專利名稱：穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白和抑制甲狀腺素運(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來說涉及蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊。更具體地說，本發(fā)明提供用于穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白、抑制甲狀腺素運(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊以及治療與其相關(guān)的淀粉樣病變的組合物和方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)是一種存在于血液和腦脊髓液中的55kDa同源四聚體蛋白。TTR的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)L-甲狀腺素(T4)和全視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)。TTR是超過20種非同源性淀粉樣蛋白之一，它們可轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)致人體病變的纖維和其它聚集物。這些疾病似乎不是由蛋白聚集導(dǎo)致的功能缺失引起。相反，聚集似乎通過迄今尚不明了的機(jī)制引起神經(jīng)元/細(xì)胞功能障礙。
在變性條件下，限速的野生型TTR四聚體解離和快速的單體錯(cuò)折疊可使其錯(cuò)組裝成公認(rèn)為引起老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性(SSA)的淀粉樣蛋白。80多種TTR變異體中的一種解離和錯(cuò)折疊就會(huì)導(dǎo)致家族性淀粉樣多神經(jīng)病(FAP)和家族性淀粉樣心肌病(FAC)。
TTR四聚體具有兩個(gè)C2對(duì)稱的T4-結(jié)合位點(diǎn)。已知T4的負(fù)協(xié)同結(jié)合穩(wěn)定TTR四聚體，并抑制淀粉樣蛋白纖維形成。不幸的是，由于甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)與T4的親和性比TTR高一個(gè)數(shù)量級(jí)，所以在人血清中與T4結(jié)合的TTR少于1％。而且，T4的血清濃度(0.1μM)比TTR的血清濃度(3.6-7.2μM)低。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定抑制蛋白錯(cuò)折疊。此發(fā)現(xiàn)的重要性在于蛋白錯(cuò)折疊在各種疾病進(jìn)程包括甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變中起作用。通過抑制甲狀腺素運(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊，人們可以干預(yù)這種疾病、改善病癥和/或在某些情況下預(yù)防或治愈疾病。
甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定有效抑制錯(cuò)折疊這一發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)潛在高特異性和低毒性的治療性組合物。因此，盡管本文公開了能夠穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白的示例性聯(lián)芳基試藥，但人們可以設(shè)計(jì)選擇性穩(wěn)定所述蛋白的其它試藥。例如，如本文所述，有可能設(shè)計(jì)和制備高選擇性結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白和穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)的多氯化聯(lián)苯、二氟尼柳類似物或苯并噁唑。
一方面，本發(fā)明特征在于一種防止或降低甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的化合物的篩選方法。該方法可包括以下步驟使甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體與候選化合物接觸；并測(cè)定所述候選化合物是否增加與甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離相關(guān)的活化能，由此防止或降低甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。所述方法可任選包括檢測(cè)所述候選化合物抑制纖維形成的附加步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟測(cè)定所述化合物是否通過使解離過渡態(tài)甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體不穩(wěn)定而防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟測(cè)定所述化合物是否通過使甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體比解離過渡態(tài)更穩(wěn)定而防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
這種方法使用的候選化合物任選為小分子。這種小分子可通過四聚體結(jié)合穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)，由此通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定機(jī)制在變性和生理?xiàng)l件下減慢解離和淀粉樣變性。當(dāng)所述化合物以10.6μM濃度給予時(shí)，其在人血中任選表現(xiàn)出對(duì)TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量超過0.1。
小分子任選其分子量低于1500，非協(xié)同或正協(xié)同結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白，賦予的結(jié)合能＞2.3kcal/mol。小分子可表現(xiàn)為Kd1和Kd2＜100nM(例如＜10nM)和/或可具有高血漿濃度，它們對(duì)蛋白穩(wěn)定的貢獻(xiàn)都超過2.0kcal/mol。所述小分子還可以降低淀粉樣病變的產(chǎn)生、降低酸介導(dǎo)或MeOH介導(dǎo)的淀粉樣蛋白生成的速率和/或降低尿素介導(dǎo)的TTR解離速率。
在某些實(shí)施方案中，所述小分子包括聯(lián)苯胺、聯(lián)苯、肟醚、吲哚或其它由兩個(gè)芳環(huán)組成的結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)芳環(huán)攜帶親水基團(tuán)，例如酸或酚，而另一個(gè)芳環(huán)攜帶疏水基團(tuán)，例如鹵素或烷基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述候選化合物為聯(lián)芳化合物，其中一個(gè)環(huán)攜帶親水取代基而另一個(gè)環(huán)具有疏水取代基，或者兩個(gè)環(huán)都攜帶至少一個(gè)親水取代基。所述親水基團(tuán)可以為酚、COOH、芐醇、硼酸或酯、四唑、醛或水合醛，或者為直接或通過水介導(dǎo)H-鍵用作蛋白的H-鍵供體或受體的官能團(tuán)。所述聯(lián)芳化合物可為兩個(gè)環(huán)都被親水官能度取代的對(duì)稱聯(lián)芳化合物，所述親水官能度包括酚、羧化物和醇，某些情況下為鹵素，以填充TTR中的鹵素結(jié)合袋，例如具有官能度3-Cl、4-OH、5-Cl和3′-Cl、4′-OH、5′-Cl的聯(lián)芳化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聯(lián)芳化合物的至少一個(gè)環(huán)被以下取代基取代2，4-二氟或3，5-二氟或2，6-二氟或3，5-二氯或3-Cl、4-OH、5-Cl或3-F、4-OH、5-F、3-COOH、4-OH或3-OH或3-COOH或4-COOH或3-CH2OH或4-CH2OH。示例性聯(lián)芳化合物是多氯化聯(lián)苯，例如羥化多氯化聯(lián)苯，其中至少一個(gè)環(huán)攜帶OH和/或Cl取代基，包括3-Cl、4-OH、5-Cl或2-Cl、3-Cl、4-OH、5-Cl或3，4-二氯，或2，3，4-三氯或2，3，4，5-四氯。氯之外的其它鹵素也可用于所述候選化合物。所述候選化合物可以為苯并噁唑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述候選化合物為二氟尼柳類似物。本文描述了二氟尼柳及各種二氟尼柳類似物的結(jié)構(gòu)。與二氟尼柳相比，二氟尼柳類似物可任選具有降低或缺失的NSAID活性。例如，與二氟尼柳相比，二氟尼柳類似物可具有降低或缺失的環(huán)加氧酶抑制劑活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定二氟尼柳類似物是否表現(xiàn)NSAID活性的附加步驟。例如，所述方法可包括測(cè)定二氟尼柳類似物是否具有環(huán)加氧酶抑制劑活性的步驟。
用于篩選方法的甲狀腺素運(yùn)載蛋白可以是野生型甲狀腺素運(yùn)載蛋白或者突變型甲狀腺素運(yùn)載蛋白，例如與甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變(例如家族性淀粉樣多神經(jīng)病或家族性淀粉樣心肌病)發(fā)病病因相關(guān)的天然存在突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白。示例性天然存在突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白包括但不限于V122I、V30M、L55P(突變體命名描述了相對(duì)于野生型在所提及氨基酸位置的取代，參見例如Saraiva等(2001)Hum.Mut.17493-503)。
本發(fā)明還提供在組織或生物體液中穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白并由此抑制錯(cuò)折疊的方法。一般來說，所述方法包括給予組織或生物體液含穩(wěn)定量的本文所述化合物的組合物，其中所述化合物結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白，并通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的天然狀態(tài)來防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
因此，在患病組織中穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白的方法改善了錯(cuò)折疊，減輕了相關(guān)疾病的癥狀，并根據(jù)疾病的情況可利于治愈疾病。本發(fā)明設(shè)想在組織和/或細(xì)胞中抑制甲狀腺素運(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊。可通過各種方法，例如實(shí)施例中描述的方法，評(píng)價(jià)錯(cuò)折疊程度以及因此通過本發(fā)明方法達(dá)到的抑制程度。
因此，本發(fā)明另一方面包括治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的方法，該方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的化合物，所述化合物通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的天然狀態(tài)來防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于一種治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變方法，該方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的二氟尼柳類似物(例如防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的二氟尼柳類似物)，防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。與二氟尼柳相比，二氟尼柳類似物可任選具有降低或缺失的NSAID活性(例如環(huán)加氧酶抑制劑活性)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于一種治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的方法，該方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的多氯化聯(lián)苯(例如防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的多氯化聯(lián)苯)，防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。多氯化聯(lián)苯可以為羥化多氯化聯(lián)苯。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特征在于一種治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的方法，該方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的苯并噁唑(例如防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的苯并噁唑)，防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變可以為例如家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性。
本發(fā)明方法治療的受試者可為人類受試者，但要理解的是，本發(fā)明的原理表明本發(fā)明對(duì)所有哺乳動(dòng)物都有效。在本文中，“哺乳動(dòng)物”應(yīng)理解為包括任何需要治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物物種，特別是農(nóng)業(yè)和馴養(yǎng)的哺乳動(dòng)物物種。
本文描述的化合物(例如聯(lián)芳化合物，如二氟尼柳類似物、多氯化聯(lián)苯或苯并噁唑)可配制為藥物可接受的，以制備含所述化合物的藥物組合物。本文使用的術(shù)語“藥物可接受的”、“生理耐受的”及其語法變體當(dāng)指組合物、載體、稀釋劑和試藥時(shí)可互換使用，表示能夠給予哺乳動(dòng)物并且不產(chǎn)生不希望的生理作用的物質(zhì)。
本發(fā)明還包括本文描述的任一種化合物或藥物組合物在治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變(例如家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性)中的用途。
本發(fā)明還包括本文描述的任一種化合物或藥物組合物在生產(chǎn)甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變(例如家族性淀粉樣多神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病或老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性)治療藥物中的用途。
本文描述的化合物和治療方法相比于目前可用于TTR淀粉樣病變的治療選擇具有明顯優(yōu)勢(shì)。TTR淀粉樣病變通常在10年內(nèi)致死，直至最近還被認(rèn)為不可治愈。因?yàn)楦闻K通常是促淀粉樣變TTR的來源，所以在家族性病例中，肝移植是一種用野生型等位基因替換疾病相關(guān)等位基因的有效方案。盡管肝移植作為基因治療的形式是有效的，但它不是不存在問題。移植是復(fù)雜的，在于受體和供體都需侵入性手術(shù)、移植后長(zhǎng)期免疫抑制治療、供體短缺、高成本、以及大量的TTR淀粉樣病變受試者由于其病情發(fā)展而不是好的候選者。不幸的是，由于野生型TTR經(jīng)常繼續(xù)堆積，某些家族性受試者的心臟淀粉樣變性甚至在肝移植后繼續(xù)進(jìn)展。由于通過脈絡(luò)叢合成，移植也沒有減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的TTR堆積。移植對(duì)最流行的TTR疾病老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性(SSA)不是一個(gè)可行的方案，由于野生型TTR堆積，80歲以上的人約25％患有這種變性。
除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都和本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義一致。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或?qū)嶒?yàn)中可以使用類似或等同于本文所述的方法和材料，但優(yōu)選的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都通過引用整體結(jié)合到本文中。在有沖突時(shí)，本申請(qǐng)包括定義有控制權(quán)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而不是限制。
由以下的詳述和權(quán)利要求書顯而易見本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示甲狀腺素運(yùn)載蛋白的T4結(jié)合位點(diǎn)。
圖2A和2B圖示不同抑制劑存在時(shí)甲狀腺素運(yùn)載蛋白解折疊的時(shí)程。
圖3A和3B圖示不同抑制劑存在時(shí)纖維形成的時(shí)程。
圖4A和4B圖示不同抑制劑存在時(shí)纖維形成的時(shí)程。
圖5圖示所篩選的用于在血漿中結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白的多氯化聯(lián)苯的結(jié)構(gòu)。
圖6圖示羥化多氯化聯(lián)苯的結(jié)構(gòu)，其在血漿中與甲狀腺素運(yùn)載蛋白的結(jié)合和其體外淀粉樣蛋白纖維化抑制特性合在一起評(píng)價(jià)。
圖7圖示苯并噁唑化合物對(duì)甲狀腺素運(yùn)載蛋白纖維形成的抑制。苯并噁唑上的羧基位置沿左側(cè)顯示，而C(2)苯環(huán)沿底部顯示。條棒表示纖維形成(ff)百分比，即存在苯并噁唑化合物(7.2μM)時(shí)由甲狀腺素運(yùn)載蛋白(3.6μM)形成纖維的量相比于沒有抑制劑時(shí)由甲狀腺素運(yùn)載蛋白形成的量(此量定義為100％)。
圖8圖示了在人血漿中孵育后結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白的苯并噁唑的化學(xué)計(jì)量(s)。使用免疫沉淀(采用樹脂結(jié)合抗體)捕獲甲狀腺素運(yùn)載蛋白。從樹脂上釋放甲狀腺素運(yùn)載蛋白后，由HPLC色譜圖中其峰下的面積確定甲狀腺素運(yùn)載蛋白和抑制劑的量。s的最大可能值是2。沿底部軸線顯示了化合物編號(hào)。細(xì)垂直線表示檢測(cè)偏差。
圖9圖示了沒有抑制劑或在3.6μM化合物20、21或27或1.8μM化合物20存在時(shí)6M尿素中野生型甲狀腺素運(yùn)載蛋白(1.8μM)解離的時(shí)間(t)函數(shù)。
圖10圖示結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白的化合物20的X-射線共晶體結(jié)構(gòu)。不同亞單位中的相同殘基以有撇號(hào)和無撇號(hào)的殘基數(shù)區(qū)分，成對(duì)的鹵素結(jié)合袋也是如此。
發(fā)明詳述至少某些淀粉樣疾病看起來象是由20多種非同源蛋白或蛋白片段中任一種的累積引起，最終產(chǎn)生一種纖維狀交聯(lián)-β-折疊四級(jí)結(jié)構(gòu)。由正常折疊蛋白如甲狀腺素運(yùn)載蛋白形成淀粉樣纖維需要蛋白錯(cuò)折疊，以產(chǎn)生有組裝能力的中間體。甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)淀粉樣變性的過程似乎引起三種不同的淀粉樣病變-老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性(SSA)、家族性淀粉樣多神經(jīng)病(FAP)和家族性淀粉樣心肌病(FAC)。SSA與野生型TTR的累積有關(guān)，而FAP和FAC由80多種TTR變異體中一種的淀粉樣變性引起。參見例如Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-60；Kelly，J.W.Curr.Opin.Struct.Biol.1996，6，11-7；Liu，K.等；Nat.Struct.Biol.2000，7，754-7；Westermark，P.等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-5；Saraiva，M.J.等；J.Clin.Invest.1985，76，2171-7；Jacobson，D.R.等；N.Engl.J.Med.1997，336，466-73；Buxbaum，J.N.；Tagoe，C.E.Ann.Rev.Med.2000，51，543-569；和Saraiva，M.J.Hum.Mutat.1995，5，191-6，這些文獻(xiàn)中的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
TTR是一個(gè)55kDa的同源四聚體，特征在于2，2，2對(duì)稱性，在二聚體-二聚體交界面具有兩個(gè)等同的漏斗型結(jié)合位點(diǎn)，甲狀腺激素(T4)可以在血漿和CSF中結(jié)合于此處。TTR結(jié)合的全視黃醇結(jié)合蛋白通常小于1當(dāng)量。TTR錯(cuò)折疊包括四聚體解離為單體，接著單體內(nèi)三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，使得蛋白能夠錯(cuò)組裝，最終產(chǎn)生淀粉樣蛋白?？尚械腇AP治療使用由肝移植介導(dǎo)的基因治療，以野生型(WT)蛋白替換血液中的變異TTR。此方法對(duì)FAC可能無效，原因是野生型TTR持續(xù)堆積，同樣其對(duì)于SSA治療也是無用的，其中野生型TTR堆積的過程似乎是病因。肝移植治療對(duì)于大約10種在柔腦膜堆積淀粉樣纖維導(dǎo)致CNS病的TTR變異體也無效，因?yàn)檫@些TTR由脈絡(luò)叢合成。因此，迫切需要開發(fā)基于通用非侵入型藥物的治療策略。理想的藥物是非蛋白、非肽或非核酸型藥物。參見例如Blake，C.C.等；J.Mol.Biol.1978，121，339-56；Wojtczak，A.等；Acta Crystallogr.，Sect.D1996，758-810；Monaco，H.L.；Rizzi，M.；Coda，A.Science 1995，268，1039-41；Lai，Z.；Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1996，35，6470-82；Holmgren，G.等；Lancet 1993，341，1113-6；Suhr，O.B.；Ericzon，B.G.；Friman，S.Liver Transpl.2002，8，787-94；Dubrey，S.W.等；Transplantation 1997，64，74-80；Yazaki，M.等；Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，702-6；和Cornwell，C.G.III等；Am.J.of Med.1983，75，618-623，這些文獻(xiàn)中的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
抑制甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣纖維形成的二氟尼柳類似物的合成可以通過T4介導(dǎo)的四聚體穩(wěn)定化防止導(dǎo)致淀粉樣纖維形成的TTR錯(cuò)折疊。某些結(jié)構(gòu)各異的四聚體穩(wěn)定物家族結(jié)合TTR的一個(gè)或兩個(gè)T4位點(diǎn)，防止淀粉樣變性，且沒有激素T4可能存在的副作用。這些四聚體穩(wěn)定化合物包括某些非甾族抗炎藥物(NSAID)，例如氟芬那酸、雙氟芬酸、氟比洛芬和二氟尼柳，它們似乎通過基態(tài)結(jié)合和穩(wěn)定化增加與四聚體解離相關(guān)的動(dòng)力學(xué)屏障起作用。因?yàn)門TR在血液中是T4的第二載體，所以TTR的T4結(jié)合能力95％以上未利用，這使得可以給予靶向這些位點(diǎn)的四聚體穩(wěn)定化合物。因?yàn)槎崃黔h(huán)加氧酶-2抑制劑，所以長(zhǎng)期給予可能導(dǎo)致胃腸副作用。因此理想的二氟尼柳類似物應(yīng)降低或缺失NSAID活性，但在血液中對(duì)TTR具有高親和性。為此目標(biāo)的第一步是設(shè)計(jì)和合成為淀粉樣蛋白纖維形成抑制劑的二氟尼柳類似物。參見例如Miroy，G.J.等；.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-6；Klabunde，T.等；Nat.Struct.Biol.2000，7，312-21；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-401；Petrassi，H.M.等；J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；Baures，P.W.等；Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-47；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Oza，V.B.等；J.Med.Chem.2002，45，321-32；Bartalena，L.；Robbins，J.Clin.Lab.Med.1993，13，583-98；Aldred，A.R.；Brack，C.M.；Schreiber，G.Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.1995，111，1-15；和Mao，H.Y.等；J.Am.Chem.Soc.2001，123，10429-10435，這些文獻(xiàn)中的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
TTR四聚體的亞單位關(guān)系到三條正交C2-軸。圖1圖示了TTR的T4結(jié)合位點(diǎn)，表明了抑制劑羧化物參與與Lys 15和15′ε-銨鹽的靜電相互作用的正向結(jié)合模式(forward binding mode)。由四級(jí)結(jié)構(gòu)界面產(chǎn)生的兩個(gè)相同T4結(jié)合位點(diǎn)與和C2對(duì)稱晶軸垂直的兩個(gè)C2軸立體交叉。每個(gè)T4結(jié)合位點(diǎn)都可分為內(nèi)部和外部結(jié)合腔。參見例如Blake，C.C.；Oatley，S.J.Nature 1977，268，115-20，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。內(nèi)部結(jié)合腔包含一對(duì)鹵素結(jié)合袋(HBP)，命名為HBP 3和3′，由Leu 17、Ala 108、Val 121和Thr 119的側(cè)鏈組成。每個(gè)亞單位的四個(gè)Ser 117側(cè)鏈的會(huì)聚限定了最內(nèi)部區(qū)域和兩個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)之間的分界面。Ser 117羥基可用作氫鍵供體或受體，以便和所述化合物(例如淀粉樣蛋白形成抑制劑)上的官能團(tuán)互補(bǔ)或通過水分子介導(dǎo)與所述化合物的靜電作用。外部結(jié)合位點(diǎn)由HBP 1和1′組成，而HBP 2和2′位于內(nèi)部和外部結(jié)合腔之間的交界面上。Lys 15和15′ε-銨基限定了外部結(jié)合腔的極外區(qū)域，使得可以和化合物上的帶負(fù)電取代基發(fā)生靜電作用。許多TTR四聚體穩(wěn)定化合物以正向結(jié)合模式結(jié)合，位于外部結(jié)合袋中的親水苯環(huán)上的帶負(fù)電取代基參與和Lys 15ε-銨基的靜電作用。在正向結(jié)合模式中，疏水苯環(huán)(通常由鹵素取代)可占據(jù)內(nèi)部結(jié)合袋。但是，也觀察到以相反方向(反向結(jié)合模式)結(jié)合的實(shí)例。在反向結(jié)合模式中，親水芳環(huán)可位于內(nèi)部腔，使得羧化物與Ser 117和Ser 117′以氫鍵鍵合。在反向結(jié)合模式中，鹵素取代的疏水環(huán)可位于外部腔。
二氟尼柳可降低TTR酸-介導(dǎo)的淀粉樣蛋白生成。二氟尼柳的結(jié)構(gòu)(參見實(shí)施例2)可用作抑制TTR淀粉樣蛋白生成的新化合物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。參見例如Verbeeck，R.K.等；Biochem.Pharm.1980，29，571-576；和Nuemberg，B.；Koehler，G.；Brune，K.Clin.Pharmacokin.1991，20，81-89。
所述化合物可為下式 其中Ar1是芳基或雜芳基，Ar1任選被以下一種或多種取代鹵素、-R1、-OR1、-OC(＝O)R1、-OC(＝O)OR1、-OC(＝O)NHR1、-SR1、-S(＝O)R1、-S(＝O)2R1、-C(＝O)R1、-CO2R1、-C(＝O)NHR1、-NR1R2、-NHC(＝O)R1、-NHC(＝O)NHR1、-NHC(＝O)OR1或-NHS(＝O)2R1。
Ar2是芳基或雜芳基，Ar2任選被以下一種或多種取代鹵素、-R1、-OR1、-OC(＝O)R1、-OC(＝O)OR1、-OC(＝O)NHR1、-SR1、-S(＝O)R1、-S(＝O)2R1、-C(＝O)R1、-CO2R1、-C(＝O)NHR1、-NR1R2、-NHC(＝O)R1、-NHC(＝O)NHR1、-NHC(＝O)OR1或-NHS(＝O)2R1。
每個(gè)R1獨(dú)立地為氫，或?yàn)槿〈蛭慈〈耐榛?、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、炔基、芳基或雜芳基。
每個(gè)R2獨(dú)立地為氫，或?yàn)槿〈蛭慈〈耐榛?、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、炔基、芳基或雜芳基。
在某些情況下，Ar1可為取代或未取代的苯基。Ar2可獨(dú)立地為取代或未取代的苯基。Ar1和Ar2可同時(shí)為取代或未取代的苯基。所述取代基可以為氟、氯、羥基、-CO2H、-CO2Me、-OMe、-CH2OH或甲?；1可為低級(jí)烷基。
