專利名稱：檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種研究家蠶蛋白抗細胞凋亡的方法，該方法利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)表達并純化目的蛋白，通過自建的過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型，進而研究目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。
背景技術：
目前，對酵母和哺乳動物細胞凋亡的研究越來越多，這些研究成果雖然促進了對昆蟲細胞凋亡的研究，但昆蟲細胞與酵母和哺乳動物細胞不同，在誘導細胞凋亡的因子、誘導方法和細胞凋亡的檢測方面都有很多的不同之處，如病毒感染、紫外線輻射、蛋白質合成抑制劑、脂類信號小分子、重金屬離子和植物源農藥等都可以誘導昆蟲細胞的凋亡，但誘導的條件和檢測方法均有很大的差異。同時，昆蟲細胞內既有類似于線蟲的凋亡信號通路，也有類似于哺乳動物細胞的凋亡信號通路。這些都表明昆蟲細胞的凋亡與其他動物細胞存在著一些差異。隨著家蠶基因組框架圖的完成，關于家蠶細胞凋亡機制的探索已成為研究熱點之一，建立適應于昆蟲細胞的凋亡誘導條件和檢測的方法將具有重要意義。目前有關家蠶細胞凋亡的研究工作主要集中在對家蠶血淋巴對細胞凋亡的抑制作用，研究結果表明家蠶血淋巴能抑制由多種化學物質，如放線菌素D、喜樹堿和星形孢菌素和丁酸鈉誘導的細胞凋亡。大量的研究結果已證實家蠶血淋巴中對昆蟲細胞和多種哺乳動物細胞具有凋亡抑制作用的成份即為家蠶30K蛋白。家蠶30K蛋白是家蠶生長發(fā)育過程中的主要存儲蛋白之一，兼具載脂功能。家蠶30Kc6蛋白為該蛋白家族成員，有研究結果表明該蛋白具有一定抗昆蟲細胞凋亡的功能，但由于缺乏適當?shù)睦ハx細胞凋亡模型，有關其抗凋亡的作用機制還鮮見報道
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測目的蛋白對抗過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡是否具有抑制作用的方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，包括以下步驟:I)、目的蛋白的表達和純化；2)、建立過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型:利用過氧化氫誘導家蠶細胞的凋亡，從而建立體外細胞凋亡模型；3)、檢測目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的改進:家蠶細胞凋亡模型的建立方法為:將處于對數(shù)生長期的半貼壁家蠶培養(yǎng)細胞BmN按3X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C (例如為27°C)培養(yǎng)至細胞鋪滿孔底(培養(yǎng)時間約為24h),棄去細胞全培養(yǎng)基后；用Hanks液洗,再分別加入100 μ mol/L、lmmol/L、5mmol/L和lOmmol/L H2O2梯度處理2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分別加入細胞全培養(yǎng)基，繼續(xù)于26 28。。(例如為27°C)培養(yǎng)22 26h (例如為24h)；細胞全培養(yǎng)基為Sf-900:FBS=9: I的體積比。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:家蠶細胞凋亡模型的建立方法中，BmN細胞的最佳處理條件為:5mmol/L H2O2處理細胞，27°C培養(yǎng)4h。

作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的改進:步驟3)為通過ELISA法檢測目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:步驟3)為:將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞BmN，按3X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C (例如為27°C)培養(yǎng)至細胞鋪滿孔底(培養(yǎng)時間約為24h);再加入純化的目的蛋白至目的蛋白終濃度為4飛μ g/ml，對細胞進行預處理；繼續(xù)于26 28°C (例如為27°C)培養(yǎng)22 26h (例如為24h)后，用Hanks液洗，再加入5mmol/LH2O2于26 28°C (例如為27°C )處理3.5 4.5h (例如為4h)，接著用Hanks液洗，再加入含有濃度為5 μ g/ml目的蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基，于26 28°C (例如為27°C)培養(yǎng)22 26h(例如為24h)；然后分別檢測細胞的活力、檢測細胞的凋亡情況、檢測細胞內8-1soprostane的濃度；無血清細胞培養(yǎng)基為Sf-900。