一種磷酸三酯酶的超高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領域，涉及一種針對磷酸三酯酶的超高通量篩選方法， 具體地說涉及一種磷酸三酯酶熒光底物的設計合成，以及基于該底物的針對磷酸三 酯酶的體外區(qū)室化 -焚光激活細胞分選（in vitro compartmentalization based fluorescence-activated cell sorting，IVC-FACS)超高通量篩選技術。
【背景技術】
[0002] 磷酸三酯酶（EC 3. 1. 8. 1)是降解有機磷化合物的有效生物催化劑，在有機磷 農(nóng)藥、有機磷化學戰(zhàn)劑的檢測、降解和解毒方面有著重要的應用（Afriat-J Urn〇U，L.; Roodveldtj C. ；Manco,G. ；Tawfik,D. S. Biochemistry 2006,45, 13677 - 13686. Afriat-Jurnouj L. ；Jackson, C. J. ；Tawfik, D. S. Biochemistry 2012, 51，6047 - 6055) 〇 同時，磷酸三酯酶還是一類研究蛋白質(zhì)自然進化機理的重要模式酶（Tokuriki，N.; Tawfikj D. S. Nature 2009, 459, 668 - 673. Gupta, R. D. ；Tawfik, D. S. Nat. Methods2008, 5, 939 - 942.)，由于自然界中的磷酸三酯酶是近幾十年來伴隨著有機磷農(nóng) 藥的出現(xiàn)才迅速進化出來的，因此被公認為是自然界中對非天然底物催化活性進化最快 的酶之一，研究該類酶的進化模式，有助于人類更好地了解自然界定向進化的機制。近年 來，研究者對磷酸三酯酶進行了大量的定向進化研究（Zhang，Y. ;An，J. ;Ye，W. ;Yang，G.; Qian, Z. G. ；Chen, H. F. ；Cui, L. ；Feng, Y. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 6647 - 6655. Meier, Μ. M. ；Rajendran, C. ；Malisi, C. ；Fox, N. G. ；Xu, C. ；Schlee, S. ；Barondeau, D. P. ； Hocker, B. ；Sterner, R. ；Raushel, F. M. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 11670 - 11677. Mandrich, L. ；Merone, L. ；Manco, G. Environ. Technol. 2010, 31, 1115 - 1127. Draganov, D. I. Chem. Biol. Interact. 2010, 187, 370 - 372.)，以期獲得催化性質(zhì)優(yōu)良的突變酶，并揭示 該類酶進化的分子機制。
[0003] 對磷酸三酯酶進行定向進化研究，需要從大量的突變體中篩選出極少數(shù)性質(zhì)提 高的突變體，因此要求對突變庫進行快速高效的篩選。而常規(guī)的基于底物平板或微孔板 的篩選方法由于篩選通量低（<1〇 5/天）、費時費力而很難滿足對酶進行快速定向進化的 要求。區(qū)室化-焚光激活細胞分選（in vitro coipartmentalization based fluorescence-activated cell sorti呢，IVC-FACS)是新近出現(xiàn)的酶活丨生超高通量篩選技術（Aharoni, A ；Amitai，G. ;Bemath，K·; Magdassi, S. ；Tawfik, D. S. Chem. Biol. 2005,12,1281-1289. Mastrobattista, E. ；Taly V. ；Chanudet, E.； Treacy, P. ;Kelly, a T. !Griffiths, A D. ChaiL Biol. 200512,1291-1300.)，該技術利用"水包油包水"二級 微液滴作為酶反應體系，在皮升級的體積中包裹酶、基因、底物及熒光產(chǎn)物，利用流式細胞 儀可以根據(jù)微液滴的熒光強度而對其中的酶活性進行定量，并快速分選出符合預期性質(zhì) 的突變體，其篩選通量高達IO 8個液滴/天，同時大大降低了篩選的試劑和人力消耗，因此 被稱為超高通量篩選體系。IVC-FACS技術的關鍵在于獲得適于微液滴實驗的底物，該底 物經(jīng)酶催化后的熒光產(chǎn)物必須能夠在微液滴中有很好的保留才能夠準確反映其中的酶活 性。目前，只有Tawf ik等人開發(fā)的一種基于3-氰基-7-羥基香豆素的底物應用磷酸三酯 酶的 IVC-FACS 篩選（Gupta，R.D. ;Goldsmith，M. ;Ashani，Y. ;Simo，Y. ;Mullokandov，G.; Bar, H. ；Ben-David, M. ；Leader, H. ；Margalit, R. ；Silman, I. ；Sussman, J. L. ；Tawfik, D. S. Nat. Chem. Biol. 2011，7, 120-125)，但該底物的產(chǎn)物3-氰基-7-羥基香豆素在微液滴中 仍然擴散很快，使得篩選方法的靈敏度和準確度都受到了極大的影響。這里，我們通過對香 豆素進行極性修飾，獲得了基于羧基香豆素的磷酸三酯酶底物，其酶反應產(chǎn)物具有良好的 液滴保留性能，基于該底物的IVC-FACS體系能夠快速準確地對磷酸三酯酶進行活性定量 和篩選，在磷酸三酯酶定向進化領域有著重要應用潛力。