所述化合物的使用形式可以為由無機(jī)或有機(jī)的酸與堿產(chǎn)生的藥物可接受鹽。所包括的酸鹽如下乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽(glucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。堿鹽包括銨鹽、堿金屬鹽如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽、有機(jī)堿鹽如二環(huán)己胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺鹽，以及氨基酸鹽，如精氨酸鹽、賴氨酸鹽，等等。此外，堿性含氮基團(tuán)可以用以下物質(zhì)季銨化低級(jí)烷基鹵，如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；長(zhǎng)鏈鹵素，如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷酰氯、溴和碘；芳烷基鹵，如芐基和苯乙基溴；等等。由此獲得可溶于或分散于水或油中的產(chǎn)物。
所述化合物可穩(wěn)定TTR四聚體，并抑制TTR淀粉樣蛋白的形成。所述化合物可為特征在于微細(xì)結(jié)構(gòu)改變的二氟尼柳類似物。所述化合物可用于評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)-活性的關(guān)系，因?yàn)樗鼈兒蚑TR淀粉樣蛋白抑制有關(guān)。取代模式和取代基(包括鹵素、羧化物、?；⑼檠趸土u基)的數(shù)量可以變化。其它類型化合物的結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)揭示，羧化物取代基或類似的陰離子或H-鍵基團(tuán)似乎很重要，可能參與與Lys 15和15′ε-銨基的靜電相互作用或與Ser 117和117′的氫鍵鍵合相互作用，同時(shí)鹵素取代的疏水環(huán)填補(bǔ)TTR的鹵素結(jié)合袋?？稍u(píng)價(jià)氟和氯取代芳基，包括2-氟、4-氟、3，5-二氟、2，4-二氟和2，6-二氟。碘取代芳基可能不太理想，因?yàn)樗鼈兙哂胁环€(wěn)定性和潛在的甲狀腺素激動(dòng)劑作用。在某些類似物中可以沒有羧化物(陰離子)取代基，以評(píng)價(jià)其對(duì)纖維抑制和血漿結(jié)合選擇性的影響。可以合成含醛或醇官能團(tuán)的化合物，以評(píng)價(jià)不帶電氫鍵受體和供體對(duì)結(jié)合選擇性和淀粉樣蛋白纖維化抑制的影響。醛的偕二醇形式可能是主要結(jié)合種類。
一般來說，所述化合物可通過本領(lǐng)域已知的方法合成。Suzuki偶聯(lián)是制備所述化合物的一種方法
BY2＝B(OH)2、B(OR)2、9-BBN、B(CHCH3CH(CH3)2)2X＝I、Br、Cl、OSO2(CnF2n+1)，n＝0、1、4R1＝芳基、烯基、炔基R2＝芳基、烯基、芐基、烯丙基、烷基例如，聯(lián)苯化合物可由苯基硼酸和溴苯或碘苯進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)形成?？赡苄枰线m的保護(hù)基，以避免在化合物制備過程中形成副產(chǎn)物。例如，可用合適的氨基保護(hù)基如三氟乙?；蚴宥⊙豸驶Ｗo(hù)氨基取代基。其它的保護(hù)基和反應(yīng)條件可見于T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，(第3版，1999，John Wiley &Sons，New York，N.Y.)。
藥物組合物本文描述的化合物(例如二氟尼柳類似物、多氯化聯(lián)苯或苯并噁唑)可配制成藥物組合物，可口服、胃腸外、噴霧吸入、局部、直腸、鼻、口腔、陰道給予或通過植入貯庫給予。本文使用的術(shù)語“胃腸外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或灌注技術(shù)。
所述藥物組合物可包括任一種化合物或其藥物可接受的衍生物，以及任何藥物可接受的載體。本文使用的術(shù)語“載體”包括可接受的輔料和賦形劑?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物的藥物可接受載體包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚烯吡酮、纖維素類物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。
所述藥物組合物可為無菌可注射的制劑形式，例如無菌可注射的水性或油性懸浮液。此懸浮液可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)，使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑配制。所述無菌可注射制劑也可以為在無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？捎玫目山邮苜x形劑和溶劑是水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發(fā)油通?？捎米魅軇┗驊腋〗橘|(zhì)。為此，可使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制備注射劑，也可以使用天然的藥物可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化形式。這些油性溶液或懸浮液可以包含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑。
所述藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型經(jīng)口給藥，所述劑型包括但不限于膠囊、片劑、水性懸浮液或溶液。當(dāng)以片劑口服使用時(shí)，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以添加潤滑劑，如硬脂酸鎂。以膠囊形式經(jīng)口給藥時(shí)，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要以水性懸浮液口服使用時(shí)，將活性成分與乳化劑和懸浮劑組合。如有需要，還可以添加某些甜味劑、矯味劑或著色劑。
或者，所述藥物組合物可以以栓劑形式直腸給藥?？赏ㄟ^將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合進(jìn)行制備，所述賦形劑于室溫為固體，但于直腸溫度為液體，因此將在直腸融化釋放藥物。此類物質(zhì)包括可可油、蜂蠟和聚乙二醇。
所述藥物組合物還可以局部給藥，尤其是在治療靶位包括局部施藥易于到達(dá)的部位或器官時(shí)，包括眼睛、皮膚或下腸道的疾病。對(duì)于這些部位或器官的每一種，都容易制備合適的局部制劑。
可以直腸栓劑形式(參見上文)或合適的灌腸劑進(jìn)行下腸道局部用藥。還可以使用局部給藥的經(jīng)皮貼劑。
對(duì)于局部用藥，所述藥物組合物可配制成包含懸浮或溶解在一種或多種載體中的活性組分的合適軟膏。用于化合物局部給藥的載體包括但不限于礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘?，所述藥物組合物可配制成合適的洗劑或乳劑，其包含懸浮或溶解在一種或多種藥物可接受載體中的活性組分。合適的載體包括但不限于礦物油、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
對(duì)于眼部用藥，所述藥物組合物可配制為在等滲、pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的微粉化懸浮液，或者優(yōu)選為在等滲、pH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的溶液，有或者沒有防腐劑如苯扎氯銨?；蛘?，對(duì)于眼部用藥，所述藥物組合物可配制為軟膏形式，例如凡士林。
所述藥物組合物還可以通過使用噴霧器、干粉吸入器或定量吸入器以鼻氣溶膠或吸入劑給藥。所述組合物按照本領(lǐng)域眾所周知的藥劑技術(shù)制備，可制備為鹽水溶液，使用芐醇或其它合適的防腐劑、增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、氟代烴和/或其它常規(guī)的增溶劑或分散劑。
可與載體物質(zhì)組合以生產(chǎn)單劑型的活性成分的量根據(jù)治療對(duì)象和具體的給藥方式有所變化。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，任何特定受試者的具體劑量和治療方案取決于各種因素，包括使用的具體化合物的活性、年齡、體重、身體健康情況、性別、飲食情況、給藥時(shí)間、排泄速率、藥物組合和主治醫(yī)師的判斷以及要治療的特定疾病的嚴(yán)重性。如果有的話，活性成分的量還取決于與所述活性成分共同給予的治療或預(yù)防的藥物。
藥物組合物的有效量為對(duì)治療受試者產(chǎn)生治療效果需要的量，其取決于多種因素，例如抑制劑性質(zhì)、受試者大小、治療目標(biāo)、要治療的病理特征、使用的具體藥物組合物以及主治醫(yī)師的判斷。相關(guān)文獻(xiàn)參見Freireich等，Cancer Chemother.Rep.1966，50，219和Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537?？捎玫幕钚猿煞值膭┝克綖槊刻旒s0.001-約100mg/kg體重、每天約0.1-約10mg/kg體重。
以下為實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)施例。不能以任何方式將它們理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1通過改變蛋白錯(cuò)折疊能量學(xué)預(yù)防甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?cè)S多的人類疾病，包括淀粉樣變性病，都與蛋白錯(cuò)折疊有關(guān)。惡化[例如Val30→Met30(V30M)和Leu55→Pro55(L55P)]或改善[Thr119→Met119(T119M)]甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)淀粉樣病變的80種家族突變提供了有價(jià)值的機(jī)理理解。迄今為止，所有疾病相關(guān)突變的特征都是使TTR四聚體不穩(wěn)定，許多突變影響了限速性四聚體解離的速度，快速率促進(jìn)淀粉樣變性，慢速率延緩淀粉樣變性。我們利用T119M預(yù)防V30M化合物雜合子所引起疾病的機(jī)制，開發(fā)急劇減緩初始錯(cuò)折疊事件(四聚體解離)的小分子TTR淀粉樣蛋白抑制劑，初始錯(cuò)折疊事件是部分單體變性所需要的，使其能錯(cuò)組裝成淀粉樣蛋白或其它聚集物。
分離雜種四聚體，以更好地理解反式抑制機(jī)制。增加T119M亞單位相對(duì)于V30M[或L55P]的化學(xué)計(jì)量將最大的酸介導(dǎo)纖維形成轉(zhuǎn)移到較低的pH，降低了生理可到達(dá)pH(＞4.0)時(shí)淀粉樣蛋白的總產(chǎn)量，并減慢了酸誘導(dǎo)(pH 4.4)和甲醇介導(dǎo)的淀粉樣變性的速率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了某些小分子TTR淀粉樣蛋白纖維化抑制劑，本文研究了其亞類，包括美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的兩種藥物(抑制劑8和10)(Sacchettini等，Nature Rev.Drug Disvovery 1，267(2002))。小分子抑制劑結(jié)合對(duì)野生型(WT)TTR纖維形成的產(chǎn)量和速率的影響類似于加入T119M亞單位的影響。但是，沒有在所有抑制劑中都觀察到最適于纖維形成的pH降低。這些抑制劑的作用是結(jié)合至TTR四聚體中的兩個(gè)相同的甲狀腺素(T4)位點(diǎn)，而不是單體。
通過將緩慢的四級(jí)結(jié)構(gòu)變化與解折疊過渡態(tài)聯(lián)系在一起，檢測(cè)四聚體解離速率，解折疊過渡態(tài)的速率是解離速率的5×105倍(Hammarstr_m等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16427(2002))。變性檢測(cè)解離是不可逆的，因?yàn)樗褂媚蛩氐臐舛?＞6.0M)不支持重折疊。增加T119M亞單位相對(duì)于V30M[或L55P]的化學(xué)計(jì)量揭示，TTR(1.8μM)四聚體解離速率(限速淀粉樣變性)在三種不同變性環(huán)境(酸性pH、甲醇水溶液或尿素)中急劇下降，解釋了疾病預(yù)防的起源。
在抑制劑6-10(1.8和3.6μM)存在時(shí)，野生型TTR四聚體(1.8μM)解離速率的檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)所有TTR抑制劑復(fù)合物都是劑量依賴性減慢。四聚體初始解離速率與結(jié)合兩種抑制劑(T·I2)的四聚體的摩爾分?jǐn)?shù)粗略成反比。在抑制劑6、7和9(1.8μM)存在時(shí)，單指數(shù)振幅(amplitude of single exponential)主要與未配位四聚體解離相關(guān)(較小程度上與T·I相關(guān))，暗示T·I2在6M尿素中防止四聚體解離。相反，抑制劑8和10時(shí)形成的T·I和T·I2在尿素中基本不能保護(hù)四聚體免于解離，說明僅結(jié)合還不足。在6、7和9(3.6μM)中觀察到的有效抑制的起因是結(jié)合能穩(wěn)定T·I2復(fù)合物超過2.3kcal/mol的自由能(ΔG1＝RT ln([T·I]/[T])＝RT ln([I]/Kd1)和ΔG2＝RT ln([T·I2]/[T])＝RTln{([I]2/(Kd1*Kd2))。T·I2相比于T穩(wěn)定2.7kcal/mol將使TTR四聚體解離速率降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。抑制劑8和10(3.6μM)的強(qiáng)負(fù)協(xié)同結(jié)合表明，結(jié)合第二個(gè)位點(diǎn)(T·I2，μM解離常數(shù))相比于結(jié)合第一個(gè)位點(diǎn)(T·I)不會(huì)進(jìn)一步穩(wěn)定TTR。抑制劑6、7和9的nM解離常數(shù)(Kd1和Kd2)確保，基態(tài)穩(wěn)定(＞2.3kcal/mol)基本上足以增加TTR四聚體解離的活化障礙，前提是所述抑制劑不結(jié)合并同樣穩(wěn)定解離過渡態(tài)。T·I2和T·I復(fù)合物的抑制劑解離速率也可以在抑制劑6、7和9的效力中起作用。通過抗體樹脂固定化抑制劑飽和的TTR，使水性緩沖液以5.0ml/分鐘經(jīng)過，以評(píng)價(jià)6-10的有效解離速率。最好的抑制劑是具有最低表觀解離速率的抑制劑。
盡管淀粉樣變性速率(酸性條件)與四聚體解離速率(在尿素中)在抑制劑存在時(shí)一般來說關(guān)聯(lián)很好，但不需要是這種情況。淀粉樣變性需要解離后濃度依賴性錯(cuò)組裝。因此，一般來說小分子預(yù)防纖維形成比預(yù)防四聚體解離更有效，尤其是在抑制劑可以將單體淀粉樣蛋白中間體濃度保持得較低時(shí)(＜3.6μM)，此時(shí)纖維形成完全無效。有時(shí)，在尿素中檢測(cè)到的四聚體解離速率不能精確預(yù)測(cè)酸性條件下抑制劑效力的排列次序。例如，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的藥物二氟尼柳(8)是比四聚體解離抑制劑好得多的淀粉樣蛋白抑制劑。關(guān)于此觀察結(jié)果的一個(gè)可能解釋是Kd1和/或Kd2在酸中比尿素中低(18)。另外，猜測(cè)有些抑制劑在變性條件下比其在生理?xiàng)l件下測(cè)定的結(jié)合常數(shù)要好得多。例如，化合物9在防止四聚體解離(尿素)和纖維形成(酸)方面比抑制劑7更有效或等效，盡管抑制劑9的Kd1和Kd2值分別是7的10倍和83倍(在生理?xiàng)l件下檢測(cè))。因此，重要的是在各種變性條件下而不是僅在生理?xiàng)l件下判斷錯(cuò)折疊抑制劑的效力。
通過穩(wěn)定四聚體基態(tài)的程度高于穩(wěn)定過渡態(tài)的程度(此時(shí)是使用小分子抑制劑的情況)和/或使解離過渡態(tài)不穩(wěn)定，使四聚體包含T119M反式抑制劑亞單位而不是由疾病相關(guān)亞單位組成可以降低四聚體解離速率。為區(qū)別這些可能性，我們對(duì)比了野生型和T119M同源四聚體的重構(gòu)動(dòng)力學(xué)。T119M單體重折疊快速且在野生型TTR單體折疊速率的誤差范圍之內(nèi)。但是，T119M折疊單體的再組裝比尿素稀釋啟動(dòng)的野生型TTR單體四聚化慢兩個(gè)數(shù)量級(jí)。再組裝過程是雙相的，這可由組裝途徑中存在可觀測(cè)的中間體(可能是二聚體)得到解釋。在相反方向，T119M四聚體以野生型TTR四聚體解離速率的1/37解離。這些動(dòng)力學(xué)作用無法影響三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和/或四聚體穩(wěn)定性的差異。野生型和T119M單體(使用基因工程單體TTR構(gòu)建物(M-TTR))熱力學(xué)穩(wěn)定性的直接比較揭示，解折疊的自由能變化ΔG僅為0.4kcal/mol，遠(yuǎn)低于分別解釋解離和組裝速率差異所需的2.1和2.7kcal/mol。T119M和野生型TTR的熱力循環(huán)分析表明，T119M通過以約3.1kcal/mol使解離過渡態(tài)不穩(wěn)定防止四聚體解離，而不是通過四聚體穩(wěn)定化。按照此分析結(jié)果，與野生型相比，實(shí)際上T119M四聚體不穩(wěn)定0.9kcal/mol，這進(jìn)一步支持了動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定機(jī)制。野生型和T119M四聚體解離之間的自由能差異不能通過尿素介導(dǎo)的解折疊檢測(cè)，這是因?yàn)門119M在尿素中變性需要特別長(zhǎng)的誘導(dǎo)周期(數(shù)周)，在此期間TTR被修飾。對(duì)比氯化胍(GdmCl)和硫氰酸胍(GdmSCN)變性曲線表明，野生型TTR比T119M更能抵抗GdmCl變性，而在GdmSCN中則相反。這些變性中點(diǎn)的差異可能是由于有差別的陰離子穩(wěn)定化，提示這些蛋白的真實(shí)熱力學(xué)穩(wěn)定性非常相似，盡管在這些離液劑中進(jìn)行定量分析是不可能的。
T119M反式抑制主要由解離過渡態(tài)不穩(wěn)定介導(dǎo)，與T-119M在二聚體-二聚體交界面的定位一致。將解離過渡態(tài)能增加至3.1kcal/mol能有效防止四聚體解離，這是因?yàn)榛罨系K變得不可逾越(解離半衰期t1/2由約42小時(shí)增加至1500小時(shí)以上)。小分子結(jié)合同樣以劑量依賴方式增加與四聚體解離相關(guān)的活化障礙，盡管其通過四聚體穩(wěn)定化(相對(duì)于過渡態(tài)穩(wěn)定化)介導(dǎo)。小分子解離常數(shù)Kd1和Kd2盡可能低且抑制劑濃度盡可能高時(shí)，穩(wěn)定程度最大。我們實(shí)驗(yàn)中基態(tài)穩(wěn)定使用的濃度與血漿中觀測(cè)到的眾多口服利用藥物的濃度相當(dāng)。
小分子結(jié)合和反式抑制增加了與TTR纖維形成的限速步驟四聚體解離相關(guān)的活化能。確立此類推的重要性在于已知反式抑制防止V30M化合物雜合子引起的疾病。考慮到小分子錯(cuò)折疊寡聚物為神經(jīng)毒劑這個(gè)新證據(jù)，天然狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定是特別吸引人的策略?，F(xiàn)在應(yīng)當(dāng)考慮找尋小分子結(jié)合劑或開發(fā)調(diào)節(jié)其它容易錯(cuò)折疊的病理相關(guān)蛋白的能量地形面(energy landscape)的反式抑制方法。
實(shí)施例2二氟尼柳類似物穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)并是甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣蛋白纖維形成的抑制劑二氟尼柳(1)可減少甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)淀粉樣變性。例如，在某些條件(例如3.6μM TTR、3.6μM二氟尼柳、pH 4.4、72小時(shí)、37℃)下，二氟尼柳將TTR淀粉樣變性減少63％。在這些條件下，加倍二氟尼柳濃度(至7.2μM)將TTR淀粉樣變性減少97％。二氟尼柳是迄今報(bào)道的較好的淀粉樣蛋白纖維化抑制劑之一，口服給予的二氟尼柳具有高度的生物利用度，250mg每日兩次的劑量產(chǎn)生100μM以上的穩(wěn)定血漿濃度。因?yàn)槎崃鵀榄h(huán)加氧酶-2抑制劑，所以長(zhǎng)期給予可能導(dǎo)致胃腸道副作用。二氟尼柳類似物降低或缺失NSAID活性，但在血漿中對(duì)TTR具有高親和性，因此是理想選擇。故二氟尼柳的結(jié)構(gòu)可用作抑制TTR淀粉樣變性的新化合物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。參見例如Verbeeck，R.K.等；Biochem.Pharm.1980，29，571-576；和Nuemberg，B.；Koehler，G.；Brune，K.Clin.Pharmacokin.1991，20，81-89。
使用芳基鹵與芳基硼酸間Pd介導(dǎo)的Suzuki偶聯(lián)合成二氟尼柳類似物?？赏ㄟ^以下方法合成類似物2-10用乙酸酐和吡啶乙?；?-或4-碘苯酚，接著與合適的氟苯基硼酸在標(biāo)準(zhǔn)Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)條件下如流程1所示進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)。用Na0和MeOH(Zemplén條件)除去酯獲得苯酚2-10。參見例如Miyaura，N.；Yanagi，T.；Suzuki，A.Synth.Commun.1981，11，513-519；Sharp，M.J.；Snieckus，V.Tetrahedron Lett.1985，26，5997-6000；Sharp，M.J.；Cheng，W.；Snieckus，V.TetrahedronLett.1987，28，5093-5096；Pozsgay，V.；Nanasi，P.；Neszmelyi，A.Carbohydr.Res.1981，90，215-231；Jendralla，H.；Chen，L.-J.Synthesis1990，827-833；和Kelm，J.；Strauss，K.Spectrochim.Acta，Part A 1981，37，689-692，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
流程1使用如流程2所示的固相合成法合成二氟尼柳類似物11。將3-碘苯甲酸經(jīng)酯鍵偶聯(lián)至Wang樹脂，產(chǎn)生樹脂結(jié)合的碘代苯，然后將其偶聯(lián)至2，4-二氟苯基硼酸，用1∶1的TFA∶CH2Cl2混合物將其與樹脂切開。參見例如Guiles，J.W.；Johnson，S.G.；Murray，W.V.J.Org.Chem.1996，61，5169-5171，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
流程2使用標(biāo)準(zhǔn)的Suzuki偶聯(lián)條件(參見上文)，如流程3所示，將3-溴苯甲酸甲酯或4-溴苯甲酸甲酯(都有市售)與合適的氟苯基硼酸偶聯(lián)，組裝成含羧化物的底物12-22。然后用LiOH·H2O皂化酯，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的羧酸。參見例如Bumagin，N.A.；Bykov，V.V.Tetrahedron 1997，53，14437-14450；Ananthakrishnanadar，P.；Kannan，N.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2 1982，1305-1308；Homis，F(xiàn).；Nozaki，K.；Hiyama，T.Tetrahedron Lett.2000，41，5869-5872；和Hajduk，P.J.等；J.Med Chem.1997，40，3144-3150，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
流程3使用TMS-CH2N2酯化5-碘代水楊酸，使用MeI將苯酚轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞ァＨ缌鞒?所示，將保護(hù)的水楊酸與各種氟苯基硼酸偶聯(lián)，隨后通過LiOH·H2O皂化和BBr3脫甲基化去保護(hù)，獲得水楊酸衍生物23-27。參見例如Nicolaou，K.C.等；Chem.Eur.J 1999，5，2602-2621；和Chu-Moyer，M.Y.等；J.Med.Chem.2002，45，511-528。
流程4首先通過將市售溴苯酚保護(hù)為甲酯(MeI和K2CO3)，合成含3′，5′-二鹵代-4′-羥基的類似物28-31。與(甲氧基羰基苯基)硼酸進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)形成全保護(hù)聯(lián)苯底物。如流程5所示，BBr3介導(dǎo)的甲酯剪切和LiOH·H2O皂化產(chǎn)生全官能化二氟尼柳類似物28-31。
流程5通過用TMS-重氮甲烷酯化羧酸產(chǎn)生32，接著任選用MeI和K2CO3醚化，并用LiOH·H2O進(jìn)行酯水解，獲得33，合成二氟尼柳的甲醚和甲酯類似物。參見流程6。
流程6如流程7所示，將碘苯和一系列含鹵素的硼酸進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)，組裝成一系列鹵化聯(lián)苯34-38。參見例如Patrick，T.B.；Willaredt，R.P.DeGonia，D.J.J.Org.Chem.1985，50，2232-2235；Kuchar，M.等；Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1988，53，1862-1872；Allen，K.J.；Bolton，R.；Williams，G.H.J.Chem.Soc.，PerkinTrans.2 1983，691-695；Nakada，M.等；Bull.Chem.Soc.Jpn.1989，62，3122-3126；和Weingarten，H.J.Org.Chem.1961，26，730-733，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
流程7如流程8所示，使用3，5-二氯碘苯和2-、3-或4-甲?；交鹚峤M裝氯化聯(lián)芳醛。類似地制備沒有鹵素取代的醛42-44。醛39-41用KMnO4的丙酮/水溶液氧化，產(chǎn)生流程8對(duì)應(yīng)的羧酸45-47，或者，用NaBH4的MeOH溶液還原，產(chǎn)生流程8對(duì)應(yīng)的芐醇48-50。用NaBH4和MeOH還原非氯化醛42-44，產(chǎn)生聯(lián)苯芐醇51-53。參見例如Song，X.P.；He，H.T.；Siahaan，T.J.Org.Lett.2002，4，549-552；和Nicolaou，K.C.等；J.Am.Chem.Soc.2001，123，9313-9323；Hashizume，H.等；Chem.Pharm.Bull.1994，42，512-520；Indolese，A.F.Tetrahedron Lett.1997，38，3513-3516；Pridgen，L.N.；Snyder，L.；Prol，J.J.Org.Chem.1989，54，1523-1526；Huang，C.G.；Beveridge，K.A.；Wan，P.J.Am.Chem.Soc.1991，113，7676-7684；Wendebom，S.等；Synlett.1998，6，671-675；Stevens，C.V.；Peristeropoulou，M.；De Kimpe，N.Tetrahedron2001，57，7865-7870；Tanaka，K.；Kishigami，S.；Toda，F(xiàn).J.Org.Chem.1990，55，2981-2983；和Clive，D.L.J.；Kang，S.Z.J.Org.Chem.2001，66，6083-6091，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
流程8如流程9所示，將3，5-二氟苯基硼酸與2-或3-碘苯甲醛進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)，合成3′，5′-二氟甲酰-官能化聯(lián)苯54和55。通過類似的方法和前述的方法合成所有其它抑制劑?；衔?0、21、35、36和43有市售。
流程9試劑和溶劑購自Aldrich、Lancaster、Acros、Combi-Blocks、Matrix和Pfaltz-Bauer。THF和CH2Cl2經(jīng)Al2O3干燥。其它的溶劑和試劑得自市場(chǎng)供應(yīng)商，除非另有聲明，否則都沒有進(jìn)一步純化就使用。在硅膠60F254預(yù)涂板上進(jìn)行分析性薄層層析(TLC)，用購自EM Science的熒光指示劑監(jiān)測(cè)反應(yīng)。通過UV照射、磷鉬酸處理后加熱或鉬酸高鈰銨處理后加熱使TLC板顯色。使用EM Science的硅膠60(230-400目)進(jìn)行快速層析。通過HPLC測(cè)定對(duì)本文所得結(jié)論必不可少的新化合物純度。用Waters 600泵/控制器、Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器和Waters NovaPak硅膠柱進(jìn)行正相HPLC。使用的溶劑系統(tǒng)是己烷和乙酸乙酯，梯度在30分鐘內(nèi)由50∶50己烷∶乙酸乙酯至0∶100己烷∶乙酸乙酯。用Waters 600泵/控制器、Waters 2847雙波長(zhǎng)檢測(cè)器和Vydac蛋白和肽C18柱進(jìn)行反相HPLC。溶劑系統(tǒng)A為含0.5％三氟乙酸的95∶5水∶乙腈，而溶劑系統(tǒng)B為含0.5％三氟乙酸的5∶95水∶乙腈。梯度在20分鐘內(nèi)由100∶0 A∶B至0∶100 A∶B，再以100％B保持10分鐘。用AVIV Instruments的202SF型光譜儀進(jìn)行圓二色性光譜學(xué)檢測(cè)。用Varian FT NMR光譜儀以400MHz質(zhì)子頻率記錄NMR光譜。除非另有說明，否則質(zhì)子化學(xué)位移參照內(nèi)部化學(xué)位移標(biāo)準(zhǔn)品CHCl3(7.26ppm)以ppm報(bào)告。偶合常數(shù)以赫茲(Hz)報(bào)道。除非另有說明，否則碳化學(xué)位移參照內(nèi)部化學(xué)位移標(biāo)準(zhǔn)品CDCl3(77.23ppm)以ppm報(bào)告。所有的質(zhì)譜都在Scripps研究所質(zhì)譜中心或伊利諾伊大學(xué)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室獲得。
按照流程1制備化合物2-10。將合適的乙酸-碘苯酯(1.0當(dāng)量)溶解在足量甲苯中，得到濃度為0.05M的溶液，向其中加入苯基硼酸(1.1當(dāng)量)溶解在EtOH獲得的0.6M硼酸溶液。加入2M Na2CO3水溶液，使乙酸-碘苯酯的終反應(yīng)濃度為0.03M，接著加入Pd(PPh3)4(4.0mol％)。將反應(yīng)液在氬氣中加熱回流20小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2提取(2×)，用鹽水洗滌(1×)，經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮。殘余物經(jīng)快速層析(10∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得乙酰化聯(lián)苯。
