專利名稱：一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)受體與配體相互作用領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法。
背景技術(shù)：
肽酸酯(PAEQ是一類重要的有機(jī)化合物，屬環(huán)境雌激素類物質(zhì)，其常見的主要有鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)和鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)。肽酸酯類物質(zhì)對(duì)人類及動(dòng)物體的肝臟、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有一定的毒性作用，某些條件下對(duì)生物體還具有急性毒性作用，有研究發(fā)現(xiàn)肽酸酯還具有遠(yuǎn)期的生物毒理效應(yīng)。有研究認(rèn)為，肽酸酯類物質(zhì)主要是通過(guò)與生物體內(nèi)的雌激素受體發(fā)生作用，進(jìn)而干擾生物體的正常機(jī)能。表面等離子共振SI^R是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。其原理為當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)(如鍍?cè)诓ＡП砻娴慕鹉?界面時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，電子吸收光能量從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的入射光角度即為共振角(sra角)。sra隨金屬表面的折射率變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比，因而可通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程中sra角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子相互作用的特異信號(hào)。該技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于受體-配體、抗體-抗原、免疫識(shí)別等生物分子之間的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，該方法受體與配體的結(jié)合特異性好，檢出限低，可達(dá)10_17g/L，靈敏度為10_8ng/L，操作快捷簡(jiǎn)便，可用于研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括(1)將喂養(yǎng)于含肽酸酯的水中的鯉魚殺死并取出肝臟，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入與肝臟質(zhì)量體積比為Ig 4 6ml的HEDG緩沖液勻漿，離心取上清，即得含有受體的細(xì)胞溶質(zhì)；(2)使用SDS-PAGE電泳對(duì)上述含有受體的細(xì)胞溶質(zhì)進(jìn)行分離分析，濃縮膠中使用 80 90V電壓，進(jìn)入分離膠后使用120 130V電壓；分離分析結(jié)束后將目的蛋白條切碎， 裝入ImL電洗脫液，置于電泳槽中以120 130V的電壓洗脫，離心取上清，即為純化后的受體蛋白溶液；(3)用超純水沖洗金片，將金片放入硫酸/過(guò)氧化氫混合液中，靜置，隨后依次用超純水、丙酮、超純水、無(wú)水乙醇、超純水沖洗金片表面，烘干；將金片置于lOmmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30 40min，取出金片用乙醇(80vol % )洗滌，再用超純水沖洗、吹干；在金片上分別滴加150 μ 1 EDC/NHS混合液和150 μ 1 200 μ g/L的鏈霉親和素溶液，分別于室溫靜置、超純水沖洗、吹干；
(4)將經(jīng)上述預(yù)處理的金片放到表面等離子共振儀上，通入PBS緩沖液，注入 70 μ 1受體，靜置反應(yīng)20min，再用PBS緩沖液沖洗至穩(wěn)定，再依次進(jìn)樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到雌激素受體-肽酸酯配體結(jié)合曲線。所述步驟(1)中的KCl溶液濃度為0. 15 0. 2mol/L。所述步驟⑵中的濃縮膠(質(zhì)量百分比濃度)為5%，分離膠(質(zhì)量百分比濃度) 為 12%。所述步驟(3)中的靜置時(shí)間為15 20min。所述步驟(3)中的吹干采用隊(duì)吹干。所述步驟⑷中的肽酸酯溶液濃度分別為lX10-17g/L、lXl(r15g/L、lX10-13g/L、 1 X 10_ng/L、1 X 10_9g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_5g/L。有益效果本發(fā)明受體與配體的結(jié)合特異性好，檢出限低，可達(dá)10_17g/L，靈敏度為10_8ng/L， 操作快捷簡(jiǎn)便，可用于研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應(yīng)用前景。


