘基的任一位點上的蛋白水解加工產(chǎn)生一個附加的大(21KD)和小(18.5KD)的中間體?？梢詮纳鲜鲋虚g體中的任一個經(jīng)蛋白水解作用得到成熟的NGF。在某些生物合成NGF成熟形式的情況下，蛋白水解釋放一個COOH-末端二肽(arg-gly)。
已經(jīng)表明，在體內(nèi)γ-亞單位蛋白水解裂解NGF原前體形成成熟的NGF(Edward，etal.，1988，J.Biol.Chem.2636810-6815)。試圖在體外模仿上述過程，但未成功，體外模仿導致不可信的NGF原前體的加工。這可能由于體外翻譯產(chǎn)物的不正常折疊造成的。Silen和Agard(1989，Nature341∶462-464)證明原區(qū)域可有助于α-溶解蛋白酶前體的適當折疊。因此，NGF前體的原區(qū)域也可能在內(nèi)蛋白水解加工前需要適當?shù)恼郫B，以形成成熟的形式，并連接到有生物活性的7SNGF復合體中。Suter等人(1991，EMBOJ.10∶2395-2400)的描述支持上述假設(shè)，他們確定了在NGF原區(qū)域中，兩個部分保守區(qū)域的功能。已證明區(qū)域Ⅰ對于NGF在COS細胞中的表達是必需的。另外，發(fā)現(xiàn)定位在NGF原區(qū)域中，鄰近成熟編碼區(qū)的區(qū)域Ⅱ參與蛋白水解加工。
最近已經(jīng)證明在體內(nèi)NGF原的內(nèi)蛋白水解加工由人類的fur基因產(chǎn)物控制，該產(chǎn)物是與膜相連的內(nèi)蛋白酶，與編碼一酵母內(nèi)蛋白酶(Bresnahan，etal.，1990，J.CellBiol111∶2851-2859)的KEXZ基因有結(jié)構(gòu)同源性。
因此，活性形式的小鼠NGF的生物合成起始階段包括NGF基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能的可變拼接，以便產(chǎn)生能夠翻譯長或短的NGF前原前體的mRNA。長或短的前原NGF前體隨后進行一系列的內(nèi)蛋白水解加工過程，該加工過程可能是借助原區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征，使前體進行適當折疊而誘導，從而形成NGF的成熟形式。
2.1.2來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)性因子用豬腦為原料，Barde等人(1982，EMBO.J.1∶549-553)報告了一種因子，現(xiàn)稱作來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)性因子(BDNF)，它表現(xiàn)出可促進E10/E11小雞胚的脊根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活。在強堿性蛋白(等電點，pI10.1)中存在神經(jīng)營養(yǎng)性活性，該堿性蛋白在十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳中顯示有一個12.3KD的帶。應注意到BDNF的強堿性和分子大小與NGF單體很相似。
在互補的未決美國專利申請系列號07/400，591，申請日1989，8.30中第一次描述了完成克隆BDNF基因，該文獻引入本文作文參考(也可參見PCT國際公開No.WO91/03568，
公開日1991，3.21)。已對來自各種品種包括人，豬、大鼠和小鼠的完整的CDNA和/或基因組BDNF基因進行克隆，并測定了這些基因的序列。在COS細胞中完成了重組BDNF的表達。
BDNF神經(jīng)元特異性與NGF的區(qū)別的第一個證明是在體外證明純化的BDNF維持小雞胚E6，E9或E12的40-50%的與神經(jīng)基板衍生的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)無關(guān)的感覺神經(jīng)元的存活(Lindsayetal.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3∶115-129)。通過其自身或與BDNF偶聯(lián)，NGF對這些神經(jīng)元都沒有明顯的影響。在后來的外植體培養(yǎng)研究中表明BDNF似乎維持來自其他神經(jīng)基板衍生的感覺神經(jīng)節(jié)，包括巖狀神經(jīng)節(jié)，膝狀神經(jīng)節(jié)和腹側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)的存活和軸突生長(Daviesetal.，1986，J.Neurosci6∶1897-1904)，沒有任何一個神經(jīng)節(jié)對NGF敏感，除影響來自外周神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)的神經(jīng)元外，發(fā)現(xiàn)BDNF刺激來自鶉神經(jīng)脊突的培養(yǎng)細胞的存活和神經(jīng)原的分化(KalcheimandGendreau，1988，Develop，BrainRes.4179-86)。
兩項對BDNF的最新研究(Kalcheim，etal.，1987，EMBOJ.6∶2871-2873;HoferandBarde，1988，Nature311261-262)已經(jīng)指出在鳥類PNS發(fā)育中BDNF的生理作用。除了對神經(jīng)脊和神經(jīng)基板源的外周感受器神經(jīng)原的影響外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BDNF維持正在發(fā)育的CNS神經(jīng)元的存活，Johnson等人(1986，J.Neurosci63031-3938)提供的資料說明BDNF可維持來自E17大鼠胚的視黃醛神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)細胞的存活。
除影響培養(yǎng)中正在發(fā)育的神經(jīng)原的存活外，已經(jīng)表明，BDNF也影響培養(yǎng)的成熟的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
分析成熟BDNF的預測的一級結(jié)構(gòu)表明與NGF有驚人的相似;僅具有3個引入NGF序列中的缺口得到最佳匹配，對于各種NGF(從蛇到人)和BDNF共有51個等同物。重要的是，這些等同物包括6個半胱氨酸殘基。
2.1.3.促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3發(fā)現(xiàn)了叫做促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素家族的另一成員，并克隆了來自小鼠、大鼠和人中的NT-3基因(參見美國專利申請系列No.07/490，004，申請日1990，3，7，該文獻引入本文作為參考;也參見PCT國際公開No.WO91/03569，
公開日1991，3，21)。發(fā)現(xiàn)估算的PI為約9.5，有119個氨基酸組成的成熟小鼠NT-3蛋白質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)與確認的NGF和BDNF的相似;一個假設(shè)的含18個氨基酸的信號序列(分別與BDNF和NGF有5和9個氨基酸等同物)后面跟隨有含121個氨基酸的原序列(相當于小鼠NGF的103個氨基酸的原序列和小鼠BDNF的含112個氨基酸的原序列)。對成熟的小鼠NGF，BDNF和NT-3進行比較表明它們有54個氨基酸相同。已知在NGF和BDNF中參與形成二硫鍵(Leibrocketal.，1989，Nature341∶149-152;Angeletti，1973，Biochem.12∶100-115)的全部6個半胱氨酸殘基在保守的殘基中間。同樣，成熟的大鼠NT-3表現(xiàn)出與大鼠NGF有57%的同源性，與大鼠BDNF有58%的同源性;全部3種蛋白質(zhì)都享有120個殘基中的57個(48%)。此外，發(fā)現(xiàn)大鼠NGF和BDNF的6個半胱氨酸殘基在大鼠NT-3中是絕對保守的，并且這三種蛋白質(zhì)之間的最大同源區(qū)域表現(xiàn)出群集在這些半胱氨酸殘基周圍。
除在同一種內(nèi)NT-3，NGF和BDNF之間具有同源性外，在大鼠和人NT-3之間，編碼成熟多肽(119個氨基酸)的區(qū)域中觀察到高度保守的核酸序列。推測的成熟大鼠和人的氨基酸序列(以及小鼠的NT-3)表現(xiàn)出絕對相同使人聯(lián)想起高度保守的BDNF。在大鼠、小鼠、人和豬之間的成熟多肽的氨基酸序列中表現(xiàn)出完全相同。相反，成熟人的NGF和嚙齒類(大鼠和小鼠)的NGF的氨基酸序列有約10%的區(qū)別。
研究NT-3的神經(jīng)營養(yǎng)性活性表明NT-3能促進培養(yǎng)中的游離的脊根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活和軸突生長。進一步觀察NT-3發(fā)現(xiàn)，NT-3促進來自結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)節(jié)外植體的軸突生長，而BDNF促進從結(jié)狀神經(jīng)節(jié)而不是交感神經(jīng)節(jié)突出生長，并且NGF促進交感神經(jīng)節(jié)而不是結(jié)狀神經(jīng)節(jié)外植體的突出生長。因此，NT-3比BDNF或NGF有更寬的作用特異性。