備注說明:當目的蛋白處理組(細胞活力、8-1soprostane的濃度、DNA片段化)與過氧化氫處理組相比有顯著差異時，證明目的蛋白對抗過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡具有抑制作用；反之，當目的蛋白處理組(細胞活力、8-1soprostane的濃度、DNA片段化)與過氧化氫處理組相比沒有顯著差異時，證明目的蛋白對抗過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡不具有抑制作用。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:利用Cell Proliferation ELISA試劑盒(Roche)檢測細胞的活力、Cell DeathDetection ELISA (Roche)試劑盒檢測細胞的凋亡情況、8-1soprostane EIA kit檢測細胞內 8-1soprostane 的濃度。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:利用蛋白免疫印跡法檢測細胞色素c的釋放。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:利用蛋白免疫印跡法檢測細胞色素c的釋放包括以下步驟:將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞BmN按I X IO6個/皿接種于培養(yǎng)皿(60mm的直徑)中，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C (例如為27°C)培養(yǎng)至細胞鋪滿平皿(培養(yǎng)時間約為12h);加入純化的目的蛋白樣品至目的蛋白終濃度為5 μ g/ml，對細胞進行預處理；繼續(xù)于26 28°C (例如為27°C )培養(yǎng)22 26h (例如為24h)后，用Hanks液洗，加入5mmol/L H2O2于26 28。。(例如為27°C)處理3.5 4.5h (例如為4h)，接著用Hanks液洗，再加入含有濃度為5 μ g/ml的目的蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基，于26 28°C (例如為27°C )繼續(xù)培養(yǎng)22 26h(例如為24h);收集細胞，細胞用預冷的PBS清洗，加入裂解液(150 250 μ I);用細胞刮刮下細胞，收集細胞裂解液(即裂解所得物)于離心管中離心，取上清，進行SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜；將膜置于含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液(S卩，每L的TBST緩沖液含有50g脫脂奶粉)的中封閉過夜，然后在含0.1% (體積比)Tween-20的TBST緩沖液與純化鼠抗細胞色素c單克隆抗體4°C孵育過夜(12h);清洗后，用辣根過氧化物酶標記的二抗雜交，進行化學發(fā)光顯色。備注說明:當PVDF膜上目的蛋白處理組的線粒體條帶比過氧化氫處理組的線粒體條帶更亮，而目的蛋白處理組的細胞質的條帶比過氧化氫的條帶比過氧組的細胞質條帶更暗，表明目的蛋白能夠抑制過氧化氫誘導的細胞色素C從線粒體釋放進入細胞質，證明目的蛋白對過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡具有抑制作用；反之，目的蛋白處理組的細胞質以及線粒體的條帶明暗與過氧化氫處理組沒有明顯差異時，證明目的蛋白不能抑制過氧化氫誘導的細胞色素C從線粒體釋放進入細胞質。作為本發(fā)明的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法的進一步改進:目的蛋白包括家蠶30Kc6蛋白、家蠶30K蛋白Sip、家蠶30K蛋白Lsp_t。在本發(fā)明中，在96孔培養(yǎng)板的孔內加入各種培養(yǎng)基(或H2O2)等的量為15(T200ul。本發(fā)明利用自建的過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型來研究家蠶30Kc6蛋白抗細胞凋亡的研究方法:利用過氧化氫誘導家蠶細胞的凋亡，建立體外細胞凋亡模型，通過ELISA法檢測家蠶30Kc6蛋對昆蟲細胞凋亡的抑制作用。在本發(fā)明中，當目的蛋白處理組的細胞活力、DNA片段化以及細胞內8-1soprostane的濃度與過氧化氫處理組相比有顯著差異，能得出目的蛋白對過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡具有抑制作用。