圖ι為實(shí)施例ι的sra檢測(cè)雌激素受體-肽酸酯配體相互作用曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1一、鯉魚體內(nèi)雌激素受體的提取與純化1.含雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)的提取取馴養(yǎng)于含肽酸酯的水中的鯉魚肝臟，先用0. 15mol/L的KCl溶液將肝臟表面血液清洗干凈，再將表面水分吸干，稱重，再以質(zhì)量體積比為Ig 細(xì)1的比例加入HEDG緩沖液進(jìn)行研磨，獲得肝組織勻漿(以上操作均在冰上進(jìn)行)。勻漿液于15000rmp，4°C下離心 1小時(shí)，吸取上清，即為含有受體的細(xì)胞質(zhì)溶液。分裝于-80°C保存。2.雌激素受體的分離純化使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離分析，濃縮膠質(zhì)量百分比濃度為5%，分離膠質(zhì)量百分比濃度為12%，濃縮膠中使用80V電壓，進(jìn)入分離膠后使用120V電壓；跑膠過(guò)程結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，后用脫色液脫色，至背景清晰。將目的蛋白條帶切下，切碎，裝入合適的透析袋中，裝入ImL電洗脫液，置于電泳槽中，加入適量電洗脫液，以120V的電壓洗脫2小時(shí)，然后取上清于10000rmp，4°C下離心15min，取上清，在尿素緩沖液中梯度透析復(fù)性，即為純化后的受體蛋白溶液。二、sra特殊芯片的制備取一鍍金芯片，用超純水沖洗金膜，將金膜放入硫酸/過(guò)氧化氫Piranha混合液中，靜置15min，隨后用超純水-丙酮-超純水-無(wú)水乙醇-超純水沖洗金膜表面，烘干；將金片置于lOmmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30min，取出金片用80VOl%乙醇洗滌，再用超純水沖洗，N2吹干；將金片置于培養(yǎng)皿中，在金片正中間滴加150 μ 1 EDC/ NHS混合液，室溫靜置15min，超純水沖洗，N2吹干；重新將金片置于培養(yǎng)皿中，在金膜正中間滴加150 μ 1200 μ g/L的SA (鏈霉親和素)溶液，室溫靜置15min，超純水沖洗，N2吹干。三、表面等離子共振檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體的相互作用將處理好的金片放到表面等離子共振儀上，通PBS緩沖液，使其注滿整個(gè)流通池， 待基線平穩(wěn)后，注入70 μ 1雌激素受體，靜置反應(yīng)20min，再通入PBS緩沖液沖洗未結(jié)合上的受體，穩(wěn)定后再依次進(jìn)樣不同濃度的DBP，其濃度分別為1 X 10_5g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_9g/ L、1 X ΙΟ—1、/!、1 X 10_13g/L、1 X 10_15g/L、1 X 10_17g/L，得到雌激素受體-肽酸酯配體結(jié)合曲線。由圖ι可見，當(dāng)雌激素受體結(jié)合到芯片上后，sra的響應(yīng)強(qiáng)度顯著增大，讓其反應(yīng)約 20min，然后繼續(xù)用PBS緩沖液沖洗，將多余的未結(jié)合上的受體洗脫，待穩(wěn)定后開始進(jìn)樣DBP 溶液，濃度由低到高，由圖中曲線可見，當(dāng)配體與受體結(jié)合后SPR響應(yīng)強(qiáng)度隨之增大，且隨著DBP溶液濃度的增大而增大，當(dāng)受體上的結(jié)合位點(diǎn)基本上都與配體結(jié)合后，增大趨勢(shì)便開始減弱，至基本飽和，然后繼續(xù)用PBS緩沖液將多余的DBP沖洗掉，此時(shí)，sra的響應(yīng)強(qiáng)度基本穩(wěn)定，可見雌激素受體與肽酸酯配體已穩(wěn)定地結(jié)合。實(shí)施例2四、鯉魚體內(nèi)雌激素受體的提取與純化3.含雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)的提取取馴養(yǎng)于含肽酸酯的水中的鯉魚肝臟，先用0. 2mol/L的KCl溶液將肝臟表面血液清洗干凈，再將表面水分吸干，稱重，再以質(zhì)量體積比為Ig 6ml的比例加入HEDG緩沖液進(jìn)行研磨，獲得肝組織勻漿(以上操作均在冰上進(jìn)行)。勻漿液于15000rmp，4°C下離心1 小時(shí)，吸取上清，即為含有受體的細(xì)胞質(zhì)溶液。分裝于_80°C保存。4.雌激素受體的分離純化使用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離分析，濃縮膠質(zhì)量百分比濃度為5%，分離膠質(zhì)量百分比濃度為12%，濃縮膠中使用90V電壓，進(jìn)入分離膠后使用130V電壓；跑膠過(guò)程結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，后用脫色液脫色，至背景清晰。將目的蛋白條帶切下，切碎，裝入合適的透析袋中，裝入ImL電洗脫液，置于電泳槽中，加入適量電洗脫液，以130V的電壓洗脫2小時(shí)，然后取上清于10000rmp，4°C下離心15min，取上清，在尿素緩沖液中梯度透析復(fù)性，即為純化后的受體蛋白溶液。