包含5型磷酸二酯酶抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】包含5型磷酸二酯酶抑制劑的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用 組合物 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制劑的腦 神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡（apoptosis)抑制用組合物、保健功能食品及細(xì)胞凋亡的抑制方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase)為對(duì)在細(xì)胞中分別使用5-腺苷酸及5-鳥(niǎo) 昔酸來(lái)使環(huán)腺昔酸（cAMP，cyclic adenosine monophosphate)和/或環(huán)鳥(niǎo)昔酸（cGMP， cyclic guanosine monophosphate)水解的作用進(jìn)行催化的酶，由此，這些對(duì)環(huán)腺苷酸或 環(huán)鳥(niǎo)苷酸水平的細(xì)胞性調(diào)節(jié)重要。眾所周知，至今已知的磷酸二酯酶共有11種（Nature， 674-682(2002))。據(jù)報(bào)告，在上述磷酸二酯酶中，5型磷酸二酯酶為分解環(huán)鳥(niǎo)苷酸來(lái)生成 5' -鳥(niǎo)苷酸的酶，因而若抑制上述5型磷酸二酯酶，則維持環(huán)鳥(niǎo)苷酸的濃度來(lái)持續(xù)勃起 (Boolel, M. et al.，Br. J. of Urology, 78, 257-261 (1996))。由此，5 型磷酸二酯酶抑制劑使 用為勃起功能障礙治療劑。
[0003] 眾所周知，這種5型磷酸二酯酶抑制劑有很多化合物。萬(wàn)艾可（Viagra)?(通用 名：西地那非；W0 94/28902)為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)認(rèn)可的最初男性用勃起功 能障礙治療劑，并且，許可了西力士（Cialis)?(通用名：他達(dá)拉非；W0 95/19978)及艾力 達(dá)（Levitra)?(通用名：伐地那非；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters)。眾所周 知，5型磷酸二酯酶抑制劑還有Mvix?(通用名：米羅那非；KR0358083)。眾所周知，如上所 述的藥劑呈現(xiàn)優(yōu)秀的治療效果，來(lái)改善約70%的患者的性功能。眾所周知，5型磷酸二酯 酶抑制劑的其他醫(yī)藥用途有門(mén)脈高壓癥、肝-腎綜合癥、肝-肺綜合癥的治療效果（韓國(guó)公 開(kāi)特許第10-2012-0024807號(hào)），據(jù)報(bào)告，還有改善哺乳動(dòng)物的生殖能力（韓國(guó)公開(kāi)特許第 1〇- 2〇〇2_0〇31〇62 號(hào)）的效果。
[0004] 并且，據(jù)報(bào)告，作為5型磷酸二酯酶抑制劑的西地那非及伐地那非誘導(dǎo)B-慢 性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（B-chronic lymphocytic leukemia cells)的胱天蛋白酶 (caspase) -依賴性細(xì)胞凋亡（Marika Sarfati et al.，BLOOD, VOLUME 101，NUMBER 1(2003)) 〇
[0005] 本說(shuō)明書(shū)全文中，參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，并表示了其引用。所引用的論文及 專利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容全部插入于本說(shuō)明書(shū)作為參照，從而更加明確說(shuō)明本發(fā)明所屬的技術(shù) 領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]【技術(shù)問(wèn)題】
[0007] 本發(fā)明人在對(duì)5型磷酸二酯酶抑制劑進(jìn)行研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了5型磷酸二酯酶 抑制劑在腦神經(jīng)細(xì)胞中反而抑制細(xì)胞凋亡。具體地，將5型磷酸二酯酶抑制劑給藥到由腦 損傷誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的動(dòng)物模型中，其結(jié)果確認(rèn)到顯著抑制了腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡，并通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果，改善動(dòng)物模型的認(rèn)知及運(yùn) 動(dòng)功能的降低，從而完成了本發(fā)明。
[0008] 【解決問(wèn)題的手段】
[0009] 本發(fā)明的目的在于，提供腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用藥劑學(xué)組合物。
[0010] 本發(fā)明的再一目的在于，提供腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用保健功能食品。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于，提供腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的抑制方法。
[0012] 根據(jù)以下發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明、發(fā)明要求保護(hù)范圍及附圖更加明確本發(fā)明的其他目的 及優(yōu)點(diǎn)。
[0013] 【發(fā)明效果】
[0014] 歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)如下：
[0015] (i)本發(fā)明提供包含5型磷酸二酯酶抑制劑的腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用組合 物、保健功能食品及細(xì)胞凋亡的抑制方法。