向乙酰化聯(lián)苯的MeOH溶液中加入催化量的Na0，以使終反應(yīng)物濃度為0.3M。使反應(yīng)物在氬氣中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)，此后加入Dowex 50W-X8陽離子交換樹脂，以中和反應(yīng)混合物。過濾樹脂，將濾過液真空濃縮并快速層析(3∶1己烷∶乙酸乙酯)，獲得為白色固體的羥基聯(lián)苯產(chǎn)物，收率為22-75％。
2′，4′-二氟聯(lián)苯-3-醇(2)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ9.63(br s，1H)，7.54(td，1H，J＝8.9，6.7Hz)，7.34(ddd，1H，J＝11.1，9.2，2.6Hz)，7.27(m，1H)，7.17(tdd，1H，J＝8.3，2.6，1.2Hz)，6.92(m，2H)，6.81(ddd，1H，J＝8.1，2.5，1.0Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ162.8，160.3，157.4，135.4，131.8，129.7，119.4，115.6，114.9，111.9，104.4。C12H8F2O(M-H)的HRESIMS理論值為205.0466，實(shí)測(cè)值為205.0465。正相HPLC保留時(shí)間10.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間1.3分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氟聯(lián)苯-4-醇(3)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.49(td，1H，J＝9.4，8.6Hz)，7.34(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝2.5Hz，JXA＝8.7Hz，JX′A′＝8.5Hz，JX′A＝0.3Hz，JXA′＝0.3Hz，νA＝νA′＝2934.1Hz，νX＝νX′＝2746.2Hz)，7.28(ddd，2H，J＝11.3，9.4，2.6Hz)，7.13(dddd，1H，J＝8.3，7.5，2.8，1.0Hz)，6.87(AA′XX′，2H，同上)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ162.3，160.0，157.2，131.4，129.9，124.8，115.4，111.8，104.3。C12H8F2O(M-H)的HRESIMS理論值為205.0464，實(shí)測(cè)值為205.0465。正相HPLC保留時(shí)間11.2分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.6分鐘。＞98％純。
3′，5′-二氟聯(lián)苯-3-醇(8)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ9.65(br s，1H)，7.34(m，2H)，7.28(t，1H，J＝7.9Hz)，7.19(tt，1H，J＝9.1，2.2Hz)，7.13(ddd，1H，J＝7.8，1.8，1.0Hz)，7.08(t，1H，J＝2.1Hz)，6.86(ddd，1H，J＝8.0，2.4，1.0Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ162.9，158.0，144.1，139.1，130.1，117.6，115.7，109.7，102.6。C12H8F2O(M-H)的HRESIMS理論值為205.0465，實(shí)測(cè)值為205.0468。正相HPLC保留時(shí)間11.4分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.9分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氟聯(lián)苯-4-醇(9)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.44(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝3.0Hz，JXA＝8.0Hz，JX′A′＝8.5Hz，JX′A＝0.7Hz，JXA′＝0.5Hz，νA＝νA′＝2973.8Hz，νX＝νX′＝2766.0Hz)，7.05(dtd，2H，J＝6.6，2.4，0.7Hz)，6.92(AA′XX′，2H，同上)，6.74(tt，1H，J＝8.9，2.4Hz)，5.11(s，1H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ164.7，156.1，144.2，131.8，128.6，116.1，109.6，102.1。C13H8Cl2O2(M-H)的HRESIMS理論值為205.0465，實(shí)測(cè)值為205.0465。正相HPLC保留時(shí)間10.8分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.9分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氟聯(lián)苯-3-甲酸(11)。按照流程2制備化合物11。將3-碘苯甲酸(200mg，0.81mmol)、DIEA(140μL，0.81mmol)、EDCI·HCl和HOBt加入到在CH2Cl2(10mL)中溶脹的Wang樹脂溶液(265mg，0.67mmol，2.53mmol/g)中。在肽振蕩器上于室溫劇烈振蕩22小時(shí)后，去除溶劑，用DMF(3×10mL)和CH2Cl2(3×10mL)洗滌樹脂，并經(jīng)真空徹底干燥。
將2，4-二氟苯基硼酸(112mg，0.71mmol)、K2CO3(98mg，0.71mmol)和Pd2(dba)3(4mg，0.01mmol)加入到在DMF(2mL)中溶脹的官能化Wang樹脂(140mg，0.35mmol)溶液中。于室溫?cái)嚢韬?，過濾反應(yīng)物，用DMF(3×)、H2O(3×)、CH2Cl2(3×)和MeOH(3×)洗滌樹脂，并經(jīng)真空徹底干燥。
將TFA∶CH2Cl2(3mL 1∶1)溶液加入到官能化樹脂(140mg，0.35mmol)中，在肽振蕩器上于室溫劇烈振蕩13小時(shí)。完成后，過濾反應(yīng)物，用CH2Cl2(3×)洗滌樹脂，濾過液真空濃縮，通過快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯，0.5％乙酸)純化，獲得為白色固體的11(81mg，100％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.19(br s，1H)，8.07(q，1H，J＝1.7Hz)，7.99(dt，1H，J＝7.9，1.6Hz)，7.78(dq，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.64(m，2H)，7.40(ddd，1H，J＝11.1，8.8，2.5Hz)，7.22(tdd，1H，J＝8.4，2.8，1.0Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ1670，160.7，160.4，134.5，133.0，132.0，131.3，129.4，129.1，128.7，123.9，112.2，104.6。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0426。正相HPLC保留時(shí)間13.7分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.5分鐘。＞99％純。
按照流程3制備化合物12-22。將合適的溴苯甲酸甲酯(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.1M的溶液，向其中加入苯基硼酸(2.0當(dāng)量)溶解于EtOH中獲得的1.0M硼酸溶液。加入2M Na2CO3水溶液，使溴苯甲酸酯的終反應(yīng)濃度為0.06M，接著加入Pd(PPh3)4(10.0mol％)。將反應(yīng)物在氬氣中于70℃下攪拌25小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(10∶1 己烷∶乙酸乙酯)純化，得到甲酯。
向0.06M濃度的甲酯(1.0當(dāng)量)的THF∶MeOH∶H2O(1∶1∶1)溶液中加入LiOH·H2O(3.0當(dāng)量)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，一結(jié)束就用30％HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(CH2Cl2，1％MeOH，0.2％乙酸)純化，得到為白色固體的聯(lián)苯羧酸，收率為6-93％。
2′，4′-二氟聯(lián)苯-4-甲酸(12)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.09(br s，1H)，8.04(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝2.0Hz，JXA＝JX′A′＝8.0Hz，JX′A＝JXA′＝0.7Hz，νA＝νA′＝3213.3Hz，νX＝νX′＝3056.2Hz)，7.65(AA′XX′，2H，同上)，7.63(m，1H)，7.38(ddd，1H，J＝11.2，9.0，2.8Hz)，7.21(td，1H，J＝8.4，2.2Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.1，160.8，158.0，138.6，132.1，130.1，129.6，129.0，123.9，112.2，104.7。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0407。正相HPLC保留時(shí)間13.3分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.6分鐘。＞99％純。
2′-氟聯(lián)苯-3-甲酸(15)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.18(q，1H，J＝1.4Hz)，8.03(dt，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.76(dq，1H，J＝7.7，1.5Hz)，7.55(t，1H，J＝7.8Hz)，7.48(td，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H，J＝8.3，7.5，5.1，1.8Hz)，7.26(td，1H，J＝7.6，1.3Hz)，7.20(ddd，1H，J＝11.0，8.2，1.2Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ169.7，161.2，137.5，134.6，132.4，132.0，131.3，130.1，129.9，129.5，126.0，117.2。C13H9FO2(M-H)的HRESIMS理論值為215.0508，實(shí)測(cè)值為215.0498。正相HPLC保留時(shí)間10.6分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.1分鐘。＞99％純。
2′-氟聯(lián)苯-4-甲酸(16)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.10(br s，1H)，8.05(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝1.7Hz，JXA＝J′X′A＝8.5Hz，JX′A＝JXA′＝0.3Hz，νA＝νA′＝3217.9Hz，νX＝νX′＝3070.0Hz)，7.67(AA′XX′，2H，同上)，7.58(td，1H，J＝8.0，1.8Hz)，7.34(m，1H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.1，159.1，139.4，130.8，130.3，130.2，129.6，129.0，127.3，125.1，116.2。C13H9FO2(M-H)的HRESIMS理論值為215.0508，實(shí)測(cè)值為215.0515。正相HPLC保留時(shí)間12.3分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.2分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氟聯(lián)苯-3-甲酸(17)。1H NMR(丙酮-d6，400MHz)δ8.30(td，1H，J＝2，0.5Hz)，8.10(dtd，1H，J＝7.6，1.1，0.5Hz)，7.97(ddd，1H，J＝7.8，2.0，1.1Hz)，7.64(td，1H，J＝7.8，0.6Hz)，7.39(m，2H)，7.06(tt，1H，J＝9.3，2.4Hz)。13C NMR(丙酮-d6，100MHz)δ167.4，165.6，163.2，144.6，139.8，132.5，132.4，130.6，130.3，128.9，111.0，103.7。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0425。正相HPLC保留時(shí)間13.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.7分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氟聯(lián)苯-4-甲酸(18)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.15(br s，1H)，8.02(d，2H，J＝8.2Hz)，7.85(d，2H，J＝8.5Hz)，7.49(m，2H)，7.26(tt，1H，J＝9.4，2.4Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ166.4，164.1，161.7，142.6，141.6，130.9，130.0，127.1，110.2，103.5。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0423。正相HPLC保留時(shí)間13.0分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.8分鐘。＞99％純。
2′，6′-二氟聯(lián)苯-3-甲酸(19)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ8.03(dt，1H，J＝7.8，1.6Hz)，8.00(m，1H)，7.72(dt，1H，J＝7.8，1.4Hz)，7.64(t，1H，J＝7.7Hz)，7.53(m，1H)，7.26(t，2H，J＝8.3Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.7，158.7，135.0，132.2，131.4，131.1，129.9，129.5，129.5，112.8，110.9。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0410。正相HPLC保留時(shí)間12.1分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.1分鐘。＞97％純。
2′，6′-二氟聯(lián)苯-4-甲酸(20)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ8.06(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝2.0Hz，JXA＝JX′A′＝8.0Hz，JX′A＝JXA′＝0.7Hz，νA＝νA′＝3243.6Hz，νX＝νX′＝3018.6Hz)，7.60(AA′XX′，2H，同上)，7.54(m，1H)，7.27(t，2H，J＝8.3Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ171.0，164.0，134.1，125.7，122.0，121.9，121.1，103.4。C13H8F2O2(M-H)的HRESIMS理論值為233.0414，實(shí)測(cè)值為233.0425。正相HPLC保留時(shí)間14.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.1分鐘。＞99％純。
聯(lián)苯-4-甲酸(22)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ13.07(br s，1H)，8.03(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝1.8Hz，JXA＝JX′A′＝8.3Hz，JX′A＝JXA′＝0.3Hz，νA＝νA′＝3210.7Hz，νX＝νX′＝3122.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.75(m，2H)，7.51(tt，2H，J＝7.2，1.1Hz)，7.43(tt，1H，J＝7.4，1.2Hz)。13CNMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.2，144.2，139.0，130.0，129.8，129.1，128.3，127.0，126.8。C13H10O2(M+)的HREIMS理論值為198.0683，實(shí)測(cè)值為198.0683。正相HPLC保留時(shí)間13.8分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.2分鐘。＞99％純。
5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯。將TMS-重氮甲烷(19.25mL，38.50mmol，2M己烷溶液)加入到5-碘水楊酸(5.08g，19.24mmol)的MeOH(20mL)溶液中，于室溫?cái)嚢?1小時(shí)。一結(jié)束就真空濃縮反應(yīng)物，殘余物不用進(jìn)一步純化就進(jìn)行下一步。
將甲基碘(2.40mL，38.48mmol)和K2CO3(10.60g，76.96mmol)加入到5-碘-2-甲氧基苯甲酸(5.37g，19.24mmol)的DMF(20mL)溶液中，在氬氣中于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。一結(jié)束就加入乙酸乙酯，用1％HCl(2×20mL)、鹽水(1×)洗滌反應(yīng)物，經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮。殘余物通過快速層析(3∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯(4.93g，88％)。參見例如Corey，E.J.；Myers，A.G.J.Am.Chem.Soc.1985，107，5574-5576，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.90(d，1H，J＝2.4Hz)，7.80(dd，1H，J＝8.8，2.4Hz)，6.96(d，1H，J＝9.0Hz)，3.81(s，3H)，3.79(s，3H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ164.7，158.0，141.6，138.5，122.2，115.2，82.1，55.9，52.0。C9H9IO3(M+)的HREIMS理論值為291.9608，實(shí)測(cè)值為291.9596。
按照流程4制備化合物23-27。將5-碘-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.08M的溶液，向其中加入苯基硼酸(2.0當(dāng)量)溶解于EtOH中獲得的0.8M硼酸溶液。加入2MNa2CO3水溶液，使甲氧基苯甲酸酯的終反應(yīng)濃度為0.06M，接著加入Pd(PPh3)4(10.0mol％)。將反應(yīng)物在氬氣中于60℃下攪拌15小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(3∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，得到甲基化水楊酸酯。
將BBr3(2.0當(dāng)量，1M的CH2Cl2溶液)加入到甲基化水楊酸酯(1.0當(dāng)量)溶于足量CH2Cl2所獲得的0.06M濃度溶液中。反應(yīng)物在氬氣中于室溫?cái)嚢?小時(shí)，一結(jié)束就用H2O(10mL)猝滅，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物不用進(jìn)一步純化就進(jìn)行下一步。
向0.06M濃度的甲酯(1.0當(dāng)量)的THF∶MeOH∶H2O(1∶1∶1)溶液中加入LiOH·H2O(3.0當(dāng)量)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，一結(jié)束就用30％HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(CH2Cl2，1％MeOH，0.2％乙酸)純化，得到為白色固體的聯(lián)苯水楊酸，收率為12-42％。
4′-氟-4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(23)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.01(d，1H，J＝2.5Hz)，7.65(dd，1H，J＝8.7，2.5Hz)，7.51(m，2H)，7.11(tt，2H，J＝10.0，3.0Hz)，6.97(d，1H，J＝8.7Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ173.5，165.0，162.7，137.7，135.1，132.6，129.6，129.3，118.9，116.7，116.6，114.2。C13H9FO3(M-H)的HRESIMS理論值為231.0459，實(shí)測(cè)值為231.0457。正相HPLC保留時(shí)間14.2分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.8分鐘。＞99％純。
2′-氟-4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(24)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.98(dd，1H，J＝2.2，1.4Hz)，7.59(ddd，1H，J＝8.7，2.4，1.7Hz)，7.36(td，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.26(dddd，1H，J＝9.9，7.4，4.9，1.7Hz)，7.16(td，1H，J＝7.5，1.2Hz)，7.10(ddd，1H，J＝11.1，8.2，1.3Hz)，6.95(d，1H，J＝8.5Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ173.5，162.9，162.4，137.2，131.8，130.2，130.1，129.1，128.1，125.8，118.5，117.1，114.0。C13H9FO3(M-H)的HRESIMS理論值為231.0457，實(shí)測(cè)值為231.0446。正相HPLC保留時(shí)間13.8分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.7分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氟-4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(25)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.07(d，1H，J＝2.5Hz)，7.73(dd，1H，J＝8.5，2.7Hz)，7.15(m，2H)，7.01(d，1H，J＝8.9Hz)，6.86(tt，1H，J＝9.0，2.5Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ173.3，166.3，163.8，145.1，135.2，131.0，129.8，119.2，114.4，110.4，103.0。C13H8F2O3(M-H)的HRESIMS理論值為249.0363，實(shí)測(cè)值為249.0356。正相HPLC保留時(shí)間14.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間13.3分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氯-4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(26)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.83(d，1H，J＝2.2Hz)，7.70(d，1H，J＝2.0Hz)，7.58(dd，1H，J＝8.6，2.4Hz)，7.48(ABX，1H，JAB＝8.4Hz，JAX＝2.2Hz，JBX＝0.0Hz，νA＝2989.4Hz，νB＝2973.0Hz)，7.44(ABX，1H，同上)，7.06(d，1H，J＝8.7Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ171.6，160.8，137.5，136.4，132.8，132.6，132.4，130.8，129.2，128.5，127.7，117.2，112.9。C13H8Cl2O3(M-H)的HRESIMS理論值為280.9772，實(shí)測(cè)值為280.9782。正相HPLC保留時(shí)間13.1分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.4分鐘。＞99％純。
4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(27)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.08(d，1H，J＝2.4Hz)，7.73(dd，1H，J＝8.7，2.3Hz)，7.54(m，2H)，7.41(tt，2H，J＝7.3，1.8Hz)，7.29(tt，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H，J＝8.8，6.4Hz)，7.05(d，1H，J＝8.7Hz)，6.93(m，1H)，6.90(ddd，1H，J＝7.3，1.9Hz)，7.00(d，1H，J＝8.5Hz)。13C NMR(CD3OD，100MHz)δ161.5，140.1，134.0，132.4，128.7，128.3，126.9，126.3，117.5，112.9。C13H10O3(M-H)的HRESIMS理論值為213.0552，實(shí)測(cè)值為213.0545。正相HPLC保留時(shí)間12.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間12.6分鐘。＞99％純。
4-溴-2，6-二氟苯甲醚。將甲基碘(580μL，10.06mmol)和K2CO3(2.80g，20.12mmol)加入到4-溴-2，6-二氟苯酚(1.05g，5.03mmol)的DMF(10mL)溶液中，在氬氣中于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。一結(jié)束就加入乙酸乙酯，用1％HCl(2×20mL)、鹽水(1×)洗滌反應(yīng)物，經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮。殘余物通過快速層析(己烷)純化，獲得為白色固體的4-溴-2，6-二氟苯甲醚(747mg，67％)。參見例如Chambers，R.D.等；J.Fluorine Chem.2000，102，169-174，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.06(m，2H)，3.97(q，3H，J＝1.1Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ155.8，136.3，116.2，113.8，61.9。C7H5F2OBr(M+)的LREIMS實(shí)測(cè)值為223.0。
4-溴-2，6-二氯苯甲醚。將甲基碘(467μL，8.12mmol)和K2CO3(2.24g，16.24mmol)加入到4-溴-2，6-二氯苯酚(982mg，4.06mmol)的DMF(10mL)溶液中，在氬氣中于室溫?cái)嚢?0分鐘。一結(jié)束就加入乙酸乙酯，用1％HCl(2×20mL)、鹽水(1×)洗滌反應(yīng)物，經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮。殘余物通過快速層析(己烷)純化，獲得為白色固體的4-溴-2，6-二氯苯甲醚(768mg，74％)。參見例如Li，J.等；J.Med.Chem.1996，39，1846-1856，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.75(s，2H)，3.81(s，3H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ151.3，131.5，129.6，116.5，60.6。C7H5BrCl2O(M+)的HREIMS理論值為253.8905，實(shí)測(cè)值為253.8901。
按照流程5制備化合物28-31。將合適的鹵代苯甲醚(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.25M的溶液，向其中加入苯基硼酸(2.0當(dāng)量)溶解于EtOH中獲得的1.5M硼酸溶液。加入2M Na2CO3水溶液，使鹵代苯甲醚的終反應(yīng)濃度為0.08M，接著加入Pd(PPh3)4(10.0mol％)。將反應(yīng)物于65℃下攪拌17小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(20∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的甲基化聯(lián)苯。
將BBr3(2.0當(dāng)量，1M的CH2Cl2溶液)加入到甲基化聯(lián)苯(1.0當(dāng)量)溶于足量CH2Cl2所獲得的0.20M濃度溶液中。反應(yīng)物在氬氣中于室溫?cái)嚢?小時(shí)，一結(jié)束就用H2O(10mL)猝滅，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物不用進(jìn)一步純化就進(jìn)行下一步。
向0.04M濃度的甲酯(1.0當(dāng)量)的THF∶MeOH∶H2O(1∶1∶1)溶液中加入LiOH·H2O(3.0當(dāng)量)。反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?小時(shí)，一結(jié)束就用30％HCl酸化，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(CH2Cl2，1％MeOH，0.2％乙酸)純化，得到為白色固體的聯(lián)苯產(chǎn)物，收率為14-39％。
