專利名稱：新的人促神經(jīng)營養(yǎng)因子及其編碼序列, 及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)學和基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人源蛋白及其核苷酸編碼序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的促神經(jīng)生長因子-人SHMUN01及其cDNA序列。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及含人SHMUN01的藥物組合物。
近10年來，腦與神經(jīng)科學領域飛速發(fā)展，其中有關神經(jīng)損傷修復及抗衰老的課題更是該領域的研究熱點，并且?guī)由窠?jīng)生物學、臨床解剖學、創(chuàng)傷外科學等前沿學科的發(fā)展。在該領域的任何研究進展，無論是對于實驗室的基礎理論研究；抑或是對于醫(yī)院臨床應用，都有著重要的意義。
目前，對于神經(jīng)科千百萬罹患老年性癡呆、外周神經(jīng)退行性病變、截癱、外傷后神經(jīng)損傷等疾病的病人而言，可以接受的有效治療方法極為有限。其中，就常規(guī)使用的藥物而言，譬如用于營養(yǎng)神經(jīng)的維生素B12，以及地巴唑、激素類和神經(jīng)節(jié)苷脂等，無論是品種還是效果都非常有限。
雖經(jīng)過多年研究，但是目前已知的、具有促進神經(jīng)生長作用的蛋白主要僅包括神經(jīng)營養(yǎng)因子(TNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子3和4(NT-3和NT-4)等。因此，人們對神經(jīng)發(fā)育生長和修復過程中所涉及的因子和多肽還知之甚少，迫切需要找到與神經(jīng)發(fā)育、營養(yǎng)及損傷修復等有關的各種因子和/或多肽，以便設計和制造出造福于人類的藥物。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種新的促神經(jīng)生長因子，本發(fā)明的促神經(jīng)生長因子成員被命名為人SHMUN01。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人源的促神經(jīng)生長因子，該蛋白被命名為人SHMUN01蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種生產(chǎn)所述的新的人SHMUN01多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種含人SHMUN01的藥物組合物，以及人SHMUN01核酸序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的人SHMUN01蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人SHMUN01蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人SHMUN01蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人SHMUN01蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人SHMUN01蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第六方面，提供了與上述的人SHMUN01多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-828個核苷酸。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在SHMUN01蛋白的方法，它包括將樣品與SHMUN01蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在SHMUN01蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人SHMUN01異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的人SHMUN01蛋白、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；以及藥學上可接受的載體。此外，該藥物組合物還含有安全有效量的選自下組的成分神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、和神經(jīng)營養(yǎng)因子4。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種本發(fā)明人SHMUN01蛋白的用途，它被用于制備治療神經(jīng)生長缺陷或神經(jīng)損傷病癥的藥物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
在本發(fā)明中，術語“SHMUN01蛋白”、“SHMUN01多肽”或“促神經(jīng)營養(yǎng)因子SHMUN01”可互換使用，都指具有人促神經(jīng)營養(yǎng)因子SHMUN01氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。這些術語包括含有或不含起始甲硫氨酸的人促神經(jīng)營養(yǎng)因子SHMUN01。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“人SHMUN01蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-828位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框1-828位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中1-828位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸1-828位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸1-828位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人SHMUN01相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“人SHMUN01蛋白或多肽”指具有人SHMUN01蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人SHMUN01相同功能的、SEQID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人SHMUN01蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人SHMUN01 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人SHMUN01多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人SHMUN01多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人SHMUN01多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人SHMUN01多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人SHMUN01蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人SHMUN01多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人SHMUN01保守性變異多肽”指與SEQ ID