[0016] (ii)根據(jù)本發(fā)明，5型磷酸二酯酶抑制劑抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，來(lái)呈現(xiàn)對(duì) 神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
[0017] (iii)本發(fā)明的組合物可抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防、改善及治療腦神經(jīng) 疾病。 【【附圖說(shuō)明】】
[0018] 圖1為示出米羅那非的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果（腦萎縮性、退行性神經(jīng)元、胱天蛋白 酶-3及聚（腺苷二磷酸_核糖）聚合酶）的組織病理學(xué)照片。
[0019] A :假手術(shù)對(duì)照（Sham)組
[0020] B :神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組
[0021] C :0? 5mg/kg的米羅那非給藥組
[0022] D :lmg/kg的米羅那非給藥組
[0023] E :2mg/kg的米羅那非給藥組
[0024] 比例尺=100 um
[0025] 箭頭表示近端大腦中動(dòng)脈。
[0026] 圖2示出借助米羅那非處理的動(dòng)物模型的體重變化。
[0027] 圖3為示出米羅那非的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果（腦萎縮性、退行性神經(jīng)元、胱天蛋白 酶-3及聚（腺苷二磷酸_核糖）聚合酶）的腦切片的組織病理學(xué)照片。
[0028] A :假手術(shù)對(duì)照組
[0029] B :神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組
[0030] C :手術(shù)后24小時(shí)開(kāi)始將lmg/kg的米羅那非進(jìn)行給藥的實(shí)驗(yàn)組
[0031] D :手術(shù)后72小時(shí)開(kāi)始將lmg/kg的米羅那非進(jìn)行給藥的實(shí)驗(yàn)組
[0032] E :手術(shù)后168小時(shí)開(kāi)始將lmg/kg的米羅那非進(jìn)行給藥的實(shí)驗(yàn)組
[0033] 比例尺=100 ym
[0034] 箭頭表示神經(jīng)細(xì)胞凋亡手術(shù)（大腦損傷）的東側(cè)面。
[0035] 圖4示出米羅那非處理時(shí)期的動(dòng)物模型的體重變化。
[0036] 圖5示出米羅那非處理時(shí)期的前肢放置檢查的變化。
[0037] 與基于最小顯著差異（LSD)試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ap < 0. 01。
[0038] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組進(jìn)行比較，bp < 0. 01。
[0039] 與基于麗試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ep< 0. 01。
[0040] 圖6示出米羅那非處理時(shí)期的后肢放置檢查的變化。
[0041] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ap < 0. 01及bp < 0. 05。
[0042] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組進(jìn)行比較，p < 0. 01。
[0043] 與基于麗試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，dp< 0. 01。
[0044] 圖7示出米羅那非處理時(shí)期的身體搖擺的變化。值由8只大鼠的平均值（mean) 土 標(biāo)準(zhǔn)差（SD)來(lái)表示。
[0045] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ap < 0. 01。
[0046] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組進(jìn)行比較，bp < 0. 01。
[0047] 圖8示出米羅那非處理時(shí)期的認(rèn)知運(yùn)動(dòng)行為（水迷宮檢查）的變化。值由8只大 鼠的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。
[0048] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ap < 0. 01及bp < 0. 05。
[0049] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組進(jìn)行比較/p < 0. 01、dp < 0. 05。
[0050] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的假手術(shù)對(duì)照組進(jìn)行比較，ep < 0. 01。
[0051] 與基于最小顯著差異試驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)照組進(jìn)行比較，fp < 0.01及5 < 0? 05〇
[0052]【最佳實(shí)施方式】
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制用藥劑學(xué)組合 物，其包含：（i) 5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制劑的藥劑學(xué)有效劑 量；以及（ii)藥劑學(xué)上接受的載體。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法，上 述抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法包括將包含5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制劑的組合物以有效劑量給藥到需要上述組合物的個(gè)體（subject)的步 驟。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供改善認(rèn)知功能障礙或運(yùn)動(dòng)功能障礙 的方法，上述改善認(rèn)知功能障礙或運(yùn)動(dòng)功能障礙的方法包括將包含5型磷酸二酯酶 (phosphodiesterase type 5)活性抑制劑的組合物以有效劑量給藥到需要上述組合物的 個(gè)體（subject)的步驟。