五、sra特殊芯片的制備取一鍍金芯片，用超純水沖洗金膜，將金膜放入硫酸/過(guò)氧化氫Piranha混合液中，靜置20min，隨后用超純水-丙酮-超純水-無(wú)水乙醇-超純水沖洗金膜表面，烘干；將金片置于15mmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育40min，取出金片用80VOl%乙醇洗滌，再用超純水沖洗，N2吹干；將金片置于培養(yǎng)皿中，在金片正中間滴加150μ 1EDC/NHS 混合液，室溫靜置20min，超純水沖洗，N2吹干；重新將金片置于培養(yǎng)皿中，在金膜正中間滴加150 μ 1200 μ g/L的SA (鏈霉親和素)溶液，室溫靜置20min，超純水沖洗，隊(duì)吹干。六、表面等離子共振檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體的相互作用將處理好的金片放到表面等離子共振儀上，通PBS緩沖液，使其注滿整個(gè)流通池， 待基線平穩(wěn)后，注入70 μ 1雌激素受體，靜置反應(yīng)20min，再通入PBS緩沖液沖洗未結(jié)合上的受體，穩(wěn)定后再依次進(jìn)樣不同濃度的DBP，其濃度分別為1 X 10_5g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_9g/ L、1 X ΙΟ—1、/!、1 X 10_13g/L、1 X 10_15g/L、1 X 10_17g/L，得到雌激素受體 _ 肽酸酯配體結(jié)合曲線。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括(1)將喂養(yǎng)于含肽酸酯的水中的鯉魚殺死并取出肝臟，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入與肝臟質(zhì)量體積比為Ig 4 6ml的HEDG緩沖液勻漿，離心取上清，即得含有受體的細(xì)胞溶質(zhì)；(2)使用SDS-PAGE電泳對(duì)上述含有受體的細(xì)胞溶質(zhì)進(jìn)行分離分析，濃縮膠中使用80 90V電壓，進(jìn)入分離膠后使用120 130V電壓；分離分析結(jié)束后將目的蛋白條切碎，裝入 ImL電洗脫液，置于電泳槽中以120 130V的電壓洗脫，離心取上清，即為純化后的受體蛋白溶液；(3)用超純水沖洗金片，將金片放入硫酸/過(guò)氧化氫混合液中，靜置，隨后依次用超純水、丙酮、超純水、無(wú)水乙醇、超純水沖洗金片表面，烘干；將金片置于10 15mmol/L的 3-巰基丙酸乙醇溶液中，40°C下孵育30 40min，取出金片用乙醇洗滌，再用超純水沖洗、 吹干；在金片上分別滴加150 μ 1 EDC/NHS混合液和150 μ 1 200 μ g/L的鏈霉親和素溶液， 分別于室溫靜置、超純水沖洗、吹干；(4)將經(jīng)上述預(yù)處理的金片放到表面等離子共振儀上，通入PBS緩沖液，注入70μ 1受體，靜置反應(yīng)20min，再用PBS緩沖液沖洗至穩(wěn)定，再依次進(jìn)樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到雌激素受體-肽酸酯配體結(jié)合曲線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特征在于所述步驟(1)中的KCl溶液濃度為0. 15 0. 2mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特征在于所述步驟O)中的濃縮膠濃度為5 %，分離膠濃度為12%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特征在于所述步驟(3)中的靜置時(shí)間為15 20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特征在于所述步驟(3)中的吹干采用N2吹干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，其特征在于所述步驟⑷中的肽酸酯溶液濃度分別為lX10_17g/L、lX10_15g/L、lX10_13g/L、 1 X 10_ng/L、1 X 10_9g/L、1 X 10_7g/L、1 X 10_5g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雌激素受體與肽酸酯配體相互作用的方法，包括將SPR的金屬芯片進(jìn)行特殊處理，再將從鯉魚肝臟中提取的雌激素受體固定到經(jīng)過(guò)特殊處理的金屬芯片上，再進(jìn)樣不同濃度的肽酸酯溶液，得到受體-配體結(jié)合曲線。本發(fā)明受體與配體的結(jié)合特異性好，檢出限低，可達(dá)10-17g/L，靈敏度為10-8ng/L，操作快捷簡(jiǎn)便，可用于研究低濃度下配體-受體的相互作用，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/55GK102253008SQ20111015656
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者康丹妮, 祁明亮, 趙曉祥, 鄭寅 申請(qǐng)人:東華大學(xué)