專利名稱：抗甲狀腺素受體相互作用蛋白的人源抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學領域，具體涉及一種抗甲狀腺素受體相互作用蛋白15的人源抗體及其制法和用途。
背景技術：
抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。
實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類有目的利用抗體第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對抗體結構和功能的進一步研究和應用。
雜交瘤技術的誕生被認為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術發(fā)展的一個里程碑。利用這種技術制備的單克隆抗體在疾病診斷、治療和科學研究中得到廣泛的應用。這種單克隆抗體多是由鼠B細胞與鼠骨髓瘤細胞經(jīng)細胞融合形成的雜交瘤細胞分泌的，具有鼠源性，進入人體會引起機體的排異反應；完整抗體分子的分子量較大，在體內(nèi)穿透血管的能力較差；生產(chǎn)成本太高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在80年代初，抗體基因結構和功能的研究成果與重組DNA技術相結合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術。
抗體工程技術的發(fā)展，即將鼠源單克隆抗體改造為人源化抗體，或者直接產(chǎn)生人源抗體，大大減少鼠源抗體帶來的副作用如人抗鼠抗體反應等，有利于臨床應用。
目前，人源化或人源抗體的產(chǎn)生主要采用三種方法(1)鼠源抗體改造用人類抗體的Fc段和部分Fab替換鼠源抗體片段，減少小鼠來源的片段，以減輕人類對抗體的不良反應；(2)轉(zhuǎn)基因方法將人類抗體基因轉(zhuǎn)移至小鼠，免疫動物后產(chǎn)生人類抗體；(3)噬菌體展示技術是近年發(fā)展的新方法，利用噬菌體的特性篩選抗體可以直接篩選人源抗體，該方法利用人抗體基因構建含有VH和VL的組合文庫，以噬菌體表面顯示系統(tǒng)篩選抗原特異性人源抗體。它以細菌克隆取代了B細胞克隆，被譽為抗體技術的革命性進展。
上述三種方法各有利弊。前二種方法能篩選高親和力抗體，但費用大，不易操作，第三種方法操作簡便、花費少，但親和力有時較低。
采用噬菌體抗體庫技術篩選抗體不必進行動物免疫，易于制備稀有抗原的抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。噬菌體抗體庫技術是生命科學研究的突破性進展之一，同時也將抗體工程的研究推想了一個新的高潮。
噬菌體選擇方法對于抗體或短肽的分離都不受限制，而且適用于其它具有生物活性的分子的研究，如細胞因子、受體、酶底物、酶抑制劑、抗體酶、DNA結合蛋白、構建具有特異性結合分子的受體域、以及纖維素結合域等。據(jù)報道，抗體的支架不同可形成用于各種類型分子的合適的結合配體，而且許多例子可說明，宿主支架可容納許多有效的可調(diào)節(jié)一些合適的置換的區(qū)域，(可根據(jù)這點制備局部變化的庫)，這些支架包括β-折疊蛋白、α-螺旋束蛋白、這兩個蛋白的組合、以及綠色熒光蛋白(GFP)和纖維素結合域等。
甲狀腺素受體相互作用蛋白15(thyroid receptor interacting protein 15，TRIP15)是一種已知蛋白(登錄號為NP 004227或HS.30212)，它與甲狀腺素受體在細胞內(nèi)發(fā)生相互作用，從而影響甲狀腺素的生理功能。
目前，還缺乏有效針對甲狀腺素受體相互作用蛋白(TRIP15)的抗體，因此，本領域迫切需要開發(fā)新的針對TRIP15的高特異性和中和力的單克隆抗體，尤其是人源化的高親和力的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種抗TRIP15的特異性抗體，尤其是人源化單克隆抗體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗體，該抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ IDNO2中1-114位的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，該抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4中1-108位的氨基酸序列。
更佳地，所述的抗體具有SEQ ID NO6所編碼的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是人源化的單克隆抗體。更佳地，為單鏈抗體。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發(fā)明所述的抗TRIP15的特異性的抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子含有SEQ ID NO1所示的編碼抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子還含有SEQ ID NO3所示的編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
更佳地，所述的核酸分子具有SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有編碼本發(fā)明所述的抗TRIP15的特異性抗體的核苷酸序列，以及與所述核苷酸序列的操作性相連的表達調(diào)控序列。