3′，5′-二氟-4′-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(28)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ10.60(br s，1H)，8.14(t，1H，J＝1.7Hz)，7.91(dt，1H，J＝7.7，1.1Hz)，7.88(ddd，1H，J＝8.0，2.0，1.1Hz)，7.55(t，1H，J＝7.9Hz)，7.41(m，2H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.3，154.0，151.5，138.4，133.6，131.6，130.8，129.9，129.4，128.4，127.1，110.3。C13H8F2O3(M-H)的HRESIMS理論值為249.0363，實(shí)測(cè)值為249.0358。正相HPLC保留時(shí)間18.3分鐘。反向HPLC保留時(shí)間10.5分鐘。＞98％純。
3′，5′-二氟-4′-羥基聯(lián)苯-4-甲酸(29)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.98(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝1.7Hz，JXA＝JX′A′＝8.2Hz，JX′A＝JXA′＝0.5Hz，νA＝νA′＝3189.9Hz，νX＝νX′＝3122.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.51(m，2H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.7，154.5，142.5，136.0，130.5，130.5，130.4，126.9，111.0。C13H8F2O3(M-H)的HRESIMS理論值為249.0363，實(shí)測(cè)值為249.0375。正相HPLC保留時(shí)間18.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間10.2分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氯-4′-羥基聯(lián)苯-3-甲酸(30)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ8.13(t，1H，J＝1.6Hz)，7.91(m，2H)，7.70(s，2H)，7.56(t，1H，J＝7.8Hz)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.2，149.0，137.9，132.2，131.6，130.8，129.3，128.4，127.1，126.8，122.9，123.0。C13H8Cl2O3(M-H)的HRESIMS理論值為280.9772，實(shí)測(cè)值為280.9767。正相HPLC保留時(shí)間16.2分鐘。反向HPLC保留時(shí)間11.6分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氯-4′-羥基聯(lián)苯-4-甲酸(31)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.98(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝1.7Hz，JXA＝JX′A′＝8.1Hz，JX′A＝JXA′＝0.5Hz，νA＝νA′＝3189.9Hz，νX＝νX′＝3110.0Hz)，7.81(AA′XX′，2H，同上)，7.78(s，2H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ167.2，141.8，141.7，134.7，129.9，129.7，126.9，126.4，123.0。C13H8Cl2O3(M-H)的HRESIMS理論值為280.9772，實(shí)測(cè)值為280.9785。正相HPLC保留時(shí)間15.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間11.4分鐘。＞97％純。
2′，4′-二氟-4-羥基聯(lián)苯-3-甲酸甲酯(32)。按照流程6制備化合物32和33。將TMS-重氮甲烷(5.87mL，11.75mmol，2M己烷溶液)加入到二氟尼柳(1.03g，4.11mmol)的MeOH(10mL)溶液中，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。一結(jié)束就真空濃縮反應(yīng)物，殘余物經(jīng)快速層析(10∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的32(774mg，71％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.97(dd，1H，J＝2.2，1.3Hz)，7.59(dt，1H，J＝8.8，2.1Hz)，7.36(dq，1H，J＝7.7，1.5Hz)，7.48(td，1H，J＝7.8，1.7Hz)，7.38(dddd，1H，J＝8.8，6.4Hz)，7.05(d，1H，J＝8.7Hz)，6.93(m，1H)，6.90(ddd，1H，J＝10.6，8.9，2.5Hz)，3.96(s，3H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ170.6，163.6，161.3，158.5，136.4，131.2，130.3，126.2，124.2，118.0，112.6，111.8，104.6，52.6，124.2。C14H10F2O3(M+)的HRFABMS理論值為264.0596，實(shí)測(cè)值為264.0598。正相HPLC保留時(shí)間6.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.7分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氟-4-甲氧基聯(lián)苯-3-甲酸(33)。將甲基碘(350μL，1.16mmol)和K2CO3(320mg，2.32mmol)加入到32(152mg，0.58mmol)的DMF(4mL)溶液中，在氬氣中于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。一結(jié)束就加入乙酸乙酯，用1％HCl(2×20mL)、鹽水(1×)洗滌反應(yīng)物，經(jīng)MgSO4干燥并真空濃縮，不用進(jìn)一步純化就可以進(jìn)行下一步。
向全甲基化二氟尼柳(140mg，0.50mmol)的MeOH∶THF∶H2O(1∶1∶1)溶液中加入LiOH·H2O(60mg，1.43mmol)，于室溫?cái)嚢?小時(shí)。一結(jié)束就用30％HCl酸化反應(yīng)物，用乙酸乙酯(3×5mL)提取，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(2∶1乙酸乙酯∶己烷，1％乙酸)純化，得到為白色固體的33(122mg，93％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ10.77(br s，1H)，8.31(dd，1H，J＝2.5，0.9Hz)，7.75(dt，1H，J＝8.6，2.1Hz)，7.41(dt，1H，J＝8.9，6.6Hz)，7.15(d，1H，J＝8.8Hz)，6.94(m，1H)，4.13(s，3H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ177.7，161.4，158.2，135.7，133.9，131.4，129.0，123.5，118.1，112.2，112.0，104.6，56.9。C14H10F2O3(M-H)的HRESIMS理論值為263.0520，實(shí)測(cè)值為263.0514。正相HPLC保留時(shí)間21.6分鐘。反向HPLC保留時(shí)間11.9分鐘。＞99％純。
按照流程7制備化合物34-38。按照流程8制備化合物39-44。將芳基碘(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.07M的溶液，向其中加入合適的甲?；交鹚崛芙庥谧懔縀tOH所獲得的0.4M濃度硼酸溶液。加入2M Na2CO3水溶液，使芳基碘的終反應(yīng)濃度為0.04M，接著加入Pd(PPh3)4(3.0mol％)。將反應(yīng)物在氬氣中加熱回流18小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(40∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的聯(lián)苯醛，收率為40-91％。
3′，5′-二氯-3-甲?；?lián)苯(39)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ10.09(s，1H)，8.04(t，1H，J＝1.8Hz)，7.91(dt，1H，J＝7.6，1.3Hz)，7.80(ddd，1H，J＝7.8，2.0，1.3Hz)，7.64(t，1H，J＝7.8Hz)，7.49(d，2H，J＝1.8Hz)，7.38(t，1H，J＝1.9Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ192.0，142.8，139.7，137.2，135.8，133.0，130.1，130.0，128.1，128.0，125.9。C13H8Cl2O(M+H)的HRFABMS理論值為251.0027，實(shí)測(cè)值為251.0027。正相HPLC保留時(shí)間8.0分鐘。反向HPLC保留時(shí)間15.2分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氯-4-甲?；?lián)苯(40)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.99(AA′XX′，2H，JAA′＝JXX′＝2.1Hz，JXA＝JX′A′＝8.5Hz，JX′A＝JXA′＝0.7Hz，νA＝νA′＝3193.7Hz，νX＝νX′＝3077.8Hz)，7.70(AA′XX′，2H，同上)，7.47(t，1H，J＝1.9Hz)，7.39(d，2H，J＝1.9Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ191.8，144.4，142.9，136.2，135.8，130.6，128.5，127.9，126.1。C13H8Cl2O(M-H)的HREIMS理論值為248.9873，實(shí)測(cè)值為248.9874。正相HPLC保留時(shí)間7.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間15.2分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氯-2-甲酰基聯(lián)苯(41)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.98(s，1H)，8.03(dd，1H，J＝7.8，1.3Hz)，7.66(td，1H，J＝7.6，1.5Hz)，7.55(tt，1H，J＝7.6，1.0Hz)，7.44(t，1H，J＝1.9Hz)，7.39(dd，1H，J＝7.7，1.0Hz)，7.27(d，2H，J＝1.9Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ191.4，142.9，141.0，135.3，134.0，133.7，130.7，129.0，128.5，128.4，128.4。C13H8Cl2O(M+H)的HRFABMS理論值為251.0030，實(shí)測(cè)值為251.0029。正相HPLC保留時(shí)間7.0分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.9分鐘。＞99％純。
按照流程8制備化合物45-47。將聯(lián)苯醛(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.07M的溶液，向其中加入KMnO4(2.0當(dāng)量)溶于足量水所獲得的0.2M濃度高錳酸鉀溶液。將反應(yīng)物于室溫?cái)嚢?6小時(shí)，一結(jié)束就真空濃縮，將獲得的殘余物再溶解于10∶1CH2Cl2∶MeOH中，通過玻璃棉塞過濾。粗產(chǎn)物通過快速層析(10∶1CH2Cl2∶MeOH)純化，獲得為白色固體的羧酸(58mg，100％)，收率為82-100％。
2′，4′-二氯聯(lián)苯-3-甲酸(45)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ8.22(br s，1H)，8.00(br s，1H)，7.94(d，1H，J＝7.5Hz)，7.76(s，2H)，7.63(s，1H)，7.60(br s，1H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ168.0，143.7，138.1，135.4，131.6，129.9，127.9，126.2。C13H8Cl2O2(M-H)的HRESIMS理論值為264.9823，實(shí)測(cè)值為264.9810。正相HPLC保留時(shí)間12.3分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.2分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氯聯(lián)苯-4-甲酸(46)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.11(brs，2H)7.72(m，2H)，7.64(d，2H，J＝1.9Hz)，7.46(t，1H，J＝1.7Hz)。13CNMR(DMSO-d6，100MHz)δ170.3，140.6，135.2，127.2，126.4，119.3，118.6，117.4。C13H8Cl2O2(M-H)的HRESIMS理論值為264.9830，實(shí)測(cè)值為264.9823。正相HPLC保留時(shí)間12.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.4分鐘。＞99％純。
2′，4′-二氯聯(lián)苯-2-甲酸(47)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ7.75(br s，1H)，7.56(s，2H)，7.48(m，2H)，7.36(m，2H)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ170.1，152.5，145.2，133.3，130.0，129.6，128.0，127.2，126.3。C13H8Cl2O2(M-H)的HRESIMS理論值為264.9823，實(shí)測(cè)值為264.9834。正相HPLC保留時(shí)間11.4分鐘。反向HPLC保留時(shí)間13.6分鐘。＞99％純。
按照流程8制備化合物48-53。將聯(lián)苯醛(1.0當(dāng)量)溶解于足量MeOH中，獲得濃度為0.1M的溶液，向其中加入NaBH4(2.0當(dāng)量)溶于足量MeOH所獲得的0.3M濃度硼氫化物溶液。于0℃攪拌反應(yīng)物，緩慢溫至室溫，攪拌16小時(shí)后，真空濃縮，通過快速層析(3∶1 己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的聯(lián)苯醇，收率為94-100％。
3′，5′-二氯聯(lián)苯-3-基-甲醇(48)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.54(m，1H)，7.46(d，2H，J＝1.8Hz)，7.45(m，2H)，7.39(m，1H)，7.34(t，1H，J＝1.9Hz)，4.77(s，2H)，1.90(br s，1H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ144.1，141.9，139.0，135.5，129.5，127.4，127.1，126.5，125.8，125.7，65.3。C13H10Cl2O(M+)的HREIMS理論值為252.0103，實(shí)測(cè)值為252.0109。正相HPLC保留時(shí)間13.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.0分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氯聯(lián)苯-4-基-甲醇(49)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.53(AA′XX′，2H，JAA′＝1.9Hz，JXX′＝3.1Hz，JXA＝8.7Hz，JX′A′＝6.4Hz，JXA＝JXA′＝0.5Hz，νA＝νA′＝3009.8Hz，νX＝νX′＝2977.8Hz)，7.45(AA′XX′，2H，同上)，7.45(d，2H，J＝1.9Hz)，7.33(t，1H，J＝1.9Hz)，4.75(br d，2H，J＝4.8Hz)，1.81(br t，1H，J＝5.2Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ144.0，141.4，138.0，135.5，127.8，127.4，127.4，125.8，65.1。C13H10Cl2O(M+)的HREIMS理論值為251.0110，實(shí)測(cè)值為252.0109。正相HPLC保留時(shí)間15.4分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.0分鐘。＞97％純。
3′，5′-二氯聯(lián)苯-2-基-甲醇(50)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.55(dd，1H，J＝7.5，1.3Hz)，7.43(td，2H，J＝7.5，1.4Hz)，7.38(m，2H)，7.29(d，2H，J＝1.9Hz)，7.24(dd，1H，J＝7.4，1.4Hz)，4.58(s，2H)，1.79(s，1H)。13CNMR(CDCl3，100MHz)δ143.7，138.9，137.9，134.9，130.0，129.0，128.9，128.2，127.9，127.6，63.0。C13H10Cl2O(M+)的HREIMS理論值為252.0110，實(shí)測(cè)值為252.0109。正相HPLC保留時(shí)間11.5分鐘。反向HPLC保留時(shí)間14.0分鐘。＞99％純。
按照流程9制備化合物54和55。將合適的碘苯甲醛(1.0當(dāng)量)溶解于足量甲苯中，獲得濃度為0.07M的溶液，向其中加入3，5-二氟苯基硼酸(2.0當(dāng)量)溶解于足量EtOH所獲得的1.0M濃度硼酸溶液。加入2M Na2CO3水溶液，使碘苯甲醛的終反應(yīng)濃度為0.04M，接著加入Pd(PPh3)4(4.0mol％)。將反應(yīng)物在于60℃攪拌17小時(shí)，一結(jié)束就冷卻至室溫，用CH2Cl2(2×)提取，用鹽水(1×)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，并真空濃縮。殘余物通過快速層析(10∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，獲得為白色固體的聯(lián)苯醛，收率為78-80％。
3′，5′-二氟-3-甲酰基聯(lián)苯(54)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ10.06(s，1H)，8.02(t，1H，J＝1.4Hz)，7.88(dt，1H，J＝7.8，1.4Hz)，7.78(ddd，2H，J＝7.8，2.0，1.2Hz)，7.61(t，2H，J＝7.7)，7.10(m，2H)，6.80(tt，11H，J＝8.8，2.3Hz)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ192.0，164.8，162.3，143.0，139.8，137.1，132.9，129.9，127.9，110.4，103.5。C13H8F2O(M+H)的HRFABMS理論值為219.0620，實(shí)測(cè)值為219.0621。正相HPLC保留時(shí)間8.9分鐘。反向HPLC保留時(shí)間13.7分鐘。＞99％純。
3′，5′-二氟-4-甲酰基聯(lián)苯(55)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.98(s，1H)，8.02(dd，1H，J＝7.8，1.5Hz)，7.65(td，1H，J＝7.3，1.4Hz)，7.54(t，1H，J＝7.8Hz)，7.40(dd，1H，J＝7.6，1.2Hz)，6.90(m，3H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ191.5，164.1，161.6，143.4，141.3，134.0，133.7，130.6，129.0，128.3，113.3，103.8。C13H8F2O(M+H)的HRFABMS理論值為219.0620，實(shí)測(cè)值為219.0621。正相HPLC保留時(shí)間7.0分鐘。反向HPLC保留時(shí)間13.4分鐘。＞99％純。
可以使用多種體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所述化合物穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體或防止纖維形成的能力。所述實(shí)驗(yàn)可包括纖維形成測(cè)定、血漿選擇性測(cè)定、甲狀腺素運(yùn)載蛋白化合物復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)測(cè)定(例如通過X-射線晶體學(xué))、甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離或纖維形成的動(dòng)力學(xué)，以及通過例如離心或熱量測(cè)定法測(cè)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白化合物相互作用的化學(xué)計(jì)量和能量學(xué)。以下給出了代表性體外測(cè)定的詳述。
每種化合物都進(jìn)行滯止纖維形成測(cè)定?；衔锝?jīng)P2O5干燥過夜，并用DMSO溶解至7.2mM終濃度，獲得一級(jí)原液(10×原液)。用DMSO將一級(jí)原液稀釋5倍，至終濃度為1.44mM，獲得二級(jí)原液(2×原液)。在抑制劑(1.44mM)存在時(shí)如下檢測(cè)TTR(3.6μM)的酸介導(dǎo)淀粉樣蛋白變性向一次性UV比色皿中加入495μL的0.4mg/mL野生型TTR蛋白的10mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA溶液(pH 7.6)，以及5μL的1.44mM抑制劑DMSO溶液的二級(jí)原液(2×原液)。渦旋混合物，并溫育30分鐘(25℃)，此時(shí)用500μL的200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA溶液(pH 4.2)將pH降低至4.4。渦旋最終的1mL溶液，在不攪拌的情況下于37℃溫育72小時(shí)。72小時(shí)后，渦旋比色皿以懸浮存在的任何纖維，使用UV-可見分光光度計(jì)于350和400nm檢測(cè)懸浮液的濁度。觀測(cè)的每個(gè)TTR加抑制劑樣品的濁度比上以同樣方式制備的無抑制劑樣品的濁度，乘以100，得到纖維形成的百分率。使用1×二級(jí)原液如上進(jìn)行使用等摩爾抑制劑和TTR濃度(3.6μM)的纖維形成測(cè)定。用DMSO將7.2mM 10×一級(jí)原液稀釋10倍至終濃度為0.72mM，制備1×原液，將其用于如上所述的纖維形成測(cè)定。所有測(cè)定都平行進(jìn)行三次，使用野生型TTR測(cè)定全部化合物。通過測(cè)定無野生型TTR時(shí)溶液的濁度，發(fā)現(xiàn)所有化合物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都是可溶的，確保了濁度由TTR淀粉樣蛋白形成所產(chǎn)生。
通過抗體捕獲/HPLC法評(píng)價(jià)潛在抑制劑在血漿中結(jié)合TTR的化學(xué)計(jì)量。在評(píng)價(jià)時(shí)，將1.0mL人血漿和7.5μL抑制劑的1.44mMDMSO溶液裝入1.5mL Eppendorf管中。溶液于37℃溫育并溫和震蕩24小時(shí)。將猝滅瓊脂糖的1∶1凝膠∶TSA(Tris鹽水)漿(125μL)加入溶液中，于4℃溫和震蕩1小時(shí)。將溶液離心(16,000×g)，將上清液分為400μL兩等份，然后將其加入不同的200μL抗-TTR抗體綴合瓊脂糖的1∶1凝膠∶TSA漿樣品中。溶液于4℃溫和震蕩20分鐘，離心(16,000×g)，去除上清液。用1mL TSA/0.05％皂苷于4℃洗滌凝膠(3×，各10分鐘)，接著用1mL TSA于4℃洗滌凝膠(2×，各10分鐘)。樣品離心(16,000×g)，去除最終的洗滌液，加入155μL的100mM三乙胺(pH 11.5)，將TTR和結(jié)合的抑制劑由抗體上洗脫下來。于4℃溫和震蕩30分鐘后，離心(16,000×g)洗脫的樣品，取出145μL含TTR和抑制劑的上清液。然后通過先前描述的反相HPLC分析上清液。參見例如Purkey，H.E.；Dorrell，M.I.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，5566-71，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
以懸滴法用2M硫酸銨平衡7mg/mL蛋白溶液(其100mM KCl、1mM EDTA、10mM磷酸鈉，pH 7.0，0.35-0.50M硫酸銨的溶液)，由蛋白溶液獲得野生型TTR晶體。用10倍摩爾的過量配體浸泡晶體3周以上，制備TTR-配體復(fù)合物。聯(lián)合使用CCD-PXL-L600檢測(cè)器(Bruker instruments)和RU200旋轉(zhuǎn)式陽極X-射線發(fā)生器收集20或26浸泡晶體的數(shù)據(jù)。使用14-BM-C，BIOCARS，Advance Photon Source的單色高能源Quantum-4檢測(cè)器收集1或18浸泡晶體的數(shù)據(jù)。將晶體置于冷凍保護(hù)劑Paratone油中并冷卻，以進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)(20和26為120K，1和18為100K)。TTR·配體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)和脫輔基晶體(apo crystal)為同晶型，晶胞大小接近a＝43_，b＝85_和c＝66_；空間群為P21212，不對(duì)稱單位含兩個(gè)單體。使用DENZO和SCALEPACK簡(jiǎn)化1和18的數(shù)據(jù)集。參見Otwinowski，Z,；Minor，W.Macromolecular Crystallography，A部，載于Methods in Enzymology；Carter，C.W.，Sweet，R.M.主編，Academic Press1997；276卷，307-326頁，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。使用SAINT和PROSCALE(Bruker AXS，Inc.)簡(jiǎn)化20和26的數(shù)據(jù)集。
在利用EPMR進(jìn)行分子置換檢索的過程中，使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的TTR蛋白原子坐標(biāo)(登錄號(hào)1BMZ)作為原型。通過CNS的分子力學(xué)和能量最小化方案精修EPMR的最佳解決方案。獲得的差值Fourier圖揭示，TTR四聚體的每個(gè)結(jié)合袋中都有配體結(jié)合(18、20和26的兩個(gè)構(gòu)象，以及1的四個(gè)構(gòu)象)。使用這些圖譜，可以清楚定位配體在密度圖中的位置，將其納入晶體學(xué)精修。幾輪模擬退火以及隨后的位置和溫度因子精修后，定位了差值Fourier圖中水分子的位置。使用根據(jù)振動(dòng)/扭曲偏差去除法計(jì)算的無偏差加權(quán)電子密度圖，進(jìn)行最后一輪圖形擬合。所有的配體結(jié)合構(gòu)象都與沒有抑制劑時(shí)定相的無偏差退火省略圖以及振動(dòng)/扭曲無偏差加權(quán)圖十分一致。利用Refmac約束精修法進(jìn)行最后一輪精修。因?yàn)樵谧罱K圖中沒有可解釋的電子密度，所以9個(gè)N-端殘基和3個(gè)C-端殘基沒有包括在最終模型中。晶體學(xué)分析的總結(jié)示于表2。參見例如Kissinger，C.R.；Gehlhaar，D.K.；Fogel，D.B.Acta Crystallogr.，Sect.D 1999，55，484-491；Brunger，A.T.等；Acta Crystallogr.，Sect.D 1998，54，905-921；Kantardjieff，K.等；Acta Crystallogr.，Sect.D 2002，58，735-743；Bailey，S.Acta Crystallogr.，Sect.D 1994，50，760-763；和Murshudov，G.N.；Vagin，A.A.；Dodson，E.J.Acta Crystallogr.，Sect.D 1997，53，240-255，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
通過相連的尿素中單體解折疊評(píng)價(jià)TTR四聚體解離動(dòng)力學(xué)。遠(yuǎn)紫外CD分光法未檢測(cè)到緩慢的四聚體解離，但其與如前所述的遠(yuǎn)紫外CD易于檢測(cè)的快速解折疊步驟(快500,000倍)相連。通過向已加入127.4μL磷酸緩沖液的69μL野生型TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸鈉，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.0)中加入3.6μL 1mM的目標(biāo)抑制劑溶液(乙醇溶液)，評(píng)價(jià)隨抑制劑(3.6μM)變化的TTR四聚體(3.6μM)解離動(dòng)力學(xué)。因?yàn)橐种苿舛?7.2μM)兩倍于TTR濃度(3.6μM)，所以將7.2μL 1mM目標(biāo)抑制劑溶液(乙醇溶液)加入至已加入123.8μL磷酸緩沖液的69μL野生型TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸鈉，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.0)中。將100μL的目標(biāo)蛋白-抑制劑溶液加入到600μL 10.3M尿素和300μL磷酸緩沖溶液中，產(chǎn)生的最終尿素濃度為6.5M。渦旋溶液，以如下間隔收集圓二色性光譜0、5、8、23、46、71、95、118、144和168小時(shí)。制備含7.2μL乙醇而不是抑制劑的對(duì)照樣品進(jìn)行對(duì)比，并以上文確定的時(shí)間點(diǎn)收集光譜。掃描每0.5mm、平均時(shí)間10秒收集220和213nm之間的CD光譜。每個(gè)波長(zhǎng)掃描一次。對(duì)220和213nm之間的振幅值取平均值，以測(cè)定整個(gè)實(shí)驗(yàn)中β-折疊的損失程度。