2.1.4.促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-4最近已經(jīng)克隆并分離了NGF家族的一個新成員促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-4(Hallbooketal.，1991，Neuron6∶845-858)。已獲得了相當于爪蟾屬(Xenopus)和蝰蛇的NT-4基因的PCR片段，并隨后分離了基因組爪蟾屬的克隆。該克隆的核苷酸序列分析表明有一個236個氨基酸蛋白質(zhì)的開放閱讀框架，具有數(shù)個與NGF，BDNF和NT-3相似的結(jié)構(gòu)特征。這些特征包括一個推測的氨基酸末端信號序列和一個靠近蛋白水解斷裂位點的潛在的N-糖基化作用位點。如NGF，BDNF，和NT-3一樣，在一個外顯子中編碼了全部爪蟾屬前-原-NT-4蛋白質(zhì)。
2.2.生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素已經(jīng)試圖利用各種表達型載體和宿主生產(chǎn)重組促神經(jīng)營養(yǎng)性激素。
所有使用動物細胞表達系統(tǒng)(哺乳動物腎細胞)的研究中，Liebrock等人[Nature341∶149(1989)]報道了有生物活性的豬BDNF的表達，且Rosenthal等人[Neuron4∶767(1990)]，Maisonpierre等人[Science247∶1446(1990)]和Hohn等人[Nature344399(1990)]分別報道了有生物活性的各個種的NT-3的表達。另外，Chan等人[EP公開No.370171，
公開日1990.5]報道了通過桿狀病毒表達系統(tǒng)，用昆蟲細胞表達有生物活性的成熟的人BDNF。
就促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的微生物生產(chǎn)而論，Iwai等人[Chem.Pharm.Bull.344727(1986)]報道了編碼人NGF和其融合體的合成“基因”在大腸桿菌中的表達。產(chǎn)物唯一特征在于分子量，在用還原劑處理后，沒有任何信息表明有生物活性存在。
Dicou等人[J.NeuroscienceRes.22∶13(1989)]報告了在大腸桿菌中分別表達大鼠和hNGF融合體。Dicou等人(1989，J.Neurosci.Res.22∶13-19)把完整的小鼠前原一神經(jīng)生長因子DNA序列與大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的羧基末端融合，并且把相當于人神經(jīng)生長因子基因11到106密碼子的基因組DNA片段β-半乳糖苷酶氨基末端的第五密碼子融合。兩種細菌載體與表達大量的嵌合蛋白質(zhì)相關(guān)。雖然細菌細胞溶解后，大多數(shù)嵌合小鼠前原一神經(jīng)生長因子表現(xiàn)出是不溶的，但大多數(shù)人的嵌合β-神經(jīng)生長因子似乎存在于上清液中。還未報告神經(jīng)營養(yǎng)性活性。
最后，Hu等人[Gene70∶57(1988);andAbstract343.16ofthe20thAnn.MeetingoftheSocforNeuroscience(1990)]報告了在大腸桿菌中表達小鼠NGF。
本發(fā)明涉及新的含有生物活性神經(jīng)營養(yǎng)性因子的嵌合前原蛋白質(zhì)或前原肽，以及使用上述前體和它們的核酸序列生產(chǎn)有一種或多種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素生物活性的蛋白質(zhì)或肽。由本發(fā)明提供的嵌合前原分子包含一個與成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的雜合前原區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明可使用的成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列是指包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的同源分子。相似地，可以從包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神經(jīng)營養(yǎng)性激素分子中得到前原區(qū)域。本質(zhì)上，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)含有與腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的成熟部分融合的神經(jīng)生長因子的前原區(qū)域的嵌合前原蛋白或前原肽(前原NGF/BDNF)比同源前源腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子(前源BDNF)可更有效地經(jīng)真核宿主細胞加工。
本發(fā)明進一步基于發(fā)現(xiàn)能表達嵌合前原NGF/BDNF的經(jīng)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染和擴增的真核宿主細胞僅把BDNF的成熟形式分泌到培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明，可以用NGF的“長”或“短”的前原區(qū)域構(gòu)建嵌合的神經(jīng)營養(yǎng)性基因。
本發(fā)明也以發(fā)現(xiàn)含有與腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的成熟編碼區(qū)融合的NT-3的前原區(qū)域的嵌合前原蛋白質(zhì)或前原肽(前原NT-3/BDNF)比同源前原腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子(前原BDNF)可更有效地加工為基礎(chǔ)。本發(fā)明進一步以發(fā)現(xiàn)表達嵌合NT-3/BDNF經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和擴增的真核宿主細胞僅把BDNF的成熟形式分泌到培養(yǎng)基中為基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸，以及通過使用上述核酸表達這些嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白和肽的方法。
圖1重組BDNF，NGF，和嵌合前體形式的聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳辨別用各種構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的代謝標記的CHO-DG44細胞的細胞上清液，并通過放射自顯影方法觀察。第1泳道野生型對照CHO-DG44細胞，使用下列構(gòu)建體含人NGF基因的表達型載體pCDM8(第2泳道);短前原BDNF構(gòu)建體(第3泳道);長前原NGF/BDNF嵌合物構(gòu)件體(第4泳道);泳道5分子量標記物。
圖2重組BDNF的生物活性。用胚(E8)小雞脊根神經(jīng)節(jié)檢測來自轉(zhuǎn)染的CHO細胞系的粗上清液記錄軸突突出物。密封的實心菱形DGC-N/B-2.5-＃23細胞系(含長前原NGF/BDNF嵌合構(gòu)建體)。帶點的方塊DGZ1000-B-3-2.5細胞系(含短前原BDNF構(gòu)建體)。
圖3人BDNFCDNA序列(SEQIDNO∶1)和推導出的氨基酸序列(SEQIDNO∶2)，和來自豬(SEQIDNO∶3和SEQIDNO∶4)，大鼠(SEQIDNO∶5和SEQIDNO∶6)及雞(SEQIDNO∶7和SEQIDNO∶8)的DNA序列比較。該圖來自PCT國際公開NO.WO91/03568，
公開日1991.3.21。
圖4人NGF的核苷酸(SEQIDNO∶9)和推導出的氨基酸(SEQIDNO∶10)序列。-187至-1表明長前原區(qū)。序列資料來自EP公開121，338，
公開日1984.10.10，由Gray和Ullrich提供。
圖5大鼠(SEQIDNO∶11)和人(SEQIDNO∶13)NT-3基因的校對的DNA序列。由“PREPRO--”表明預測的翻譯起始位點，用“MATURE--”表明預測的成熟NT-3的起始位點。成熟大鼠(SEQIDNO∶12)和人(SEQIDNO∶14)NT-3蛋白質(zhì)有相同的氨基酸序列，而它們的前原區(qū)域在下面劃線的11位不同。該圖所示來自PCT國際公開NO.WO91/03569，
公開日1991，3，21。
圖6在NT-3/BDNF嵌合構(gòu)建體中使用的DNA片段3(SEQIDNO∶15和16)，它們相當于NT-3前原區(qū)的35個氨基酸(SEQIDNO∶17)。
圖7Western印跡分析來自CHO細胞的限制性培養(yǎng)基，CHO細胞表達原始的前原BDNF(第2-11泳道)或嵌合前原NT-3/BDNF(第12-19泳道)第1泳道是用450ng純化的成熟人BDNF載樣。第20泳道是用來自BRL的預染色的低分子量標記物載樣。第8泳道和第16泳道代表來自每個轉(zhuǎn)染體的非生產(chǎn)克隆。