[0004] 現(xiàn)有的基于氰基香豆素磷酸三酯酶底物DEPCyC的IVC-FACS體系由于反應產(chǎn)物氰 基香豆素（圖l，3-cyano_7-hydroxycoumarin，CYHC)疏水性較強，容易快速通過"水包油 包水"二級微液滴的油相進入外水相，造成熒光信號快速擴散出微液滴，因而無法準確反映 酶活性，進而影響篩選的準確度和效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種新型的磷酸三酯酶底物，可用于篩選和富集磷酸三酯酶，磷 酸三酯酶突變體或者含有磷酸三酯酶突變體的工程菌。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述磷酸三酯酶底物的制備方法。
[0008] 本發(fā)明還提供了利用上述磷酸三酯酶底物的磷酸三酯酶高通量篩選方法。
[0009] 這種磷酸三酯酶底物是7-羥基香豆素-3-酸-磷酸二烷酯，結(jié)構(gòu)如式（I)所示：
[0011] 其中R1選自Cl~C6烷基；A為羧基、羧甲基、羧乙基、羧丙基或羧丁基。
[0012] 優(yōu)選的，R1為甲基、乙基、丙基或丁基。
[0013] 所述磷酸三酯酶熒光底物選自：7_羥基香豆素-3-羧酸-磷酸二乙酯、7-羥基香 豆素-3-羧酸-磷酸二甲酯、7-羥基香豆素-3羧酸-磷酸二丙酯、7-羥基香豆素-3-羧 酸-磷酸二丁酯、7-羥基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二乙酯、7-羥基香豆素-3-羧甲酸-磷酸 二甲酯、7-羥基香豆素-3羧甲酸-磷酸二丙酯、7-羥基香豆素-3-羧甲酸-磷酸二丁酯、 7-羥基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二乙酯、7-羥基香豆素-3-羧乙酸、7-羥基香豆素-3羧乙 酸一磷酸二丙酯、7-羥基香豆素-3-羧乙酸-磷酸二丁酯。
[0014] 上述磷酸三酯酶熒光底物可應用于篩選和富集磷酸三酯酶突變體或者含有磷酸 三酯酶突變體的工程菌。
[0015] 磷酸三酯酶熒光底物的制備方法，步驟為：
[0016] (1)將式（II)的7-羥基豆香素-3-酸類化合物及1，8-二氮雜雙環(huán)十一碳-7-烯 溶解于DMF中，加入芐基溴，攪拌反應10~16小時；
[0019] (2)向反應體系中加水過濾，取沉淀干燥后溶解于四氯化碳與四氫呋喃的混合液 中；0~4°C下加入三乙胺，再加入式（III)的磷酸二烷酯，攪拌反應2~6小時；
[0020] (3)用水和二氯甲烷萃取，分離有機相蒸發(fā)濃縮，殘留液體經(jīng)硅膠柱層析，溶解于 乙酸乙酯；溶液中加入Pd/C催化劑并加氫還原；過濾取沉淀重結(jié)晶。
[0021] 磷酸二甲酯、磷酸二丙酯、磷酸二丁酯代替磷酸二乙酯，或者用7-羥基香豆 素-3-羧甲酸、7-羥基香豆素-3-羧乙酸、7-羥基香豆素-3-磺酸、7-羥基香豆素-3-甲磺 酸、7-羥基香豆素-3-乙磺酸代替7-羥基香豆素-3-羧酸進行反應，獲得具有熒光性的底 物。
[0022] 用上述底物進行磷酸三酯酶高通量篩選方法，該方法為磷酸三酯酶 的體外區(qū)室化-焚光激活細胞分選（in vitro compartmentalization based fluorescence-activated cell sorting，IVC-FACS)超高通量篩選技術，包括如下步驟：
[0023] (1)制備粒徑在9~12 μ m的水-油-水二級微液，其中油相成分為含有乳化劑的 輕石蠟油，并將胞內(nèi)表達磷酸三酯酶突變體的單細胞包裹在內(nèi)水相中；
[0024] (2)在水-油-水二級微液的外水相中加入上述磷酸三酯酶熒光底物，所述磷酸三 酯酶熒光底物在外水相中的含量為〇. 3~0. 8mmol/L ;
[0025] (3)檢測產(chǎn)物熒光反應后的熒光強度，并篩選熒光陽性的群體。
[0026] 水-油-水二級微液的內(nèi)水相-油相的粒徑為3~5 μ m。所述的內(nèi)水相和外水相 為pH = 7. 3~7. 5的磷酸緩沖液，優(yōu)選為pH = 7. 4的磷酸緩沖液。更優(yōu)選的，外水相中還 含有1. 5%~2. 5%體積比的表面活性劑，例如Triton X-120。
[0027] 所述水-油-水二級微液的制備方法為：
[0028] a.用含有乳化劑的輕石蠟油為油相，含有胞內(nèi)表達磷酸三酯酶突變體的單細胞、 pH = 7. 3~7. 5的磷酸緩沖液為內(nèi)水相，乳化擠出獲得粒徑為3~5 μπι的內(nèi)水相-油相； 優(yōu)選的，所述的油相中所含乳化劑的體積比為2. 5%~3. 2% ;
[0029] b.步驟a獲得的內(nèi)水相-油相乳液擠出注入外水相，混合獲得水-油-水二級微 液；所述的外水相為pH = 7. 4的磷酸緩沖液。
[0030] 本發(fā)明應用具有較高分子極性的羧基修飾香豆素基團，從而提