No.P的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人SHMUN01多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)人SHMUN01的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核酸分子，該分子通常具有人SHMUN01多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人SHMUN01的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人SHMUN01核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于人SHMUN01多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人SHMUN01 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人SHMUN01基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人SHMUN01基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人SHMUN01蛋白的分子，也包括那些并不影響人SHMUN01蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人SHMUN01基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人SHMUN01基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人SHMUN01或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人SHMUN01功能的抗體以及不影響人SHMUN01功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人SHMUN01基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人SHMUN01基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人SHMUN01核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與SHMUN01蛋白發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于神經(jīng)生長缺陷或障礙方面的治療，或者用于促進受損神經(jīng)細胞的修復。在使用本發(fā)明SHMUN01蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如神經(jīng)營養(yǎng)因子(TNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子3和4(NT-3和NT-4)等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明SHMUN01多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的SHMUN01蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人SHMUN01蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人SHMUN01蛋白水平，可以用作解釋人SHMUN01蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷SHMUN01蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在SHMUN01蛋白的方法是利用SHMUN01蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與SHMUN01蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在SHMUN01蛋白。
人SHMUN01蛋白的多聚核苷酸可用于SHMUN01蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，SHMUN01蛋白的多聚核苷酸可用于檢測SHMUN01蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下SHMUN01蛋白的異常表達。如SHMUN01 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷SHMUN01蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用SHMUN01蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測SHMUN01蛋白的轉錄產(chǎn)物。
檢測SHMUN01基因的突變也可用于診斷SHMUN01蛋白相關的疾病。SHMUN01蛋白突變的形式包括與正常野生型SHMUN01 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
在本發(fā)明一個實施例中，本發(fā)明人根據(jù)本人以前發(fā)現(xiàn)的大鼠tropic1808的核苷酸序列(中國專利申請No.99113473.7,1999年02月11日申請，該文獻在此引用作為參考)，設計特異性引物(SEQ ID No.3和4)，以胎兒肌肉組織的mRNA為模板，通過RT-PCR擴增后得到了人SHMUN01編碼序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為828個堿基，其開放讀框位于1-828位，編碼全長為275個氨基酸的SHMUN01蛋白(SEQ ID NO:2)。經(jīng)瞬時表達，測定了表達產(chǎn)物對大鼠背根神經(jīng)節(jié)的影響，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新的人源蛋白有明顯的促神經(jīng)生長作用。
本發(fā)明所提供的新的SHMUN01多肽和編碼序列，為進一步研究SHMUN01在生物體內(nèi)的功能以及由該類基因引起的疾病提供了基礎，并為將來的疾病治療提供了新的前景。
本發(fā)明的人SHMUN01除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人SHMUN01還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。
針對本發(fā)明SHMUN01的抗體，用于篩選與SHMUN01同源的蛋白，或者用于親和純化相關蛋白。
此外，本發(fā)明SHMUN01核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人SHMUN01的表達水平或者抑制人SHMUN01的過度表達。本發(fā)明的SHMUN01蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人SHMUN01缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
由于本發(fā)明的人SHMUN01具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性極低或甚至沒有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的含有pcDNA3-人SHMUN01表達載體的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)的照片。