本發(fā)明的有益之處在于:通過多個途徑來證實所建立的凋亡模型是穩(wěn)定可靠的，并且桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的家蠶30Kc6蛋白對過氧化氫誘導的家蠶細胞的凋亡有明顯的抑制作用，同時也證明了 30Kc6蛋白能有效抑制H2O2誘導的BmN細胞中細胞色素c從線粒體向細胞質中的釋放。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1為ELISA檢測H2O2對BmN細胞凋亡的影響圖。圖2是ELISA法檢測家蠶Bm30Kc6蛋白對H2O2誘導凋亡的BmN細胞活力的影響圖；CKO為正常培養(yǎng)的BmN細胞；CK1為30Kc6蛋白處理的正常BmN細胞；CK2為H2O2誘導的BmN細胞；30Kc6為純化的30K蛋白+H2O2誘導的BmN細胞；不同字母表示在口 < 0.05
水平差異顯著，相同字母表示無顯著差異。圖3是ELISA法檢測家蠶30Kc6蛋白對H2O2誘導的BmN細胞凋亡的影響圖；CKO為正常培養(yǎng)的BmN細胞；CK1為30Kc6蛋白處理的正常BmN細胞；CK2為H2O2誘導的BmN細胞；30Kc6為純化的30K蛋白+H2O2誘導的BmN細胞；不同字母表示在口 < 0.05
水平差異顯著，相同 字母表示無顯著差異性。圖4是30Kc6蛋白對H2O2誘導形成的8-1soprostane的影響CKO為正常培養(yǎng)的BmN細胞；CK1為30Kc6蛋白處理的正常BmN細胞；CK2為H2O2誘導的BmN細胞；30Kc6為純化的30K蛋白+H2O2誘導的BmN細胞；不同字母表示在p < 0.01
水平差異顯著，相同字母表示無顯著差異性。圖5是30Kc6蛋白對H2O2誘導的細胞色素c釋放的影響圖；CKO為正常培養(yǎng)的BmN細胞；CK1為30Kc6蛋白處理的正常BmN細胞；CK2為H2O2誘導的BmN細胞；30Kc6為純化的30K蛋白+H2O2誘導的BmN細胞。圖6是家蠶重組蛋白Slp和Lsp-t的純化和鑒定圖；A為純化的重組蛋白Slp的SDS-PAGE ；B為純化的重組蛋白Lsp_t的SDS-PAGE ；C為純化的重組蛋白Slp與Lsp-t的Western blotting分析。圖7是家蠶重組蛋白Slp與Lsp-t對H2O2誘導的BmN細胞的影響圖；A為MTT檢測不同濃度H2O2對BmN細胞活力的影響；B為ELISA檢測不同濃度H2O2對BmN細胞凋亡的影響；C為MTT檢測重組蛋白Slp與Lsp-t對H2O2處理的BmN細胞活力的影響；D為ELISA檢測重組蛋白Slp與Lsp-t對H2O2處理的BmN細胞凋亡的影響。
具體實施例方式實施例1、一、家蠶30Kc6蛋白的表達與純化

1、家蠶30Kc6蛋白的表達以MOI=IO的重組桿狀病毒Bacmid-BmLp_C6感染處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，72h后待細胞剛剛出現(xiàn)感染癥狀后，IOOOrpm離心IOmin收集細胞。用PBS緩沖液(pH7.4)重懸洗滌細胞，IOOOrpm離心IOmin收集細胞，加入100 μ I PBS重懸細胞(約I X IO6個/mL)，冰浴超聲(40ΚΗΖ的頻率和100W的功率)破碎細胞3min (lmin/次，共3次)。重組桿狀病毒Bacmid-BmLp_C6的構建方法已公開發(fā)表于《蠶業(yè)科學》2012年第3期“3種家蠶30K蛋白基因的克隆表達及抗凋亡功能分析”一文中。2、家蠶30Kc6蛋白的鎳柱親和層析純化加4mL I XNative Binding Buffer(pH8.0)重懸細胞(IX IO7個/mL),冰浴30min。速凍(液氮)速溶(37°C)方法反復凍溶，至少兩次。冰水浴(40KHZ的頻率和100W的功率)超聲3min, 12000rpm離心20min,取上清分裝于1.5mL的Eppendorf管中。鎳柱需用6個柱體積IXNative Binding Buffer平衡。取上清液，以10倍柱體積的流速上柱,至樣品峰值不再升高，冰上結合(輕輕攪拌)過夜。用8個柱體積,梯度Imidazole濃度的Nativewash Buffer (50mL I XNative Purification Buffer, 335 μ L 3M imidazole,pH 8.0)分批洗柱，最后用 I 個柱體積的 Native Elution BufferC 13.75mL I XNative PurificationBuffer, 1.25mL 3M imidazole, pH 8.0)洗脫結合蛋白，獲得純化的家蠶30Kc6蛋白樣品，將所有回收樣品用12%SDS-PAGE檢測純化效果。備注說明:I XNative Binding Buffer (ρΗ8.0)為:30mL I XNative Purification Buffer(50 mM NaH2PO4, pH 8.0,0.5 M NaCl), 100 μ I 3M imidazole, ρΗ8.0。當經過12%SDS_PAGE檢測，在蛋白膠上30KDa左右出現(xiàn)單一的目的條帶時，認為符合純化要求。