本發(fā)明涉及新的含生物活性神經(jīng)營養(yǎng)性因子的嵌合前原蛋白質(zhì)或前原肽，以及使用上述前體和它們的核酸序列生產(chǎn)有一種或多種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素生物活性的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明提供的嵌合前原分子含有與成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的一種雜合前原區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明可使用的成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列是包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的同源分子。相似地，可以從包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神經(jīng)營養(yǎng)性激素分子中得到前原區(qū)域。本質(zhì)上，本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)嵌合前原蛋白質(zhì)或前原肽可比同源前原腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子(前原BDNF)能更有效地經(jīng)真核宿主細胞加工，所述的嵌合前原蛋白質(zhì)或前原肽含有神經(jīng)生長因子的前原區(qū)域和源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的成熟分部分(前原NGF/BDNF)或者NT-3的前原區(qū)域和成熟部分的腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)性因子(前原NT-3/BDNF)。本發(fā)明進一步以發(fā)現(xiàn)表達嵌合前原NGF/BDNF或NT-3/BDNF的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和擴增的真核宿主細胞僅向培養(yǎng)基中分泌BDNF的成熟形式。同源前原BDNF的翻譯后加工是高度無效的。相反，可有效地加工同一神經(jīng)營養(yǎng)基因家族的成員之一NGF。暫留轉(zhuǎn)染后，僅把NGF的成熟生物活性形式分泌到宿主細胞培養(yǎng)基中。為了生產(chǎn)成熟的生物活性BDNF，通過穩(wěn)定宿主細胞系的繁殖解決BDNF加工問題。通過表達嵌合構(gòu)建體，本發(fā)明提供了一種新的解決加工問題的方法，在一個特殊的實施方案中，嵌合構(gòu)建體含有融合在成熟BDNF框架中的NGF的長前原區(qū)域，并且在另一特殊的實施方案中，它含有融合在成熟BDNF框架中的NT-3的前原區(qū)域。
本發(fā)明提供編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白質(zhì)或前原肽的核酸，以及通過使用上述核酸表達這些嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白質(zhì)和肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸的表達比使用編碼同源神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的表達具有更顯著的優(yōu)點。生產(chǎn)嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽提供提高了表達水平的生物活性神經(jīng)營養(yǎng)性因子。提高的表達水平另外應提供了比污染的表達的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的未加工形式更好的生物活性神經(jīng)營養(yǎng)性純化模式，上述污染的表達神經(jīng)營養(yǎng)性因子的未加工形式在粗上清液中是不明顯的。
5.1本發(fā)明的表達產(chǎn)物根據(jù)本發(fā)明可獲得的生物活性蛋白質(zhì)是天然的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，它們是促神經(jīng)營養(yǎng)性激素基因家族的成員或生物活性蛋白質(zhì)或其衍生物。本文所用的術(shù)語“生物活性”是指能夠顯示出成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的一種或多種生物活性。上述促神經(jīng)營養(yǎng)激素包括但不限于成熟的BDNF，NT-3，NGF和NT-4以及用確定促神經(jīng)營養(yǎng)性激素基因家族成員所用的方法鑒別類似于上述的其它成員(如，使用分子探針，由PCR生產(chǎn)，相當于家族內(nèi)同源區(qū)域;參見PCT公開WO91/03569)。
可獲得用本發(fā)明可表達的編碼各種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素蛋白質(zhì)的DNA序列。參見Ullrich等人的(Nature303∶821(1983);E.P.公開121，388，
公開日1984.10.10)關(guān)于hNGF編碼序列和如Meier等人(EMBOJ.5∶1489(1986))和Schwarz等人(J.Neurochem.52∶1203(1989))關(guān)于來自其它各種的NGFcDNA;ATCC質(zhì)粒菌株phBDNF-C-1(保藏號4068)是關(guān)于一個hBDNFcDNA克隆和如，Leibrock等人，在下文，關(guān)于一個豬BDNFcDNA;和ATCC質(zhì)粒菌株pC8-hN3(P1)(保藏號40765)關(guān)于一個人的NT-3cDNA克隆和Maisonpierre等人(Science247∶1446(1990))和Hohn等人(Nature344∶339(1990))的關(guān)于來自其他各種的NT-3編碼序列。已經(jīng)報告了人(Rosenthaletal.，Neuron4∶767(1990))和大鼠(Maisonpierreet，ol.，見下文)的NT-3基因克隆。進一步說，在PCT公開WO91/03568，
公開日1991，3，21，和互補的待審美國申請系列No.570657，申請日1990.8.20中公開了BDNF的核苷酸和氨基酸序列;在PCT公開WO91/03569
公開日1991.3.21和互補的待審申請系列No.570，189，申請1990.8.20中公開了NT-3的核苷酸和氨基酸序列。另外，本文分別在圖3，4和5中展示了BDNF(SEQIDNO∶1-8)，NGF(SEQIDNO∶9-10)和NT-3(SEQIDNO∶11-14)的核苷酸和氨基酸序列。
另外，可用上文所述的方法，用BDNF/NGF/NT-3/NT-4家族任意兩個成員共有的同源區(qū)域鑒別來自任何有機體的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素基因。例如，但不限于，通過BDNF/NGF/NT-3/NT-4合成的簡并寡核苷酸鑒別并克隆一種新的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素，所述的簡并寡核苷酸相應于任意兩個促神經(jīng)營養(yǎng)性激素之間高度保守的蛋白質(zhì)序列片段。然后，在用CDNA模板的多聚酶鏈反應(PCR)中用這些寡核苷酸作引物，所述的CDNA模板是從推測能表達所需促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的細胞中制備的。然后可以用PCR產(chǎn)物作為探針克隆完整的CDNA和/或基因組基因，可通過標準方法確定它們的序列。通過選擇那些除含有與其他已知的促神經(jīng)營養(yǎng)激素同源的序列外，還含有與其他已知的促神經(jīng)營養(yǎng)激素不同源的序列(例如，至少含六個相鄰核苷酸，其中至少有兩個核苷酸不同)的細胞而鑒別新的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素。同樣，相應于一個種內(nèi)促神經(jīng)營養(yǎng)激素序列的寡核苷酸可用于PCR中生產(chǎn)用于克隆來自其它種的促神經(jīng)營養(yǎng)性激素基因的探針。
NGF和BDNF是約120個氨基酸的堿性蛋白質(zhì)它們共有約50%的氨基酸序列相同，包括6個絕對保守的半胱氨酸殘基，在活性NGF中，已發(fā)現(xiàn)這6個半胱氨酸殘基形成3個二硫鍵(Bradshaw，A.，1978，Ann.Rev.Biochem4]∶191-216;Leibrocketal.，1989Nature341∶149-52)。比較來自進化趨異種的NGF序列發(fā)現(xiàn)，在這些半胱氨酸殘基側(cè)面的氨基酸含有該分子的大部分高度保守區(qū)域(Meieretal.，1986，EMBOJ.5∶1489-93;Selbyetal.，1987，J.Neurosci.Res.18∶293-8)。驚人的是，這些也是BDNF和NGF之間最相似的區(qū)域(Leibrocketal.，1989，Nature341∶149-152)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選情況中，通過表達有關(guān)本發(fā)明的嵌合前原分子，生產(chǎn)一種成熟的人促神經(jīng)營養(yǎng)性激素。在一個特殊的實施方案中，由一個核酸編碼嵌合前原分子，該核酸含融合在成熟BDNF編碼序列框架中的NGF的長前原區(qū)域。在另一實施方案中，由一核酸編碼嵌合前原分子，該核酸含有融合在成熟BDNF編碼區(qū)框架中的NT-3前原區(qū)域。仍在另一實施方案中，NGF的長前原區(qū)融合在NT-3編碼區(qū)的框架中。