[0056] 本發(fā)明人在對(duì)5型磷酸二酯酶抑制劑進(jìn)行研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了 5型磷酸二酯酶 抑制劑在腦神經(jīng)細(xì)胞中反而抑制細(xì)胞凋亡。具體地，將5型磷酸二酯酶抑制劑給藥到由腦 損傷誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的動(dòng)物模型中，其結(jié)果確認(rèn)到顯著抑制了腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞 凋亡，并通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果，改善動(dòng)物模型的認(rèn)知及運(yùn) 動(dòng)功能的降低。
[0057] 在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"5型磷酸二酯酶活性抑制劑"或"5型磷酸二酯酶抑制劑"是 指可對(duì)5型磷酸二酯酶的催化作用選擇性或非選擇性地抑制或減少的物質(zhì)。上述5型磷酸 二酯酶抑制劑包含化合物、肽、小分子、抗體或其的片段及天然提取物。
[0058] 在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制劑為化合物。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述5型磷酸二酯酶抑制劑選自由米羅那非 (mirodenafil)、西地那非（sildenafil)、伐地那非（vardenafil)、他達(dá)拉非（tadalafil)、 烏地那非（udenafil)、達(dá)生他非（dasantafil)、阿伐那非（avanafil)以及它們的藥劑學(xué)上 接受的鹽、溶劑化物及水合物組成的組中。
[0060] 在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制劑為米羅那非、西地那非、伐地那非或它 們的藥劑學(xué)上接受的鹽。
[0061] 上述藥劑學(xué)上接受的鹽是指對(duì)將化合物進(jìn)行給藥的有機(jī)體不誘發(fā)嚴(yán)重的刺激，并 防止化合物的生物學(xué)活性和物性受損的、化合物的劑型。上述藥劑學(xué)上接受的鹽為藥劑學(xué) 上可接受的、以利用實(shí)質(zhì)上非毒性的有機(jī)酸及無(wú)機(jī)酸的該領(lǐng)域中眾所周知的通常的方法制 備而得的鹽。上述酸包含鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸、甲磺酸（methanesulfonic acid)、乙橫酸（ethanesulfonic acid)、對(duì)甲苯橫酸（p-toluenesulfonic acid)等橫酸、酒 石酸、甲酸、朽1檬酸、醋酸、三氯醋酸（trichloroacetic acid)、三氟醋酸（trifluoroacetic acid)、癸酸、異丁酸、丙二酸、丁二酸、鄰苯二甲酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富馬酸、馬來(lái)酸 及水楊酸等有機(jī)酸。并且，也可使本發(fā)明的化合物和堿發(fā)生反應(yīng)來(lái)形成銨鹽、鈉或鉀鹽等堿 金屬鹽、鈣或鎂鹽等堿土金屬鹽等鹽、二環(huán)己胺（dicyclohexylamine)、N-甲基-D-葡糖胺 (N-methyl-D-glucamine)、三（輕甲基）甲胺（tris(hydroxymethyl)methylamine)等有機(jī) 堿的鹽以及精氨酸、賴氨酸等氨基酸鹽。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述藥劑學(xué)上接受的鹽為米羅那非鹽酸鹽、西地那非檸檬 酸鹽或伐地那非鹽酸鹽。
[0063] 上述水合物（hydrate)是指包含借助非共價(jià)分子間力（non-covalent intermolecular force)結(jié)合的化學(xué)計(jì)量（stoichiometric)或非化學(xué)計(jì)量 (non-stoichiometric)的水的本發(fā)明的化合物或它們的鹽。
[0064] 上述溶劑化物（solvate)是指包含借助非共價(jià)分子間力結(jié)合的化學(xué)計(jì)量或非化 學(xué)計(jì)量的溶劑的本發(fā)明的化合物或它們的鹽。與其相關(guān)的優(yōu)選溶劑為揮發(fā)性、非毒性和/ 或適于給藥到人的溶劑。
[0065] 如在以下實(shí)施例中所證明，包含上述5型磷酸二酯酶抑制劑作為有效成分的本發(fā) 明的組合物抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)細(xì)胞" 包含中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦、腦干、脊髓、形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)和末梢神經(jīng)系統(tǒng)的接合部分等的結(jié) 構(gòu)的神經(jīng)元、神經(jīng)支持細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)及施萬(wàn)細(xì)胞等。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)細(xì)胞的保 護(hù)"是指減輕或改善（amelioration)神經(jīng)性損傷（nervous insult)的作用、或減輕或抑 制由神經(jīng)性損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的作用、或保護(hù)或恢復(fù)受到神經(jīng)性損傷的神經(jīng) 細(xì)胞的作用。并且，在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)性損傷"是指由多種原因（如外傷性腦損傷 之類的外部因素、遺傳原因、代謝原因、毒性原因、神經(jīng)毒性原因、生理原因及生物化學(xué)原因 等）導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織的損傷。