在本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明上述的載體。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備抗體的方法，該方法包括a)培養(yǎng)本發(fā)明上述的轉(zhuǎn)化的宿主細胞，從而表達抗體；和d)分離純化所述抗體，從而獲得本發(fā)明所述的抗TRIP15的特異性抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明所述的抗TRIP15的特異性的抗體以及藥學上可接受的載體。


圖1顯示了ELISA鑒定結果，表明抗TRIP15噬菌體抗體具有高親和力及特異性。
圖2顯示了GST-抗TRIP15單鏈抗體的融合蛋白的可溶性表達結果。
具體實施例方式
本發(fā)明人利用噬菌體表面展示系統(tǒng)，首次篩選出一個與TRIP15有良好親和力和特異性的抗體，測定序列后。合成全基因，進行了重組表達，獲得了重組的抗TRIP15的單克隆抗體。
本發(fā)明提供了一種重組抗TRIP15人源化單克隆抗體，它包括人源恒區(qū)(如人源恒區(qū)IgG1-Fc)，而其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)具有獨特的不同于現(xiàn)有技術的結構。
本發(fā)明還提供了抗TRIP15單克隆抗體的氨基酸序列及其其可變區(qū)鏈，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。
抗體的抗原結合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描述，稱為超變區(qū)域(CDR)，將該段間隔成4個框架區(qū)域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環(huán)狀結構，通過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以用常規(guī)方法，通過比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構成了FR或CDR區(qū)域。
此外，最近還發(fā)現(xiàn)由輕鏈可變區(qū)構成的相關結構，與相應的重鏈可變區(qū)相比，其結合的動力學比較小，分離的重鏈可變區(qū)域自身具有抗原結合活性。
此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementarity determiningregion，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
如本文所用，術語“本發(fā)明抗體”指TRIP15單克隆抗體和/或嵌合TRIP15抗體。該術語還包括與GST等形成的融合蛋白，只要在該融合蛋白中抗體部分仍然保留與TRIP15的結合活性。
本發(fā)明的TRIP15單克隆抗體含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重鏈，并且還含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的輕鏈。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體?？捎糜诒景l(fā)明的形成嵌合抗體的技術是本領域中已知的。
本發(fā)明還提供了編碼上述單克隆抗體或其片段的DNA分子。本發(fā)明的單抗的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發(fā)明中，“核酸分子”指聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，還包括由核苷酸類似物形成的DNA或RNA的等效物、類似物，單鏈(有義鏈或反義鏈)和雙鏈聚核苷酸。該術語還包括同源序列。對本領域技術人員來說，很顯然，任意一種上述形式的核酸分子都當然地涵蓋了該“核酸分子”的所有上述等效形式。
在本發(fā)明的一優(yōu)選例中，編碼所述TRIP15單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列包含SEQ ID NO1所示序列，編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列包含SEQ ID NO3所示序列。
此外，目前已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發(fā)明還提供了一種治療移植排斥的藥物組合物，它含有上述的單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明的單克隆抗體對TRIP15有高親和力和特異性，并且本發(fā)明的單克隆抗體是人源化的。這種高親和力的單克隆抗體在臨床上具有重要的價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1從抗體庫中篩選抗TRIP15抗體的可變區(qū)基因本發(fā)明利用噬菌體抗體組合文庫技術將人源抗體輕鏈基因和重鏈基因在體外重組并借助噬菌體表面展示技術(phage display)系統(tǒng)篩選針對目的抗原的特異性抗體基因。該技術繞過雜交瘤途徑，不經(jīng)過免疫就可制備和生產(chǎn)可用于檢測目的抗原表達的單克隆抗體。方法如下按照中國專利申請01126858.1(申請日2001.09.25；
發(fā)明者張新, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心