同理，當經過12%SDS-PAGE檢測，蛋白膠上出現(xiàn)多條雜帶，認為純化效果差，如目的條帶明顯，可通過重復步驟2達到純化效果；如目的條帶不明顯，而雜帶很多，則需重新表達純化。二、家蠶細胞凋亡模型的建立將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，按3X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，力口入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為27°C)至細胞鋪滿孔底(培養(yǎng)時間約為24h)，棄去細胞全培養(yǎng)基(Sf-900:FBS=9:1的體積比)(例如，Sf-900貨號=10902-088 ；FBS貨號:10099-141，均購自美國Gibco公司)，用Hanks液洗2次，分別加入100 μ mol/L,lmmol/L、5mmol/L和10mmol/L H2O2梯度處理2h、4h和6h,然后用Hanks液洗3次，再分別加入細胞全培養(yǎng)基(Sf-900:FBS=9:1)，繼續(xù)培養(yǎng)24h (培養(yǎng)條件為27°C)。然后利用CellDeath Detection ELISA (Roche)試劑盒檢測細胞的凋亡情況。具體操作按試劑盒說明書執(zhí)行。結果如圖1所示，用H2O2處理的 家蠶BmN的細胞凋亡率具有顯著的濃度與時間依賴性，結果表明BmN細胞的最佳處理條件為:5mmol/L H2O2處理細胞，27°C培養(yǎng)4h。備注說明:Sf_900即sF-900 II培養(yǎng)液。在96孔培養(yǎng)板的孔內加入培養(yǎng)基(或H2O2)等的量為150-200ul，以下同。三、家蠶30Kc6蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，按3X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，力口入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為27°C)至細胞鋪滿孔底(培養(yǎng)時間約為24h)，即，所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等同于上述步驟二。再加入純化的家蠶30Kc6蛋白樣品至蛋白終濃度為5 μ g/ml，對細胞進行預處理；繼續(xù)培養(yǎng)24h(培養(yǎng)條件為27°C)后，用Hanks液洗2次，加入5mmol/L H2O2處理4h(于27°C )，用Hanks液洗3次，再加入含有濃度為5 μ g/ml家蠶30Kc6蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基(無血清細胞培養(yǎng)基，即，Sf-900),繼續(xù)培養(yǎng)24h(于27°C)。然后利用 Cell Proliferation ELISA試劑盒(Roche)檢測細胞的活力、Cell DeathDetection ELISA (Roche)試劑盒檢測細胞的凋亡情況、8-1soprostane EIA kit檢測細胞內8-1soprostane的濃度。每次實驗均設空白對照組CKO (正常培養(yǎng)的BmN細胞),對照組CKl (純化的家蠶30Kc6蛋白處理的正常BmN細胞)；對照組CK2 (H2O2誘導的BmN細胞)和處理組30Kc6 (純化的30Kc6蛋白處理H2O2誘導的BmN細胞)，每組設置3個重復。結果如圖2、3、4所示，純化后的5 μ g/ml的家蠶30Kc6蛋白能有效增加家蠶細胞的活力，抑制家蠶細胞的凋亡并降低了家蠶細胞內8-1soprostane的濃度。四、蛋白免疫印跡法檢測細胞色素c的釋放將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，按I X IO6個/皿接種于60mm (直徑)培養(yǎng)皿中，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為27°C)至細胞鋪滿平皿(培養(yǎng)時間約為12h)，所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等同于步驟二。加入純化的家蠶30Kc6蛋白樣品至蛋白終濃度為5 μ g/ml，對細胞進行預處理。繼續(xù)培養(yǎng)24h (培養(yǎng)條件為27°C)后，用Hanks液洗2次，加入5mmol/L H2O2處理4h (于27°C )，用Hanks液洗3次，再加入含有終濃度為5 μ g/ml的家蠶30Kc6蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基(無血清細胞培養(yǎng)基，即，Sf-900)，繼續(xù)培養(yǎng)24h(于27°C)。收集細胞，細胞用預冷的PBS清洗2遍，加入200 μ I裂解液。