如上文討論的，沒有資料證明NGF前體的“長”和“短”前原區(qū)域間有明顯的生物學區(qū)別。在本發(fā)明的另一特殊情況中，在構(gòu)建嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性基因中，可利用“長”或“短”前原區(qū)域。當構(gòu)建本發(fā)明的含NGF前原區(qū)的嵌合融合體時，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可利用“短”NGF前原區(qū)或“長”NGF前原區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明可以表達為嵌合前原前體的成熟的促神經(jīng)營養(yǎng)激素分子實質(zhì)上也包括有生物活性的等序列，片段或衍生物。
例如，可以通過提供功能分子的取代，添加，或缺失改變促神經(jīng)營養(yǎng)激素核酸序列。由于核苷酸編碼序列的簡并，在本發(fā)明實施時，也可使用本質(zhì)上編碼同樣的促神經(jīng)營養(yǎng)激素氨基酸序列的其它DNA序列。這些包括但不限于含有全部或部分由不同密碼子取代改變的促神經(jīng)營養(yǎng)激素基因，所述的不同密碼子編碼序列內(nèi)功能相同的氨基酸殘基，因此產(chǎn)生沒有痕跡的改變。同樣，本發(fā)明的促神經(jīng)營養(yǎng)激素蛋白或其片段或其衍生物包括但不限于那些含有其部分一級氨基酸序列改變的序列，在改變的序列中，功能相等的氨基酸殘基取代序列內(nèi)的殘基，這種取代使序列不產(chǎn)生任何變化。如，用作為功能等同物的相似極性的另一氨基酸取代序列中的一個或多個氨基酸殘基不產(chǎn)生任何改變。可從氨基酸所屬的該類的其它成員中選擇序列內(nèi)氨基酸的取代物。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性的)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是通過翻譯期間或翻譯后修飾，如，通過糖基化作用，蛋白水解裂解，連接到一抗體分子上或其它細胞配體上，乙酰化作用，磷酸化作用，還原作用，裂解，等獲得的促神經(jīng)營激素蛋白或其片段或其衍生物。
另外，可以在體外或體內(nèi)突變給定的促神經(jīng)營養(yǎng)激素序列，以便產(chǎn)生和/或破壞翻譯，起始，和/或終止序列，或者在編碼區(qū)產(chǎn)生變異和/或形成新的限制性內(nèi)切酶位點或破壞以前存在的限制性位點有利于在體外進一步修飾?？梢允褂帽绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于，體外位點特異性誘變(Hutchinson，et al.，1978，J.Biol.Chem.253∶6551)，使用TAB 接頭(Pharmacia)，等。
本發(fā)明也涉及編碼嵌合前原促神經(jīng)營養(yǎng)激素分子的核酸的表達，并回收成熟的促神經(jīng)營養(yǎng)激素產(chǎn)物。
5.2構(gòu)建嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽可以使用標準的重組DNA技術(shù)，如通過限制酶消化并連接編碼所需前原和成熟區(qū)域的核酸序列構(gòu)建編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸。或者，可以使用化學合成法，如固相氨基磷酸酯技術(shù)構(gòu)建核酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，可以用多聚酶鏈反應(PCR;Saikietal.，1985，Science230∶1350-1354)通過重疊延伸(Hortonetal.，1989，Gene77∶61-68)完成核酸序列的拼接，并因此產(chǎn)生本發(fā)明的編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸(參見，如，在下文第5部分)。
在一優(yōu)選的情況中，通過使用兩個分別用不同模板的不同PCR反應生產(chǎn)本發(fā)明的核酸。為了舉例說明，如果需要一個X-Y嵌合體，首先，用一個模板，如，X，使用與X完全同源的探針，以及一個既與X有同源區(qū)域又與Y有同源區(qū)的探針完成PCR反應。然后分離PCR反應產(chǎn)物，并在用Y作為模板的第二個PCR反應中，把它用作探針，以及用第二個完全與Y同源的探針。
進一步期望能在引物中滲入有用的限制性內(nèi)切酶裂解位點。
另外，可通過利用3個寡核苷酸引物的一步PCR生產(chǎn)嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性因子。例如，通過生產(chǎn)的3個寡核苷酸引物，把編碼至少部分所需前原區(qū)域(X)的核酸與編碼一成熟神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白或肽(Y)的核酸序列連接，所述的三個引物中，一個相當于X序列的一部分(X引物)，另一個相當于Y序列的一部分(Y引物)，第三個含有X和Y序列的第一部分(XY引物)。在一步PCR中，結(jié)合這三個寡核苷酸，并X和Y引物的量大于XY引物，如，以X∶XY∶Y為約100∶1∶100的比率。[在PCR中所用的模板可以是編碼所需前原區(qū)域和成熟神經(jīng)營養(yǎng)性蛋白或肽的核酸的混和物]通過橋接核苷酸(如，XY引物)確定拼接位點的位置。
可以使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的條件，如使用標準PCR反應溶液和方法的在94℃1分鐘，在約43℃2分鐘，在約72℃3分鐘進行35次循環(huán)。然后用凝膠電泳純化所得的PCR片段，并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化所得的PCR片段，并把它連接到適當?shù)目寺≥d體中。
構(gòu)建本發(fā)明嵌合體的其它方法對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。
可以用本領(lǐng)域已知的方法克隆DNA反應產(chǎn)物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何數(shù)量的載體宿主系統(tǒng)。可能的載體包括，但不限于粘性質(zhì)粒，質(zhì)?；蛐揎椷^的病毒，但載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細胞相匹配。上述載體包括，但不限于，噬菌體如入噬菌體衍生物，或質(zhì)粒如pBR322，pUC，或Bluescript
(stratagene)質(zhì)粒衍生物。經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔、等可以把重組分子引入宿主細胞。
5.3表達編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸可以把編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核苷酸序列連接到適當?shù)谋磉_載體中，所述載體即含有對于轉(zhuǎn)錄克隆的嵌合DNA序列所必需的元素的載體。利用一個促神經(jīng)營養(yǎng)激素基因和/或與嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽相應的其兩側(cè)的區(qū)域也可以提供必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號。可以用各種真核宿主-載體系統(tǒng)表達克隆的嵌合DNA序列和所得的mRNA轉(zhuǎn)錄體、這些包括但不限于用病毒(如疫苗病毒，腺病毒等)感染的，用其它載體轉(zhuǎn)染的，含本發(fā)明染色體整合的核酸的哺乳動物細胞系統(tǒng)，但所用的宿主系統(tǒng)必須有適當?shù)?，把前原嵌合體加工成成熟促神經(jīng)營養(yǎng)激素的細胞機制。改變載體的表達元素的強度和特異性。依據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用大量適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元素中任何一個元素。
可以用以前所述的有關(guān)把DNA片段插入到載體中的任意方法構(gòu)建含有編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽序列的表達型載體，該載體包括在嵌合DNA序列上游含有適當?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(基因重組)?？梢酝ㄟ^第二個核酸序列調(diào)節(jié)編碼嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的核酸序列的表達，以便在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽。例如可以用本領(lǐng)域已知的在哺乳動物細胞中有活性的啟動子/增強子元素控制表達?？梢杂糜诳刂魄逗仙窠?jīng)營養(yǎng)性因子表達的啟動子包括，但不限于細胞肥大病毒(CMV)啟動子，SV40早期啟動子區(qū)域(BernoistandChambon，1981，Nature290∶304-310)，在勞氏肉瘤病毒的3’長末端重復所含的啟動子(Yamamoto，etal.，1980，Cell22∶787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶144-1445)，金屬硫熏，基因的調(diào)節(jié)序列(Brinsteretal.，1982，Nature296∶39-42);以及表現(xiàn)組織特異性并已在轉(zhuǎn)基因動物中使用的下列動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，在胰腺泡細胞中有活性的胰肽酶EI基因控制區(qū)域(Swiftetal.