專利名稱：抗人磷酸二酯酶4d相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗體的醫(yī)藥配制品，或單克隆抗體的制備，具體是一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Myomegalin(MMG/MMGL/PDE4DIP, phosphodiesterase 4D interacting protein, 磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)是一種嶄新的蛋白，它分布于胞漿中，并在高爾基體和中心體處聚集，提示該分子的主要功能涉及這兩個(gè)細(xì)胞器的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Myomegalin基因很長(zhǎng)，約15萬(wàn)堿基對(duì),但是其每個(gè)外顯子都很小,大約只有30-40氨基酸，因此Myomegalin的變體很多。目前尚不清楚具體有多少個(gè)Myomegalin的變體存在。Myomegalin蛋白結(jié)構(gòu)中含有α螺旋和coiled-coil結(jié)構(gòu)，以及微管相關(guān)蛋白結(jié)合域和亮氨酸拉鏈模式。Myomegalin還被稱作Η)Ε40ΙΡ,這是由于該蛋白可以結(jié)合循環(huán)中的 TOE4D(核苷酸磷酸二酯酶)。在腫瘤性疾病中能夠見(jiàn)到Myomegalin的異常表現(xiàn)。骨髓增生異常的病人中可以檢測(cè)出PDE4DIP-PDGFRB融合基因。在食管腫瘤中可以見(jiàn)到Myomegalin 變體5蛋白的高表達(dá)。變體I蛋白則在大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞中缺失。由此可見(jiàn)，Myomegalin 變體與腫瘤的關(guān)系尚未完全闡明，值得進(jìn)一步研究。1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診斷、預(yù)防、治療提供了新的工具。單克隆抗體是研究蛋白質(zhì)表達(dá)和分布的主要工具之一， 針對(duì)Myomegalin的單克隆抗體可以檢測(cè)細(xì)胞和組織,尤其是腫瘤組織中Myomegalin的表達(dá)水平和定位情況，有助于深入研究Myomegalin的細(xì)胞學(xué)功能及在腫瘤中的生物學(xué)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決Myomegalin在細(xì)胞生物功能中的作用，以及Myomegalin與腫瘤之間的關(guān)系，應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測(cè)問(wèn)題，而提供一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的?！N抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體,特點(diǎn)是該抗體特異性識(shí)別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白1103-1116位點(diǎn)氨基酸；該抗體由保藏號(hào)為CGMCC No. 5078的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，氨基酸序列為序列表所示的氨基酸序列。一種雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞株保藏號(hào)為CGMCC No. 5078。所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，用來(lái)檢測(cè)人體組織及細(xì)胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達(dá)與定位。以此原核表達(dá)多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)細(xì)胞融合，用上述原核表達(dá)多肽進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性克隆，亞型鑒定及小鼠腹腔注射制備腹水， 腹水抗體進(jìn)行細(xì)胞和組織的免疫組化，觀察Myomegalin變體5蛋白的表達(dá)和定位檢測(cè)。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，其抗體與Myomegalin變體5蛋白具有特異性結(jié)合能力，制備人Myomegalin變體5蛋白的免疫組化檢測(cè)試劑,用來(lái)檢測(cè)人體組織特別是腫瘤組織細(xì)胞中 Myomegalin變體5的表達(dá)與定位。雜交瘤細(xì)胞株由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏；
地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
保藏號(hào)為CGMCC No. 5078，保藏日期:2011年7月22日。


圖I是Hela細(xì)胞的Myomegalin變體5蛋白免疫熒光染色圖2顯示Myomegalin變體5蛋白在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)與定位；
圖3顯示Myomegalin變體5蛋白在正常乳腺中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明?！yomegalin變體5 (磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5)的單克隆抗體的制備
I.實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源
BALB/c小鼠由天津腫瘤醫(yī)院提供，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；Hela細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)由天津腫瘤醫(yī)院提供，購(gòu)自中科院血研所。福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、HAT、HT條件培養(yǎng)基成分購(gòu)自Invitrigen公司。DMEM培養(yǎng)基、聚乙二醇 (PEG)、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠Ig、 鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、8_氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)購(gòu)自Sigma公司。2.動(dòng)物免疫
取7 10周齡BALB/c雌性小鼠4只，將IOOug Myomegalin變體5蛋白多肽(1103-1116 氨基酸，帶有GST標(biāo)簽)(香港科技大學(xué)齊眾教授提供)溶于O. 2ml O. IM PBS (pH7. 2)，與等體積弗氏完全佐劑(Sigma)充分混勻，腹部皮下多點(diǎn)注射。第I次免疫后第15和29天， 分別用IOOug多肽/ 0.2ml PBS與等體積弗氏不完全佐劑(Sigma)充分混勻后加強(qiáng)免疫， 融合前3d由尾靜脈強(qiáng)化免疫注射50ug多肽/ O. 2ml PBS I次。3.細(xì)胞融合
取經(jīng)加強(qiáng)免疫的BALB/c小鼠I只，放血處死后，無(wú)菌條件下取脾，制備脾細(xì)胞懸液。取 2X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，于37°C水浴中加50%PEG (MW 4000)1 ml融合，將融合細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別采用HAT和HT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底面1/3時(shí)，用Myomegalin變體5蛋白多肽作包被抗原，以ELISA法篩選抗體，選擇抗體分泌陽(yáng)性孔，采用有限稀釋法，將雜交瘤細(xì)胞稀釋為5-10個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)， 選擇單個(gè)細(xì)胞集落孔的培養(yǎng)上清作抗體檢測(cè)，陽(yáng)性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體分泌陽(yáng)性率為100%。4.陽(yáng)性雜交瘤腹水單克隆抗體的制備