圖2是含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)的照片。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人源肌肉組織cDNA的制備以正常引產(chǎn)胎兒的肌肉組織為材料，以GIBCO-BRL公司的TRIzol(Cat.#15596-026)試劑提取總RNA后，應用該公司的Superscriptpreamplification(Cat.#10928-018)試劑盒，以寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸為引物，在42攝氏度下反應一小時，完成逆轉錄反應，合成得到cDNA。
實施例2SHMUN01編碼核苷酸序列的獲得人工合成寡核苷酸引物，即為5′-TAAAG CTTAT GAATT TGGCT CAAATCGC-3′(SEQ ID NO.3)和5′-GCGGA ATTCT TACGA TAGCA GCAAT GTC-3′(SEQ ID NO.4)，分別作為上下游引物。
以人源肌肉組織的cDNA為模板，使用GENE公司的Taq DNA聚合酶(5U/μl,Cat.#GT-TAQ251)，進行PCR擴增。每100μl反應體系中包括逆轉錄反應產(chǎn)物10μl，上下游寡核苷酸引物各100pmol，及10mmol/L Tris-Hcl(pH8.3,20℃),1.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl,2mmol/L dNTP,20μg/ml BSA,2.5單位TaqDNA聚合酶，再覆蓋100μl液體石蠟。在PERKIN ELMER/CETUS公司的DNAThermal Cycler480上94℃變性1min,55℃退火1min及72℃延伸3min，共進行30個循環(huán)，最后在72℃保溫10min。取5μl反應產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠進行電泳，EB染色，紫外燈下觀察鑒定。結果，獲得含有完整SHMUN01結構基因的DNA片段，長度為845bp(該864bp的擴增產(chǎn)物的序列就是SHMUN01編碼序列加上兩側的酶切位點的序列TAAAGCTT和GAATTCCGC,)，且上游攜帶HindⅢ酶切位點，下游攜帶EcoRⅠ酶切位點。
經(jīng)將如上獲得的PCR擴增片段進行測序，結果證實擴增產(chǎn)物除去兩端酶切位點之外的序列，與SEQ ID No.1中第1-828位的序列相一致。
實施例3SHMUN01編碼產(chǎn)物在真核表達系統(tǒng)CHO細胞株中的表達將實施例2中的獲得的含有SHMUN01的編碼序列的cDNA，經(jīng)HindⅢ+EcoRⅠ雙酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的Invitrogen公司表達載體pcDNA3(Cat.#V790-20)中，經(jīng)酶切及DNA測序證實插入片段大小及方向正確無誤后，轉染CHO細胞，進行瞬時表達。
實施例4SHMUN01編碼產(chǎn)物在原核表達系統(tǒng)中的表達和表達產(chǎn)物的純化將實施例2中的獲得的含有SHMUN01的編碼序列的cDNA，經(jīng)HindⅢ+EcoRⅠ雙酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的Novagen公司表達載體pET21a(Cat.#70763-3)中，經(jīng)酶切及DNA測序證實插入片段大小及方向正確無誤后，轉化BL21宿主菌。含表達質粒的BL21過夜菌50ml加到1ml新鮮的LB培養(yǎng)液中，37攝氏度培養(yǎng)2小時，加入IPTG到終濃度為0.4mM誘導表達4小時后收集菌體。含表達產(chǎn)物的菌體以PBS懸浮，經(jīng)超聲波破碎，收集的上清液經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow(PharmaciaBiotech Cat.#17-0709-10)離子交換柱和Superdex200(Pharmacia Biotech Cat#17-1043-10)分子篩柱，純化得到SHMUN01蛋白。
用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例5重組表達產(chǎn)物的活性檢測首先分離新生SD大鼠的背根神經(jīng)節(jié)。按常規(guī)準備不含有血清的DMEM基礎培養(yǎng)液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，保存于4℃。另取少量于37℃孵育2天，觀察有無污染。用鼠尾膠包被96孔培養(yǎng)板，回收多余的膠。37℃,5％CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。用基礎培養(yǎng)液洗滌上述培養(yǎng)板3-4次，于超凈臺自然風干備用。選用新生SD大鼠(出生24-48hr內(nèi))，取材前在75％乙醇中浸泡10min。于無菌條件下，將鼠斷頭處死，用無菌脫脂棉充分吸凈血液。用眼科剪自鼠背部正中剪開皮膚，將棘突兩側的肌肉及軟組織仔細剝離、剔除。仔細剪開椎管，盡量剪短并修齊椎弓，小心剝離脊髓，暴露位于兩側椎間孔中的背根神經(jīng)節(jié)。輕柔取出背根神經(jīng)節(jié)，置于裝有基礎培養(yǎng)液的無菌平皿中，小心去除其它組織，用基礎培養(yǎng)液盡量沖洗干凈。將上述背根神經(jīng)節(jié)置于已經(jīng)處理的培養(yǎng)板中。
活性檢測時，分別將含有pcDNA3-SHMUN01表達載體的CHO細胞和只含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)在無血清基礎培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)。將培養(yǎng)板置于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24-48hr。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)后的背根神經(jīng)節(jié)，觀察是否有明顯神經(jīng)突起生長。
參見附圖，圖1為含有pcDNA3-SHMUN01表達載體的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)的照片，圖中可檢查到有許多神經(jīng)纖維自神經(jīng)節(jié)中心、呈放射狀向外生長，這說明本發(fā)明的SHMUN01具有明顯的促神經(jīng)生長作用。而圖2中只含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)則無類似效應。因此，本發(fā)明的人SHMUN01是一種新的促神經(jīng)生長因子，具有明顯的促神經(jīng)生長效應，并在神經(jīng)發(fā)育與再生過程中起著促進神經(jīng)生長的重要作用。
實施例6藥物組合物冷凍干燥制品取純化的SHMUN01蛋白1mg，神經(jīng)生長因子(NGF)1mg,5％氫氧化鈉適量，注射用水加至1000ml。
在無菌操作室內(nèi)稱取SHMUN01蛋白和NGF，置于適當無菌容器中，加無菌注射用水至950ml，攪拌溶解，加5％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.3-6.7范圍內(nèi)，補加滅菌水至1000ml，然后加配制量的0.02％活性炭，攪拌5-10分鐘，用無菌抽濾漏斗過濾，分裝于2ml安瓶中，低溫冷凍干燥約24小時后無菌熔封即得。