，1984，Cell.38639-646，Ornitzetal.，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50∶399-409;MacDonald，1987，Hepatology7∶425-515);在胰β細胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)域(Hanahan，1985，Nature315∶115-122);在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)域(Grosschedletal.，1984，Cell38∶647-658;Adamesetal.，1985，Nature318∶533-538;Alexanderetal.，1987Molo.Cell.Biol.7∶1436-1444);在睪丸、乳房淋巴樣和肥大細胞中有活性的小鼠乳汁腫瘤病毒控制區(qū)域(Lederetal.，1986，Cell45∶485-495)，在肝中有活性的清蛋白基因控制區(qū)域(Pinkertetal.，1987，GenesandDevel1∶268-276)，在肝中有活性的α1-胎兒球蛋白基因控制區(qū)域(Krumlaufetal.，1985，Mol.Cell.Biol.5∶1639-1648;Hammer，etal.，1987，Science235∶53-58);在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)域(Kelseyetal.，1987，GenesandDevel.1∶161-171)，在髓樣細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)域(Mogrametal.，1985，Nature315∶338-340，Kolliasetal.，1986，Cell46∶89-94);在腦的少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因控制區(qū)域(Readheadetal.，1987，Cell48∶703-712);在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)域(Sani，1985，Nature314∶283-286);在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)域(Masonetal.，1986，Science234∶1372-1378)。
可以使用的表達型載體的特殊實施例是CDM8.(Seed，1987，Nature329∶840-842;SeedandAruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶3365-3369;Aruffo＆Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶8573-8577);另一個實施例是pCMX(參見共有未決申請系列No.678，408，申請日1991，3，28)。
可以通過3種一般方法鑒別含有嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽基因的表達型載體(a)DNA-DNA雜交，(b)存在或不存在“標記物”基因功能，和(c)表達插入序列。在第一種方法中，通過使用探針的DNA-DNA雜交，檢測插入到表達型載體中外源基因的存在，所述的探針含有與至少部分插入的嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽基因同源的序列。在第二種方法中，可以在某種“標記”基因功能(如，胸苷激酶活性，轉(zhuǎn)化表型，等)存在或不存在的基礎(chǔ)上鑒別并選擇重組載體/宿主系統(tǒng)，所述的某種“標記”基因功能是由載體中外源基因的插入的。例如，如果把嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的編碼序列插入到載體的標記基因序列中，那么通過沒有標記基因功能，可以鑒別含嵌合插入序列的重組體。在第三種方法中，可以通過檢測由重組體表達的外源基因產(chǎn)生鑒別重組表達型載體。例如，上述檢測可以以如上文5.4部分中描述的生物檢測系統(tǒng)中，神經(jīng)營養(yǎng)性因子基因產(chǎn)物的物理或功能特性為基礎(chǔ)。
一旦鑒別和分離了一個特定的重組DNA分子，就可以用本領(lǐng)域已知的幾種方法進行繁殖。一旦建立了適宜的宿主系統(tǒng)和生長條件，就可以大量地繁殖并制備重組表達型載體。
在某些誘導子存在的情況下，可以增加某種啟動子的表達;因此，可以控制經(jīng)過遺傳工程加工的嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性前原蛋白或前原肽的表達。此外，對于蛋白質(zhì)的翻譯和翻譯后加工及修飾(如，糖基化，裂解)，不同的宿主細胞有特有的和特殊的機制。為了確保必要的加工(如，由裂解除去前原區(qū))和任何所需的修飾，應選擇適當?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)。因此，哺乳動物宿主細胞如猴，人或牛是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的特殊實施方案中，根據(jù)上文列出的方法，可以在CHO細胞系統(tǒng)中表達編碼嵌合促神經(jīng)營養(yǎng)激素的DNA。一旦鑒別了表達嵌合促神經(jīng)營養(yǎng)激素的重組體，就應分析成熟的基因產(chǎn)物。通過以產(chǎn)物的物理或功能特性為基礎(chǔ)的分析，可以完成上述分析。參見上文5.4部分。
一旦鑒別了成熟的神經(jīng)營養(yǎng)性因子蛋白或肽，就可以通過包括層析(如，離子交換、親和性和大小柱層析)，離心，不同的溶解性的標準方法，或純化蛋白質(zhì)的任何其它標準方法分離并純化上述的神經(jīng)營養(yǎng)性因子蛋白或肽。
5.4神經(jīng)營養(yǎng)性因子檢測方法根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的促神經(jīng)營養(yǎng)激素蛋白或肽能夠表現(xiàn)出一種或多種包括但不限于神經(jīng)營養(yǎng)活性，通過抗體與促神經(jīng)營養(yǎng)激素結(jié)合，與同源受體結(jié)合等等的生物活性。應把本文所用的術(shù)語“神經(jīng)營養(yǎng)性活性”解釋成一種涉及對神經(jīng)系統(tǒng)細胞的生物效應，所述的神經(jīng)系統(tǒng)細胞包括，但不限于神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞，膠質(zhì)細胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞和施旺代細胞。對于沒有直接或間接地受到嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性因子作用的神經(jīng)系統(tǒng)細胞，生物效應是可在神經(jīng)系統(tǒng)細胞的結(jié)構(gòu)和/或生理學方面改變的。生物效應的例子是延長存活，軸突突起，維持和發(fā)展分化功能(如表達一種酶，如膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，或酪氨酸羥化酶)或，相反地，細胞死亡或衰老，或去分化。
可以使用任何已知的檢測上述活性的檢測方法以及將來可發(fā)展的系統(tǒng)確定神經(jīng)營養(yǎng)性活性的存在。檢測系統(tǒng)可以包括體外測試系統(tǒng)，如使用組織外植體的組織培養(yǎng)生物檢測系統(tǒng)，從組織制備的細胞，或不死的細胞系，如從腦，脊髓、或外周神經(jīng)系統(tǒng)得到的，以及體內(nèi)測試系統(tǒng)，其中可以給動物服用神經(jīng)營養(yǎng)性因子;可以使用上述動物，通過完成化學的，組織學或行為測試，確定在上述動物中的神經(jīng)營養(yǎng)性效應。另外，在非人的轉(zhuǎn)基因動物中，可以摻入作為轉(zhuǎn)基因的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，并可以檢測在所述動物中的生物學效應。
例如，但不限于，可以用下列已知的生物檢測系統(tǒng)測量神經(jīng)營養(yǎng)性活性(ⅰ)在Bardeetal.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77∶1199-1203中描述的脊根神經(jīng)節(jié)檢測系統(tǒng)，該文獻全部引入本文作為參考;
(ⅱ)由Lindsayetal.，1985，Dev.Biol.112∶319-328，描述的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)檢測系統(tǒng)，該文獻全部引入本文作為參考;
(ⅲ)在Bardeetal.，1982，EMBOJ.1∶549-553中描述的交感神經(jīng)節(jié)檢測系統(tǒng)，該文獻全部引入本文作為參考;