通過濁度監(jiān)測(cè)pH 4.4時(shí)酸介導(dǎo)的纖維形成速率?；衔锝?jīng)P2O5過夜干燥，并用DMSO溶解至終濃度7.2mM，獲得一級(jí)原液(10×原液)。用DMSO將一級(jí)原液稀釋5倍，至終濃度為1.44mM，制備二級(jí)原液(2×原液)。使用7.2μM濃度抑制劑和3.6μM TTR(四聚體)，如下進(jìn)行纖維形成測(cè)定向一次性UV比色皿中加入495μL的0.4mg/mL野生型TTR蛋白的10mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA溶液(pH 7.6)，以及5μL的1.44mM二級(jí)抑制劑原液(2×原液)。渦旋混合物，并溫育30分鐘(25℃)。30分鐘后，用500μL的200mM乙酸、100mM KCl、1mM EDTA(pH 4.2)將pH降至4.4。渦旋最終的1mL溶液，并于37℃不攪拌溫育。渦旋溶液，檢測(cè)350和400nm的濁度。酸化后以如下間隔收集UV光譜0、4、8、24、48、72、96、120、144、168和192小時(shí)。制備含5μL DMSO的對(duì)照樣品進(jìn)行對(duì)比，并以上述時(shí)間點(diǎn)收集光譜。每種抑制劑溶液都制備成10個(gè)的組，以防止讀數(shù)前存在比色皿干擾。獲得UV吸光度后，廢棄對(duì)應(yīng)于該時(shí)間點(diǎn)的比色皿。使用1×二級(jí)抑制劑原液如上所述進(jìn)行使用等摩爾(3.6μM)濃度TTR和抑制劑的纖維形成測(cè)定，所述1×二級(jí)抑制劑原液制備方法如下用DMSO將7.2 mM 10×一級(jí)原液稀釋10倍至終濃度為0.72mM，將其用于上述纖維形成測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有化合物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都是可溶的，確保了濁度由TTR淀粉樣蛋白形成所產(chǎn)生。
分析存在抑制劑的情況下pH 4.4時(shí)的TTR四級(jí)結(jié)構(gòu)。在3.6μM或7.2μM抑制劑存在時(shí)，在滯止纖維形成測(cè)定條件下，將蛋白(3.6μM)溫育72小時(shí)，評(píng)價(jià)18和20穩(wěn)定TTR的機(jī)制。72小時(shí)后，離心(14,000×g)樣品，從測(cè)定中形成的任何固體去除上清液。用Beckman XL-I分析型超速離心機(jī)進(jìn)行平衡和速度超速離心分析。如前述進(jìn)行數(shù)據(jù)的獲取和分析。參見例如Lashuel，H.A.；Lai，Z.；Kelly，J.W.Biochemistry1998，37，17851-64；和Lashuel，H.A.等；Biochemistry 1999，38，13560-73，這些文獻(xiàn)的每一個(gè)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
使用Microcal instrument(Microcal Inc.，Northhampton，MD)，通過等溫滴定量熱法，測(cè)定為18和20與野生型TTR結(jié)合的特征的解離常數(shù)。制備抑制劑溶液(300μM或500μM的25mM tris緩沖液，100mM KCl，1mM EDTA，12％EtOH，pH 8.0)，并滴定入含野生型TTR(15μM或25μM的25mM tris緩沖液，100mM KCl，1mM EDTA，12％EtOH，pH 8.0)的ITC池中。首先注射2.5μL，接著以每次5.0μL注射50次(25℃)?？鄢镜缀髮?duì)溫譜圖積分，獲得結(jié)合等溫線，其與具有負(fù)協(xié)同性的兩個(gè)連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)模型擬合得最好。使用Microcal提供的ORIGIN 2.9版的ITC數(shù)據(jù)分析模塊，利用具有四個(gè)可調(diào)節(jié)參數(shù)(即K1、ΔH1、K2、ΔH2)的非線性最小二乘法擬合數(shù)據(jù)。
使用濁度測(cè)定評(píng)價(jià)為TTR淀粉樣蛋白纖維化抑制劑的所述化合物。通過酸化用抑制劑預(yù)溫育(25℃，30分鐘)的TTR，使用加入后將pH跳至最終值4.4的緩沖液，開始野生型TTR淀粉樣變性。每種混合物溫育72小時(shí)(37℃)后，使用UV-可見分光光度計(jì)檢測(cè)350和400nm的濁度。將無抑制劑時(shí)的野生型TTR淀粉樣變性指定為100％纖維形成，所有的淀粉樣蛋白纖維形成數(shù)據(jù)都對(duì)此值歸一化。因此，5％纖維形成相當(dāng)于72小時(shí)后化合物抑制野生型TTR纖維形成達(dá)95％。首先對(duì)3.6μM濃度TTR四聚體評(píng)價(jià)7.2μM濃度的每種潛在抑制劑。以等于TTR濃度(3.6μM)的濃度再評(píng)價(jià)使纖維形成低于15％的化合物，以選擇高效抑制劑。在這些條件下纖維形成低于40％表征為極好抑制劑，而40-70％抑制表示為適中化合物。纖維形成數(shù)據(jù)示于表1。
表1化合物對(duì)纖維形成的作用






根據(jù)化合物2-55的抑制劑效力數(shù)據(jù)，似乎與二鹵代官能化疏水環(huán)直接連接的羧基取代親水環(huán)足以獲得極佳的活性(表1)。酚取代基代替羧基(2-10)變成活性低得多的抑制劑，遠(yuǎn)次于母體化合物1。在疏水環(huán)的鄰位或間位具有鹵素的抑制劑優(yōu)于沒有鹵素或具有單一對(duì)位鹵素的化合物。這提示對(duì)位鹵素不以與間位和鄰位鹵代聯(lián)芳化合物相同的方式填補(bǔ)HBP。完全去除所有鹵素得到的抑制劑極差，估計(jì)是沒有立體互補(bǔ)來填充鹵素結(jié)合袋(例如化合物10、21-22、27、42-44和51-53)。在測(cè)試條件下，最好的酚化合物(8)劣于在親水環(huán)上同時(shí)具有酚和羧基官能團(tuán)的1。以單羧基穩(wěn)定的聯(lián)芳化合物(例如11-22)可能是極佳的淀粉樣蛋白纖維化抑制劑，例如化合物11、12、15-20。這些化合物與二氟尼柳競(jìng)爭(zhēng)抑制，那些僅含有對(duì)位鹵素的化合物(例如化合物13和14)是例外。間位或?qū)ξ蝗〈姆蓟人峥赡茏阋再x予極佳的抑制特性，提示1的羥基取代基不是良好抑制劑活性所必須的。另外，對(duì)位羧基定位似乎產(chǎn)生更好的抑制劑，表明對(duì)位羧基能更好地利用與Lys 15和15′的ε-銨基之間的靜電作用(正向結(jié)合模式)，如20的情況，或者能更好地利用與Ser 117和117′羥基的氫鍵鍵合作用(反向結(jié)合模式)，如18的情況。疏水環(huán)由鹵素在對(duì)位以外的位置取代且親水環(huán)具有間位和(特別是)對(duì)位羧基的聯(lián)芳化合物是高效的TTR淀粉樣蛋白纖維形成抑制劑。
向含羧基取代基的環(huán)加入羥基取代基(水楊酸取代，例如23-27)也可以獲得類似于二氟尼柳的高活性抑制劑。對(duì)于具有水楊酸核的聯(lián)芳化合物，鹵素的確切位置似乎不是和先前的情況一樣至關(guān)重要，提示此環(huán)對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)不成比例。對(duì)位羥基可能參與和Lys 15和15′的ε-銨基(正向結(jié)合模式)或Ser 117和117′羥基(反向結(jié)合模式)的氫鍵鍵合。氯取代1中的氟(26)可獲得活性相等或更好的抑制劑，而完全去除鹵素(27)可獲得適中的抑制劑。應(yīng)當(dāng)指出的是，27在體外僅略優(yōu)于對(duì)位羧酸22，而它們兩個(gè)都優(yōu)于在間位具有羧基的無鹵素抑制劑21和含羥基類似物10。
在含鹵素環(huán)上包含3′，5′-二鹵代-4′-羥基取代基和在對(duì)位或間位具有羧基(28-31)可獲得類似于二氟尼柳的高抑制劑活性。包含4-羥基取代基更精確地模擬TTR的天然配體甲狀腺素。這些抑制劑還可以更精確地模擬甲狀腺素激素活性，因此可以作為甲狀腺激動(dòng)劑或拮抗劑，該作用是不需要的。
將羧基保護(hù)為甲酯或?qū)⒘u基保護(hù)為甲醚(32和33)得到的抑制劑劣于1。結(jié)合電荷損失和空間體積增大或許可以解釋這些觀測(cè)結(jié)果。去除所有的親水取代基(例如34-38)得到的抑制劑極差。僅含間位氯取代基的聯(lián)芳化合物(例如38)是適中的抑制劑，提示與含氟聯(lián)芳化合物(37)相比，氯增強(qiáng)鹵素結(jié)合袋中的接觸。
合成幾種含氯抑制劑，評(píng)價(jià)其TTR纖維化抑制活性。當(dāng)此類抑制劑成員在間位或?qū)ξ缓恤然?例如45和46)時(shí)，它們可具有高活性，而具有鄰位羧基的成員(例如47)可能是較差的抑制劑。此觀察結(jié)果提示鄰位羧基可能離Lys 15和15′ε-銨基太遠(yuǎn)，以至于不能產(chǎn)生良好的靜電作用(正向結(jié)合模式)，或者離Ser 117和117′羥基太遠(yuǎn)，以至于不能進(jìn)行氫鍵鍵合作用(反向結(jié)合模式)。芐醇48-50令人驚奇地證實(shí)為極佳的纖維形成抑制劑。一個(gè)環(huán)上的間位二氯取代似乎由鄰位、間位或?qū)ξ坏钠S醇官能團(tuán)補(bǔ)償，潛在的原因是氫鍵鍵合或水介導(dǎo)的氫鍵鍵合。一系列-CH2OH基團(tuán)由醛官能團(tuán)取代的醛類似物(39-41)顯示出良好的抑制性，對(duì)位醛41是例外，這可能是由于醛水合為偕二醇的作用。醛、芐醇和羧酸可能經(jīng)不同機(jī)制結(jié)合在所述袋。但是，在沒有結(jié)構(gòu)信息時(shí)，不能排除相似的結(jié)合模式。醛也有可能通過半縮醛共價(jià)結(jié)合Ser 117(117′)或通過亞胺鍵共價(jià)結(jié)合Lys 15(15′)。在醛化合物情況下由氟取代氯(54和55)獲得的抑制劑相當(dāng)差(39和41)。如前所述，完全去除鹵素獲得的抑制劑活性較差(42和44)，只有間位醛43具有適中活性是個(gè)例外。此適中活性可能源自高度的水合作用。令人驚奇的是，3′，5′-二氟-間位醛(54)劣于沒有鹵素的醛(42)。
對(duì)于以和TTR(3.6μM)相等的濃度保持TTR纖維形成低于50％的抑制劑，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其選擇結(jié)合TTR超過血漿中所有其它蛋白的能力。血液中的二氟尼柳在單劑500mg后20小時(shí)可超過30μM，或者在相同劑量后4小時(shí)可超過300μM。盡管此高水平的持續(xù)血漿濃度提示極佳的生物利用度，但選擇性更強(qiáng)的抑制劑將容許更低的劑量和潛在更少的副作用；因此，將此抑制劑的亞類以10.8μM終濃度(人血漿中的平均TTR濃度大約為5μM)與人血漿溫育。然后使用樹脂結(jié)合抗體捕獲TTR，用TSA(tris鹽水)/0.05％皂苷溶液洗滌固定化的TTR三次，接著用TSA洗滌兩次。用100mM三乙胺(pH 11.5)將TTR-抑制劑復(fù)合物由樹脂上釋放下來，通過反向HPLC分析測(cè)定存在的抑制劑對(duì)TTR的化學(xué)計(jì)量。每個(gè)TTR四聚體最大可結(jié)合2當(dāng)量抑制劑。表1總結(jié)了洗滌后的血漿結(jié)合化學(xué)計(jì)量，結(jié)果顯示下限源自與洗滌相關(guān)的損失。
含氯聯(lián)苯化合物在人血漿中可選擇性結(jié)合TTR(平均化學(xué)計(jì)量為0.8，理論最大化學(xué)計(jì)量為2.0，參見表1)。觀測(cè)到的所有測(cè)試抑制劑的平均化學(xué)計(jì)量為0.4。在含氟抑制劑中，18和20分別表現(xiàn)出非常好和可接受的TTR結(jié)合選擇性，優(yōu)于相似條件下1所顯示的0.13化學(xué)計(jì)量。表1報(bào)告的化學(xué)計(jì)量值可代表下限，原因是TTR螯合在多克隆抗體樹脂上時(shí)抑制劑的洗滌相關(guān)損失。39和41的TTR結(jié)合選擇性結(jié)果應(yīng)當(dāng)慎重考慮，因?yàn)槿缟纤鲞@些化合物可能共價(jià)連接至TTR。
這些抑制劑在體外表現(xiàn)出極佳的TTR淀粉樣蛋白纖維抑制數(shù)據(jù)，還表現(xiàn)出較差的血漿選擇性，它們可能優(yōu)先結(jié)合白蛋白中的藥物結(jié)合位點(diǎn)和/或血漿中存在的其它蛋白中的相似位點(diǎn)。這樣的抑制劑未必能夠在類似于血漿或CSF的復(fù)雜環(huán)境中防止TTR錯(cuò)折疊和淀粉樣變性。
通過用10倍摩爾過量抑制劑浸泡TTR晶體三周以上，獲得結(jié)合TTR的1及其三種類似物26、18和20的高分辨率X射線共晶體結(jié)構(gòu)。表2概述了晶體學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
表2晶體學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
二氟尼柳(1)以正向和反向兩種方式結(jié)合TTR。在TTR的每個(gè)激素結(jié)合位點(diǎn)中都發(fā)現(xiàn)二氟尼柳的四個(gè)不同結(jié)合構(gòu)象具有大致相同的占有率—正向和反向結(jié)合方式各自都具有兩種對(duì)稱等價(jià)結(jié)合方式。二氟尼柳的聯(lián)苯體系變得遠(yuǎn)離激素結(jié)合袋的中心，并占據(jù)兩個(gè)不同位置，在TTR的激素結(jié)合袋形成電子密度的“V”型錐體。這種結(jié)合模式同時(shí)增強(qiáng)了抑制劑和由Leu 17、Ala 108、Leu 110、Thr 119和Val 121形成的TTR疏水袋之間的疏水作用和范德華作用。羧基和內(nèi)部結(jié)合袋中的Thr 119側(cè)鏈氧以及Ala 108主鏈氧之間的氫鍵作用增進(jìn)了二氟尼柳的反向結(jié)合模式。令人驚奇的是，Ser 117既沒有參與多個(gè)構(gòu)象，也沒有與抑制劑形成任何靜電作用。在反向結(jié)合模式中，二氟尼柳的一個(gè)氟取代基在Thr 119側(cè)鏈氧的氫鍵鍵合距離之內(nèi)(3.3_)。在外部結(jié)合袋中，Lys 15′側(cè)鏈原子的電子密度僅在低∑水平可見，表明其可能在一個(gè)以上的構(gòu)象中。Lys 15殘基的最可能構(gòu)象被建模在正向結(jié)合模式中二氟尼柳羧基的氫鍵鍵合距離內(nèi)。
化合物20以正向結(jié)合模式結(jié)合TTR，羧基取代的親水環(huán)朝向外部結(jié)合袋，以和Lys 15和15′產(chǎn)生靜電作用。氟化芳環(huán)位于內(nèi)部結(jié)合袋中，其中鹵素位于HBP 2和2′。令人感興趣的是，對(duì)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的嚴(yán)格檢查表明聯(lián)苯環(huán)方向存在顯著差異。苯環(huán)平面之間的夾角由一個(gè)結(jié)合部位的32.6度變至另一個(gè)結(jié)合部位的63.8度。該觀測(cè)結(jié)果可能是20和TTR負(fù)協(xié)同結(jié)合的結(jié)果。
化合物18以反向模式結(jié)合TTR，羧基取代的親水芳環(huán)朝向內(nèi)部結(jié)合袋，在Ser 117和Ser 117′的氫鍵鍵合距離之內(nèi)。芳環(huán)相互之間旋轉(zhuǎn)34度，以利用和Leu 17、Ala 108、Val 121和Thr 119的疏水作用。氟位于鹵素結(jié)合袋1和1′中。預(yù)期反向結(jié)合模式不是如此，而是羧基位于外部結(jié)合袋中，以利用與Lys 15和15′的靜電作用，氟螯合至鹵素結(jié)合袋2和2′中。但是，反向結(jié)合模式并不是完全出乎意料，先前觀測(cè)到雙氯芬酸(聯(lián)芳胺)和幾個(gè)雙氯芬酸類似物就是如此。
二氟尼柳中氯代替氟導(dǎo)致26與TTR結(jié)合的顯著差異?；衔?6以反向結(jié)合模式結(jié)合TTR，羧基取代的芳環(huán)朝向內(nèi)部結(jié)合袋，而氯螯合至鹵素結(jié)合袋2和2′中。同18和20一樣，化合物26也占據(jù)激素結(jié)合袋的中心。TTR原體的殘基Ala 108、Lys 15、Leu 17、Leu 110、Lys 17和Thr 119與抑制劑形成范德華作用和疏水作用。在內(nèi)部結(jié)合袋中，Ser 117的側(cè)鏈以兩種構(gòu)象存在，以和26的羧基取代基以及其它單體的Ser 117作用。26的同一個(gè)羧基氧也與Ser 117的主鏈氧形成氫鍵。26的另一個(gè)羧基氧與Ala 108的主鏈氧形成氫鍵。與二氟尼柳相反，Thr 119殘基背向抑制劑，對(duì)結(jié)合袋的疏水性而不是與抑制劑的氫鍵鍵合起作用。
為進(jìn)一步探究這些抑制劑的作用機(jī)制，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定TTR抗隨時(shí)間變化的尿素誘導(dǎo)解離的能力。將四聚體解離速率與不可逆地、快速、易于監(jiān)測(cè)、使用單體能再折疊濃度以上尿素濃度的單體解折疊相關(guān)聯(lián)。在6.5M尿素中以遠(yuǎn)紫外-CD探測(cè)解折疊監(jiān)測(cè)的解離，結(jié)果表明酸介導(dǎo)淀粉樣變性的所有優(yōu)秀抑制劑都以劑量依賴方式減慢四聚體解離速率(圖2A和2B)。某些抑制劑，包括20、46和48，顯示出對(duì)淀粉樣變性的限速步驟TTR四聚體解離的巨大作用。參見例如Hammarstrom，P.等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002，25，16427-32，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
因?yàn)椴孪脒@些化合物抑制TTR纖維形成的模式是通過基態(tài)穩(wěn)定化劑量依賴性地調(diào)整四聚體解離屏障，所以最好的抑制劑應(yīng)當(dāng)將四聚體解離減慢得最多。以最終pH 4.4時(shí)的濁度監(jiān)測(cè)192小時(shí)內(nèi)纖維形成的速率。參見圖3A、3B、4A和4B。在低pH能夠穩(wěn)定四聚體TTR的抑制劑防止四聚體解離、錯(cuò)折疊和錯(cuò)組裝成淀粉樣蛋白。最好的淀粉樣蛋白纖維形成抑制劑將四聚體解離減慢得最多(圖2A和2B)。但是，關(guān)聯(lián)不完全，因?yàn)槟承┮种苿┰谀蛩刂斜仍谒嵝詶l件下結(jié)合得更好，反之亦然。
為確保抑制劑穩(wěn)定四聚體形式的TTR(3.6μM)，用平衡和速度分析性超速離心研究探測(cè)TTR的四級(jí)結(jié)構(gòu)。測(cè)定與18和20(3.6μM或7.2μM)于pH 4.4溫育72小時(shí)后的蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)。在平衡AUC以及速度研究中，3.6μM和7.2μM抑制劑濃度時(shí)四聚體都是主導(dǎo)形式。
使用等溫滴定量熱法(ITC)測(cè)定18和20與TTR在pH 8.0(25℃)時(shí)的結(jié)合常數(shù)。二氟尼柳和兩種類似物負(fù)協(xié)同性結(jié)合TTR，這是許多其它配體表現(xiàn)出的特征。對(duì)于二氟尼柳和20，第一個(gè)部位的結(jié)合比第二個(gè)部位的結(jié)合強(qiáng)15倍。聯(lián)芳化合物18的Kd1大約比Kd2低120倍(表3)。表3概述了通過ITC測(cè)定的1、18和20與野生型TTR結(jié)合的第一和第二解離常數(shù)。1的結(jié)合常數(shù)先前已報(bào)道，本文提供其是為了進(jìn)行對(duì)比。參見實(shí)施例1。
表3化合物結(jié)合野生型TTR的解離常數(shù)
四聚體野生型TTR解離的t1/2為42小時(shí)，解折疊快500,000倍。因此，通過與在6.5M尿素中的不可逆解折疊相關(guān)聯(lián)，可探測(cè)其解離速率。因?yàn)樗木垠w解離是淀粉樣蛋白變性的限速步驟，所以如果推測(cè)的通過選擇性結(jié)合天然狀態(tài)而使動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的作用機(jī)制是正確的，那么所有表現(xiàn)出極佳的體外活性和血漿中的結(jié)合化學(xué)計(jì)量超過0.50的抑制劑都應(yīng)當(dāng)減慢四聚體解離(參見圖2A和2B)。
在168小時(shí)時(shí)程內(nèi)，在6.5M尿素中，檢測(cè)隨抑制劑濃度變化的TTR四聚體解離速率。選擇的抑制劑，具體地說是18、20、39、41、45、46、48和49，如振幅變化反映的，證實(shí)在160小時(shí)內(nèi)四聚體解離程度相比于無抑制劑的TTR全面下降。如時(shí)程斜率下降反映的，抑制劑存在時(shí)四聚體解離速率也急劇減慢。抑制劑20、45、46和48較好，推測(cè)是由于其在尿素中的高結(jié)合性而與TTR·I和TTR·I2非常緩慢地解離?；旧蠈?duì)于20、45、46和48來說，由于TTR·I和TTR·I2這些復(fù)合物的Kd低，所以形成TTR·I和TTR·I2可顯著穩(wěn)定天然狀態(tài)，并增加四聚體解離的動(dòng)力學(xué)屏障。即使16和18結(jié)合TTR，似乎其親和性也不足以影響動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。可能有意義的是，3.6μM抑制劑濃度(3.6μM蛋白)時(shí)尿素中抑制劑效力的排列順序是20≈45＞46≈48，這與7.2μM抑制劑濃度不同(20≈46＞45≈48)。這可能反映出尿素中Kd2值的差異。
天然狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定是一種有吸引力的治療策略，因?yàn)橛行伦C據(jù)表明錯(cuò)折疊的寡聚物無論開啟還是關(guān)閉淀粉樣蛋白途徑都具有神經(jīng)毒性。用抑制劑實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定可為SSA、FAP和FAC提供非侵入性治療。
給定抑制劑存在時(shí)尿素中的四聚體解離速率未必總能預(yù)測(cè)出抑制劑在低pH時(shí)防止淀粉樣變性的能力。因?yàn)槠襁€不清楚人體中的淀粉樣蛋白怎樣和在哪里形成，所以在各種變性環(huán)境中發(fā)揮功能的TTR四聚體穩(wěn)定劑比較理想。在酸性條件下探測(cè)隨抑制劑濃度變化的TTR纖維形成速率(圖3A、3B、4A和4B)。抑制劑20、45和48在此環(huán)境中預(yù)期也表現(xiàn)良好。抑制劑46作為四聚體抑制劑在尿素中比在酸中更好，而1在酸中比在尿素中好得多。與在給定環(huán)境中形成TTR·I和TTR·I2復(fù)合物相關(guān)的穩(wěn)定自由能決定了基態(tài)穩(wěn)定程度和四聚體解離活化自由能的相關(guān)增加程度。這些數(shù)據(jù)提示抑制劑在低pH減慢TTR淀粉樣變性遠(yuǎn)比它們?cè)?.5M尿素中減慢TTR四聚體解離有效。這可能是因?yàn)榈矸蹣幼冃孕枰诮怆x后濃度依賴性再組裝。更有效的抑制劑可將TTR單體淀粉樣變性中間體的濃度保持在足夠低的水平，以使纖維形成基本無效。正如在抑制劑存在時(shí)TTR的尿素變性中觀察到的一樣，低pH時(shí)抑制劑效力的等級(jí)排序明顯在3.6μM抑制劑(圖3A和3B)和7.2μM抑制劑(圖4A和4B)濃度中不同。此觀測(cè)結(jié)果可能反映出低pH時(shí)各種抑制劑Kd2值的差異。最引人注目的實(shí)例是二氟尼柳——由于其Kd2較高，所以3.6μM時(shí)它是最有效的纖維形成抑制劑之一，但7.2μM時(shí)其是最低效的抑制劑之一。
二氟尼柳類似物代表著一類有前途的治療TTR淀粉樣變性的化合物。盡管某些雙氯芬酸類似物是非常好的纖維形成抑制劑，但二氟尼柳類似物提供了另外一類高效TTR四聚體穩(wěn)定劑。某些雙氯芬酸類似物有能力抑制兩種TTR突變體-Val30Met和Leu55Pro的解離和錯(cuò)折疊導(dǎo)致的纖維形成。X-射線共晶體結(jié)構(gòu)表明雙氯芬酸類似物主要以反向結(jié)合模式結(jié)合，但是，二氟尼柳類似物結(jié)構(gòu)輕微變化就可以容許正向或反向結(jié)合。另外，二氟尼柳能夠以正向或反向結(jié)合方式結(jié)合，兩種方式的占有率幾乎相等。獲得的雙氯芬酸解離常數(shù)(Kd1為60nM，Kd2為1200nM)與獲得的二氟尼柳和20的解離常數(shù)相當(dāng)，而18根據(jù)其Kd1值證實(shí)其第一結(jié)合要牢固接近10倍。另外，兩種抑制劑類型都表現(xiàn)出負(fù)協(xié)同結(jié)合。更值得注意的是，某些二氟尼柳類似物對(duì)人血漿中TTR的選擇性很高，具有降低毒性和副作用的潛力。參見Oza，V.B.等；J.Med.Chem.2002，45，321-32。
合成的28種化合物基本可抑制TTR淀粉樣變性。其中幾種顯示在人血漿中的結(jié)合化學(xué)計(jì)量超過0.50當(dāng)量。較好抑制劑的氯化和氟化芳基結(jié)構(gòu)都已在已知藥物中發(fā)現(xiàn)，因此，有充分理由相信可將這些化合物或其類似物開發(fā)成不表現(xiàn)出1的NSAID活性的藥物。氟化化合物18和20可在6.5M尿素中結(jié)合并穩(wěn)定四聚體TTR，急劇減慢錯(cuò)折疊和淀粉樣變性的第一步TTR四聚體解離。這些化合物以及其它化合物還急劇減慢酸介導(dǎo)的TTR淀粉樣變性。在測(cè)試的化合物中，18、20、39、41、45、46、48和49在尿素和酸性條件下將TTR四聚體穩(wěn)定得最好。這些聯(lián)芳化合物似乎通過基態(tài)穩(wěn)定化增加與淀粉樣蛋白形成的限速步驟四聚體解離相關(guān)的活化障礙。
實(shí)施例3口服給予的二氟尼柳穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白抗變性甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)是轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素和全視黃醇結(jié)合蛋白的同源四聚體蛋白質(zhì)。在變性條件下，限速性四聚體解離和快速的單體錯(cuò)折疊能夠?qū)⑵溴e(cuò)組裝成引起老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病和家族性淀粉樣心肌病的淀粉樣蛋白。已知二氟尼柳結(jié)合TTR中兩個(gè)未被占據(jù)的甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)中的至少一個(gè)，以此穩(wěn)定TTR四聚體，也增加了體外解離活化障礙。研究了使用二氟尼柳治療TTR淀粉樣變性的可行性。
方法在給出知情同意后招收30個(gè)健康志愿者(25個(gè)男性，5個(gè)女性)。受試者年齡由23-53歲(平均年齡37.6±8.8)，平均體重78.0±12.1kg。每個(gè)受試者用二氟尼柳(Dolobid_)以125、250或500mg每天兩次(每12小時(shí))的劑量治療7天(共13劑)。在治療前1天和第8天、以及攝入二氟尼柳后第4和12小時(shí)采血。該研究設(shè)計(jì)方案得到Scripps臨床受試者委員會(huì)、Scripps綠色醫(yī)院、Scripps研究所和Scripps綜合臨床研究中心的批準(zhǔn)。
檢測(cè)血清二氟尼柳水平。將100μL血清加入900μL乙腈中沉淀蛋白質(zhì)。離心后，將100μL上清液加入到900μL的100mM三乙胺水溶液(pH 11.5)中。過濾后，將100μL的各樣品注入Keystone 3厘米C18反相柱，該柱在10分鐘內(nèi)使用40-100％梯度的溶液B(溶液A94.8％水/5％乙腈/0.2％三氟乙酸；溶液B94.8％乙腈/5％水/0.2％三氟乙酸)，由Waters 600E多元溶劑傳送系統(tǒng)操控。用Waters 486可調(diào)吸光度檢測(cè)器于280nm完成檢測(cè)，積分峰，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得二氟尼柳濃度。
分析二氟尼柳結(jié)合人血清中TTR的化學(xué)計(jì)量。將Sepharose的1∶1凝膠/10mM Tris·HCl，pH 8.0/140mM NaCl/0.025％NaN3(TSA)漿(62.5μL)加入到500μL血清中，并于4℃溫育1小時(shí)。離心后，將400μL上清液加入到200μL抗TTR抗體綴合的Sepharose的1∶1凝膠/TSA漿中，于4℃緩慢搖動(dòng)20分鐘。離心后，于4℃用1mL TSA/0.05％皂苷(Fisher Scientific)洗滌凝膠(兩次，各10分鐘)，再用1mL TSA洗滌(一次，10分鐘)。然后加入155μL的100mM三乙胺水溶液(pH11.5)，以將TTR和結(jié)合的二氟尼柳從抗體上洗脫下來。于4℃溫和搖動(dòng)30分鐘后，離心樣品，取出145μL上清液。分離出135-μL注射樣品，并如先前所述進(jìn)行分析(Purkey等，Proc Natl Acad Sci USA2001；985566-71)。
評(píng)價(jià)血清TTR四聚體對(duì)尿素變性的穩(wěn)定性。10μL血清樣品在90μL含各種濃度尿素的50mM磷酸緩沖液(pH 7.0；100mM KCl、1mM EDTA、1mM DTT)中溫育(25℃)。用折射率檢查尿素濃度，以確認(rèn)按據(jù)重量制備的濃度。通過加入10μL戊二醛(25％)實(shí)現(xiàn)蛋白的戊二醛交聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行4分鐘，然后加入10μL NaBH4(7％的0.1M NaOH溶液)猝滅。將樣品與120μL SDS還原性凝膠上樣混合物(SDS終濃度＝2.5％)混合，并煮沸5分鐘。使用12％SDS-PAGE分離樣品，使用抗-TTR抗血清通過免疫印跡分析凝膠(Purkey等，同上)。
評(píng)價(jià)血清TTR四聚體對(duì)酸變性的穩(wěn)定性。10μL血清樣品與90μL的100mM酸性緩沖液溫育(37℃)。當(dāng)最終pH要求≤3.8時(shí)使用檸檬酸緩沖液；評(píng)價(jià)時(shí)的pH范圍為4.2-5.4時(shí)使用乙酸緩沖液。交聯(lián)后，如上所述通過SDS-PAGE和免疫印跡分析樣品。
用含TTR和氨芐青霉素抗性基因的pmmHα質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21/DE3Epicurian gold大腸桿菌(Stratagene)，以該菌株表達(dá)重組野生型TTR和變異體。如前所述(Lashuel等，Biochemistry 1999；3813560-73)進(jìn)行表達(dá)和純化。
用圓二色性光譜法檢測(cè)TTR四聚體的解離速率。使用重組TTR(3.6μM)樣品的6.5M尿素溶液進(jìn)行四聚體解離速率的評(píng)價(jià)，6.5M尿素濃度是位于三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的過渡后區(qū)間中的濃度(Hammarstr_m等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002；9916427-32)。通過與快速的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)聯(lián)，檢測(cè)隨時(shí)間變化的TTR遠(yuǎn)紫外CD光譜(210-220nm)，由此評(píng)測(cè)緩慢的四聚體解離速率。
如下進(jìn)行纖維形成測(cè)定。用100mM酸性緩沖液以1∶1稀釋重組TTR原液(7.2μM)。當(dāng)最終pH要求≤3.8時(shí)使用檸檬酸緩沖液；評(píng)價(jià)時(shí)的pH范圍為4.2-6.0時(shí)使用乙酸緩沖液，pH 6.5時(shí)評(píng)價(jià)淀粉樣變性使用磷酸緩沖液。樣品在酸化后不攪拌于37℃溫育72小時(shí)。通過于400nm檢測(cè)濁度探測(cè)纖維形成的程度。