實施例7SHMUN01蛋白的抗體制備將實施例4中獲得的SHMUN01蛋白作為抗原，配成1mg/ml溶液，與完全佐劑以體積1∶1充分混合，每只Bal b/c小鼠于腹腔注射100μl，此為第一次免疫動物。此后每隔三周，以不完全佐劑替代完全佐劑免疫一次，共進行四次免疫。免疫動物完成后，處死小鼠取血，收集血清，經(jīng)HiTrap Protein A Column(pharmacia BiotechCat.#17-0402-03)純化，以酶標法測定抗體的滴度。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司(ⅱ)發(fā)明名稱新的人促神經(jīng)營養(yǎng)因子及其編碼序列，及制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目4(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度828bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.11 ATGAATTTGG CTCAAATCGC TGCGTTGAAT CAAATTTCAA ATTTGAATGC AATCCGCGTG61 GGACAAGTTT TGAAGGTATC TAACGCCGCC GGTTCAAATA ATACGCAAAA TACAACCCAG121 CCTTCTGCAG GGGTACCAAC GAATACGGCG TCAAGCACAA CAGGTTATAC TGTTAAGTCT181 GGGGATACGT TGTCAGCAAT CGCTGCGGCA AACGGTGTTT CATTGGCGAA CTTGCTCAGC241 TGGAACAACT TGTCATTGCA AGCCATTATC TATCCTGGAC AAAAGTTAAC GATTCAAAAC301 GCTAACAATG CCACGGTCAC AACGCCAAAC GCACCGACAA GTACGCCAAC GGTTATGCCA361 TCAACGAACG GTAGTTACAC GGTGAAGTCA GGCGATACAT TGTATGGTAT TGCAGCAAAG421 CTAGGGACGA ACGTGCAAAC GTTGCTATCT TTGAATGGTT TGCAATTGTC AAGCACCATT481 TATGTGGGGC AAGTTTTGAA AACAACAGGC GCACCAGTTG CTGGTGCTGG AACTGCCACA541 TCAACACCAA CACCAGTAAC ACCAACAGTC TCAAAACCGG CTGCAGCAAA CGGTGTGTCA601 ACAGCTGGCT TAAGTGCTGC GCAAGCCGCA TGGTTGCGGA CAGCGGTTGT TGATGCGCAA661 GCGGCAACAG CAGGGACGGG CGTTTTGGCA TCCGTAACGG TTGCTCAAGC GATTCTTGAA721 AGCGGTTGGG GACAATCAGC GTTGGCTTCA GCACCATACC ATAACTTTAA TTTATATTTA781 ATAAAGGTGA AAAACACATG GAAATTGATG ACATTGCTGC TATCGTAA(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.21 Met Asn Leu Ala Gln Ile Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ser Asn Leu16 Asn Ala Ile Arg Val Gly Gln Val Leu Lys Val Ser Asn Ala Ala31 Gly Ser Asn Asn Thr Gln Asn Thr Thr Gln Pro Ser Ala Gly Val46 Pro Thr Asn Thr Ala Ser Ser Thr Thr Gly Tyr Thr Val Lys Ser61 Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Gly Val Ser Leu76 Ala Asn Leu Leu Ser Trp Asn Asn Leu Ser Leu Gln Ala Ile Ile91 Tyr Pro Gly Gln Lys Leu Thr Ile Gln Asn Ala Asn Asn Ala Thr106 Val Thr Thr Pro ASh Ala Pro Thr Ser Thr Pro Thr Val Met Pro121 Ser Thr Asn Gly Ser Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Tyr136 Gly Ile Ala Ala Lys Leu Gly Thr Asn Val Gln Thr Leu Leu Ser151 Leu Asn Gly Leu Gln Leu Ser Ser Thr Ile Tyr Val Gly Gln Val166 Leu Lys Thr Thr Gly Ala Pro Val Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr181 Ser Thr Pro Thr Pro Val Thr Pro Thr Val Ser Lys Pro Ala Ala196 Ala Asn Gly Val Ser Thr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gln Ala Ala211 Trp Leu Arg Thr Ala Val Val Asp Ala Gln Ala Ala Thr Ala Gly226 Thr Gly Val Leu Ala Ser Val Thr Val Ala Gln Ala Ile Leu Glu241 Ser Gly Trp Gly Gln Ser Ala Leu Ala Ser Ala Pro Tyr His Asn256 Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Val Lys Asn Thr Trp Lys Leu Met271 Thr Leu Leu Leu Ser(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.3:
TAAAGCTTAT GAATTTGGCT CAAATCGC 28(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.4:GCGGAATTCT TACGATAGCA GCAATGTC 28
權利要求
1．一種分離的人SHMUN01蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它編碼具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，且該多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3．如權利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸1-828位的核苷酸序列。
4．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的人SHMUN01蛋白、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；以及藥學上可接受的載體。
5．如權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，它含有具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的人SHMUN01蛋白。
6．如權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，它還含有安全有效量的選自下組的成分神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、和神經(jīng)營養(yǎng)因子4。
7．一種如權利要求1所述的人SHMUN01蛋白的用途，其特征在于，它被用于制備治療神經(jīng)生長缺陷或神經(jīng)損傷病癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人源蛋白及其編碼核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人源蛋白SHMUN01的cDNA序列,該序列所編碼的蛋白是一種促神經(jīng)生長因子。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及含人SHMUN01蛋白的藥物組合物。
文檔編號A61P25/00GK1324821SQ0011574
公開日2001年12月5日 申請日期2000年5月18日 優(yōu)先權日2000年5月18日
發(fā)明者顧建新, 陳淳, 徐沁, 張頌文, 方向東 申請人:上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司