BALB/c小鼠腹腔注射PristaneO. 5ml /只，I周后腹腔注射生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞 IO7, 10 d左右，小鼠腹部脹大至其活力極差時(shí)，處死小鼠，抽取其腹水，離心去沉淀，收集上清測(cè)定效價(jià)。5.間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)
以Myomegalin變體5蛋白多肽包被酶標(biāo)板，設(shè)空白對(duì)照組，37 °C包被過(guò)夜。用O. 25%BSA 37°C封閉I h。加入腹水抗體，以封閉液作系列梯度稀釋，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠Ig，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。OPD底物顯色系統(tǒng)顯色5-10 min，測(cè)定0D492值。6.抗體亞型鑒定
以羊抗鼠Ig包被酶標(biāo)板，37°C包被過(guò)夜。用O. 25%BSA 37°C封閉I h。加入雜交瘤培養(yǎng)上清，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。分別加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，37°C孵育 lh, PBS-T 洗 5 次。OPD 底物顯色系統(tǒng)顯色 5-10 min，測(cè)定 0D492 值。7.結(jié)果
細(xì)胞融合后，以重組Myomegalin變體5蛋白多肽為檢測(cè)抗原，間接ELISA篩選獲得一株單抗，亞型鑒定為IgGl，小鼠腹水效價(jià)為I :8000。二、Myomegalin變體5單抗的特異性檢測(cè)
I.實(shí)驗(yàn)方法
將Hela細(xì)胞胰酶消化，取適量細(xì)胞點(diǎn)于載玻片上，37°C培養(yǎng)8小時(shí)后，冷甲醇固定， 2%BSA封閉Ih,加Myomegalin變體5單抗、微管蛋白(Y -tubulin)抗體孵育37°C 2h, PBS 洗滌后加不同熒光素標(biāo)記的二抗室溫閉光孵育lh，熒光顯微鏡下觀察。見(jiàn)附圖I。2.結(jié)果判定
微管蛋白(Y-tubulin)作為在細(xì)胞中心體和高爾基體上均有染色，以中心體為強(qiáng)； Myomegalin變體5主要在高爾基體上有明顯熒光顯色，中心體處略弱，說(shuō)明該抗體對(duì)于 Myomegalin蛋白具有明顯的特異性,特異性識(shí)別人Myomegalin蛋白變體5的1103-11160
位點(diǎn)氨基酸。三、Myomegalin變體5蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用
I.乳腺癌切片制備
乳腺癌切片取自天津腫瘤醫(yī)院病理室，常規(guī)脫蠟。2.免疫組化步驟
將載玻片取出置于500ml甲醇+15ml 3% H202溶液中，浸泡15分鐘，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。浸入檸檬酸緩沖液(PH=6. O)中，微波爐抗原修復(fù)12分鐘。每片點(diǎn)I滴正常羊血清，37°C溫浴20分鐘。應(yīng)用Myomegalin變體5單抗I :800稀釋，4°C過(guò)夜。PBS漂洗3遍， 加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37°C孵育15分鐘，DAB顯色，常規(guī)復(fù)染與封片。3.結(jié)果判定
乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌染色顯示，Myomegalin變體5蛋白在陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)呈均勻著色的棕/黃色顆粒，或(和)密集散在分布，纖維間質(zhì)細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等不著色，背景清晰。正常乳腺很少著色，見(jiàn)附圖2、3。因此,該抗體制備的人Myomegalin變體5蛋白的免疫組化檢測(cè)試劑，用來(lái)檢測(cè)人體組織及細(xì)胞中Myomegalin變體5的表達(dá)與定位。
SEQUENCE LISTING <110>天津市腫瘤醫(yī)院
〈120〉抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應(yīng)用 〈130〉 I 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 I 〈211〉 14 〈212〉 PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉
<221> protein 〈222〉 (I).· (14)
〈400〉 I
Gly Glu Leu Glu Ser Val Arg lie His His Lys His Ala Tyr I510
權(quán)利要求
1.一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體，其特征是該抗體特異性識(shí)別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的1103-1116位點(diǎn)氨基酸；該抗體由保藏號(hào)為 CGMCC No. 5078的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，氨基酸序列為序列表所示的氨基酸序列。
2.一種雜交瘤細(xì)胞，其特征在于該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞株保藏號(hào)為=CGMCC No. 5078。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體在制備免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，用來(lái)檢測(cè)人體組織及細(xì)胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達(dá)與定位。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于含有抗體的醫(yī)藥配制品，或單克隆抗體的制備。該抗體特異性識(shí)別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的1103-1116位點(diǎn)氨基酸；該抗體由保藏號(hào)為CGMCCNo.5078的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，氨基酸序列為GELESVRIHHKHAY。本發(fā)明的單克隆抗體與磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5具有特異性結(jié)合能力，用來(lái)檢測(cè)人體組織及細(xì)胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達(dá)與定位，用作為人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的免疫組化檢測(cè)試劑。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102584995SQ20111029724
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者張霖, 楊毅, 牛瑞芳, 羅藝, 魏熙胤, 齊眾 申請(qǐng)人:天津市腫瘤醫(yī)院