(ⅳ)脊髓神經(jīng)元。簡單地，從檢測動物中無菌移出脊髓，然后分離尾部到延髓部分，并除去感覺神經(jīng)節(jié)和腦脊膜。然后，可再把索分成腹部和中背部片段，分別進行培養(yǎng)，把組織切成小碎片，并經(jīng)研磨通過Pasteur吸管在50%DMEM(Gibco)和50%的Ham′s營養(yǎng)混和物F12(Gibco)中離解，50%的Ham′s營養(yǎng)混和物用33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，15mM NaHCO3，10mM HEPES，25μg/ml胰島素100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，60μm丁二胺，20nM黃體酮，30nM亞硒酸鈉，0.5μg/ml青霉素G，0.5μg/ml鏈霉素，和2.5μg/ml小牛血清白蛋白補充。然后可重復研究兩次，并收集上清液，用40μm的Tetko過濾器過濾。然后將離解的腹部細胞以每35mm培養(yǎng)皿0.5百萬個細胞的密度鋪在用多聚-D-賴氨酸覆蓋的(10μg/ml)培養(yǎng)皿中?？梢悦?5mm培養(yǎng)皿1.5百萬個細胞的密度，把離解的中背部細胞鋪在用多聚-D-賴氨酸(10μg/ml)，多聚-L-鳥氨酸(10μg/ml)或多聚-L-鳥氨酸加昆布氨酸(laminin)(5μg/ml)覆蓋的培養(yǎng)皿中。
(ⅴ)基部前腦膽堿能神經(jīng)元檢測方法(參見PCT公開WO91/03568，
公開日1991，3.21);
(ⅵ)腹部中腦dopaminergic神經(jīng)元檢測系統(tǒng)(參見PCT公開WO91/03568，
公開日1991，3，21);和(ⅶ)PC12細胞檢測系統(tǒng)6.實施例構(gòu)建并表達前原-NGF/成熟-BDNF嵌合體6.1.用多聚酶鏈反應構(gòu)建嵌合核酸分子用多聚酶鏈反應克隆(PCR，Saikietal.，1985，Science230∶1350-1354)構(gòu)建前原NGF/成熟BDNF嵌合體，該嵌合體由與成熟人BDNF序列融合的小鼠NGF的長前原形式組成。
為了完成上述內(nèi)容，合成兩個PCR引物。5′引物(5′-CTC-GTC-GAC-AGC-CGG-CAC-TCT-GAC-CCT-GCG-CGC-CGA-3′)[SEQIDNO∶17]編碼BDNF的前7個氨基酸，并包括兩個唯一的通過使用修飾密碼子產(chǎn)生的限制位點，NaeⅠ，和BssH2。3′PCR引物是一個3′pCDM8寡核苷酸，該寡核苷酸相當于來自在pC8hB中BDNF序列3′末端的多聚連接子序列的下游區(qū)域[5′-CAA-AGA-TCC-TCT-AGA-GTC-G-(C)-3′][SEQIDNO∶18]。多聚連接子含有一個NotⅠ限制位點。在同pC8hB(hBDNF在PCDM8中)DNA作模板的PCR中，使用這兩個引物。用5微克pC8hB與各500ng的引物進行5個PCR循環(huán)。同時用Nael和Notl消化PCR產(chǎn)物，并用凝膠電泳分離365bp的消化產(chǎn)物。通過用Eco47和Not1消化pC81mN(在pCDM8中的長小鼠NGF)完成載體的制備，并通過凝膠電泳分離4.6kb的載體片段。把365bp的片段連接到pC81mN的Eco47/Not1位點。這種連接導致小鼠NGF前原區(qū)與成熟BDNF編碼區(qū)在框架中直接融合。通過用BssH2消化，通過估計在亞克隆中Eco47位點的損失，并最后經(jīng)DNA定序診斷檢測構(gòu)建體。
6.2.表達嵌合分子用CHO-DG44細胞生產(chǎn)穩(wěn)定的細胞系以生產(chǎn)有生物活性的BDNF。CHO-DG44細胞(從在Columbia University的Dr.L.chasin得到)缺兩拷貝的二氫葉酸還原酶基因(Urlaub and chasin 1980，Proc.Natl.Acad Sci USA.77∶4216-4220)。已經(jīng)預先描述了表達BDNF的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細胞系(PCT國際公開No.WO 91/03568，
公開日1991，3，21)。通過用pC8hB DNA轉(zhuǎn)染而生產(chǎn)這些細胞系，pC8hB DNA編碼包括克隆到表達型載體pCDM8中的前原區(qū)的人BDNF基因。采用磷酸鈣共沉淀方法將20μg NGF/BDNF嵌合體(pC81mN/B)與0.2μg質(zhì)粒p410共轉(zhuǎn)染CHO-DG44細胞(1×106細胞/100mm平皿)，所述的質(zhì)粒p410編碼一個減弱的二氫葉酸還原酶基因(dhfr.)。轉(zhuǎn)染48小時后，細胞在選擇培養(yǎng)基(沒有次黃嘌呤和胸苷的，含10%可透析的胎牛血清及各1%青霉素和鏈霉素的Ham′s F12;-HT培養(yǎng)基)上傳代培養(yǎng)。用氨甲喋呤(MTX)處理-HT-抗性克隆收集物，以便用于擴增。在2.5μM MTX中處理用0.05μM MTX獲得的克隆收集物，進行進一步擴增，將首先在0.5μM MTX中然后在2.5μM MTX(因此擴增兩循環(huán))中選擇的克隆分離(DGC-N/B-2.5-＃23)，如通過生物活性和代謝標記估計的一樣，證明該克隆是BDNF的最高效生產(chǎn)者。通過記錄雞胚(E8)脊根神經(jīng)節(jié)(DRG)的軸突生長，評估生物活性(Maisopierre et al.，1990，Science247∶1446-1451)。
7.實施例比較在同源前原BDNF和前原NGF/BDNF嵌合體之間的加工效率通過實驗直接比較在CHO細胞中前原BDNF與前原NGF/BDNF的加工和表達。
7.1.代謝標記代謝標記比較用pC8hB或pC81mN/B轉(zhuǎn)染并用2.5μM氨甲喋呤擴增的CHO-DG44細胞系(圖1)。為完成該標記實驗，把從短前原BDNF構(gòu)建體(細胞系＝DGZ1000-B-3-2.5)或長小鼠前原NGF/BDNF嵌合構(gòu)建體(細胞系＝DGC-N/B-2.5＃23)表達BDNF的CHO-DG44細胞，在標記前等密度(在6-孔平皿中2×105細胞/孔)培養(yǎng)24小時。然后在無血清的條件下，用35S-半胱氨酸和35S-甲硫氨酸將細胞標記4小時。用SDS聚丙烯酰胺凝膠(15%凝膠)電泳分析30μl標記細胞上清液樣品，并把標記的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并通過放射自顯影肉眼觀察。如在圖1中觀察到的，用在表達型載體pCDM8中的人NGF基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細胞表達NGF的成熟形式，該NGF的成熟形式遷移成約12，300分子量(圖2，第二泳道)。在第一泳道中所示的是用野生型CHO-DG44細胞作對照。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系DGZ1000-B-3-2.5(用與細胞系DGC-N/B-2.5＃23相似的MTX選擇和擴增方法獲得)(圖1，第三泳道中，檢測未加工的BDNF原(31KD)，已加工的BDNF原前體的原部分(16KD)以及短前原BDNF蛋白的成熟形式(14KD)。僅在用長NGF/BDNF原嵌合構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DGC-N/B-2.5-＃23中檢測到經(jīng)蛋白水解加工的BDNF的成熟形式(14KD)(圖1，第四泳道)。在限制培養(yǎng)基中，從該細胞系未檢測到?jīng)]有加工的NGF/BDNF原。我們估計成熟BDNF的標記密度，細胞系DGC-N/B-2.5-＃23比較短BDNF原構(gòu)建體構(gòu)建的細胞系DGZ-1000-B-3-2.5每個細胞多產(chǎn)生約5倍的成熟BDNF蛋白。
7.2.生物活性比較上述兩個CHO細胞系中產(chǎn)生的BDNF的活性。用雞胚(E8)脊根神經(jīng)節(jié)檢測粗上清液并記錄軸突的生長。與代謝標記實驗一致，細胞系DGC-N/B-2.5＃23比細胞系DGZ1000-B-3-2.5多產(chǎn)生約5倍的成熟BDNF。例如，當需要50μl的DGZ1000-β-3-2.5上清液以便達到最大DRG生物活性時，用10μl的DGC-N/B-2.5-＃23細胞上清液就可得到最大軸突生長效果(圖2.)7.3.比較用長和短NGF前原區(qū)的NGF的表達用前原NGF轉(zhuǎn)染COS細胞，該前原NGF含長(“1mNGF”)或短(“smNGF”)NGF前原區(qū)和成熟NGF編碼區(qū)。轉(zhuǎn)染48小時后，收集培養(yǎng)上清液，并將DRG外植塊與純化的NGF和假轉(zhuǎn)染的COS細胞上清液一起檢測。在表1中，列出了用各構(gòu)建體的三種不同濃度得到的結(jié)果表明，用前原區(qū)的長或短形式表達的NGF有顯著的生物活性。
表1各種COS上清液對DRG外植體的影響
7.4.結(jié)論我們從上述研究中得出結(jié)論，NGF的長原部分比BDNF的短原部分更適于在CHO細胞中加工BDNF。因此，嵌合NGF原/成熟BDNF基因構(gòu)建體的優(yōu)點是，它可以允許在哺乳動物細胞中以每個細胞為基礎(chǔ)，高水平表達BDNF。另外，由于在粗上清液中污染的BDNF的未加工形式不明顯，所以能提供更好的純化方法。
另外，使用NGF的長或短前原區(qū)導致有生物活性的NGF的表達。這表明，可以在嵌合神經(jīng)營養(yǎng)性基因構(gòu)建體中，使用NGF的長或短前原區(qū)。
8.實施例構(gòu)建并表達前原-NT-3/BDNF嵌合體8.1構(gòu)建嵌合核酸分子從用相應限制酶消化的pC8hB中，得到含有前原和成熟人BDNF整個編碼區(qū)的HindⅢ-xholDNA片段。通過把包括完整前原區(qū)的人BDNF編碼序列克隆到表達型載體pCDM8(上文討論的)中，而得到質(zhì)粒pC8hB。把該片段連接到pDSRα2(參見公開的歐洲專利申請90305433.6;EPO公開No.0398753A2，該文獻全部引入本文作為參考)中。預先消化質(zhì)粒pDSRα2，以便得到用于與人BDNF片段連接的克隆位點5′-HindⅢ和3′-SalⅠ。所得的質(zhì)粒叫做pDSRα2(BDNF)。