如下檢測(cè)纖維形成動(dòng)力學(xué)。將重組TTR溶液(7.2μM)與等體積的100mM乙酸緩沖液混合，獲得的最終pH為4.4。樣品于37℃溫育，監(jiān)測(cè)168小時(shí)時(shí)程內(nèi)的400nm濁度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)備單獨(dú)的樣品。
通過將二氟尼柳加入到溫育3小時(shí)(37℃)的TTR溶液中，然后使蛋白經(jīng)受尿素變性或pH介導(dǎo)的淀粉樣蛋白變性，以此評(píng)價(jià)二氟尼柳對(duì)尿素介導(dǎo)的四聚體解離和pH介導(dǎo)的纖維形成的作用。
結(jié)果通過HPLC檢測(cè)攝入第13劑后4和12小時(shí)的平均血清二氟尼柳濃度，125mg每天兩次的組別為20.1±7.1和6.9±3.0μM，250mg每天兩次的組別為233.5±76.0和145.8±38.9μM，而500mg每天兩次的組別為517.0±79.5和421.9±78.1μM。99％以上的二氟尼柳是蛋白結(jié)合的。250mg每天兩次和500mg每天兩次的組別觀測(cè)到的這些濃度比血清中的TTR濃度高很多(3.6-7.2μM)，如果與競(jìng)爭(zhēng)性蛋白(如對(duì)小分子具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的TBG(0.3-0.5μM和/或白蛋白(580-725μM)的結(jié)合不是高親和性的，則產(chǎn)生的二氟尼柳化學(xué)計(jì)量接近最大值2。
為觀察最大動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，二氟尼柳優(yōu)選以至少1、理想值2的化學(xué)計(jì)量在血液中結(jié)合四聚體TTR。為確定每個(gè)受試者二氟尼柳化學(xué)計(jì)量的下限，我們?nèi)缜八?Purkey等，同上)用含有結(jié)合至固相樹脂的多克隆抗體的血清中免疫沉淀甲狀腺素運(yùn)載蛋白。洗滌固定化TTR3次，以消除非特異性結(jié)合，由樹脂解離TTR-二氟尼柳復(fù)合物，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線以HPLC測(cè)定二氟尼柳化學(xué)計(jì)量。在攝取后4和12小時(shí)在血清中二氟尼柳結(jié)合TTR的化學(xué)計(jì)量在125mg每天兩次的組別為0.45±0.11和0.31±0.12，250mg每天兩次的組別為1.12±0.08和0.95±0.13，而500mg每天兩次的組別為1.51±0.09和1.48±0.08。二氟尼柳化學(xué)計(jì)量隨其血清濃度(最高約300μM)增加。這比預(yù)期的300μM血清濃度時(shí)的最大化學(xué)計(jì)量1.5低，原因是方法局限(洗滌相關(guān)的損失)和/或二氟尼柳與其它血漿蛋白結(jié)合，因此我們用重組TTR進(jìn)行二氟尼柳結(jié)合化學(xué)計(jì)量研究。洗滌相關(guān)損失解釋了最大結(jié)合化學(xué)計(jì)量1.5主要源自低親和性位點(diǎn)的解離。二氟尼柳負(fù)協(xié)同結(jié)合TTR，因此低親和性位點(diǎn)的解離明顯更快。根據(jù)由等溫滴定量熱法測(cè)定的解離常數(shù)(Kd1，75nm；Kd2，1.1μM)計(jì)算緩沖液中預(yù)期的結(jié)合化學(xué)計(jì)量。將計(jì)算的和實(shí)驗(yàn)測(cè)定的化學(xué)計(jì)量共同繪圖，后者由免疫沉淀(3次洗滌)和HPLC分析產(chǎn)生，圖形使人們估測(cè)到250mg每天兩次組別的真實(shí)化學(xué)計(jì)量為1.75-1.91，提示可以使用該劑量。
對(duì)比受試者中(0.8-1)與重組TTR(1.5)的二氟尼柳(100μM)結(jié)合化學(xué)計(jì)量，結(jié)果揭示明顯結(jié)合TTR以外的血清蛋白，這提供了開發(fā)更選擇性結(jié)合TTR的二氟尼柳類似物的動(dòng)機(jī)。所有組別給予二氟尼柳后，TTR的血清水平都增加，總T4和RBP的血清水平下降。這些發(fā)現(xiàn)提示二氟尼柳影響TTR代謝。在研究中或研究后沒有觀察到明顯的副作用。但是，500mg每天兩次組別的白蛋白血清水平顯著下降，BUN和肌酸酐水平略微增加。在250mg每天兩次的組別中，白蛋白的血清水平中度下降，BUN水平略微增加。
開發(fā)一種新方法來證明口服給予的二氟尼柳穩(wěn)定血清TTR抗變性壓力，包括淀粉樣蛋白變性。該方法可用作替代指標(biāo)以鑒別應(yīng)當(dāng)預(yù)防TTR錯(cuò)折疊疾病的化合物。通過加入尿素(0-9M)或加入酸(pH3.8-5.4)使受試者全血清經(jīng)受變性。因?yàn)門TR必須解離才能變性，所以可使用四級(jí)結(jié)構(gòu)變化來監(jiān)測(cè)解折疊程度(Hammarstr_m等，同上)。血清經(jīng)受變性壓力后加入戊二醛交聯(lián)血清中的所有蛋白，以確定何種TTR組分正常折疊(四聚體或二聚體)和變性(單體)。全血清SDS-PAGE將交聯(lián)的TTR四聚體和二聚體(這些表示折疊的TTR)和單體分離開。免疫印跡能定量比較折疊TTR的量。多克隆抗體幾乎不結(jié)合解折疊的TTR單體以及折疊的TTR，因此其對(duì)比較有和沒有二氟尼柳時(shí)四聚體和二聚體條帶的強(qiáng)度最有用。還可以通過該方法評(píng)價(jià)二氟尼柳抑制TTR變性的時(shí)間相關(guān)性。在二氟尼柳存在時(shí)幾乎不能看出該過程的時(shí)間相關(guān)性，這強(qiáng)有力地支持了二氟尼柳穩(wěn)定基態(tài)使四聚體解離屏障無法逾越的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定機(jī)制(參見實(shí)施例1)。預(yù)計(jì)這些變性時(shí)程中的二氟尼柳效力(250mg每天兩次)比檢測(cè)的化學(xué)計(jì)量(0.8-1.2)更好，這提供了進(jìn)一步的證據(jù)證明免疫沉淀法低估了實(shí)際的結(jié)合化學(xué)計(jì)量，尤其當(dāng)其超過1時(shí)。
已知人體中二氟尼柳結(jié)合化學(xué)計(jì)量的范圍和在試管中模擬這些化學(xué)計(jì)量所需的二氟尼柳濃度，這使得可以進(jìn)行相關(guān)的體外生物物理學(xué)研究，以探測(cè)TTR·二氟尼柳和TTR·二氟尼柳2復(fù)合物防止解離和淀粉樣變性的機(jī)制。經(jīng)研究，尿素介導(dǎo)(6.5M)的解離速率和酸介導(dǎo)(pH 4.4)的淀粉樣蛋白纖維形成速率隨二氟尼柳濃度(5、10、20和60μM)變化，表現(xiàn)為劑量依賴性減慢。因?yàn)樗木垠w解離是淀粉樣蛋白纖維形成的限速步驟，因而推斷尿素中的四聚體解離速率應(yīng)當(dāng)可以預(yù)示由酸化介導(dǎo)的淀粉樣蛋白纖維形成的程度。二氟尼柳抑制淀粉樣變性比抑制尿素介導(dǎo)的解離更佳，因?yàn)榈矸蹣幼冃砸残枰獫舛纫蕾囆栽俳M裝。與二氟尼柳結(jié)合TTR相關(guān)的Kd1和Kd2在酸中也有可能比在尿素中低。
80多種TTR突變體通過變性能量地形面的序列依賴性改變使個(gè)體傾向于遺傳性淀粉樣變性。其中，V122I淀粉樣蛋白沉積導(dǎo)致3-4％的非洲裔美國人患家族性淀粉樣心肌病(FAC)，而V30M是家族性淀粉樣多神經(jīng)病(FAP)的主要突變。二氟尼柳以劑量依賴方式同時(shí)抑制V122I和V30M淀粉樣變性的發(fā)生，證明該方法具通用性。
高度需要開發(fā)一種通用的、非侵入性的、改善TTR淀粉樣變性的治療策略。本文概述的結(jié)果表明，口服給予二氟尼柳可通過結(jié)合和穩(wěn)定非促淀粉樣變性天然狀態(tài)減慢四聚體解離。根據(jù)最近的錯(cuò)折疊寡聚物而不是淀粉樣蛋白纖維化引起神經(jīng)變性的報(bào)告，天然狀態(tài)穩(wěn)定是特別吸引人的策略。二氟尼柳(250-500mg每天兩次)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用證明了其長(zhǎng)期使用的低毒性。TTR血清半衰期為12-15小時(shí)，因此每天兩次給藥似乎對(duì)已知的二氟尼柳半衰期8-10小時(shí)最佳。二氟尼柳對(duì)抗SSA、FAC和FAP應(yīng)當(dāng)有效，因?yàn)槠渫瑫r(shí)結(jié)合野生型和變異體TTR，達(dá)到動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，類似于使TTR四聚體包含反式抑制亞單位而不是由疾病相關(guān)亞單位組成所使用的、已知改善人類疾病的機(jī)制。二氟尼柳由于其不能通過血腦屏障而可能對(duì)CNS淀粉樣變性無效，盡管二氟尼柳類似物(例如本文描述的類似物)可能具有這種能力。
實(shí)施例4羥化多氯化聯(lián)苯選擇性結(jié)合血液中的甲狀腺素運(yùn)載蛋白并抑制淀粉樣變性已知氯化聯(lián)苯(PCB)是持久的環(huán)境污染物，據(jù)報(bào)道對(duì)嚙齒類動(dòng)物有毒，并可能對(duì)人有毒。這些化合物在環(huán)境中的長(zhǎng)期存在是由于其緩慢降解和高親油性，隨著它們?cè)谑澄镦溨猩弦贫谏矬w內(nèi)累積和濃縮。羥化PCB(OH-PCB)是P450單加氧酶氧化PCB形成的代謝物。難以發(fā)現(xiàn)單種PCB化合物對(duì)人毒性的權(quán)威性數(shù)據(jù)，因?yàn)槭聦?shí)上市售PCB一般是含許多不同異構(gòu)體以及痕量已知毒素(例如氯化二苯并呋喃)的混合物。但是，已經(jīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證實(shí)了幾種純化PCB的毒性。除了OH-PCB的雌激素樣作用之外，骨質(zhì)疏松、免疫毒性、神經(jīng)毒性和甲狀腺激素水平低也與這些化合物的給予有關(guān)。
眾多研究證實(shí)PCB和OH-PCB體外結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)。已經(jīng)表明，TTR在人血液中是蛋白靶，有助于OH-PCB在接觸個(gè)體中的存留。盡管眾多的報(bào)告提示TTR在體內(nèi)為PCB結(jié)合蛋白，但沒有確切證據(jù)表明PCB在血漿中結(jié)合甲狀腺素運(yùn)載蛋白。我們開發(fā)的免疫沉淀法可用于評(píng)估生物體液中小分子與TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量的下限。本文評(píng)價(jià)PCB和OH-PCB與人血漿TTR的TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量。
需要限速四聚體解離、單體錯(cuò)折疊和錯(cuò)組裝的血漿TTR分泌后淀粉樣變性導(dǎo)致老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性、家族性淀粉樣心肌病和家族性淀粉樣多神經(jīng)病。本文證實(shí)幾種OH-PCB選擇性結(jié)合人血漿中的TTR，并通過導(dǎo)致天然狀態(tài)部分或全部動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的四聚體穩(wěn)定化抑制淀粉樣蛋白纖維形成。用X-射線晶體學(xué)鑒定了4種TTR·(OH-PCB)2復(fù)合物，以更好地理解結(jié)合的分子基礎(chǔ)，并提供最佳TTR淀粉樣變性抑制劑的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。
PCB和OH-PCB對(duì)人血漿中甲狀腺素運(yùn)載蛋白的結(jié)合選擇性評(píng)價(jià)8種PCB(化合物1-8，圖5)和14種OH-PCB(化合物9-22，圖6)的結(jié)合選擇性，據(jù)報(bào)道這8種PCB從TTR上替換甲狀腺激素，IC50低于50nM，而這14種OH-PCB據(jù)報(bào)道是在小鼠或大鼠中結(jié)合TTR或降低甲狀腺素水平的已知PCB代謝物。使用共價(jià)連接至瓊脂糖樹脂的多克隆TTR抗體，將其與用PCB或OH-PCB(10.8μM)預(yù)處理的人血漿混合，以此確定血漿中PCB與TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量的下限。洗滌后，通過反相HPLC評(píng)價(jià)PCB或OH-PCB與TTR(≈5μM)的結(jié)合化學(xué)計(jì)量。
TTR四聚體中的兩個(gè)相同甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)最多可結(jié)合兩個(gè)PCB。除了PCB 1和3之外，剩余的非羥化PCB顯示出相對(duì)較低的血漿TTR結(jié)合選擇性(表4)。相反，OH-PCB顯示出良好至極好的血漿TTR結(jié)合選擇性(表5)。某些羥化PCB(例如16和22)的結(jié)合化學(xué)計(jì)量接近2。全血中OH-PCB的結(jié)合選擇性非常類似于血漿中觀測(cè)到的結(jié)果，因此紅細(xì)胞膜沒有明顯隔離所研究的OH-PCB。
表4人血漿中PCB與TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量
表5人血漿中羥化PCB與TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量
抗體捕獲TTR·PCB復(fù)合物可能由于5次洗滌步驟中PCB與TTR的解離而低估了PCB的結(jié)合化學(xué)計(jì)量。PCB和OH-PCB(10.8μM)與重組TTR(3.6μM)溫育，以評(píng)價(jià)每次洗滌步驟后小分子結(jié)合固定化TTR的化學(xué)計(jì)量。5次洗滌后PCB 2和OH-PCB 18降低化學(xué)計(jì)量達(dá)10-17％，而PCB 4降低達(dá)45％。洗滌相關(guān)損失定量使人們可以估測(cè)血漿中PCB和OH-PCB的真實(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量。此外，OH-PCB結(jié)合重組TTR的最終化學(xué)計(jì)量和血漿中結(jié)合TTR的量之間的良好關(guān)聯(lián)表明，OH-PCB 18之類的化合物在血漿中是高度選擇性的TTR結(jié)合劑。相反，PCB 2和4在緩沖液中比在血漿中具有更高的TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量，這強(qiáng)有力地表明它們?cè)谘獫{中結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)蛋白以及TTR。
羥化PCB抑制TTR淀粉樣蛋白纖維化評(píng)價(jià)OH-PCB和PCB 3體外抑制TTR纖維形成的能力，因?yàn)檫@些化合物在血液中具有良好的TTR結(jié)合選擇性。由肝臟分泌入血液中的TTR似乎是全身TTR淀粉樣蛋白的來源。盡管還不清楚人體中的淀粉樣蛋白在哪里或如何形成，但酸是細(xì)胞中的典型變性劑，其將幾乎所有的淀粉樣變性肽和蛋白有效轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸蹣拥鞍缀?或相關(guān)的聚集物。因此，以濁度監(jiān)測(cè)酸介導(dǎo)(pH 4.4)的纖維形成，用此來監(jiān)測(cè)PCB作為抑制劑的有效性。羥化PCB和PCB 3是高度有效的TTR纖維化抑制劑。在抑制劑濃度等于野生型TTR濃度(3.6μM)時(shí)，在72小時(shí)誘導(dǎo)期后只觀察到正常量12-50％的纖維形成。此活性等于迄今為止發(fā)現(xiàn)的最佳纖維化抑制劑(例如氟芬那酸(Flu)，將其作為陽性對(duì)照納入)所表現(xiàn)的活性。
OH-PCB 18與TTR的結(jié)合先前的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)提示，OH-PCB 18對(duì)TTR的兩個(gè)C2相關(guān)的甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)具有正協(xié)同結(jié)合性。當(dāng)將亞化學(xué)計(jì)量(＜1∶1)的18加入至TTR中時(shí)，質(zhì)譜中觀察到的主要組分是脫輔基-TTR和TTR·182復(fù)合物，這與正協(xié)同結(jié)合性一致。18的TTR結(jié)合特性與負(fù)協(xié)同結(jié)合的眾多其它TTR淀粉樣蛋白纖維形成抑制劑所具有的特性相反。在生理?xiàng)l件下進(jìn)行的等溫滴定量熱法研究揭示，OH-PCB 18與野生型TTR的結(jié)合與解離常數(shù)為相等Kd(3.2±1.8nM)的模型擬合得最好。該結(jié)果與正協(xié)同結(jié)合沒有沖突，因?yàn)榛跓崃酷尫挪怀浞值木壒嗜藗儾荒塬@得足夠低的TTR濃度來探測(cè)正協(xié)同性。嘗試將收集的數(shù)據(jù)與正或負(fù)協(xié)同結(jié)合模型進(jìn)行擬合，結(jié)果擬合得很差。
OH-PCB 12、16、17和18的共晶體結(jié)構(gòu)通過用10倍過量的抑制劑浸泡TTR晶體4周，獲得結(jié)合野生型TTR的OH-PCB 12、16、17和18晶體。然后解析每種復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)。晶體學(xué)不對(duì)稱單位中的TTR二聚體形成兩個(gè)配體結(jié)合袋的一半。因?yàn)閮蓚€(gè)結(jié)合位點(diǎn)由同一個(gè)二重對(duì)稱軸兩等分，所以通常觀察到所述抑制劑的兩種對(duì)稱等同結(jié)合模式。每個(gè)TTR結(jié)合位點(diǎn)可以再分為內(nèi)部和外部腔。這些腔包含三個(gè)所謂的鹵素結(jié)合袋(HBP)，因?yàn)樗鼈冇杉谞钕偎貎蓚€(gè)芳環(huán)上的碘占據(jù)。HBP 3和3′處于內(nèi)部結(jié)合腔的中心，HBP 2和2′確定了內(nèi)部和外部結(jié)合腔之間的邊界，而HBP 1和1′位于外部結(jié)合腔的外周附近。共晶體結(jié)構(gòu)揭示，連接OH-PCB兩個(gè)芳環(huán)的C-C鍵幾乎位于二重對(duì)稱軸中心，呈現(xiàn)單一結(jié)合構(gòu)象的表象。兩個(gè)苯環(huán)之間的二面角為12是59°，16和17都是37°，而18是44°。所有的OH-PCB都在內(nèi)部和外部結(jié)合袋中占據(jù)相似的位置。聯(lián)芳環(huán)體系的范德華補(bǔ)償促進(jìn)了某些內(nèi)部亞單位的相互作用，該作用涉及組成每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)亞單位中的殘基X、Y和Z以及另一個(gè)亞單位中的殘基n′、m′和o′。苯環(huán)上的某些取代基位于軸外，可在所觀測(cè)到的電子密度圖中的多個(gè)位置建模。
OH-PCB 18結(jié)合TTRTTR·182復(fù)合物的1.8_ X射線結(jié)構(gòu)證實(shí)，該抑制劑對(duì)TTR結(jié)合位點(diǎn)具有極好的立體互配。分子力學(xué)(Insight II，Accelrys)表明，18的未結(jié)合構(gòu)象接近于其結(jié)合結(jié)構(gòu)。精修結(jié)構(gòu)明確了有助于18的高親和性結(jié)合的直接和水介導(dǎo)的靜電作用。3-Cl、4-OH、5-Cl等價(jià)取代芳環(huán)的其中一個(gè)占據(jù)內(nèi)部結(jié)合袋，其氯取代基凸出到HBP 3和3′中。如由無偏差電子密度圖識(shí)別出的，Ser 117和Thr 119的側(cè)鏈通過圍繞著其Cα-Cβ鍵旋轉(zhuǎn)而采用互變構(gòu)象(alternative conformation)。如根據(jù)電子密度分布識(shí)別出的，Ser 117的側(cè)鏈采用全部三種旋轉(zhuǎn)體構(gòu)象。令人感興趣的是，兩個(gè)水分子位于二重軸上鄰近Ser 117殘基之間，占有率為50％，這有利于連接Ser 117殘基、鄰近水分子和18的苯酚官能團(tuán)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)結(jié)構(gòu)檢查還不清楚為什么18以非協(xié)同或正協(xié)同特性結(jié)合。其它等價(jià)取代環(huán)以其鹵素凸出到HBP 1和1′中而占據(jù)外部TTR結(jié)合袋。
結(jié)合TTR的化合物1616的3-Cl、4-OH、5-Cl三取代基苯酚環(huán)朝向TTR內(nèi)部結(jié)合袋，產(chǎn)生與上述TTR·182結(jié)構(gòu)中該環(huán)作用相同的與TTR的靜電和疏水作用。3，4-二氯芳環(huán)占據(jù)外部結(jié)合袋，鹵素根據(jù)所設(shè)想的對(duì)稱等價(jià)結(jié)合模式投向HBP-1或1′。16的電子密度與OH-PCB 18一樣是對(duì)稱的，因此根據(jù)電子密度圖不可能明確地定位對(duì)位OH和對(duì)位Cl。無偏差電子密度圖與Ser 117的三個(gè)旋轉(zhuǎn)體構(gòu)象一致，在Ser 117殘基之間含有兩個(gè)水分子，類似于TTR·182結(jié)構(gòu)。
結(jié)合TTR 的OH-PCB 17抑制劑17以其朝向內(nèi)部結(jié)合袋的3-Cl、4-OH、5-Cl取代芳環(huán)結(jié)合，使用的相互作用與上述TTR·162和TTR·182結(jié)構(gòu)中該環(huán)所用的相同。2，3，4-三氯化環(huán)利用與HBP-1、HBP-1′、HBP-2、HBP-2′的相互作用以兩種對(duì)稱等價(jià)結(jié)合模式占據(jù)外部結(jié)合袋。Ser 117和兩個(gè)保守水分子的多種構(gòu)象也表征了TTR·172結(jié)構(gòu)。由無偏差電子密度圖可清楚看出Thr 119側(cè)鏈的構(gòu)象改變。
結(jié)合TTR的化合物12聯(lián)芳化合物12的3-Cl、4-OH取代芳環(huán)位于外部結(jié)合袋，其兩個(gè)氯與HBP-1和1′相互作用。與苯酚位于內(nèi)部結(jié)合袋中的TTR·162和TTR·172結(jié)構(gòu)相反。羥基(可能為離子化形式)在Lys 15側(cè)鏈的氫鍵鍵合距離之內(nèi)。四氯化環(huán)位于內(nèi)部結(jié)合袋中，其中鹵素朝向HBP 2和2′以及3和3′。Ser 117和Thr 119側(cè)鏈采用的構(gòu)象與脫輔基-TTR結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象相同，與16、17和18的情況不同。
在本文先前報(bào)告的取代T4的IC50低于50nM的8種PCB中，只有1和3以可接受的化學(xué)計(jì)量在人血漿中結(jié)合TTR。相反，先前報(bào)告的結(jié)合TTR的全部14種OH-PCB在血漿中都表現(xiàn)出對(duì)TTR的顯著結(jié)合選擇性。這與OH-PCB主要在血漿中觀測(cè)到并似乎選擇性保留在血漿中的觀察結(jié)果一致，與在PCB通常累積在脂質(zhì)和其它組織中相反。OH-PCB還選擇性結(jié)合全血中的TTR，這與它們不能分配入脂膜的觀點(diǎn)一致。
使用重組野生型TTR評(píng)價(jià)洗滌步驟中由抗體·TTR·PCB復(fù)合物上洗去的PCB(或OH-PCB)的量。洗滌相關(guān)的PCB解離是分子特異性的。某些化合物在洗滌后具有高結(jié)合化學(xué)計(jì)量，這與顯著的初始結(jié)合和低洗滌相關(guān)損失一致，暗示解離速率慢。具有低結(jié)合化學(xué)計(jì)量的化合物屬于至少兩個(gè)類別高初始結(jié)合化學(xué)計(jì)量以及顯著的洗滌相關(guān)損失，或低初始結(jié)合化學(xué)計(jì)量及不顯著的洗滌相關(guān)損失，后種情況適用于與TTR高親和性結(jié)合但與另一種血漿蛋白以更高親和性結(jié)合的化合物。PCB 2和4都與重組TTR表現(xiàn)出低洗滌后結(jié)合化學(xué)計(jì)量。PCB 4由于洗滌損失45％，而PCB 2僅具有很低的初始結(jié)合化學(xué)計(jì)量以及最小的洗滌相關(guān)損失(10％)。洗滌后的選擇性值反映出血漿中PCB初始結(jié)合量的下限。類似于具有高洗滌后結(jié)合化學(xué)計(jì)量特征的PCB 18的化合物，一定具有高結(jié)合親和性和選擇性，與觀測(cè)到的低解離速率一致。
除了對(duì)血漿TTR具有高結(jié)合選擇性之外，OH-PCB和PCB 3還在體外表現(xiàn)出極佳的TTR纖維形成抑制性。在等摩爾抑制劑和TTR濃度(3.6μM)時(shí)抑制劑14、15和18的效力是迄今觀測(cè)到的最高效力之一。這有可能有助于其高結(jié)合親和性(也與其低解離速率一致)及其不常見的非協(xié)同或正協(xié)同TTR結(jié)合特性。最好的抑制劑OH-PCB 18具有nM Kd，表明以＞3kcal/mol穩(wěn)定天然狀態(tài)的TTR?；鶓B(tài)穩(wěn)定顯著提高了四聚體解離屏障(TTR淀粉樣變性的限速步驟)，以至于四聚體不能以生物相關(guān)時(shí)標(biāo)解離。四聚體解離在6M尿素中急劇減慢和在pH 4.4時(shí)緩慢淀粉樣變性，這證實(shí)了由18與基態(tài)結(jié)合介導(dǎo)的天然非淀粉樣變性狀態(tài)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。據(jù)信OH-PCB 18(3.6μM)是另人印象深刻的淀粉樣蛋白抑制劑，因?yàn)槠涫菢O佳的四聚體TTR動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定劑，即因?yàn)門TR·18和TTR·182不能形成淀粉樣蛋白，所以其在pH 4.4時(shí)防止2/3的3.6μM TTR樣品淀粉樣變性，TTR殘余物(1.18μM)由于其低濃度而無法形成淀粉樣蛋白。最好的OH-PCB抑制劑的解離速率也可能比預(yù)期低，因?yàn)镺H-PCB周圍的TTR結(jié)構(gòu)退火，但對(duì)此還沒有和需要的一樣仔細(xì)評(píng)價(jià)。這些化合物至少提供了特殊抑制劑的合成指引，或者依其毒性情況證明其自身可用作抑制劑。
TTR結(jié)合OH-PCB 12、16、17和18的結(jié)構(gòu)信息揭示，這些聯(lián)苯化合物一般沿著晶體學(xué)二重對(duì)稱軸結(jié)合。兩個(gè)環(huán)之間的二面角在約40-60°的范圍內(nèi)，使兩個(gè)相鄰亞單位上的鹵素結(jié)合袋(HBP)能同時(shí)占據(jù)，導(dǎo)致四聚體四級(jí)結(jié)構(gòu)界面穩(wěn)定化。羥化PCB 18具有最佳的TTR結(jié)構(gòu)互配性，因?yàn)槠渎饶軌蛲瑫r(shí)結(jié)合HBP 1和1′以及3和3′。16和17的情況不是這樣，它們需要考慮兩種對(duì)稱等價(jià)結(jié)合模式，以便將氯延伸入HBP 1、1′、3和3′。
苯酚環(huán)朝向內(nèi)部結(jié)合袋似乎起重要作用，因?yàn)槠淠茉谄渑c鄰近的TTR亞單位之間形成水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，推測(cè)這可以進(jìn)一步穩(wěn)定TTR的天然四級(jí)結(jié)構(gòu)。氫鍵網(wǎng)絡(luò)涉及Ser-117、抑制劑的苯酚基團(tuán)和兩個(gè)保守水分子的三種交叉構(gòu)象，產(chǎn)生內(nèi)部連接兩個(gè)亞單位、形成PCB結(jié)合位點(diǎn)的靜電網(wǎng)絡(luò)。在全部三種結(jié)構(gòu)中，Thr 119還占據(jù)多個(gè)旋轉(zhuǎn)體構(gòu)象。相反，該靜電作用網(wǎng)絡(luò)在122·TTR復(fù)合物中不存在，在該復(fù)合物中羥基取代苯環(huán)朝向外部結(jié)合袋，其中Ser 117和Thr 119采用脫輔基側(cè)鏈構(gòu)象。
OH-PCB的毒性在文獻(xiàn)中未完全證實(shí)。在各種體外和動(dòng)物研究中，OH-PCB似乎是輕微雌激素作用或抗雌激素作用。已經(jīng)闡明了其它的毒性機(jī)制，還報(bào)告在接觸這些化合物時(shí)動(dòng)物甲狀腺激素水平降低。OH-PCB結(jié)合TTR降低T4水平以及T4水平降低反映小分子TTR結(jié)合的觀點(diǎn)難以得到直接支持。因?yàn)榇蠹s一半的T4由白蛋白運(yùn)載，所以取代白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的T4似乎更可能是接觸PCB個(gè)體T4水平降低的原因。甲狀腺結(jié)合球蛋白對(duì)甲狀腺素的親和性最高，是人體中的主要載體，但其在許多低等動(dòng)物中不存在，包括研究這些化合物的多種毒理學(xué)性質(zhì)的大鼠和小鼠。因此，在這些物種中，更有可能是結(jié)合TTR的化合物對(duì)T4的整體結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)有影響。顯示PCB與TBG結(jié)合的數(shù)據(jù)表明它們基本沒有相互作用，只有一個(gè)或兩個(gè)微弱結(jié)合的化合物是例外。因此，OH-PCB對(duì)人甲狀腺素水平的影響應(yīng)當(dāng)是最小的，除非它們結(jié)合白蛋白。還報(bào)告了這些化合物可能干擾甲狀腺激素活化或增加T4硫酸化速率，因此使T4失活。OH-PCB還可以結(jié)合其它甲狀腺激素靶，包括甲狀腺激素受體，如果有T4類似結(jié)構(gòu)的話這似乎是有可能的。
很明顯，關(guān)于羥化PCB毒性，尤其是在人體中的毒性，基本沒有得到證實(shí)。預(yù)期對(duì)嚙齒類動(dòng)物的毒性更嚴(yán)重，因?yàn)門TR主要起甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用。清楚的是，羥化PCB作為甲狀腺素運(yùn)載蛋白纖維形成抑制劑具有極佳活性，提示此類化合物有潛力用于抑制淀粉樣蛋白纖維形成。
材料和方法甲狀腺素運(yùn)載蛋白抗體純化和與瓊脂糖的綴合生產(chǎn)、純化抗體，并將其偶聯(lián)至瓊脂糖。樹脂儲(chǔ)存為1∶1 TSA漿(10mM Tris、pH 8.0/140mM NaCl/0.025％NaN3)中。另外，通過用200mM Tris、pH 8.0代替抗體與樹脂偶聯(lián)制備猝滅瓊脂糖。
人血漿制備按照Scripps綜合臨床研究中心的標(biāo)準(zhǔn)取血程序從健康志愿者采集全血，并轉(zhuǎn)移至50mL圓錐管中。用配有甩平轉(zhuǎn)子的Sorvall RT7臺(tái)式離心機(jī)于25℃對(duì)該管以3000RPM(1730×g)離心10分鐘。取出血漿上清液，再以3000RPM離心10分鐘，去除殘余的細(xì)胞。加入疊氮化鈉，獲得0.05％溶液。將血漿儲(chǔ)存在4℃，直至使用。
免疫沉淀甲狀腺素載蛋白和結(jié)合的PCB在評(píng)測(cè)時(shí)，將1.5mL人血漿和7.5μL PCB的2.16mM DMSO溶液注入2mL eppendorf管。將該溶液于37℃溫育24小時(shí)。將猝滅瓊脂糖的1∶1樹脂/TSA漿(187μL)加入到溶液中，并于4℃溫和震蕩1小時(shí)。離心溶液(16,000×g)，將上清液分為各400μL的3等份。向其中各加入200μL抗甲狀腺素運(yùn)載蛋白抗體綴合的瓊脂糖的1∶1樹脂/TSA漿，并于4℃緩慢震蕩20分鐘。離心樣品(16,000×g)，去除上清液。用1mL TSA/0.05％皂苷(Acros)于4℃洗滌樹脂(3×10分鐘)，再用1mL TSA于4℃洗滌(2×10分鐘)。離心樣品(16,000×g)，去除最終的洗滌液，加入155μL 100mM甲狀腺素運(yùn)載蛋白(pH 11.5)，從抗體上洗脫TTR和結(jié)合的小分子。于4℃溫和震蕩30分鐘，離心樣品(16,000×g)，取出145μL含TTR和抑制劑的上清液。