用細胞刮輕輕刮下細胞，收集細胞裂解液(即裂解所得物)于1.5mL的離心管中，15000rpm離心lOmin，取上清，進行12% (分離膠)SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜。將膜置于含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉過夜，然后在含0.1% Tween-20的TBST緩沖液與純化鼠抗細胞色素C單克隆抗體4°C孵育過夜。充分清洗后，用辣根過氧化物酶標記的二抗雜交，進行化學發(fā)光顯色。結果如圖5所示，表明家蠶30Kc6蛋白能有效抑制H2O2誘導的BmN細胞中細胞色素c從線粒體向細胞質中的釋放。實施例2、一、家蠶30K蛋白Slp的表達與純化1、家蠶蛋白Slp的表達和純化以MOI=IO的重組桿狀病毒Bacmid-Slp感染處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，72h后收集細胞，超聲裂解后取細胞裂解液，經鎳柱純化后獲得純化的目的蛋白Slp，SDS-PAGE和Western blot檢測結果如圖6A和C所示，具體操作方法同實施例1的步驟一。該結果表明:純化的家蠶蛋白Slp在30kD附近出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，與6XHis-tag抗體具有良好的特異性反應。二、家蠶細胞凋亡模型的建立方法同實施例1中的步驟二。 三、重組家蠶30K蛋白Slp對家蠶細胞凋亡的抑制作用將純化的家蠶蛋白Slp (1.5μ g/mL)加入經H2O2誘導調亡的家蠶細胞培養(yǎng)細胞BmN中，利用 Cell Proliferation ELISA 試劑盒(Roche)檢測細胞的活力、Cell DeathDetection ELISA (Roche)試劑盒檢測細胞的凋亡情況,具體檢測方法同實施例1步驟三，結果如圖7所示，表明家蠶Slp蛋白能有效增加家蠶細胞的活力，抑制家蠶細胞的凋亡。實施例3、一、家蠶30K蛋白Lsp-t的表達與純化1、家蠶蛋白Lsp-t的表達和純化以MOI=IO的重組桿狀病毒Bacmid-Slp-t感染處于對數(shù)生長期的家蠶細胞(BmN)，72h后收集細胞，超聲裂解后取細胞裂解液，經鎳柱純化后獲得純化的目的蛋白Slp-t，SDS-PAGE和Western blot檢測結果如圖6B和C所示，具體操作方法同實施例1的步驟一。該結果表明:純化的家蠶蛋白Lsp-t在30kD附近出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，與6XHis-tag抗體具有良好的特異性反應。二、家蠶細胞凋亡模型的建立方法同實施例1中的步驟二。三、家蠶30K蛋白Slp-t對家蠶細胞凋亡的抑制作用將純化的家蠶蛋白Slp-t (1.5μ g/mL)加入經H2O2誘導調亡的家蠶細胞培養(yǎng)細胞BmN中，檢測細胞的活力和細胞的凋亡情況，具體檢測方法同實施例1步驟三，結果如圖7所示，表明家蠶Slp-t蛋白能有效增加家蠶細胞的活力，抑制家蠶細胞的凋亡。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是包括以下步驟: 1)、目的蛋白的表達和純化； 2)、建立過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型: 利用過氧化氫誘導家蠶細胞的凋亡，從而建立體外細胞凋亡模型； 3)、檢測目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。
2.根據權利要求1所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:家蠶細胞凋亡模型的建立方法為: 將處于對數(shù)生長期的半貼壁家蠶培養(yǎng)細胞BmN按3 X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C培養(yǎng)至細胞鋪滿孔底，棄去細胞全培養(yǎng)基后；用 Hanks 液洗,再分別加入 100 μ mol/L、lmmol/L、5mmol/L 和 10mmol /T, H2O2 梯度處理 2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分別加入細胞全培養(yǎng)基，繼續(xù)于26 28°C培養(yǎng)22 26h ； 細胞全培養(yǎng)基為Sf-900:FBS=9:1的體積比。
3.根據權利要求2所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:家蠶細胞凋亡模型的建立方法中，BmN細胞的處理條件為:5mmol/L H2O2處理細胞，27°C 培養(yǎng) 4h。
4.根據權利要求1、2或3所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是: 所述步驟3)為通過ELISA法檢測目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。