為了得到含前原NT-3序列和成熟BDNF序列的嵌合質(zhì)粒，按如下步驟制備三個DNA片段，然后把制備的DNA片段以特定的方向連接。用限制酶消化，從上述的表達型質(zhì)粒pDSRα2(BDNF)中缺失一個約400bp的含全部前原人BDNF序列的5′-HindⅢ/3′NarⅠ片段。從這些消化產(chǎn)物中回收的DNA片段包含全部表達型載體pDSRα2和成熟的人BDNF序列，并以5′-HindⅢ和3′-NarⅠ位點(標記的DNA片段No.1)為末端。從用相應的限制酶消化的質(zhì)粒pC8hN3中得到一個約300個堿基對的，含人NT-3前原區(qū)的5′-HindⅢ/3′-SacⅡDNA片段。消化結(jié)果，SacⅡ位點下游缺失相當于前原NT-3區(qū)域的35個氨基酸殘基的編碼序列。通過把包括完整前原區(qū)的人NT-3編碼序列克隆到表達型載體pCDM8中，得到質(zhì)粒pC8hN3。把300個堿基對的5′-HindⅢ/3′-SacⅡ片段標記成DNA片段No.2。最后，為了再產(chǎn)生上述丟失的35個氨基酸殘基，制備DNA片段No.3，它是一個合成的寡核苷酸連接子(圖6和SEQIDNO∶15-17)。該連接子還包含5′-SacⅡ和3′-NarⅠ限制位點的一半位點，以便促使上文公開的DNA片段Nos1和2的連接。這種連接導致產(chǎn)生表達型載體pDSRα2(NT-3/BDNF)，其中，通過寡核苷酸連接子(片段No.3，圖6和SEQIDNO∶15)把NT-3的前原區(qū)(片段No.2)與成熟BDNF(片段No.1)連接。
8.2在COS細胞中表達并鑒定NT-3/BDNF嵌合體用CHO-D(-)細胞(ATCC保藏號CCL61)制備用于生產(chǎn)有生物活性BDNF的穩(wěn)定的細胞系。CHO-D(-1)細胞是編碼二氫葉酸還原酶基因缺陷型的，并在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)中維持，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基是用MEM非必需氨基酸，各1%的青霉素和鏈霉素，10%胎牛血清，次黃嘌呤和胸苷補充，用2.5μgNT-3/BDNF嵌合構(gòu)建體[pDSRα2(NT-3/BDNF)]，通過磷酸鈣共沉淀方法轉(zhuǎn)染CHO-D(-)細胞，上述的NT-3/BDNF嵌合構(gòu)建體預先用限制酶Pvul消化而線性化。上述載體(pDSRα2)編碼小鼠二氫葉酸還原酶小基因(dhfr)，該基因表達后能夠使轉(zhuǎn)染的CHO-D(-)細胞克服dhfr基因缺陷并在沒有核苷酸次黃嘌呤和胸苷的情況下生長。通過載體pDSRα2不能成功地轉(zhuǎn)染的親本CHO-D(-)細胞不能在選擇培養(yǎng)基中存活，除用經(jīng)透析的胎牛血清代替胎牛血清，并省略了次黃嘌呤和胸苷外，所述的選擇培養(yǎng)基與上述的維持培養(yǎng)基的組分相同。用胰酶消化細胞，并在轉(zhuǎn)染后，以1×105細胞/100mm平皿的密度，將細胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。兩星期后，用圓筒狀克隆篩選機挑出單個菌落。然后把每個克隆擴散到100mm平皿上。當培養(yǎng)物達到會合時，吸出原來的含血清培養(yǎng)基并用3ml無血清培養(yǎng)基代替加入。收集限制性培養(yǎng)基(CM)并把各50μl的培養(yǎng)物放在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，進行凝膠電泳。用對天然BDNF特異的兔抗血清進行Western凝膠印跡。如在圖7中所示，表達來自pDSRα2(BDNF)的原始BDNF的所有克隆除分泌已加工的BDNF外還分泌多形式的未加工BDNF。未加工形式與加工形式的比率是2∶1。相反，表達來自pDSRα2(BDNF)的嵌合NT-3/BDNF的所有克隆僅分泌完全加工過的，BDNF的成熟形式，這種BDNF帶有不能檢測到的部分加工過的前體。
來自嵌合NT-3/BDNF克隆的1升無血清限制性培養(yǎng)基經(jīng)傳代純化，所述的傳代經(jīng)S-Sepharose柱，接著通過SephacrylS-20o大小的篩析栓。SDS-PAGE分析和氨基酸序列測定表明，獲得了一個分子量為14KD(預測的成熟人BDNF)的同源蛋白質(zhì)，該同源蛋白質(zhì)有唯一與成熟人BDNF的N-末端序列一致的N-末端序列。此外，經(jīng)雞脊根神經(jīng)節(jié)檢測(上文對NGF/BDNF嵌合體描述的)表明是純化的BDNF，并有完全的生物活性。
8.3NT-3/BDNF嵌合體在COS細胞中的表達及其生物活性用COS-7細胞(ATCC保藏號CRL1651)作為暫留表達系統(tǒng)，檢測有生物活性的BDNF的生產(chǎn)。按常規(guī)方法將COS-7細胞在含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素抗生素的D-MEM中保持。用分別為20μg的pDSRα2，pDSRα2(BDNF)和pDSRα2(NT-3/BDNF)單獨在1600伏，經(jīng)0.4微秒，通過電穿孔轉(zhuǎn)染COS-7細胞(5×106細胞/ml)。以2×106細胞/60mm平皿的密度將轉(zhuǎn)染的COS-7細胞進行平皿培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后24和72小時之間積累的限制性培養(yǎng)基。通過記錄雞胚(E8)脊根神經(jīng)節(jié)(與NGF/BDNF嵌合體)的軸突生長，估計生物活性。如在表2中所示，嵌合pDSRα2(NT-3/BDNF)的克隆分離物CI 1和CI 20比來自pDSRα2(BDNF)的表達的成熟BDNF的活性高約5倍，后者含不變的DBNF前原區(qū)。
表2檢測用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的COS細胞的限制性培養(yǎng)基的雞DRG外植體
8.4結(jié)論這些研究表明，用NT-3前原區(qū)取代BDNF前原區(qū)有利于前原區(qū)的蛋白水解加工，并且顯著地提高了成熟BDNF的凈產(chǎn)量。此外，通過宿主細胞在成熟的經(jīng)加工過的BDNF的N-末端沒有任何改變就可以精確地識別在前原NT-3和成熟BDNFDNA序列之間重建的裂解位點。與嵌合NGF/BDNF基因構(gòu)建體一樣，嵌合NT-3/BDNF基因構(gòu)建體以哺乳動物的每個細胞為基礎(chǔ)，產(chǎn)生高水平的加工過的BDNF，并且通過減少污染的未加工形式，可以更好地進行純化。
本發(fā)明不限于本文所述特殊實施方案。的確，從上面的描述和附圖中，除本文中描述的外，本發(fā)明的其它各種修飾物對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。上述的修飾也包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本文引述的各種公開和專利申請，其公開的內(nèi)容全部引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種嵌合前原蛋白或前原肽，含有(a)第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的前原區(qū)；和(b)基本上等于第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的氨基酸序列，其中，第一和第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是不同的。
2.一種嵌合前原蛋白或前原肽，含有(a)第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的前原區(qū);和(b)基本上等于第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的部分成熟形成的生物活性氨基酸序列，其中，第一和第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是不同的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合前原蛋白，其中第一和第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素選自神經(jīng)生長因子，腦衍生物的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，和促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合前原蛋白，其中第一和第二種促神經(jīng)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素選自神經(jīng)生長因子，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，和促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原區(qū)是神經(jīng)生長因子的長前原區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原區(qū)是神經(jīng)生長因子的長前原區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原區(qū)是神經(jīng)生長因子的短前原區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原區(qū)是神經(jīng)生長因子的短前原區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是促神經(jīng)營養(yǎng)性激素-3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是腦衍生物的神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求5或6的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