HPLC分析和甲狀腺素運(yùn)載蛋白與結(jié)合PCB的定量將TTR抗體珠的上清液洗脫樣品(145μL)加至Waters 71P自動(dòng)取樣器。在8分鐘內(nèi)使用40-100％B梯度(A94.8％H2O/5％乙腈/0.2％TFA；B94.8％乙腈/5％H2O/0.2％TFA)，采用Waters 600E多元溶劑傳遞系統(tǒng)控制，經(jīng)Keystone 3厘米C18反相柱分離135μL注入的各個(gè)樣品。在280nm用Waters 486可調(diào)吸光度檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)峰積分，得到TTR和小分子二者的面積。為了測(cè)定各種組分的量，將已知量的四聚體TTR或PCB注入HPLC。對(duì)峰積分，使用Kaleidagraph(Synergy Software)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到校準(zhǔn)曲線。使用校準(zhǔn)曲線測(cè)定血漿樣品中存在的各種組分的摩爾數(shù)。計(jì)算小分子對(duì)蛋白的比率，獲得小分子在血漿中結(jié)合TTR的化學(xué)計(jì)量。
甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣蛋白纖維形成測(cè)定以720μM濃度將化合物溶解在DMSO中。將5μL待評(píng)測(cè)化合物溶液加入0.5mL 7.2μM TTR的10mM磷酸鹽(pH 7.6)、100mMKCl、1mM EDTA緩沖溶液中，使化合物與TTR溫育30分鐘。加入495μL的0.2mM乙酸鹽(pH4.2)、100mM KCl、1mM EDTA，獲得的最終蛋白和抑制劑濃度各為3.6μM，pH 4.4。然后將混合物于37℃溫育72小時(shí)，此后渦旋試管3秒，檢測(cè)400nm的光密度。將無抑制劑TTR的光密度定義為100％纖維形成，通過對(duì)每個(gè)光密度歸一化，測(cè)定纖維形成程度。還測(cè)試了沒有TTR時(shí)各個(gè)化合物的對(duì)照溶液，在400nm沒有明顯吸收。
PCB 18和TTR的等溫滴定量熱使用Microcal MCS等溫滴定量熱儀(Microcal，Northampton，MA)，將25μM化合物18的溶液(10mM磷酸鹽pH 7.6、100mM KCl、1mM EDTA、8％DMSO溶液)滴定入1.2μM TTR的相同緩沖溶液中。最初注入2μL，接著于25℃注入10μL共25次。對(duì)等溫線積分，扣除本底獲得結(jié)合等溫線，使用ORIGIN 5.0(Microcal)的ITC數(shù)據(jù)分析包其與兩個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)的模型擬合得最好。
結(jié)晶和X-射線數(shù)據(jù)收集在懸滴實(shí)驗(yàn)中，由對(duì)2M硫酸銨平衡的5mg/ml蛋白溶液(100mMKCl、100mM磷酸鹽pH 7.4、1mM硫酸銨)獲得重組TTR晶體。將晶體用10倍摩爾過量的配體浸泡2周，以確保兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都完全飽和，由此制備TTR·配體復(fù)合物。使用1∶1的丙酮∶水溶液作為浸泡劑。聯(lián)合使用DIP2030b成像板系統(tǒng)(MAC Science，Yokohama，Japan)和RU200旋轉(zhuǎn)陽極X-射線發(fā)生器進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。將晶體置于冷凍保護(hù)劑Paratone油中，冷卻至120K進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)。所有TTR·配體復(fù)合物的晶體都和脫輔基晶型是同晶型，晶胞大小為a＝43_、b＝86_和c＝65_。它們屬于空間群P21212，在不對(duì)稱單位中包含一半的同源四聚體。用DENZO和SCALEPACK簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)。
結(jié)構(gòu)測(cè)定和精修使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的TTR蛋白原子坐標(biāo)(登錄號(hào)1BMZ)作為初始模型，使用程序CNS通過分子動(dòng)力學(xué)和能量最小化精修天然TTR和TTR-配體復(fù)合物。對(duì)用PCB浸泡或同時(shí)共結(jié)晶的TTR晶體收集衍射數(shù)據(jù)，由此計(jì)算圖譜。對(duì)于TTR與PCB的復(fù)合物，獲得的圖揭示了配體在TTR四聚體的兩個(gè)結(jié)合袋中的大概位置，峰高在5-9r.m.s以上。為進(jìn)一步提高小分子電子密度和去除模型偏差，對(duì)模型實(shí)施數(shù)輪扭曲/振動(dòng)方案，這在圖中導(dǎo)致了顯著改善，尤其是在抑制劑周圍。隨后使用這些圖進(jìn)行模型擬合，確定了配體分子在密度圖中的位置。在全部三種情況中，由程序InsightII(Accelrys)計(jì)算的抑制劑最小能量構(gòu)象與圖譜非常一致。因?yàn)槎鼐w對(duì)稱軸在結(jié)合通道旁，所以必須應(yīng)用統(tǒng)計(jì)無序模型，為四聚體TTR兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的每一個(gè)產(chǎn)生兩種配體結(jié)合模式。根據(jù)無偏差電子密度圖置入水分子。因?yàn)樵谧罱K圖譜中沒有可解釋的電子密度，所以9個(gè)N-末端殘基和3個(gè)C-末端殘基沒有包括在最終模型中。
實(shí)施例5甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣蛋白纖維化抑制劑苯并噁唑甲狀腺素運(yùn)載蛋白的兩個(gè)甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)由其四級(jí)結(jié)構(gòu)界面產(chǎn)生。小分子結(jié)合這些位點(diǎn)可以穩(wěn)定四聚體，潛在地提供了用小分子藥物治療TTR淀粉樣蛋白病變的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多化合物家族，其結(jié)合將四聚體基態(tài)穩(wěn)定至與小分子解離常數(shù)Kd1和Kd2成比例的程度。這也有效增加了解離活性屏障，并通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定化抑制淀粉樣變性。這樣的抑制劑通常由兩個(gè)芳環(huán)組成，一個(gè)環(huán)具有鹵素取代基，另一個(gè)環(huán)具有親水取代基。在C(4)-C(7)被羧酸取代并在C(2)被鹵化苯環(huán)取代的苯并噁唑似乎也匹配TTR甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)。因此，如流程1所示，通過對(duì)N-?；被?羥基苯甲酸脫氫環(huán)化，制備這些化合物的小型庫。
流程1苯并噁唑的通用合成方法試劑(a)ArCOCl，THF，吡啶(Ar＝苯基、3，5-二氟苯基、2，6-二氟苯基、3，5-二氯苯基、2，6-二氯苯基、2-(三氟甲基)苯基和3-(三氟甲基)苯基)；(b)TsOH·H2O，回流二甲苯；(c)TMSCHN2、苯、MeOH；(d)LiOH、THF、MeOH、H2O(4步的收率為8-27％)。
使用一系列嚴(yán)格性增加的分析評(píng)價(jià)苯并噁唑。將野生型TTR(3.6μM)與測(cè)試化合物(7.2μM)溫育30分鐘(pH 7、37℃)。因?yàn)橹辽僖粋€(gè)分子的測(cè)試化合物必須結(jié)合TTR四聚體的每個(gè)分子才能夠使其穩(wěn)定，所以測(cè)試化合物的濃度7.2μM僅僅是最小有效濃度的兩倍。然后將pH調(diào)節(jié)至纖維化的最佳pH值4.4。在測(cè)試化合物存在的情況下，通過400nm的濁度測(cè)定72小時(shí)后形成的淀粉樣蛋白量(37℃)，并表示為％纖維形成(ff)，100％是只有TTR時(shí)所形成的量。在所測(cè)試的28種化合物中，11種將纖維形成降低至可忽略不計(jì)的水平(ff＜10％；圖7)。
然后評(píng)價(jià)11種最有活性化合物在血液中相對(duì)于所有其它蛋白選擇性結(jié)合TTR的能力。將人血漿(TTR濃度3.6-5.4μM)與測(cè)試化合物(10.8μM)于37℃溫育24小時(shí)。使用結(jié)合多克隆TTR抗體的瓊脂糖免疫沉淀TTR和結(jié)合的任何抑制劑。以高pH由樹脂上釋放有或沒有抑制劑結(jié)合的TTR，通過HPLC分析確定抑制劑TTR的化學(xué)計(jì)量(圖8)。在5-或6-位具有羧酸和在2位具有2，6-二氯苯基(13、20)或2-三氟甲基苯基(11、18)取代基的苯并噁唑具有最高結(jié)合化學(xué)計(jì)量。特別是20具有極好的抑制劑活性和結(jié)合選擇性。因此，進(jìn)一步特征鑒定其作用機(jī)制。
為證實(shí)20通過強(qiáng)結(jié)合四聚體抑制TTR纖維形成，用野生型TTR進(jìn)行等溫滴定量熱法(ITC)和沉降速度實(shí)驗(yàn)。ITC顯示在生理?xiàng)l件下2當(dāng)量20結(jié)合的平均解離常數(shù)為Kd1＝Kd2＝55(±10)nm。這與許多其它高效TTR淀粉樣變性抑制劑的解離常數(shù)相當(dāng)。至于沉降速度實(shí)驗(yàn)，在最佳纖維化條件下(72小時(shí)、pH 4.4、37℃)將TTR(3.6μM)與20(3.6μM、7.2μM、36μM)溫育。四聚體(55kDa)是7.2或36μM 20的溶液中唯一可檢測(cè)到的組分。3.6μM 20形成某些大聚集物，但保留在溶液中的TTR是四聚體。
包含T119M亞單位和小分子結(jié)合都通過升高四聚體解離的活化屏障防止TTR淀粉樣蛋白纖維化。通過檢測(cè)抑制劑在嚴(yán)重變性壓力6M尿素中減慢四聚體解離的效力，最嚴(yán)格地測(cè)試其在升高四聚體解離活化屏障方面的能力。因此，對(duì)比有和沒有20、21或27的情況下6M尿素中TTR四聚體解離的速率(圖9)。在6M尿素中168小時(shí)后TTR(1.8μM)完全變性。相反，3.6μM 20至少在168小時(shí)內(nèi)防止四聚體解離(＞3×血漿中的TTR半衰期)。等摩爾量20時(shí)168小時(shí)內(nèi)僅有27％的TTR變性?；衔?7(3.6μM)即使在纖維形成測(cè)定中有活性也基本不能防止四聚體解離(168小時(shí)后90％解折疊)?；衔?1根本不能阻止TTR解離。這些結(jié)果顯示抑制劑結(jié)合TTR是必須的，但不足以在強(qiáng)變性條件下動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定TTR四聚體；解離常數(shù)較低(或解離速率較低)也很重要。此外，20的官能團(tuán)形態(tài)顯然對(duì)穩(wěn)定TTR四聚體最理想；將羧酸由C(6)移至C(7)(如27)或去除氯(如21)嚴(yán)重降低其活性。
由其與TTR的共晶體結(jié)構(gòu)可明顯看出20中取代基的作用(圖10)?；衔?0將其兩個(gè)氯原子朝向鹵素結(jié)合袋2和2′附近(如此稱呼是因?yàn)榧谞钕偎亟Y(jié)合TTR時(shí)它們由碘占據(jù))。苯環(huán)上的2，6取代模式迫使苯并噁唑和苯環(huán)不在一個(gè)平面，最好將羧酸定位于苯并噁唑上，以氫鍵鍵合Lys 15/15′的ε-NH3+基團(tuán)。20的芳環(huán)和Leu 17、Leu110、Ser 117和Val 121側(cè)鏈之間的疏水相互作用額外貢獻(xiàn)了結(jié)合能。
方法以下詳述苯并噁唑合成和產(chǎn)物鑒定(1H-和13C-NMR以及高分辨率質(zhì)譜)的通用方法。
分析性超速離心使用沉降速度分析性超速離心觀測(cè)20存在時(shí)TTR的四級(jí)結(jié)構(gòu)。將樣品與3.6、7.2或36μM的20溫育72小時(shí)。以溫控型Beckman XL-I分析性超速離心機(jī)(配有An60Ti轉(zhuǎn)子和光電掃描器)收集數(shù)據(jù)。使用注射器將400-420μL樣品上樣至配有12mm Epon中心杯和藍(lán)寶石窗的雙區(qū)池中。以連續(xù)方式于25℃、3000和5000rpm的轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速收集數(shù)據(jù)，使用平均每點(diǎn)1次掃描的0.005cm步長(zhǎng)。于280nm進(jìn)行檢測(cè)。使用Philo(Philo，2000；Stafford，1992)開發(fā)的程序DCDT+對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行時(shí)間導(dǎo)數(shù)分析。分析顯示溶液中組分的分布以s值范圍表示。然后將該分布擬合不同的模型，以便確定系統(tǒng)中組分的沉降和擴(kuò)散系數(shù)。以先前報(bào)道的方法(Petrassi等，2000)測(cè)定每種組分的分子量。測(cè)定的TTRs值顯示，在7.2和36μM的20存在時(shí)TTR保持為四聚體，而3.6μM時(shí)盡管形成了一些聚集物，但保留在溶液中的TTR仍為四聚體。
結(jié)晶和X-射線數(shù)據(jù)收集在懸滴實(shí)驗(yàn)中，由對(duì)2M硫酸銨平衡的12mg/ml蛋白溶液(100mM KCl、1mM EDTA、10mM磷酸鈉、pH 7.0、0.35mM硫酸銨)獲得野生型TTR晶體。將晶體用10倍摩爾過量的配體浸泡3周，以確保兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都完全飽和，由此制備TTR-20復(fù)合物。用14-BM-C，BIOCARS，Advanced Photon Source(Argonne National Laboratory)的單色高能源Quantum-4檢測(cè)器衍射配體浸泡晶體達(dá)1.55_。將晶體浸泡在Paratone油中，驟冷至100K進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)。TTR-20復(fù)合物的晶體和脫輔基晶型同晶型，晶胞大小為a＝43.1_、b＝84.7_和c＝64.7_，空間群為P21212，在不對(duì)稱單位中包含兩個(gè)TTR亞單位。用HKL2000程序組(Otwinowski，1997)的DENZO和SCALEPACK簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)。
結(jié)構(gòu)測(cè)定和精修使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的TTR蛋白原子坐標(biāo)(登錄號(hào)1BMZ)作為初始模型進(jìn)行分子置換檢索。使用CNS的分子動(dòng)力學(xué)和能量最小化方案對(duì)TTR-20復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修。獲得的差值Fourier圖揭示配體在TTR四聚體的兩個(gè)結(jié)合袋都結(jié)合。使用這些圖譜，可以明確地定位配體在密度圖中的位置，將其納入晶體學(xué)精修。由程序Insight II(Accelrys Inc.)計(jì)算的抑制劑最小能量構(gòu)象用作晶體學(xué)精修的初始模型。因?yàn)槎鼐w對(duì)稱軸在結(jié)合通道旁，所以必須應(yīng)用統(tǒng)計(jì)無序模型，為每個(gè)TTR結(jié)合袋生成兩種配體結(jié)合模式。經(jīng)過數(shù)輪模擬退火和隨后的位置和溫度因子精修后，定位水分子在差值Fourier圖中的位置。使用由振蕩n′扭曲偏差去除方案計(jì)算的無偏差加權(quán)電子密度圖進(jìn)行最后一輪圖形擬合。配體的對(duì)稱相關(guān)結(jié)合構(gòu)象與沒有抑制劑時(shí)定相的無偏差退火省略圖以及振蕩n′扭曲無偏差加權(quán)圖非常一致。因?yàn)樵谧罱K圖中沒有可解釋的電子密度，所以9個(gè)N-末端殘基和3個(gè)C-末端殘基沒有包括在最終模型中。表6提供了晶體學(xué)分析的概述。
表6X-射線晶體結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
苯并噁唑合成-通用方法除非另有說明，否則所有的反應(yīng)都使用FirstMate有機(jī)合成儀(Argonaut Technologies)在干氬氣氛下于烘干的玻璃器皿中進(jìn)行。所有的溶劑(水性)和試劑都購自Aldrich，使用時(shí)不用進(jìn)一步純化。用Bruker DRX-500光譜儀于500MHz或用Bruker DRX-600光譜儀于600MHz檢測(cè)1H NMR譜，并參照內(nèi)標(biāo)CHD2-S(O)-CD3(2.49ppm)。用Bruker DRX-500于125MHz或用Bruker DRX-600儀器于150MHz檢測(cè)13C譜，并參照(CD3)2SO(39.5ppm)。在玻璃襯底的薄層分析平板(Kieselgel 60 F254，0.25mm，EM Science第5715-7號(hào))上進(jìn)行薄層色譜分析。使用UV吸收或10％磷鉬酸乙醇溶液完成顯色。在離心薄層色譜(Harrison Research，7924T型，2mm平板)或制備型硅膠平板(Kieselgel 60 F254，1mm，EM Science第13895-7號(hào))上進(jìn)行色譜。
苯并噁唑合成的一般步驟用吡啶(500μl，0.6mmol)和所需酰氯(0.2mmol)依次處理氨基羥基苯甲酸(0.2mmol)的THF(3mL)混合物。于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物10小時(shí)，回流1小時(shí)，真空濃縮，不用純化就用于下一步。
向粗反應(yīng)混合物的二甲苯溶液(5mL)中加入對(duì)甲苯磺酸一水合物(380.4mg，2.0mmol)，獲得的混合物回流攪拌過夜。12小時(shí)后，冷卻反應(yīng)物至室溫，用NaOH(2mL，1N)猝滅反應(yīng)，分離各相。用HCl(1N)酸化水層至pH 2，用EtOAc(4×3mL)提取。合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。將得到的殘余物溶解在MeOH∶苯(2mL；1∶4)混合物中，用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)于25℃處理，以TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(通常于0.5小時(shí)后完成)。真空濃縮反應(yīng)混合物，殘余物進(jìn)行色譜(10-25％EtOH/己烷梯度)，獲得所需的苯并噁唑甲酯。
將苯并噁唑甲酯溶解在THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)中，用LiOH·H2O(4當(dāng)量)處理。于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物，用TLC監(jiān)測(cè)。一結(jié)束就用1N HCl將混合物酸化至pH 2，用EtOH(4×)提取。合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮。殘余物經(jīng)制備型薄層色譜(4.9％MeOH、95％CH2Cl2、0.1％HOAc)純化，獲得為白色固體的產(chǎn)物。
4-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(1)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的1(7.0mg，13％)。1的數(shù)據(jù)1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.70-12.50(br.s，1H，CO2H)，8.04(AMX，1H，J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.84(br.d，2H，J＝5.6Hz，Ar)，7.62-7.58(m，1H，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.3，8.1Hz，Ar)；13CNMR(125MHz，DMSO-d6)δ165.8，162.7(d，J＝248Hz)，162.6(d，J＝248Hz)，161.1，151.0，140.3，129.3，127.0，125.8，123.6，115.2，110.8(d，J＝28Hz)，107.8(t，J＝26Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值276.0467，實(shí)測(cè)值276.0463。
4-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(2)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的2(8.2mg，15％)。2的數(shù)據(jù)1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.00(br.s，1H，CO2H)，8.06(AMX，1H，J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.80-7.74(m，1H，Ar)，7.57(AMX，1H，J＝7.6，8.1Hz，Ar)，7.40-7.38(m，2H，Ar)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ166.1，160.4(d，J＝256Hz)，160.3(d，J＝256Hz)，154.9，150.6，139.6，134.7(t，J＝10Hz)，126.8，125.8，114.8，112.8(d，J＝22Hz)，105.2(t，J＝16Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0461。
4-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(3)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的3(9.5mg，15％)。3的數(shù)據(jù)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.70-12.80(br.s，1H，CO2H)，8.50(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，8.43(s，1H，Ar)，8.06(AMX，1H，J＝8.1Hz，Ar)，8.03(ABX，1H，J＝8.1Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，7.88(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，7.54(AMX，1H，J＝8.1Hz，Ar)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ165.8，161.9，151.0，140.6，131.4，130.8，130.0(q，J＝33Hz)，128.7(d，J＝4Hz)，127.2，127.0，125.5，123.8，123.7(q，J＝273Hz)，123.2，115.2；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0535。
4-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(4)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的4(15.2mg，25％)。4的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.15(br.s，1H，CO2H)，8.18(d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，8.06(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，8.02(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.96(AMX，1H，J＝0.9，7.9Hz，Ar)，7.94-7.87(m，2H，Ar)，7.58(AMX，1H，J＝8.2Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ165.8，161.6，151.2，140.0，133.0，132.6，132.3，127.6(q，J＝32Hz)，127.2(q，J＝6Hz)，127.0，125.6，124.9，123.5，123.4(q，J＝273Hz)，115.2；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0531。
4-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(5)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的5(8.0mg，13％)。5的數(shù)據(jù)1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.60-12.60(br.s，1H，CO2H)，8.16(A2M，2H，J＝2.0Hz，Ar)，8.05(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，7.96(A2M，1H，J＝2.0Hz，Ar)，7.94(AMX，1H，J＝0.9，7.6Hz，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ165.8，160.8，151.0，140.4，135.2，131.5，129.4，127.0，126.3，125.9，125.8，123.6，115.2；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9876。
4-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(6)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的6(5.2mg，8％)。6的數(shù)據(jù)1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.80-12.50(br.s，1H，CO2H)，8.07(AMX，1H，J＝8.2Hz，Ar)，7.95(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.77-7.71(m，3H，Ar)，7.59(AMX，1H，J＝7.9，8.2Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ165.8，158.2，150.8，139.3，134.8，134.0，128.7，126.8，126.7，125.9，122.4；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9880。
4-羧基-2-苯基-苯并噁唑(7)。按照一般步驟由3-羥基鄰氨基苯甲酸制備，得到為白色固體的7(10.2mg，21％)。7的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHZ，DMSO-d6)δ13.50-12.60(br.s，1H，CO2H)，8.24-8.22(m，2H，Ar)，8.03(AMX，1H，J＝0.9，8.2Hz，Ar)，7.91(AMX，1H，J＝0.9，7.9Hz，Ar)，7.68-7.61(m，3H，Ar)，7.51(AMX，1H，J＝7.9，8.2Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.0，163.4，151.0，140.8，132.4，129.4，127.6，126.7，126.1，125.0，123.0，115.0；C14H9NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為240.0655，實(shí)測(cè)值為240.0656。
5-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(8)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的8(10.2mg，19％)。8的數(shù)據(jù)1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.60-12.80(br.s，1H，CO2H)，8.32(ABM，1H，J＝1.5Hz，Ar)，8.07(ABM，1H，J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.90(ABM，1H，J＝8.5Hz，Ar)，7.86-7.85(m，2H，Ar)，7.60(tt，1H，J＝2.4，9.2Hz，Ar)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.8，162.8(d，J＝248Hz)，162.7(d，J＝248Hz)，161.5，153.0，141.2，129.1(t，J＝11Hz)，128.2，127.7，121.4，111.2，110.8(d，J＝23Hz)，110.7(d，J＝22Hz)，107.8(t，J＝26Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0469。
5-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(9)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的9(6.8mg，12％)。9的數(shù)據(jù)1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.50-12.80(br.s，1H，CO2H)，8.39(ABM，1H，J＝0.7，1.6Hz，Ar)，8.10(ABM，1H，J＝1.6，8.7Hz，Ar)，7.95(ABM，1H，J＝0.7，8.7Hz，Ar)，7.77(m，1H，Ar)，7.40(t，2H，J＝8.8Hz，Ar)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.8，160.4(d，J＝257Hz)，160.3(d，J＝257Hz)，155.4，152.6，140.8，134.8(t，J＝11Hz)，128.2，127.7，121.6，113.0(d，J＝22Hz)，112.9(d，J＝22Hz)，111.2，104.9；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0467。