5.根據權利要求4所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是所述步驟3)為: 將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞BmN，按3X IO3個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C培養(yǎng)至細胞鋪滿孔底；再加入純化的目的蛋白至目的蛋白終濃度為4 6μ g/ml，對細胞進行預處理；繼續(xù)于26 28°C培養(yǎng)22 26h后，用Hanks液洗，再加入5mmol/L H2O2于26 28°C處理3.5^4.5h，接著用Hanks液洗，再加入含有濃度為5 μ g/ml目的蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基，于26 28°C培養(yǎng)22 26h ； 然后分別檢測細胞的活力、檢測細胞的凋亡情況、檢測細胞內8-1soprostane的濃度； 無血清細胞培養(yǎng)基為Sf-900。
6.根據權利要求5所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是: 利用 Cell Proliferation ELISA 試劑盒檢測細胞的活力、Cell Death DetectionELISA試劑盒檢測細胞的凋亡情況、8-1soprostane EIA kit檢測細胞內8-1soprostane的濃度。
7.根據權利要求f6任一所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:利用蛋白免疫印跡法檢測細胞色素c的釋放。
8.根據權利要求7所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:利用蛋白免疫印跡法檢測細胞色素c的釋放包括以下步驟: 將處于對數(shù)生長期的家蠶細胞BmN按I X IO6個/皿接種于培養(yǎng)皿中，加入細胞全培養(yǎng)基后在細胞培養(yǎng)箱中于26 28°C培養(yǎng)至細胞鋪滿平皿；加入純化的目的蛋白樣品至目的蛋白終濃度為5 μ g/ml，對細胞進行預處理；繼續(xù)于26 28°C培養(yǎng)22 26h后，用Hanks液洗，加入5mmol/L H2O2于26 28°C處理3.5^4.5h，接著用Hanks液洗，再加入含有濃度為5 μ g/ml的目的蛋白的無血清細胞培養(yǎng)基，于26 28°C繼續(xù)培養(yǎng)22 26h ;收集細胞，細胞用預冷的PBS清洗，加入裂解液；用細胞刮刮下細胞，收集細胞裂解液于離心管中離心，取上清，進行SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜；將膜置于含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉過夜，然后在含0.1% Tween-20的TBST緩沖液與純化鼠抗細胞色素c單克隆抗體4°C孵育過夜；清洗后，用辣根過氧化物酶標記的二抗雜交，進行化學發(fā)光顯色。
9.根據權利要求8所述的檢測目的蛋白對昆蟲細胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是:目的蛋白 包括家蠶30Kc6蛋白、家蠶30K蛋白Sip、家蠶30K蛋白Lsp_t。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種研究家蠶蛋白抗細胞凋亡的方法，該方法利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)表達并純化目的蛋白，通過自建的過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型，進而研究目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。具體而言，本發(fā)明包括以下步驟1)目的蛋白的表達和純化；2)建立過氧化氫誘導的家蠶細胞凋亡模型利用過氧化氫誘導家蠶細胞的凋亡，從而建立體外細胞凋亡模型；3)檢測目的蛋白對家蠶細胞凋亡的抑制作用。本發(fā)明證實了桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的家蠶30Kc6蛋白對過氧化氫誘導的家蠶細胞的凋亡有明顯的抑制作用，同時也證明了30Kc6蛋白能有效抑制H2O2誘導的BmN細胞中細胞色素c從線粒體向細胞質中的釋放。
文檔編號G01N33/577GK103215337SQ20131009108
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權日2013年3月21日
發(fā)明者于威, 應慧慧, 李擎, 全滟平, 童富淡, 張耀洲 申請人:浙江理工大學