14.根據(jù)權(quán)利要求7或8的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
15.根據(jù)權(quán)利要求9或10的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素是腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子。
16.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求1嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
17.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求2嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
18.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求3嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
19.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求4嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
20.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求5嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
21.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求6嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
22.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求7嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
23.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求8嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
24.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求9嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
25.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求10嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
26.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求11嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
27.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求12嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
28.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求13嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
29.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求14嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
30.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求15嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求16或17的核酸分子，它是一個載體。
32.根據(jù)權(quán)利要求18或19的核酸分子，它是一個載體。
33.一種含權(quán)利要求31的載體的重組細胞。
34.一種含權(quán)利要求32的載體的重組細胞。
35.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求1的核酸分子的重組細胞生長。
36.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求2的核酸分子的重組細胞生長。
37.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求3的核酸分子的重組細胞生長。
38.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)的第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求4的核酸分子的重組細胞生長。
39.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求5的核酸分子的重組細胞生長。
40.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求6的核酸分子的重組細胞生長。
41.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求6的核酸分子的重組細胞生長。
42.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求8的核酸分子的重組細胞生長。
43.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求9的核酸分子的重組細胞生長。
44.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求10的核酸分子的重組細胞生長。
45.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求11的核酸分子的重組細胞生長。
46.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素部分成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求12的核酸分子的重組細胞生長。
47.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求13的核酸分子的重組細胞生長。
48.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求14的核酸分子的重組細胞生長。
49.一種生產(chǎn)促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的方法，包括在允許細胞表達并加工嵌合前原蛋白或肽以生產(chǎn)第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素成熟形式的條件下，使含權(quán)利要求15的核酸分子的重組細胞生長。
50.根據(jù)權(quán)利要求35或36的方法，其中生產(chǎn)的第二種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素的成熟形式或其部分能夠表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)性活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有神經(jīng)營養(yǎng)性因子的前原蛋白或前原肽，以及用上述前體和它們的核酸序列生產(chǎn)有一種或多種促神經(jīng)營養(yǎng)性激素生物活性的蛋白或肽。本發(fā)明提供的嵌合前原分子含有與促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的雜合前原區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明可以使用的成熟促神經(jīng)營養(yǎng)性激素序列是包括但不限于NGF、BDNF，NT-3和NT-4的同源分子的NGF/BDNF家庭成員。相似地，可以從包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神經(jīng)營養(yǎng)性激素分子中得到前原區(qū)域。
文檔編號C07K19/00GK1078493SQ92114889
公開日1993年11月17日 申請日期1992年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月14日
發(fā)明者S·P·施奎因托, N·葉, D·吉斯, G·D·揚科普洛斯, S·-F·S·胡 申請人:里珍納龍藥品有限公司, 安姆根有限公司