5-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(10)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的10(6.7mg，11％)。10的數(shù)據(jù)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.30-12.80(br.s，1H，CO2H)，8.51(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，8.45(s，1H，Ar)，8.35(ABM，1H，J＝1.7Hz，Ar)，8.08(ABM，1H，J＝1.7，8.6Hz，Ar)，8.04(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)，7.93(ABM，1H，J＝8.6Hz，Ar)，7.89(ABX，1H，J＝7.8Hz，Ar)；13CNMR(125MHz，DMSO-d6)δ166.8，162.2，153.1，141.4，131.4，130.9，130.1(q，J＝33Hz)，128.8，128.2，127.5，127.1，123.8(q，J＝4Hz)，123.7(q，J＝273Hz)，121.3，111.2；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0530。
5-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(11)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的11(10.3 mg，17％)。11的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.19(br.s，1H，CO2H)，8.38(m，1H，Ar)，8.19(d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，8.09(dd，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)，8.03(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.94-7.88(m，3H，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.8，161.6，153.2，141.1，133.1，132.5，132.4，128.2，127.6，127.5(q，J＝32Hz)，127.2(q，J＝6Hz)，124.7，123.4(q，J＝274Hz)，121.6，111.2；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0531。
5-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(12)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的12(7.3mg，12％)。12的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.14(br.s，1H，CO2H)，8.33(AMX，1H，J＝0.6，1.8Hz，Ar)，8.16(AM，2H，J＝1.8Hz，Ar)，8.08(AMX，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)，7.95(AM，1H，J＝1.8Hz，Ar)，7.91(AMX，1H，J＝0.6，8.5Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.7，161.1，153.0，141.3，135.2，131.6，129.2，128.2，127.7，125.9，121.4，111.3；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9879。
5-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(13)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的13(10.8mg，18％)。13的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.08(br.s，1H，CO2H)，8.43(AMX，1H，J＝0.6，1.8Hz，Ar)，8.13(AMX，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)，7.98(AMX，1H，J＝0.6，8.5Hz，Ar)，7.77-7.72(m，3H，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.7，158.6，152.8，140.4，134.8，134.2，128.8，128.4，127.8，126.2，121.8，111.5；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9879。
5-羧基-2-苯基-苯并噁唑(14)。按照一般步驟由3-氨基-4-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的14(11.5mg，24％)。14的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.12(br.s，1H，CO2H)，8.30(ABX，1H，J＝1.8Hz，Ar)，8.20(dt，2H，J＝1.5，6.7Hz，Ar)，8.03(ABX，1H，J＝1.8，8.5Hz，Ar)，7.87(ABX，1H，J＝8.5Hz，Ar)，7.67-7.60(m，3H，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.9，163.6，153.0，141.6，132.4，129.4，127.9，127.5，127.0，126.0，121.0，111.0；C14H9NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為240.0655，實(shí)測(cè)值為240.0656。
6-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(15)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的15(10.3mg，19％)。15的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.22(br.s，1H，CO2H)，8.20(ABM，1H，J＝1.5Hz，Ar)，7.98(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，7.86(ABM，1H，J＝8.2Hz，Ar)，7.79-7.78(m，2H，Ar)，7.57(tt，1H，J＝2.4，9.4Hz，Ar)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.7，162.7(d，J＝248Hz)，162.6(d，J＝248Hz)，162.4，150.0，144.7，129.0(t，J＝11Hz)，128.7，126.5，120.0，112.1，110.9(d，J＝23Hz)，110.8(d，J＝22Hz)，108.0(t，J＝26Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0468。
6-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(16)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的16(8.5mg，15％)。16的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.25(br.s，1H，CO2H)，8.30(ABM，1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.04(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，7.96(ABM，1H，J＝0.6，8.2Hz，Ar)，7.76(m，1H，Ar)，7.39(t，2H，J＝8.8Hz，Ar)；13CNMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.7，160.4(d，J＝257Hz)，160.3(d，J＝257Hz)，156.6，149.7，144.2，134.9(t，J＝11Hz)，128.8，126.4，120.1，113.1，112.9，112.2(d，J＝5Hz)，105.0(t，J＝16Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0466。
6-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(17)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的17(7.4mg，12％)。17的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.20(br.s，1H，CO2H)，8.48(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，8.41(s，1H，Ar)，8.28(ABM，1H，J＝1.5Hz，Ar)，8.03(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，8.02(ABM，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，7.90(ABM，1H，J＝8.2Hz，Ar)，7.86(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ168.0，164.6，151.4，146.2，132.8，132.2，131.4(q，J＝32Hz)，130.2，129.8，128.4，127.8，125.2，125.0(q，J＝272Hz)，121.2，113.6；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0530。C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0531。
6-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(18)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的18(6.6mg，11％)。18的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.22(br.s，1H，CO2H)，8.30(ABX，1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.20(d，1H，J＝7.3Hz，Ar)，8.06(ABX，1H，J＝1.5，8.2Hz，Ar)，8.04(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.98(ABX，1H，J＝0.6，8.2Hz，Ar)，7.94(t，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.90(t，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ168.0，164.0，151.6，145.9，133.8，130.0，129.0(q，J＝32Hz)，128.6(q，J＝6)，127.7，126.0，124.7(q，J＝273Hz)，121.6，113.6；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0530。
6-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(19)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的19(6.0mg，10％)。19的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.20(br.s，1H，CO2H)，8.17(ABX，1H，J＝0.6，1.5Hz，Ar)，8.00(AB，1H，J＝2.0Hz，Ar)，7.96(ABX，1H，J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.83(AB，1H，J＝2.0Hz，Ar)，7.82(ABX，1H，J＝0.6，8.5Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.6，161.9，150.0，144.6，135.1，131.6，129.0，128.7，126.4，125.8，119.9，112.1；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9879。
6-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(20)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的20(12.7mg，21％)。20的數(shù)據(jù)1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.27(br.s，1H，CO2H)，8.38(ABX，1H，J＝0.5，1.5Hz，Ar)，8.09(ABX，1H，J＝1.5，8.3Hz，Ar)，8.02(ABX，1H，J＝8.3，0.5Hz，Ar)，7.78-7.71(m，3H，Ar)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ166.6，159.8，150.0，143.8，134.8，134.2，129.1，128.8，126.4，126.3，120.4，112.6；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9877。
6-羧基-2-苯基-苯并噁唑(21)。按照一般步驟由4-氨基-3-羥基苯甲酸制備，得到為白色固體的21(7.0mg，15％)。21的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.16(br.s，1H，CO2H)，8.27(d，1H，J＝0.9Hz，Ar)，8.25-8.22(m，2H，Ar)，8.01(dd，1H，J＝1.5，8.5Hz，Ar)，7.89(d，1H，J＝8.5Hz，Ar)，7.69-7.62(m，3H，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ166.8，164.7，150.0，145.2，132.6，129.4，128.0，127.6，126.3，126.0，119.6，112.0；C14H9NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為240.0655，實(shí)測(cè)值為240.0655。
7-羧基-2-(3，5-二氟苯基)-苯并噁唑(22)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的22(8.8mg，16％)。22的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.55(br.s，CO2H)，8.10(AMX，1H，J＝1.2，7.9HZ，Ar)，7.97(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，7.80-7.79(m，2H，Ar)，7.63(tt，1H，J＝2.4，9.2Hz，Ar)，7.55(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.5，162.8(d，J＝248Hz)，162.6(d，J＝248Hz)，160.9，149.2，142.6，129.2，128.0，125.2，124.9，116.1，110.6(d，J＝28Hz)，107.7(q，J＝25Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0469。
7-羧基-2-(2，6-二氟苯基)-苯并噁唑(23)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的23(7.3mg，13％)。23的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.48(br.s，1H，CO2H)，8.16(ABX，1H，J＝1.2，8.2Hz，Ar)，8.00(ABX，H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.78(m，1H，Ar)，7.57(ABX，1H，J＝7.6，8.2Hz，Ar)，7.40(t，2H，J＝8.5Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.5，160.4(d，J＝256Hz)，160.3(d，J＝257Hz)，154.9，148.9，142.1，134.8(t，J＝10Hz)，128.0，125.1，125.0，116.0，113.0(d，J＝22Hz)，112.9(q，J＝21Hz)，105.1(t，J＝17Hz)；C14H7F2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為276.0467，實(shí)測(cè)值為276.0467。
7-羧基-2-[(3-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(24)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的24(7.9mg，13％)。24的數(shù)據(jù)1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.51(br.s，CO2H)，8.48(ABX，1H，J＝8.2Hz，Ar)，8.40(s，1H，Ar)，8.10(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，8.05(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.96(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.94(ABX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.54(AMX，1H，J＝7.9，7.6Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.6，161.7，149.3，142.7，131.3，131.0，130.0(q，J＝32Hz)，128.6(d，J＝3Hz)，127.7，127.2，125.0，124.8，123.7(q，J＝272Hz)，123.5，116.0；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0532。
7-羧基-2-[(2-三氟甲基)苯基]-苯并噁唑(25)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的25(13.8mg，22％)。25的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.46(br.s，1H，CO2H)，8.18(d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，8.14(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，8.03(d，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.98(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.94(t，1H，J＝7.3Hz，Ar)，7.89(t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.56(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.6，161.1，149.3，142.4，133.0，132.4，132.2，127.8，127.6，127.2(q，J＝6Hz)，125.0，124.9，123.4(q，J＝273Hz)，116.2；C15H8F3NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為308.0529，實(shí)測(cè)值為308.0534。
7-羧基-2-(3，5-二氯苯基)-苯并噁唑(26)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的26(7.0mg，11％)。26的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ14.00-12.80(br.s，CO2H)，8.10-8.08(m，3H，Ar)，7.98-7.96(m，2H，Ar)，7.55(t，1H，J＝7.8Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.5，160.5，149.2，142.6，135.2，131.5，129.4，128.0，125.6，125.2，124.8，116.2；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9874。
7-羧基-2-(2，6-二氯苯基)-苯并噁唑(27)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的27(10.3mg，17％)。27的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.90-13.10(br.s，CO2H)，8.16(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，8.02(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)，7.78-7.72(m，3H，Ar)，7.60(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.4，158.3，149.1，141.7，134.9，134.2，128.8，128.2，126.5，125.3，125.2，116.2；C14H7Cl2NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為307.9876，實(shí)測(cè)值為307.9875。
7-羧基-2-苯基-苯并噁唑(28)。按照一般步驟由3-氨基水楊酸制備，得到為白色固體的28(13.1mg，27％)。28的數(shù)據(jù)1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ13.48(br.s，1H，CO2H)，8.20-8.19(m，2H，Ar)，8.05(AMX，1H，J＝1.2，7.9Hz，Ar)，7.92(AMX，1H，J＝1.2，7.6Hz，Ar)，7.66-7.62(m，3H，Ar)，7.50(AMX，1H，J＝7.9Hz，Ar)；13C NMR(150MHz，DMSO-d6)δ164.8，163.1，149.2，142.9，132.2，129.4，127.4，127.2，126.0，124.7，124.4，115.8；C14H9NO3(MH+)的HRMS(MALDI-FTMS)理論值為240.0655，實(shí)測(cè)值為240.0656。
其它實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管已經(jīng)連同其詳細(xì)說明闡述了本發(fā)明，但前文的描述僅具說明作用，不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面、優(yōu)勢(shì)和修改都在下文提出的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種篩選化合物的方法，所述化合物防止或降低甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的解離，所述方法包括使甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體與候選化合物接觸；和測(cè)定所述候選化合物是否增加與甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離相關(guān)的活化能，由此防止或降低甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的解離。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括測(cè)定所述化合物是否通過使甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離過渡態(tài)不穩(wěn)定而防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的解離。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括測(cè)定所述化合物是否通過穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體而防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的解離。
4.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括檢測(cè)所述候選化合物抑制纖維形成的能力。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括野生型甲狀腺素運(yùn)載蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括天然存在的突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括與家族性淀粉樣多神經(jīng)病發(fā)病病因相關(guān)的天然存在的突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括與家族性淀粉樣心肌病發(fā)病病因相關(guān)的天然存在突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白V122I。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白V30M。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體包括突變甲狀腺素運(yùn)載蛋白L55P。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選化合物為小分子。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選化合物為二氟尼柳類似物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述二氟尼柳類似物與二氟尼柳相比NSAID活性降低或缺失。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述二氟尼柳類似物與二氟尼柳相比環(huán)加氧酶抑制劑活性降低或缺失。
16.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括測(cè)定所述二氟尼柳類似物是否具有NSAID活性。
17.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括測(cè)定所述二氟尼柳類似物是否具有環(huán)加氧酶抑制劑活性。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述候選化合物為多氯聯(lián)苯。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述多氯聯(lián)苯為羥化多氯聯(lián)苯。
20.一種治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的方法，所述方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的、防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的二氟尼柳類似物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述二氟尼柳類似物通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的天然狀態(tài)而防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)榧易逍缘矸蹣佣嗌窠?jīng)病。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)榧易逍缘矸蹣有募〔　?br> 24.權(quán)利要求20的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)槔夏晷韵到y(tǒng)性淀粉樣變性。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述二氟尼柳類似物與二氟尼柳相比NSAID活性降低或缺失。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述二氟尼柳類似物與二氟尼柳相比環(huán)加氧酶抑制劑活性降低或缺失。
27.一種治療甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的方法，所述方法包括給予診斷為具有甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變的受試者治療有效量的、防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離的多氯聯(lián)苯。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述多氯聯(lián)苯通過動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體的天然狀態(tài)防止甲狀腺素運(yùn)載蛋白四聚體解離。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述多氯聯(lián)苯為羥化多氯聯(lián)苯。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)榧易逍缘矸蹣佣嗌窠?jīng)病。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)榧易逍缘矸蹣有募〔　?br> 32.權(quán)利要求27的方法，其中所述甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變?yōu)槔夏晷韵到y(tǒng)性淀粉樣變性。
全文摘要
動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定甲狀腺素運(yùn)載蛋白天然狀態(tài)是防止蛋白錯(cuò)折疊的有效機(jī)制。因?yàn)榧谞钕偎剡\(yùn)載蛋白錯(cuò)折疊在甲狀腺素運(yùn)載蛋白淀粉樣病變中起重要作用，所以抑制所述錯(cuò)折疊可有效地用于治療和預(yù)防所述疾病。本發(fā)明公開了治療方法、篩選方法以及具體的甲狀腺素運(yùn)載蛋白穩(wěn)定化合物。
文檔編號(hào)A61KGK1747965SQ200380109736
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者J·W·凱利, Y·塞基吉馬 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院